T.C.
SAĞLIK BAKANLIĞI HAYDARPAŞA NUMUNE EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI
ŞEF: DOÇ. DR. PAŞA GÖKTAŞ
HASTANE INFEKSIYONU ETKENI OLAN PSEUDOMONAS AERUGINOSA KÖKENLERİNDE ÇİFT DİSK SİNERJİ TESTİ
VE KOMBİNE ÇİFT DİSK SİNERJİ İLE METALLO-BETA- LAKTAMAZ VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI
(UZMANLIK TEZI)
Dr. GÜLDEN TOPÇU ALBAYRAK
Istanbul - 2008
ÖNSÖZ
Uzmanlık eğitimimi aldığım Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Başhekimi Sayın Doç.Dr. Hacı Mehmet SÖKMEN’ e,
Uzmanlık eğitimi süresince, hoşgörü ortamı içerisinde, geniş bilgi ve tecrübesinden yararlandığım Klinik Şefimiz Sayın Doç. Dr. Paşa GÖKTAŞ’ a,
Eğitimim süresince bilgi ve tecrübeleri ile bize yön veren , başta tez çalışmam sırasında yakın ilgi ve desteğini gördüğüm Dr. Seniha ŞENBAYRAK AKÇAY olmak üzere birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum Laboratuvarımız uzmanlarına, asistan arkadaşlarıma, teknisyenlerimize ve diğer çalışanlarına,
Manevi desteği ile her zaman yanımda olan sevgili eşim Dr. H. Murat ALBAYRAK’ a ve oğlum Ahmet Talha ALBAYRAK’ a teşekkür ederim.
Dr.Gülden TOPÇU ALBAYRAK 2008
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
Giriş ve Amaç 1 - 2 Genel Bilgiler 3 - 33 Materyal ve Metod 34 - 35 Bulgular 36 - 42 Tartışma ve Sonuç 43 - 49 Özet 50 - 51 Summary 52 - 53 Kaynaklar 54 - 64
GİRİŞ VE AMAÇ
Hastane infeksiyonları, günümüzde modern tıbbın en önemli problemleri arasına girmiş olup hastaneye yatan hastaların % 5-15’ inde gelişmektedir (1). Hastalarda ciddi mortalite, morbiditeye neden olmakta ve getirdikleri ekonomik kayıplar sonucunda tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de tıbbi ve farmakoekonomik bir sorun olmaya devam etmektedir.
Pseudomonas aeruginosa hastane infeksiyonlarının en önemli nedenlerinden biridir. Birçok antibiyotiğe doğal olarak dirençli olmasının yanı sıra mutasyon ile tüm tedavilere dirençli hale gelebilmesi ve son yıllarda tedavide kullanılabilecek tüm antibiyotiklere dirençli ‘’ panrezistan ‘’ kökenlerin çıkmaya başlaması, P. aeruginosa’ nın hastane infeksiyonlarında en önemli bakterilerden biri olmasında etken olmuştur (2). Pseudomonaslar yoğun bakım üniteleri, yanık üniteleri, mekanik ventilatörler, kanser kemoterapisi uygulanan veya geniş spektrumlu antibiyotik kullanılan birimlerde daha fazla kolonize olur ve bu durum invazif infeksiyonlara yatkınlık oluşturmaktadır(3, 4).
Hastane infeksiyonlarında Pseudomonasları önemli hale getiren virulans faktörlerinin yanısıra, oluşturdukları kromozomal ve plazmid kontrolündeki beta-laktamazları da bulunmaktadır. Plazmid kontrolünde ve kromozomal beta laktamaz sentezleyen kökenler hastanelerde yaygın olarak ortaya çıkmaktadır(1).
Pseudomonasların beta-laktam antibiyotik direnci çeşitli mekanizmalara bağlı olarak gelişmektedir. Beta laktam antibiyotiklere direnç gelişmesinden sorumlu mekanizmalar içinde en önemlisi, bakterilerin ürettiği beta-laktamaz enzimleridir. Beta laktam antibiyotiklerle sağaltım sırasında derepse mutantların ortaya çıkması ya da yüksek düzeyde sefalosporinaz sentezlemesi nedeniyle karbapenemler dahil tüm antibiyotikler inaktive olabilmekte ve tedavi başarısızlıkları meydana gelmektedir (1).
P. aeruginosa ’ya bağlı olarak gelişen hastane infeksiyonlarında beta- laktamaz varlığını tesbit etmek gerekmektedir. Bu nedenle bu tür infeksiyonların gelişebileceği hastanelerin klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında rutin antibiyotik duyarlılık testleri, IBL, GSBL yanı sıra MBL üretimi de araştırılmalıdır. Pseudomonas infeksiyonlarının tedavisi sırasında da direnç gelişebileceği ve bu durumda tedavide kullanılabilecek alternatiflerin bilinmesi oldukça önemlidir. Böylece tedavi başarısı, direnç gelişimi ve yüksek maliyet sorunu kontrol altına alınabilmektedir (5, 6).
Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarımızda hastane infeksiyonu etkeni olarak izole edilen P.aeruginosa kökenlerinde disk difüzyon yöntemiyle seftazidime yüksek oranda direnç saptanmıştır. CLSI önerileri doğrultusunda;
bu kökenlerde imipenem ve seftazidim duyarlılığı broth mikrodilüsyon yöntemiyle araştırılmıştır. Seftazidim minimum inhibisyon konsantrasyonu (MIK) 64 µg/ml ve üzerinde olan kökenlerde MBL varlığının araştırılması ve bu enzimlerin varlığını ortaya koyabilecek iki fenotipik tarama yönteminin test edilmesi ve karşılaştırılması amaçlanmıştır.
GENEL BİLGİLER HASTANE İNFEKSİYONLARI
Günümüzde tıp alanındaki gelişmelerin artmasına, en iyi tekniklerin uygulanmasına rağmen hastane infeksiyonları halen önemli bir sorundur.
Hastane infeksiyonları başvuru anında inkübasyon döneminde olmayan, hastaneye yatıştan sonra gelişen veya hastanede gelişmesine rağmen, bazen taburcu olduktan sonra ortaya çıkabilen infeksiyonlar olarak tanımlanmaktadır (7, 8).
Değişik çalışmalarda hastane infeksiyonlarının hastaneye yatırılan hastaların % 3.1 ile % 14.1’inde geliştiği saptanmıştır (9). Bugün Amerika Birleşik Devletleri’ nde % 5’ in üzerinde hastane infeksiyonu görülmektedir (6). Ülkemizde değişik hastanelerden bildirilen hastane infeksiyonları insidansı %3–7.8 arasındadır (10). Bu oranlar hastaneden hastaneye farklılık gösterebildiği gibi, aynı hastanenin değişik servisleri arasında da birbirinden farklı olabilir. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde infeksiyon hastalıklarının yüksek oranda görülmesi, bilinçsiz ve amaç dışı antibiyotik kullanımı, ilaç üretim hataları, ulusal antibiyotik politikalarının yetersizliği, kalabalık ve yetersiz hastane hijyen şartları gibi sosyoekonomik faktörler ve davranış bozuklukları sonucudur. Bu infeksiyonlar antimikrobiyal direncin artmasına katkıda bulunurken, büyük ekonomik kayıplara da neden olmaktadır.
PSEUDOMONASLAR VE PSEUDOMONAS AERUGİNOSA
Pseudomonas aeruginosa ilk kez Gessard tarafından 1882 yılında mavi yeşil cerahat etkeni olarak tanımlanmıştır (3). 1886 yılında yeni doğan kanında,1899 yılında ise yetişkin kanında infeksiyon etkeni olarak izole edilmiştir. 19. yüzyılın sonunda insanın hemen hemen tüm anotomik bölgelerinden infeksiyon etkeni olarak izole edilmiştir. 1980’ lerden sonra hastane infeksiyon etkeni olarak dikkat çekmeye başlamıştır (4).
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonadaceae ailesinin bir üyesi olup, Pseudomonas cinsinin en iyi tanımlanan türüdür. Pseudomonas cinsinde bulunan bakteriler rRNA homolojilerine göre, beş gruba ayrılmıştır. Son yıllarda yapılan ayrıntılı çalışmalara göre yeniden sınıflandırılmıştır (11).
Tablo 1. Pseudomonas ve yakın bakterilerin rRNA homoloji grupları (11).
rRNA Homoloji grup ve alt grupları Cins ve türler
Ι. Floresan grup Pseudomonas aeruginosa P. fluorescens
Non-Floresan grup P. stutzeri P. mendocina
P. alcaligenes P. pseudoalcaligenes II. Burkholderia pseudomallei B. mallei
B. cepacia B. picketti
III. Comamonas acidovorans C. testosteroni
IV.* P. diminuta P. vesicularis
V. Stenotrophonas maltophilia
* : İnsanlarda çok nadir izole edilebilen grup
Pseudomonas aeruginosa, aerob, gram negatif bir çomak olup düz veya hafif kıvrık olabilir, spor oluşturmaz, 0,5-0,8 µm eninde, 1,5 - 3,0 µm boyunda, uçlarında tek nadiren 2-3 adet kirpiği ile haraketli bir organizmadır . Gen transferini konjugasyon veya transdüksiyonla yapar ve DNA’ daki G+S oranı
% 67,2’ dir (3, 11).
