Önceki Kitapların Neshi

Uma das primeiras observações nesse experimento foi a constatação de que as células aderiam melhor na malha eletrofiada que nas superfícies tratadas com poli-L-lisina e laminina, que são os substratos usualmente utilizados na migração e diferenciação das neuroesferas. Essa é mais uma evidência da qualidade do material como suporte celular, por promover um ambiente adequado à ancoragem celular, e que possivelmente está ligado à menor hidrofobicidade do material.

Nos experimentos com a malha alin00, que possui fibras desalinhadas, foi observada a migração radial das células diferenciadas da neuroesfera, tal como ocorre na cultura usual, em garrafas de cultura, mas o mesmo não foi observado nos experimentos com as outras duas malhas.

Interessantemente, nos experimentos com a malha alin02, de fibras com alinhamento intermediário, a migração das células (bem como vários de seus processos) pareceu seguir a direção das fibras, como pode ser observado na

Figura 44. Isso está em acordo com o encontrado em alguns trabalhos com células neurais de origem primária [24, 118].

Finalmente, nos experimentos com a malha alin03, que possui fibras bem alinhadas, a migração celular foi interrompida. Uma causa para isso pode ser o excesso de contato físico com as fibras, de modo que estas não apenas direcionam o crescimento das células, mas também impedem que ele ocorra em qualquer outra direção, acabando por suprimir a migração. Não obstante, em algumas neuroesferas, foi possível observar pequenos neuritos emanando

quase que exclusivamente na direção de alinhamento das fibras, como mostra a Figura 43.

Esses resultados todos, consideramos conjuntamente, apontam para a existência de um intervalo na qualidade do alinhamento das fibras do substrato, em que tal alinhamento beneficia a migração das células neurais. Nos substratos de fibras pouco alinhadas, não há benefício do substrato. Já nos substratos de fibras muito alinhadas, a migração celular, de natureza radial, é restringida pelo alinhamento excessivo das fibras. Finalmente, em substratos de fibras razoavelmente alinhadas, o contato físico das fibras direciona o crescimento dos neuritos. Assim, o substrato deve conter fibras que não estejam nem muito nem pouco alinhadas.

Nesse sentido, a possibilidade de se quantificar a qualidade do alinhamento das fibras do substrato representa grande vantagem por possibilitar uma avaliação objetiva sobre o efeito do substrato anteriormente ao cultivo celular.

Figura 43: imagens de fluorescência de GFAP obtidas das culturas sobre os substratos eletrofiados. O marcador indica a presença de astrócitos migrando radialmente a partir do núcleo das neuroesferas. O tracejado azul indica o núcleo e o vermelho os limites da migração. Os substratos usados foram, respectivamente da esquerda para a direita: alin00, alin02 e alin03

Alin00

Alin02

Alin03

Figura 44: imagens de fluorescência para marcadores GFAP (verde, astrócitos), β-3-tubulina (vermelho, neurônios) e a sobreposição de ambas. Sobre cada trio de imagens é indicado o substrato sobre o qual foi feita a cultura das neuroesferas. Especialmente em alin02 e alin03, as setas indicam direções preferenciais de migração e desenvolvimento de neuritos.

5. CONCLUSÕES

Foi construído um aparato de eletrofiação, que foi utilizado na produção de malhas poliméricas contendo fibras alinhadas. Ainda que esta não tenha sido uma inovação tecnológica do ponto de vista da literatura, sua construção representou um importante incremento na coleção de ferramentas do grupo de pesquisa. Outros tipos celulares, além das células neurais, recebem influência da anisotropia do meio, de modo que a produção de suportes celulares poliméricos de fibras alinhadas pode ser de grande interesse.

Adicionalmente, a variação dos parâmetros de eletrofiação permitiu a definição de condições que produzem malhas eletrofiadas contendo fibras com diversas qualidades de alinhamento para dois polímeros distintos. Destaca-se que a variação na qualidade de alinhamento das fibras foi obtida pela alteração de outros parâmetros de eletrofiação além da velocidade de captação de fibras. Este parâmetro, contudo, mostrou ser o fator dominante na qualidade do alinhamento das fibras, em acordo com dados reportados na literatura.

A morfologia das fibras eletrofiadas foi avaliada quanto ao seu diâmetro, revelando que seu valor está próximo àqueles reportados na literatura como ideais para o crescimento e desenvolvimento de células neurais. Tal avaliação é interessante e necessária, uma vez que se somam trabalhos apontando para a importância desse parâmetro nos materiais destinados ao suporte para crescimento de células neurais.

Foi desenvolvida uma metodologia capaz de avaliar objetiva e quantitativamente a qualidade do alinhamento das fibras constituintes das malhas eletrofiadas obtidas, através de suas microscopias e de um software livre e independente de plataforma.

A metodologia proposta foi incorporada ao software utilizado, por meio de algoritmo computacional, de modo a permitir sua utilização em um grande número de micrografias, a um tempo hábil. Foram realizados testes com o algoritmo, de modo a verificar que sua resposta é significativamente equivalente à utilização manual da metodologia.

O uso do algoritmo faz jus ao poder computacional disponível, além de permitir o fácil compartilhamento da metodologia. Além disso, a vantagem computacional adquirida pelo uso do algoritmo permite que seja avaliada a representatividade da análise de qualidade de alinhamento de fibras convencionalmente descrita na literatura, feita com base em apenas uma imagem.

As malhas eletrofiadas, contendo diferentes qualidades de alinhamento de suas fibras constituintes, foram utilizadas como substrato em cultura de células precursoras neurais a fim de se avaliar os efeitos de tal variável na diferenciação celular. Os resultados mostraram haver um intervalo na qualidade de tal alinhamento fora do qual não se verificam benefícios ao crescimento e diferenciação de células neurais.

Juntamente com a metodologia desenvolvida neste trabalho, esses resultados representam ganhos significativos no entendimento e controle dos parâmetros de substratos para cultura e regeneração de células neurais.