Otuzdan fazla organik maddeyi üremek için kullanır. En iyi 37˚ C de ürerler. Pseudomonas aeruginosa ve diğer türler 42˚ C de de ürerler; fakat 4˚
C de üremezler. Nitratlı ortamlarda ve arjinin varlığında anaerop da üreyebilirler. Buyyonda yüzeyde bir zar oluşturarak homojen bir şekilde ürer ve zarın altında mavi yeşil pigment ayırt edilir. Katı besiyerinde yaklaşık 3-5 mm boyutlarında, yuvarlak, yumuşak, yassı, metalik parlaklık veren koloniler şeklinde; kanlı agarda düz, tüysü kenarlı, pürüzlü veya buzlu cam görünümünde beta hemolitik koloniler şeklindedir ve tipik yeşil metalik renkte koloniler oluşturur. Bu görünüm piyosiyanin pigmentine bağlıdır (12,13). Mac Conkey agarda laktoz negatif koloniler gelişir. İzolasyon için 24-48 saat yeterlidir (11, 12).
Pseudomonas aeruginosa’ nın kültürdeki aromatik meyve kokusu karakteristiktir.Bu özellik 2-aminosetofenon’ a aittir.
Pseudomonas aeruginosa karbonhidratları fermente etmez. Glikoz ve ksilozu, oksidasyon yoluyla parçalar fakat maltoza etkisizdir. Katalaz ve oksidaz testleri pozitiftir. L- arjinin dihidrolaz üretiminin, L-lizin dekarboksilaz ve L-ornitin dekarboksilaz üretiminin negatif olması, indol ve H2S oluşturmaması, metil kırmızısı ve Voges Proskauer testlerinin negatif olması, jelatini hidrolize etmesi, üreyi parçalaması, sitratı kullanabilmesi ve nitratın gaz oluşturması, üç şekerli demirli (TSI) besiyerinde reaksiyon oluşturmaması gibi özellikleri tanıda yardımcı olan diğer biyokimyasal testlerdir (12,13,14).
Piyoverdin (sarı - yeşil) ve piyosiyanin (mavi) adı verilen floresan pigmentler yapar. Bu da nötral pH’ da mavi veya yeşilimsi mavi görülür. Bu pigmentten dolayı aeruginosa tür adı verilmiştir (3).
Piyosiyanin oluşması üreme ortamına bağlı olup ortamdaki yüksek fosfat konsantrasyonlarında artarken, stoklanan kültürlerde pigment oluşturma özelliklerini kaybedebilirler. Pseudomonas aeruginosa’nın suda eriyen piyoverdin pigmenti ile suda ve kloroformda eriyen pyosiyanin pigmentinin birleşmesi sonucu karakteristik parlak yeşil rengi ortaya çıkar. P.aeruginosa bazı kökenleri piyorubin ve kahverengi–siyah bir pigment olan piyomelanin de üretebilirler (3).
Pseudomonas aeruginosa fırsatçı bir patojendir. Hastalık oluşturmada çeşitli yapıları ve hücre dışı enzimleri yardımcı olmaktadı. Pseudomonas aeruginosa’ nın piluslar ve tutunucu hücre yüzeyi yapıları (pilus dışı adezinler) olmak üzere iki protein adezini vardır. Bu yapılar epitel hücrelerine tutunmadan sorumludur. Pilusların saflaştırılması da, bu yapılara karşı gelişen antikorlar da epitele tutunmayı engeller. Pilusları ile, öncelikle siyalik asitsiz gangliozid reseptörlere (asialo GM1) tutunur. Pseudomonas aeruginosa kökenleri aynı zamanda nörominidaz üretir ve oluşan nörominidaz gangliozidlerdeki siyalik asit kalıntılarını kaldırır. Böylece pilusların tutunması için daha uygun bölgeler oluşturulmuş olur. Pseudomonas aeruginosa, pilusları ile epitel hücrelerine tutunur fakat musine tutunamaz. Pilus dışı adezinlerin bir bölümü hem epitele hem musine tutunmayı, diğerleri ise yalnızca musine tutunmayı sağlar (15, 11, 16).
Pseudomonas aeruginosa kökenleri, bazı koşullarda polisakkarit yapıda kapsül benzeri yapılar yapar. Hücre dışında bulunan bu yapıya slaym (slime) tabakası denildiği gibi glikokaliks veya mukoid ekzopolisakkarit olarak ta tanımlanır. Bu yapı aljinatla sonlanan, tekrar eden yapılar şeklinde mannuronik asit ve glukuronik asitten oluşmaktadır. Bu karbonhidrat bakterinin etrafında bir matriks olarak şekillenir, onu iyice tespit eder ve konak savunmasından (mukosiliyer aktivite, fagositik hücreler, antikorlar ve kompleman gibi) bakteriyi korur. Mukoid kökenlerin çoğu kistik fibrozlu hastaların örneklerinden izole edilir. Ayrıca aljinat, Pseudomonas aeruginosa tedavisinde kullanılan aminoglikozidlerin bakterisid etkisini inhibe edebilir (15, 11,16).
Klinik örneklerden izole edilen çoğu P. aeruginosa kökeni hücre dışı proteaz üretir. Bunlardan en iyi araştırılanlar elastaz ve alkali proteazdır. Her ikisi de deride, akciğerde ve korneada nekrozlar yapar (17, 11).
Başka bir toksik protein ise sitotoksindir. Bu protein 25.000 mol ağırlığındadır. Lökositlerle sitopatik etkilidir ve lökosidin adı verilir. Hücre
Pseudomonas endotoksini lipid A, diğer bakteriyel lipopolisakkaritler gibi organizmanın biyolojik etkisini düzenler. Pseudomonas lipopolisakkaritleri, biyolojik olarak diğer gram negatif bakterilerinkinden daha zayıf gibi görünmektedir (11, 21).
Ekzotoksin A hücre dışı bir enzim olup, çoğu P. aeruginosa kökeni tarafından yapılır. Konak hücrenin protein sentezini engeller, adenozindifosfatın transferini katalize eder. Bu reaksiyon elongasyon faktör 2’
yi (EF2) inaktive ederek protein sentezini inhibe eder. Ekzotoksin A’ nın lokal doku hasarı ve bakteriyel invazyonda önemli rolü vardır (11, 13).
Bir başka hücre dışı enzim Ekzotoksin S’ dir. Bir adenozindifosfat ribozil transferazdır (11, 13, 16).
Tablo 2. P. aeruginosa ’nın virulans faktörleri ve biyolojik etkileri
Pseudomonas aeruginosa’ nın virülans faktörleri
Virülans faktörleri Biyolojik etkileri Yapısal faktörler
Kapsül : Mukoid polisakkaridin yapılması Adhezyon sağlanması
Antibiyotiklerin bakterisidal etkisinin azaltılması Nötrofil ve lenfosit aktivasyonunun önlenmesi
Nöraminidaz : Pilusların adezyonunun kolaylaştırılması Piluslar ve nonpilus Akciğer ve yara yerine adezyonun sağlanması adezinler :
Lipopolisakkarid : Endotoksik aktivite
Piyosiyanin : Siliyer fonksiyonun bozulması İnflamasyonun başlatılması
Toksik oksijen radikallerinin salınması ve doku hasarı Toksin ve enzimler
Ekzotoksin A : Protein sentezinin EF2 etkileyerek önlenmesi Doku hasarının oluşması
İmmünsüpresyonun sağlanması
Ekzotoksin S : Protein sentezinin önlenmesi, immünsüpresyon Sitotoksin : Lökosit fonksiyonlarının bozulması
Pulmoner mikrovasküler yapıların hasarlanması Elastaz, Alkalin proteaz : Elastin içeren dokuların harabiyeti
Fosfolipaz C : İnflamasyon başlatılması
Rhamnolipid : Lesitin içeren dokuların harabiyeti ve pulmoner siliyer aktivitenin inhibisyonu
Pseudomonas’ larda çok sayıda plazmid bulunmaktadır. Bunlar bir yandan metabolizma ile ilgili olaylarda, diğer yandan da çeşitli antibiyotiklere direnç kazanmalarında rol oynarlar (11).
Pseudomonas’ larla enterik bakterilerin gen haritaları arasında çeşitli farklar vardır. Bunlardan biri, bakteriyosin yapımını sağlayan genlerin, enterik bakterilerde plazmidlerde yer alırken, Pseudomonas’ larda kromozoma yerleşmiş olmasıdır. Pseudomonas’ ların çeşitli kökenleri tarafından oluşturulan bakteriyosinlere piyosin ve aeuginosin de denir. P. aeruginosa’ da 35-40 kadar stabil piyosiyanin tipi belirlenmiştir (11).
Pseudomonas aeruginosa’ nın nemli ortamları sevmesi, ısı ve çeşitli fiziksel ortamlara dayanıklı olması, üreyebilmek için oldukça az besine ihtiyaç duyması, antiseptiklerden birçoğuna ve antibiyotiklere dirençli olması, distile suda dahi üreyebilmesi bu mikroorganizmanın dış ortamlarda özellikle hastane ortamında yaşamasını kolaylaştırır. Pseudomonas aeruginosa hastane infeksiyonları etkenleri içinde ilk sıralarda yer almakta; çeşitli antibiyotiklere direnç gelişebilmekte ve oluşturduğu infeksiyonlara bağlı yüksek mortalite ve morbiditeye neden olmaktadır. P. aeruginosa’ nın çok çeşitli bulaşma kaynakları vardır. Kullanılan sabunlar, göz damlaları, diyaliz sıvıları, solunum cihazları, ilaçlar, uygun koşullarda bekletilmeyen ağzı açık dezenfektanlar, kullanılan temizlik bezleri ve fırçalar, havalandırma cihazları, lavabolar, duş başlıkları, hasta odalarındaki çiçekler önemli bulaşma kaynaklarıdır. Hastane infeksiyonlarının % 10-25’ inden P. aeruginosa sorumlu tutulmaktadır (3, 11, 4).
Pseudomonas aeruginosa sağlıklı kişilerin florasında bulunabilir ve nadiren hastalık oluşturur. İnsanların normal florasındaki P.aeruginosa oranları; deride % 0-2, burun mukozasında % 0-3,3, boğazda % 0-0,6, dışkıda % 2,6 - 24 arasındadır (11, 13). 1990-1996 yılları arasında Amerika Birleşik Devletleri’nde bulunan Ulusal Hastane Infeksiyonlarını Izleme Servisi (NNIS) verilerine göre P.aeruginosa pnömonilerde ikinci, üriner sistem infeksiyonlarında üçüncü, cerrahi alan
infeksiyonlarında dördüncü ve bakteriyemilerde yedinci sırada izole edilmiştir (22-25).
Pseudomonasların en sık neden olduğu infeksiyonlar: nötropenik hastalarda, mekanik ventilasyon desteğindeki hastalarda ve kistik fibrozlu hastaların akut alevlenmelerinde görülen pnömoniler, nötropenik hastalar ve HIV infeksiyonunu da içeren bağışıklığı kırılmış hastalardaki bakteriyemiler, yanık sonrası gelişen yanık yarası infeksiyonları, diyabetik hastalarda ve yüzücülerin kulağında gelişen malign otitis media, beyin cerrahisi, kafa travması, intraventriküler şant ve Beyin Omurilik Sıvısı (BOS) sızıntısı ile komplike menenjit ve beyin apseleri, penetran yaralanma ve intraoküler cerrahi, kontakt lensler ile endoftalmit ve keratit, hematojen yayılım ya da penetran travma veya cerrahi ile ilişkili septik artrit, osteomiyelit, primer veya metastatik odaklardan kaynaklanan deri ve yumuşak doku infeksiyonları, intravenöz ilaç kullananlarda doğal kapak endokarditi ve prostetik kapak endokarditi olarak sayılabilir (22-28).
Pseudomonas aeruginosa’ nın patogenezi çok faktörlü ve karmaşıktır.
Pseudomonas aeruginosa hem invaziv hem de toksijeniktir. İnfeksiyonları üç aşamada gerçekleşir.
1- Bakteriyel tutunma ve kolonizasyon 2- Lokal yerleşme
3- Sistemik yayılım ve sistemik hastalık
Her basamak için bir önceki gereklidir. Fakat hastalık herhangi bir basamakta durabilir (11).
Pseudomonas İnfeksiyonlarından Korunma Ve Kontrol Yolları
Pseudomonas’ larla oluşan infeksiyonların kontrolü ve önlenmesinde birtakım kurallar belirlenmiştir. Hastane ortamının temiz ve kuru olmasını
Ayrıca P. aeruginosa’ nın hücre duvarından hazırlanmış en az iki ticari aşı vardır. Bu aşıların kistik fibrozlu hastalarda, ağır yanıklı hastalarda ve çocuklarda Pseudomonas infeksiyonlarının neden olduğu ölüm oranlarını azalttığı görüşü vardır (11).
Sindirim sistemi selektif dekontaminasyonu yoğun bakım hastalarında önemlidir. Yoğun bakım hastalarında orofarenks ve sindirim sistemi çok önemli rezervuarlardır.Yoğun bakım birimleri dirençli bakterilerin en fazla bulunduğu hastane ortamlarından biridir. Dirençli kökenlerin ortaya çıkmasında uygulanan antibiyotik politikalarının rolü büyüktür. Tek bir antibiyotiğin sürekli ve yoğun olarak kullanımı dirençli bakterilerin ortaya çıkmasında önemli rol oynamakta, ayrıca bu dirençli bakteriler yoğun bakım birimlerinde epidemiler oluşturabilmektedir. Pseudomonas kökenleri ilk izolasyonda aminoglikozidlere (amikasin, gentamisin ve tobramisin) ve geniş spektrumlu penisilinlere (azlosilin, karbenisilin, mezlosilin, piperasilin ve tikarsilin) duyarlı olabilirler. Fakat bu penisilin türevleri uzun süre tek başına verildiğinde direnç gelişir. Bu yüzden yüksek doz aminoglikozid ve penisilinlerin birlikte verilmesi daha etkilidir. Ayrıca üçüncü kuşak sefalosporinler (sefoperazon, sefsulodin, seftazidim), dördüncü kuşak sefalosporinler (sefepim) ve klinik kullanıma yakın geçmişte giren karbapenem grubu antibiyotiklerden imipenem ve meropenem bilinen en geniş spektrumlu antibiyotiklerdir (11, 29).
Antistafilokokkal penisilinler, sulbaktam-ampisilin, ampisilin, amoksisilin, amoksilin-klavulanik asid, 1. ve 2. kuşak sefalosporinler, sefotaksim, seftriakson, trimetoprim sulfametaksazol, nalidiksik asid’e doğal olarak dirençlidir. Tetrasiklinler, makrolidler, rifampin, kloramfenikol, sefiksim, sefpodoksime ise kural olarak dirençlidir. Tikarsilin, piperasilin, seftazidim, sefepim, sefpirom, sefoperazon, karbapenemler ve aztreonam antipseudomonal beta laktamlardır (15).
Karbapenemler, etki spekturumu dikkate alındığında başta sefalosporinler olmak üzere çoğul antibiyotik direnci gösteren etkenler ile oluşan hastane infeksiyonları ve birden fazla etkenin neden olduğu komplike infeksiyonlar için ayrılması ve rutin kullanımından kaçınılması gereken antibiyotiklerdir (29, 30).
Antibiyotik kullanımı ile bakteriyel direnç gelişimi arasındaki ilişki uzun zamandan beri dikkat çekmektedir. Bu konuda yapılan çalışmalar yaygın kullanım ile direnç gelişimi arasında bir paralellik olduğunu göstermektedir (30).
ANTİBİYOTİKLERE DİRENÇ MEKANİZMALARI
Direnç, bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine karşı koyabilme yeteneğidir. Antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik kullanımı sonucu değil, bakterilerin olumsuz çevre koşullarında yaşamlarını sürdürmek için kullandığı savunma sürecinin bir parçası olduğu da belirtilmektedir. Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni ilaçlar geliştirilmekte iken, öte yandan bunlara süratle direnç kazanan mikroorganizmalarla oluşan infeksiyonlar bildirilmekte ve bu sorunun boyutları giderek büyümektedir (31).
Bakterilerin antimikrobik maddelere karşı gösterdiği direnç mekanizmaları üç grup altında toplanabilir :
1- İlacın hedefinde değişiklik oluşması
a ) Reseptörün afinitesinde azalma olması
b ) İlaçtan etkilenmeyen farklı bir metabolik yolun kullanılması 2- Sentezlenen enzimle ilacın inaktive edilmesi
3- Hücreye giren ilaç miktarının azalması a ) Permeabilitenin azalması
b ) Aktif pompalama ile ilacın dışarı atılması
Bir bakteri,bu mekanizmalardan bir veya birkaçını kullanarak, farklı etki mekanizmasına sahip antibiyotiklere karşı direnç kazanabilmektedir (32, 33).
Bir mikroorganizmanın yapısı nedeni ile antibiyotiklere dirençli olması intrensek (doğal) direnç olarak tanımlanır. Bu tür direncin ilaç kullanımı ile ilgisi yoktur. Doğal direnç, bu mikroorganizmaların tür özelliği olarak ilacın hedefi olan yapıyı taşımamalarının veya ilacın yapısal bir özellikten dolayı hedefine ulaşamamasının bir sonucudur. Örneğin; ilacın dış membrandan geçememesi nedeni ile gram negatif bakteriler vankomisine, enterokoklar sefalosporinlere ve aminoglikozidlere, anaerob bakteriler ise aminoglikozidlere doğal olarak dirençlidir (33, 34, 35, 31) .
Kazanılan direnç ise DNA’ daki mutasyonlarla veya yeni bir DNA’nın edinilmesiyle ortaya çıkmaktadır. Mutasyonlar genellikle kromozomal DNA’da oluşmaktadır; ancak plazmid veya transpozonlardaki genlerde de olabileceği bilinmektedir (33).
a) Kromozomal Direnç : Kromozomda spontan mutasyon oluşmasına bağlıdır. Hücrenin ilaca geçirgenliği azalır ya da ilacın hedefinde değişiklik olur. Bir bakteri hücresinde spontan mutasyon oluşma olasılığı her hücre bölünmesinde 10-5-10-10 civarındadır ve bu nedenle klinikte bu tip direnç çok nadirdir (33, 36).
b) Plazmidlere Bağlı Direnç : Plazmidler, kromozomlardan bağımsız olarak replike olan, kromozom dışı genetik elementlerdir. Klinikte görülen direnç daha çok plazmidlere bağlıdır. R- plazmidi adı verilen direnç plazmidleri, sayıları 10’ a varabilen farklı antibiyotiklere karşı direnç genleri taşımaktadır. Bulaşıcı tipteki bu direnç, daha çok antibiyotiği inaktive eden enzimlerle olmaktadır (33, 36). Özellikle hastane gibi yoğun antibiyotik kullanılan yerlerde direnç genlerini taşıyan bakterilerde artış görülmektedir.
c) Transpozonlara Bağlı Direnç : Transpozonlar, bir DNA molekülünden diğerine geçebilen DNA dizileridir. Plazmidlerden farkı bağımsız olarak replike olamamalarıdır. Kromozom veya plazmid içinde bulunmakta,
bunlar arasında yer değiştirebilmektedir. Son yıllarda bazı transpozon veya plazmidlerde " integron " adı verilen ve yeni genlerin kazanılmasını sağlayan genetik yapılar bulunduğu gösterilmiştir. Bir bakterinin çok kısa bir süre içinde bir çok antibiyotiğe birden " çoğul dirençli " duruma gelişinde bu elementlerin rolü olduğu anlaşılmıştır (33, 36).
d) Çapraz Direnç : Belli bir ilaca karşı dirençli olan bazı mikroorganizmaların, aynı veya benzer mekanizmalar ile etki eden diğer ilaçlara da dirençli olması halidir. Bu durum genellikle yapıları benzer ilaçlar arasında gözlenmektedir (eritromisin-oleandomisin, neomisin- kanamisin). Ancak bazen tümüyle ilgisiz ilaçlar arasında da görülebilir.
Eritromisin-linkomisin arasındaki çapraz direnç buna örnek olarak verilebilir. Kromozomal veya ekstrakromozomal orjinli olabilir (37).
BETA LAKTAM ANTİBİYOTİKLERE DİRENÇ MEKANİZMALARI
Beta laktam antibiyotiklerinin hedefi, hücre duvarı sentezinin transpeptidasyon evresini katalize eden ’’ penisilin bağlayıcı proteinler (PBP)‘’
dir. Beta laktam antibiyotikler bu enzimler ile bağlanarak enzimin kendi substratına bağlanmasını engellemekte böylece hücre duvarı sentezini inhibe etmekte ve bakteri lizise uğramaktadır.
Bakterilerde beta laktam antibiyotiklere karşı oluşan direnç üç yolla gelişmektedir (33).
a- Penisilin Bağlayıcı Proteinlerde ( PBP ) Oluşan Değişiklikler İle Gelişen Direnç:
Penisilin bağlayan proteinlerdeki değişiklikler, PBP’ nin beta laktam antibiyotiklere afinitesinin azalması, PBP sayısında azalma olması veya beta laktam antibiyotiklere düşük afinite gösteren yeni PBP lerin sentezlenmesi sonucunda oluşabilmektedir. Bunların tümü kromozomal mutasyonlar sonucunda ortaya çıkmaktadır (33).
b- Dış Membran Proteinlerinde ( Outer Membrane Protein ( OMP ) ) Oluşan Değişiklikler İle İlacın Hücre İçine Girişinin Engellenmesi:
Beta laktam molekülleri gram negatif bakterilere dış membran proteini adı verilen, porin proteinlerinden oluşan porlar yolu ile geçmektedir. Porinlerin özellikleri ve sayıları ile antibiyotiğin özellikleri (yük, çözünürlük, büyüklük) hücre içine giriş hızını belirlemektedir (38).
Dış Membran Porin Defektleri; Dış membran gram negatif bakteriler için oldukça önemlidir. P. aeruginosa dış membranındaki asıl porin proteini OprF dir. OprB, OprC, OprD, OprE yardımcı porin proteinleridir. Opr D porin kaybı karbapenem direncini gösterir. Bu durumda meropeneme duyarlılık azalırken, imipeneme direnç ortaya çıkabilir. P. aeruginosa tedavisinde ilk haftanın sonunda Opr D kaybı ile yaklaşık olarak % 50 oranında karbapenem direnci saptandığı gösterilmiştir (39, 40, 41).
Klinik örneklerden izole edilen kökenlerde nadir olmakla birlikte, özellikle imipeneme dirençli olan P. aeruginosa kökenlerinde karbapenem antibiyotiklerin kullandığı Opr D kanalının eksik olduğu saptanmıştır (33).
Plazmid kaynaklı fosforilasyon, asetilasyon, adenilasyon ile enzimatik hidroliz, permabilite azalması, ribozomal hedeflerdeki değişiklikler, kromozomal kaynaklı aphA gen mutasyonları aminoglikozid direncinin oluşmasına katkıda bulunur. Ayrıca aktif dışa pompalama sistemleri de bu dirence neden olurlar (42, 43)
Pseudomonas aeruginosa’ da DNA giraz (Topoizomeraz II) mutasyonları, özellikle de OmpF, OmpC defektleri ile oluşan dış membran geçirgenliğinin değişmesi ve aktif dışa pompalama sistemlerinin hepsi kinolon direncine neden olur (44-47).
Aktif Dışa Pompalama Sistemleri; Pseudomonaslarda beta laktamazlardan sonra en önemli direnç mekanizmaları aktif dışa pompalama sistemleridir. Günümüzde aktif dışa pompalama sistemleri en iyi
P.aeruginosa ’da araştırılmıştır. Aktif dışa pompalama sistemleri yapısal olup normalde düzenleyici genler ile kontrol altındadır. Bu genlerdeki mutasyonlar aktif dışa pompalama sistemlerinin aşırı çalışmasına ve antimikrobiyallerin de dışarı atılmasına neden olurlar (39, 38).
P. aeruginosa’da MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY- OprM aktif dışa pompalama sistemleri tanımlanmıştır. MexAB-OprM aktif dışa pompalama sistemi en iyi tanımlanmış olanıdır (40).
Aktif pompalama sistemi ile kazanılan direnç çoğul direnç genine sahip fenotipler oluşturur (Tablo 3). MexAB-OprM aktif pompalama sistemi imipenem hariç tüm betalaktamlara ve kinolonlara direnç oluşturması nedeniyle önemlidir. MexCD-OprJ aktif pompalama sistemi 4. kuşak sefalosporinlere direnç oluşturur. MexEF-OprN aktif pompalama sistemi karbapenemlerde de dirence neden olabilir (39, 40, 48-50)
Tablo 3. P. aeruginosa’ da bulunan aktif dışa pompalama sistemleri
Sistem Düzenleyici Mutasyon Direncin oluştuğu antibiyotikler
gen geni
MexAB-OprM mexR naIB ve naIC İmipenem dışında beta laktamlar, kloramfenikol, eritromisin,
kinolonlar, tetrasiklin, trimethoprim, sulfonamid, novobiosin MexCD-OprJ nfxB nfxB İmipenem dışında beta laktamlar, kloramfenikol, eritromisin, kinolonlar, tetrasiklin, trimethoprim, novobiosin.
MexEF-OprN mexT nfxC Kloramfenikol, kinolonlar, trimethoprim.
MexXY-OprM mexZ Karbenisilin, seftazidim ve imipenem hariç beta laktamlar, aminoglikozidler, kloramfenikol, eritromisin, kinolonlar,
tetrasiklin, novobiosin
d) Beta-Laktamaz Enzimleri İle İlacın İnaktive Edilmesi :Beta laktam antibiyotiklere karşı klinikte en sık gözlenen direnç, bakterilerin bu antibiyotikleri inaktive eden beta laktamaz enzimlerinin sentezlenmesi ile oluşmaktadır. Gram negatif bakterilerde beta-laktamazlar, dış membran ile stoplazmik membran arasındaki periplazmik boşlukta bulunmaktadır (35).
Gram negatif bakterilerde beta laktamaz enzimleri kromozom veya plazmid kontrolünde sentezlenmektedir (35).
BETA- LAKTAMAZLAR
Beta-laktamazlar, beta laktam grubu antibiyotiklerde beta-laktam halkasının amid bağlarını parçalayarak etki gösterirler. Kromozomal ya da plazmid kaynaklıdırlar (51-55).
Beta-laktamazların sınıflandırılması ilk defa 1973 yılında Richmand and Sykes tarafından yapılmış, 1976 yılında ise Sykes ve Matthew tarafından genişletilmiştir. Beta-laktamazlar ilk olarak penisilinleri hidrolize etmeleriyle tanımlanmıştır. Bundan sonra her yeni beta laktam grubu antibiyotik kullanılmasıyla bu tabloya yeni beta- laktamazlar eklenmiştir (51, 54). Oksimino sefalosporinlerin 1980’ lerin başında kullanılmasıyla GSBL 1980’lerin sonlarına doğru beta laktam/beta laktam inhibitörlerinin yaygın kullanımıyla inhibitör rezistan TEM enzimleri, 1990’larda sefamisinlerin kullanımıyla plazmid kaynaklı Amp-C type enzimler, daha sonra da karbapenemlerin yaygın kullanımıyla karbapenemazlar ortaya çıkmıştır. Beta- laktamazların sınıflaması Tablo 4’ de gösterilmiştir (52, 54). Son yıllarda genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar, inhibitör-rezistan beta-laktamazlar, AmpC-tipi enzimler ve metallo-beta-laktamaz ve non metallo-beta-laktamaz tip karbapenemazlarda oldukça fazla sayıda artış gözlenmiştir (52-55).
Tablo 4. Beta laktamazların sınıflandırılması
Beta laktamaz sınıflandırması
Bush-Jacoby-Medeiros Ambler
Fonksiyonel grup Moleküler sınıflama Grup 1 sefalosporinazlar Sınıf C sefalosporinazlar Grup 2 penisilinazlar Sınıf A penisilinazlar 2a Stafilokokal penisilinazlar
2b TEM-1 ve SHV-1 Betalaktamazlar 2be-ESBL’ler
2br-inhibitör dirençli Beta- laktamazlar 2c-karbenisilinazlar
2e-sefalosporinazlar 2f-karbapenemazlar
Grup 2d Sınıf D kloksasilin hidrolize eden enzimler (OXA)
Grup 3 (3a, 3b, 3c) Sınıf B metallo-beta-laktamazlar Grup 4 Sınıflanmamış
Bush ve arkadaşları substrat özgüllüğü ve beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlılığının temel alındığı fenotipik sınıflandırma ile tüm enzimleri sınıflandırmış ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarında antibiyogram ile ilişki kurulabilmesi gibi avantajlar sağlamıştır. Dezavantajı ise tek bir nokta mutasyonu ile substrat özgüllüğünün değişebilmesidir. Bu enzimlerin moleküler sınıflandırılması ise 1980 yılında Ambler tarafından yapılmıştır.
Moleküler sınıf A, C ve D’nin aktif bölgelerinde serin bulunurken, sınıf B’ de ise çinko bulunur. Beta-laktamazların nükleotid dizilenmesini esas alan bu sınıflama mutasyonlardan etkilenmemektedir (54-57).
Kromozomal Kaynaklı Beta-Laktamazlar
Hemen hemen tüm Gram negatif bakterilerde kromozomal kaynaklı beta-laktamazlar bulunmaktadır. Bunlar arasında en önemli olan enzimler sefalosporinaz aktivitesi gösteren ve Bush sınıflandırmasında Grup 1’de yer alan enzimlerdir. Bu enzimlerin önemli özelliği indüklenebilir olmalarıdır (52-57).
Moleküler sınıf C AmpC Tip Indüklenebilen Beta-Laktamazlar (IBL)
AmpC tipi beta laktamaz enzimleri moleküler sınıf C ve fonksiyonel grup 1 olup, genellikle oksiminosefalosporinlere (seftriakson, sefotaksim), sefamisin grubu sefalosporinlere dirençlidir (52, 54, 56). Klavulanik asit, sulbaktam ve tazobaktam gibi beta-laktamaz inhibitörleri ile inhibe olmazlar.
Birçok Gram negatif bakteride bulunmakla beraber AmpC tipi enzim içeren başlıca bakteriler; Enterobacter spp,C. freundii, Serratia spp, P. stuartii, P.rettgeri, Pseudomonas spp. ve Hafnia alvei’dir (52, 54, 55).
IBL sentezleyen bakterilerde 105-107 sıklığında devamlı yüksek düzeyde enzim sentezleyen dereprese denilen mutantlar oluşmaktadır. Dereprese mutantlar IBL sentezleyen bakteri topluluklarında zayıf indükleyiciler ile tedavi sırasında ortaya çıkabilen labil beta-laktamazlardır. Ikinci kuşak, üçüncü kuşak sefalosporinler, aztreonam, üreidopenisilinler ve karboksipenisilinler zayıf indükleyicidirler.
Deprese mutantların seleksiyonunda infeksiyonun yeri, bakteri yoğunluğu, antibiyotiğin dağılımı ve kullanılan antibiyotikler önemlidir. Karbapenemler hem indükleyici hem de dereprese mutantlara etkili olduğu için seleksiyona yol açmaz. Dereprese mutantların seçilme riski nedeniyle, genişletilmiş spektrumlu sefalosporinlerin IBL sentezlediği bilinen bakteriler ile gelişen üriner sistem infeksiyonları dışındaki infeksiyonlarda kullanılması sakıncalıdır (58-61).
IBL’ lerin yapısal genlerine ampC adı verilmektedir ve bunlar ampR denilen aktivatör represör genler (LysR tip transkripsiyonel genler) tarafından kontrol altında tutulur. Bu bölge ampD genlerinin baskılayıcı etkisi altındadır. IBL’ ler için gerekli olan gen ürünleri ve proteinler Tablo 5’de gösterilmektedir (52, 54, 55).
Tablo 5. Gram Negatif Bakterilerde Beta-Laktamaz İndüksiyonu Için Gereken Proteinler
IBL’ lerde gerekli olan proteinler ve fonksiyonları Protein Rolü
Amp R Transkripsiyonun düzenlenmesi AmpG Indüksiyon sinyalinin geçirilmesi
AmpD Beta-laktamazların kontrol altında tutulması AmpE Represyonun artışı
PBP2 Beta-laktamlarla etkileşime giren proteinler
Moleküler Sınıf A’ da Bulunan Kromozomal Beta Laktamazlar
Gram negatif bakterilere özgü olan kromozomal enzimlerin çoğu moleküler sınıf C’ dedir. Moleküler Sınıf A’ da da kromozomal enzimler bulunmaktadır. Farklı substratlar üzerine olan etkilerine göre bu enzimler Bush sınıflandırmasında 2b, 2be ve 2e’ de yer alır (52, 54, 62).
Moleküler Sınıf B’ de Bulunan Kromozomal Beta Laktamazlar
Bu sınıfta yer alan enzimlere metallo-beta-laktamazlar’ da denilmektedir. Bunlar Bush sınıflamasına göre grup 3’ de yer alırlar.
Karbapenemazlar bölümünde bu enzimler anlatılacaktır (52, 54, 62).
Plazmid Kontrolündeki Beta-laktamazlar
Plazmidlerce kodlanan beta-laktamazlar dört moleküler sınıfta da yer
TEM-2 ve SHV-1 enzimleridir. Bu enzimler moleküler sınıf A fonksiyonel grup 2b’de yer alırlar ve geniş spektrumlu enzimler olarak adlandırılırlar. Klavulanik asit ile inhibe olan bu grup ampisilin, karbenisilin, tikarsilin, sefalotin, sefamandole direnç oluştururken yeni sefalosporinlere, monobaktamlara ve sefamisinlere etkisizdirler (62).
1980’ li yıllarda beta laktamazlara dayanıklı genişletilmiş spektrumlu sefalosporinlerin geliştirilmesinden kısa bir süre sonra K.pneumoniae suşlarında plazmid kontrolunda olan çeşitli beta laktamazlar tanımlanmıştır Bu enzimlerin nokta mutasyonları sonucu 1, 2 aminoasit değişikliği ile TEM veya SHV enzimlerinden köken alan bu enzimlere genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar (GSBL) denilmektedir (52, 54, 58–
60, 62).
Genişlemiş Spektrumlu Beta Laktamazlar
Kullanımdaki beta-laktam antibiyotiklerin çoğunu hidrolize etmelerinden dolayı GSBL’ ler tedavide önemli bir sorundur.
GSBL’ler sefuroksim, sefotaksim, seftriakson, seftizoksim, seftazidim, sefpirom ve sefepim gibi oksimino-sefalosporinleri benzilpenisilinle eşit yada % 10 daha fazla hidrolize edebilen, aktif bölgelerinde serin içeren ve beta-laktamaz inhibitörleri ile inhibe olabilen beta-laktamaz enzimleridir (52, 54, 60– 63).
TEM ve SVH enzimleri içeren GSBL’ ler moleküler sınıf A, fonksiyonel grup 2be’ de yer alırlar. Bu enzimler penisilinleri ve tüm sefalosporinleri, aztreonamı hidrolize ederler, beta laktam inhibitörlerine duyarlıdırlar. Günümüzde sayısı 130’ u aşmış TEM türü, 50’ yi aşmış SHV türü beta- laktamaz saptanmıştır. Daha çok Pseudomonaslarda bulunan OXA türü GSBL’ler moleküler sınıf D fonksiyonel grup d’ de yer alır (52, 54).
OXA Grubu:
OXA grubu enzimler, Ambler grup D’de fonksiyonel grup 2d’ de yer alan ve daha çok P. aeruginosa ‘ da bulunan GSBL’ lerdir.
Bu enzimlerden OXA-1’ den OXA -10’ a kadar olanları dar spektrumlu enzimlerdir. Oksasilin ve kloksasilini substrat olarak tercih ederler. Geniş spektrumlu OXA enzimlerinden ilki OXA-11 enzimidir ve Hacettepe Üniversitesi Hastanesi’nde yatan bir hastadan izole edilen bir pseudomonas suşunda bulunmuştur. Bu grupta 30’dan fazla OXA enzimi tespit edilmiştir. OXA-11, 14, 15, 16 seftazidim direncine yol açarken, OXA-17 sefotaksime direnç oluşturmaktadır. OXA-31 sefepime dirençli olması seftazidime duyarlı olması ile dikkatleri üzerine çekmiştir. Son olarak OXA-20, OXA-23, OXA-24, OXA-45 gibi yeni tanımlanan bazı enzimler karbapenamaz aktivitesi gösterir iken GSBL değildirler (60-64).
Tem Grubu GSBL
TEM-4, TEM-21, TEM-24 ve TEM-42 Pseudomonas aeruginosa’ da bulunan GSBL’lerdir.
İnhibitöre Dirençli Beta Laktamazlar
İnhibitör rezistan TEM beta-laktamazlar (İRT) olarak adlandırılan bu enzimler ilk olarak amoksasilin-klavulanik aside dirençli E. coli’ de bildirilmiştir. En çok E. coli, K. Pneumoniae, K. Oxytca, P. mirabilis, C.freundi’de bildirilmiştir. İlginç olarak piperasilin–tazobaktam kombinasyonuna karşı duyarlı olarak bulunabilirler (54-57).
SHV Grubu
SHV grubu enzimler ilk olarak K. pneumoniae’ da kromozomal olarak saptanmıştır. Daha sonra C. diversus, E. coli ve P. aeruginosae’ da bildirilmiştir (54, 57).
CTX-M Grubu
Substrat olarak sefotaksimi tercih eden plazmid aracılıklı GSBL’ lerdir.
CTX-M grubu GSBL’ lerde tazobaktamın inhibitör özelliği diğer beta laktamaz inhibitörlerine göre daha fazladır (54, 57).
Plazmid kaynaklı AmpC beta laktamazlar
Plazmid kaynaklı AmpC üretiminden ampR regulatör geninin kaybı nedeniyle yüksek seviyelerde enzim üretimi sorumlu tutulmuştur. Bu enzimler çoğunlukla K. pneumoniae, K oxytoca, Salmonella spp, P. mirabilis ve E. coli’ de bildirilmiştir (65).
AmpC beta-laktamazlar penisilinler, sefalosporinler ve monobaktamları inhibe eder, bunun yanında dış membran porin kaybı ile karbapenem direncine de yol açar. GSBL’lerden farklı olarak sefamisinleri de inhibe etmekte ancak ticari olarak var olan beta-laktamaz inhibitörlerinden etkilenmemektedir. Plazmid kaynaklı AmpC beta- laktamazlar penisilinler, sefalosporinler ve monobaktam direnciyle kalmaz (65).
KARBAPENEMAZLAR
Karbapenemleri hidrolize eden beta-laktamazlar karbapenem kullanımına paralel olarak son yıllarda artan oranlarda bildirilmektedir (58, 66). Karbapenemazlar Ambler sınıflamasında üç grupda yer alırlar.
Moleküler sınıf A’ daki karbapenemazların aktif bölgesinde serin iyonu vardır ve klavulanik asit ile inhibe olur. Moleküler sınıf B’ de enzimin aktif bölgesi çinko iyonu içerir ve Metallo-Beta-Laktamaz (MBL) olarak sınıflandırılan bu grup klasik beta-laktam inhibitörlerine dirençlidir. Metal şelatörlere ya da thiol kompenentlerine duyarlıdırlar. Moleküler sınıf D karbapenemazlar enzimin aktif bölgesinde serin içerirler, beta-laktamazlar inhibitörlerine zayıf duyarlıdırlar (66). Karbapenemazlar kromozomal kaynaklı ya da kazanılmış olabilirler
(66– 69).
Doğal olarak bulunan Karbapenemazlar
Yapısal olarak bulunan karbapenemazlar 1980 yıllarının başlarında nonfermantatif bakteriler ve Aeromonas türlerinde saptanmıştır. Bu grup karbapenemazlar aktif bölgelerinde çinko içermeleri nedeniyle moleküler sınıf B’ de yer alırlar, klinik önemleri henüz açık değildir (66-69).
Kazanılmış Karbapenemazlar
Bu enzimler sadece karbapenem direncinden değil, aynı zamanda beta laktam antimikrobiyallerin direncinden de sorumludur.
Moleküler sınıf B kazanılmış karbapenemazlar Acinetobacter spp, P.aeruginosa ve Enterobacter spp’de, moleküler sınıf D’ de Acinetobacter spp, sınıf A ise Enterobacterler’de saptanmıştır (66-69).
Kazanılmış Sınıf D Karbapenemazlar
Moleküler sınıf D’ de yer alan OXA tipi enzimler oksasilinaz aktivitesi gösterirler. Acinetobacter izolatlarında OXA- 23, 24, 25, 26, 27 tipi, P.aeruginosa’da OXA- 2, 10, 18,24 tipi saptanmıştır. Bunlar karbapenemaz aktivitesi gösterirler (66-69).
Kazanılmış Sınıf A Karbapenemazlar
Fonksiyonel grup 2f (Non metallo beta-laktamazlar):
Moleküler sınıf A’da yer alan karbapenemazlardan SME-1 ve SME-2 S. marcescens’den, NMC-A ve IMI-1 E. cloacae’dan, KPC-1 ve GES-1 K. pneumoniae’ dan izole edilmiştir . Karbapenem direncinin yanında penisilin ve aztreonam direnci de mevcuttur. En fazla tazobaktam olmak üzere diğer beta-laktam inhibitörlerine duyarlıdırlar.
Meropenemden ziyade imipenem direnci daha belirgindir. Bu direnci
ve TEM-1 tip beta laktamazları birlikte sentezleyebilmelerinden dolayı geniş spektrumlu bir beta laktam antibiyotik direnci oluşturabilirler (66-69).
Kazanılmış Ambler Sınıf B Karbapenemazlar
Ambler sınıf B veya Bush grup 3’ de yer alan karbapenemazlar MBL olarak bilinirler, klinik açıdan en önemli karbapenemazlardır. Aztreonam dışındaki tüm beta-laktamları hidrolize eden IMP ve VIM serisi metallo enzimleri içerirler. Aminoasid dizilim homolojisini araştırılarak yapılan çalışmalarda 4 tip MBL saptanmıştır. Bunlar IMP, VIM, SPM ve GIM tipi MBL’ dir. MBL’ler fonksiyonel olarak 3a, 3b ve 3c alt gruplarına ayrılır. Grup 3a’ da imipenem ve penisilinler güçlü, sefalosporinler zayıf hidrolize olur. 3b enzimleri gerçek karbapenemazlardır. Çünkü karbapenem hidrolizi spesifiktir. 3c enzimleri ise L. gormanii’ de bulunur (66-73).
IMP tipi beta-laktamaz:
IMP-1 beta-laktamaz ilk olarak Watanable ve ark. tarafından Japonya’ da P. aeruginosa ‘dan sonra da S. marcescens’den izole edilmiştir . Bu enzimin bla IMP-1 geninin horizontal geçiş kapasitesi oldukça yüksektir. Bu sebeple bla IMP-1 başta P. aeruginosa, S.marcescens, K.pneumoniae arasında daha sonra Acinetobacter spp ve Enterobacteriaceae ailesinde hızla yayılmaktadır (Tablo 6).
Japonya’dan sonra Asya ve Avrupa’dan da IMP tipi karbapenemazlar bildirilmiştir (71-73) Çok geçmeden IMP-2, IMP-3 ve takiben P.aeruginosa, A. baumannii, K. pneumoniae izolatlarında IMP-13’ e kadar saptanmıştır (74-75).
IMP tipi enzimler monobaktam hariç tüm beta laktam antimikrobiyallere dirençten sorumludur. IMP-1’de imipenem direnci daha fazla olup,IMP-2 ve IMP-3 deki direnç tüm beta-laktam antimikrobiyaller için aynıdır.IMP-tip metallo-beta-laktamaz üreten bakteriler dünya için önemli bir tehlike olarak görülmektedir. IMP üreten bla IMP-1 geni pozitif P. aeruginosa suşlarıyla yapılan bir çalışmada hastanede uzun süre kalma, steroid
kullanımı, antineoplastik tedavi verilmesi, üriner kateterin varlığı bla IMP1 pozitifliği ile birliktelik göstermiştir ve infeksiyona bağlı ölüm oranı bla IMP-1 taşıyanlarda anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur (76).
Tablo 6. IMP tipi beta-laktamazlar
IMP tipi beta-laktamazlar
Beta-laktamazlar Bulunduğu bakteri Bildirilen ülke IMP-1 Serratia marcessens Japonya
Acinetobacter baumanii Japonya Pseudomonas aeruginosa Japonya
Pseudomonas putida Japonya Klebsiella pneumoniae Japonya
IMP-2 Acinetobacter baumanii Italya
IMP-3 Shigella flexneri Japonya IMP-4 Acinetobacter baumanii Hong-Kong IMP-5 Acinetobacter baumanii Portekiz
IMP-6 Serratia marcessens Japonya IMP-7 Pseudomonas aeruginosa Kanada Malezya IMP-8 Klebsiella pneumoniae Tayvan IMP-9 Pseudomonas aeruginosa Çin IMP-10 Pseudomonas aeruginosa Japonya
Alcaligenes xylosoxidans Japonya VIM tipi beta-laktamazlar:
Ilk VIM tipi beta laktamaz 1997 yılında Italya’nın Verona şehrinde P. aeruginosa suşunda rapor edildi. VIM-2 Fransa’dan ve Yunanistan’dan VIM-3 Tayvan’dan P. aeruginosa suşlarında izole edildi (77). M tipi MBL üreten suşlar ise daha çok Avrupa ülkelerinden izole edilmekle birlikte, diğer VIM tipi MBL' ler dünyanın çeşitli bölgelerinden bildirilmiştir. VIM tipi
Tablo 7. VIM tipi beta-laktamazlar
VIM tipi beta-laktamazlar
VIM-1 P. aeruginosa Italya
A. baumanii Italya
VIM-2 S. marcessens Fransa
A. baumanii Kore
P. aeruginosa Kore
P. aeruginosa Yunanistan
P. putida Kore
E. cloace Kore
VIM-3 P. aeruginosa Tayvan
VIM-4 P. aeruginosa Polonya
VIM-5 P. aeruginosa Türkiye, Portekiz
VIM-6 P. putida Singapur
VIM-7 P. aeruginosa Amerika Birleşik
Devletleri
METALLO – BETA - LAKTAMAZLARIN ARAŞTIRILMASI
Metallo beta-laktamazlar mobil integronların yardımıyla sayılarını artırmakta ve gram negatif bakteriler arasında yayılmaktadır.
MBL üreten suşlar monobaktam hariç tüm beta laktamlara dirençlidirler. MBL üreten etkenle infekte hastaların optimal tedavisi için bu direncin tanınması ve yayılmasının kontrol edilebilmesi gerekmektedir. Ancak halen CLSI’ ın önerdiği bir tarama testi bulunmamaktadır (82, 83).
Modifiye Hodge testine ek olarak MBL aktivitesinin etilen diaminotetra asetik asit (EDTA) yada merkaptopropionik asit (MPA) gibi metal şelatör ajanlarla bloke edilmesi esasına dayanan bir çok MBL tarama çalışmaları yapılmıştır. Modifiye Hodge testi ve imipenem-EDTA çift disk difüzyon testi MBL saptanmasında kullanılan basit tarama testleridir, bunun yanında başarılı sonuçları PCR (polimerize zincir reksiyonu) ile doğrulanmış olan diğer tarama yöntemlerinden de bahsedilecektir (82-88).
1- Modifiye Hodge test:
Hodge ve arkadaşları N. gonorhoeae’de penisilinaz aktivitesinin gösterilmesi için Hodge testini kullanmışlardır. Lee ve arkadaşları ise MBL enziminini saptamak için Modifiye Hodge testini geliştirmişlerdir. Bu test için imipenem hassas E. coli ATCC 25922 kökeni, imipenem diski ( 10 μg ) ve test edilecek bakteri kökeni gerekmektedir. MHA yüzeyine 0.5 McFarland’ı ayarlanmış, bir gece inkübasyona bırakılmış standart E.coli kökeni kültür süspansiyonunun ekimi yapılır, plak kuruyunca ortasına 10 μg imipenem diski yerleştirilir. Imipenem diskinin tam kenarından başlanıp dışa doğru doğrusal olarak imipenem dirençli suşun ekimi yapılır. Bir gecelik inkübasyon sonrasında inhibisyon zonunda yonca yaprağı şeklinde bozulmanın olması MBL pozitiflği olarak kabul edilir.
Lee ve ark. MBL saptamak için yaptıkları çalışmalarda çinko sülfat (140 μg /disk) imipenem diskine eklenerek ya da Müeller-Hinton agara çinko sülfat eklenerek testin duyarlılığının artırılabileceğini belirtmişlerdir(82- 83).
2- Çift disk sinerji testleri (ÇDST):
MBL saptanması çalışmalarında imipenem ve seftazidim disklerinin EDTA, MPA, merkapto asetik asit ( SMA ) emdirilmiş disklerle yapılan çift disk sinerji testleri kullanılmıştır. Bunlar;
• IMP-EDTA çift disk sinerji testi
• IMP-MPA çift disk sinerji testi
• CAZ-MPA çift disk sinerji testi
• CAZ-SMA çift disk sinerji testi
• IMP-EDTA-SMA çift disk sinerji testi
Imipenem - EDTA ÇDST: Lee ve ark. IMP dirençli kökenlerde MBL saptanması için IMP-EDTA ÇDST’ ni uygulamışlardır. Bu test için test edilecek IMP dirençli P. aeruginosa suşunun bir gecelik inkübasyon sonrası elde edilen kültür süspansiyonu Müeller-Hinton agar plağının üzerine 0.5 McFarland bulanıklığında olacak şekilde ekilir. Plak yüzeyi kuruduktan sonra 10 μg IMP diski yerleştirilir. IMP diskinin 15 -20 mm ötesine 0.5 molarlık EDTA solüsyonunun 10 μl’ si emdirilmiş disk yerleştirilir. Bir gecelik inkübasyondan sonra inhibisyon zonundaki düzensizleşmelerin olması MBL pozitifliği olarak değerlendirilir (82,83).
CAZ-MPA, CAZ-SMA , IMP-EDTA-SMA Çift Disk Sinerji Testi : Arakawa ve ark. tarafından geliştirilen bu tarama testinde CLSI laboratuar standartlarına göre test edilecek bakteri MHA besiyerine ekilir. Iki tane CAZ diski (30 μg) 4-5 cm aralıklarla yerleştirilir. 2-MPA emdirilmiş disk seftazidim disklerinden birisinin 1-2,5 cm yakınına yerleştirilir. 37ºC’ de bir gecelik
inkübasyondan sonra CAZ diskinin inhibisyon zonunda bir genişleme olması IMP-1 üretimi açısından pozitiflik olarak değerlendirilir. Metallo-beta- laktamaz inhibitörü olarak CuCl2 (5 μl), FeCl2 (5 μl), EDTA (5 μl), 2-MPA (2- 3 μl) ve merkaptoasetik asit (2-3 μl), merkaptoetanol (2-3 μl) kullanılarak da doğru sonuçlar elde edilebilir. En iyi sonuç 2-merkapto propionik ile elde edilmiştir. Ağır metallerle yapılan testlerde de inhibitör zonlarında genişleme olmuştur, ancak PCR ile yapılan testler MBL varlığını doğrulamamıştır (84).
Jing Jou Yan ve ark. MBL tarama çalışmasında seftazidim, seftazidim klavulanik asit, sefepim diskleri ve MBL inhibitörü olarak EDTA, MPA, SMA gibi şelatörler kullanmışlardır. Bu yöntemle AmpC tip enzimlerin aşırı salınımını ya da SHV-12 salınımının yanlış pozitifliğe neden olması ortadan kaldırılmış ve test daha özgül hale getirilmiştir. Bu yöntemle imipenem hassas suşlarda da MBL taranabilmiştir. Bu çalışmalar karbapenemaz direncini yansıtan MBL sadece imipenem dirençli suşlarda değil, aynı zamanda imipenem hassas suşlarda da bulunduğunu ortaya koymuştur (85).
Lee ve ark. (82,83) P. aeruginosa’ da MBL taraması için imipenem direnci olan kökenlerle çalışmanın, seftazidim dirençli kökenler ile çalışmaktan daha iyi sonuçlar verdiğini göstermişlerdir. Her üç MBL inhibitörü kullanılarak P. aeruginosa ve Acinetobacter spp, için MBL taramaları P. aeruginosa ve Acinetobacter spp. İçin MBL taramaları yapılmış, sonuçlar eşdeğer olarak saptanmıştır (86, 87).
3- Kombine Disk Diffüzyon Testi:
Yong ve ark. (85) MBL araştırmasında kullanmışlardır. Test edilecek bakteri CLSI önerdiği şekilde MHA inokule edilir ve iki imipenem ( 10 μg ) diski yerleştirilir. Disklerden birisinin üzerine 0.5 M EDTA’ nın pH= 8’de hazırlanmış solusyonundan 4 μl eklenir ve bir gecelik inkübasyondan sonra IMP diski ile IMP–EDTA’lı diskin zon çaplarında 7 mm veya daha fazla fark olması MBL pozitifliği olarak yorumlanır. Kombine disk difüzyon testinde IMP-
nedeniyle IMP-EDTA diskleri tercih edilmiştir. IMP-EDTA diskleri kuru şekilde + 4 yada -20 derecede etkinliğinde azalma olmadan 12-16 hafta saklanabilir (85, 88, 89).
4- E- test yöntemi:
IMP ya da CAZ’ e , EDTA ya da 2-MPA eklenerek E- test stripleri geliştirilmiştir. Walsh ve ark.’ nın ( 81 ) çalışmasında MHA’a CLSI önerdiği şekilde test edilecek bakteri ekimi yapılır. Plaklar kuruduktan sonra E- test stripleri yerleştirilir. 35ºC’de inkübe edilir ve 16-18 saat sonra IMP/ IMP- EDTA MIK oranlarının 8 kat azalması ya da fantom zonunun görülmesi MBL pozitifliği olarak değerlendirilir. Bu yöntem % 94 duyarlı ve % 95 özgün bulunmuştur. Arakawa ve ark. (84) MPA kullanarak yaptıkları çalışmada da oldukça sensitif sonuçlar bulmuşlardır. E- test yöntemiyle aerobik yada anaerobik bakterilerde hem kromozomal hem de plazmid kaynaklı MBL saptanabilir (85, 88).
5-Mikrodilüsyon test:
Migliavacca ve ark. (86) tarafından geliştirilmiş olan mikrodilüsyon MBL tarama testi basit, duyarlı ve yüksek özgüllüğe sahiptir. Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında çalışılmaya da uygundur. Imipenem MIK değeri mikrodilüsyon yöntemi ile ölçülür, sonra metal şelatörlerden EDTA ve fenantirolin eklenerek tekrar MIK değerine bakılır, 8 kat azalma pozitif olarak değerlendirilir .
6- Moleküler yöntemler:
Moleküler yöntemlerden başlıca kullanılanlar şu şekilde sıralanabilir; blot hibridizasyon yöntemi, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), nükleotid sekans amflikasyon yöntemi, izoelektrik fokuslama yöntemi ve poliakrilamid jel elektroforezi (82).
MBL üreten bakterilerin neden olduğu infeksiyonların kontrolü ve direncin yayılmasının izlenmesi için basit ve hızlı tarama testleri gerekmektedir. MBL taramasında izlenecek basit algoritma Şekil -1’de verilmiştir.
IMP Dirençli Izolat
Modifiye Hodge testi
Çift Disk Sinerji Testi yap
Pozitif Negatif IMP ve VIM tip MBL üretilmiyor
Şekil 1 : IMP dirençli suşlarda MBL algoritması Pozitif
Negatif
PCR ile IMP ve VIM tip MBL geni çalışılacak
MATERYAL VE METOD
Haziran 2006 – Ocak 2008 tarihleri arasında Haydarpaşa Numune Hastanesi’ nde çeşitli kliniklerden izole edilen ve CDC kriterlerine göre nozokomiyal infeksiyon etkeni olduğu düşünülen 100 Pseudomonas aeruginosa kökeni çalışmaya alınmıştır.
Nonfermantatif, oksidaz pozitif, hareketli, Brain-Heart infüzyon broth’ da 42º C’ de ve 37º C’ de üreyen, + 4º C’de üremeyen, karakteristik kokusu olan ve mavi-yeşil pigment yapan suşlar Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilmiştir. Bu suşlar -20º C’de saklama besiyerinde saklandı.
Buyyonda mikrodilüsyon : İmipenem ve seftazidimin Pseudomonas aeruginosa’ ya duyarlılığı standart olarak buyyonda mikrodilüsyon yöntemiyle belirlendi. İn vitro antimikrobiyal testlerinin tümünün uygulaması ve sonuçlarının yorumlanması " Clinical and Laboratory Standars Institue (CLSI) " M7-A2’ ye uygun olarak gerçekleştirildi (90). İmipenem (Merck Sharp & Dohne) ve seftazidim (Glaxo Welcome A. Ş.) üretici firmalarından potensi bilinen toz olarak temin edildi. İmipenem için solvent ve dilüent olarak fosfat buffer solusyonu (0.01 mol/ L, pH: 7.2), seftazidim için solvent olarak sodyum karbonat, dilüent olarak distile su kullanıldı. Antibiyotiklerden potenslerine göre 256 µg/ml’den başlayan ve 0.5 µg/ml’ ye kadar devam eden çözeltiler hazırlandı. Logoritmik faza getirilen bakteri süspansiyonlarının bulanıklığı spektrofotometrede 546 dalga boyunda (100-110 arası değerleri) 0.5 McFarland’ a uyan değerlere göre ayarlandı. Test final bakteri konsantrasyonu 5x105 CFU/ml olarak gerçekleştirildi. İmipenem için ≥ 16 µg/ml dirençli, 8 µg/ml orta duyarlı, ≤ 4 µg/ml duyarlı olarak kabul edildi. Seftazidim için ≥ 32 µg/ml dirençli, 16 µg/ml orta duyarlı, ≤ 8 µg/ml duyarlı kabul edildi.
Broth mikrodilüsyon yönteminde kontrol kökeni olarak P.aeruginosa ATCC 27853 kullanıldı. Bu köken için kabul edilebilir minimum inhibitör konsantrasyon
IMP-EDTA Kombine disk difüzyon testi : Öncelikle EDTA stok solüsyonu hazırlandı. Bunun için, 1000 mL distile suda 186.1 g disodyum EDTA.2H2O (Sigma chemicals) çözdürülerek 0.5 M EDTA solusyonu elde edildi ve NaOH ile pH 8.0’e ayarlandı. Otoklavlanarak sterilize edildi. Test suşları CLSI’ nin önerdiği disk difüzyon yönteminde olduğu gibi Müller-Hinton agar plağının yüzeyine ekildi. Plağa ikişer adet IMP (Oxoid) (10 µg) diskleri yerleştirildi.
Disklerinin birinin üzerine 4 µl (750 µg) 0.5 M EDTA solüsyonu eklenerek kombine diskler (10 µg/750 µl) oluşturulmuş oldu. Besiyerleri 37 ºC’de bir 16-18 saat inkübe edildi. İmipenem ve EDTA içeren diskin inhibisyon zon çapında 7mm ve üzerinde genişleme olması pozitif olarak değerlendirildi.
İmipenem-EDTA çift disk sinerji testi : Test suşları CLSI’ nin önerdiği disk difüzyon yönteminde olduğu gibi Müller-Hinton agar plağının yüzeyine ekildi. Besiyerinin kurumasını takiben imipenem diski (10 µg) besiyeri yüzeyine yerleştirildi. İmipenem diskinin bir ucundan 10 mm uzağa boş bir kağıt disk yerleştirildi. Boş kağıt diskin üzerine 10 µl EDTA (0.5M, pH 8) eklendi. Plaklar 35ºC’da 18 saat inkübe edildi. İmipeneme karşı oluşan inhibisyon zon çapının EDTA’ya doğru genişlemesi metallo-beta-laktamaz varlığı açısından pozitif sonuç olarak değerlendirildi.
BULGULAR
Hastane infeksiyonları etkeni olarak izole edilen 100 Pseudomonas aeruginosa kökeninin klinik örneklere göre dağılımı; % 54 trakeal aspirat, %19 yara, %11 idrar, % 4 abse, % 3 kan, % 3 balgam, % 2 safra, % 2 BOS, %1 katater, % 1 periton olup kliniklere göre dağılımı ise % 53 reanimasyon, % 10 beyin cerrahisi, % 8 ortopedi, % 7 genel cerrahi, % 5 nöroloji, % 4 dahiliye, % 1 KBB ve % 14 diğer klinikler idi.
P. aeruginosa kökenlerinin izole edildiği klinik örneklere ve kliniklere göre dağılımı Tablo 8’ de gösterildi.
Tablo 8. P. aeruginosa kökenlerinin izole edildiği klinik örneklere ve kliniklere göre dağılımı
TRAKEAL ASPİRAT
İDRAR YARA BOS BALGAM APSE SAFRA MAYİİ
DAMAT İÇİ KATATER
PERİTON MAYİİ
KAN TOPLAM N %
REANİMASYON 46 4 _ _ 2 1 _ _ _ _ 53 53
DAHİLİYE _ 3 _ _ _ 1 _ _ _ _ 4 4
CERRAHİ _ _ 3 _ _ _ 2 _ 1 1 7 7
BEYİN
CERRAHİSİ 3 _ 3 2 1 _ _ _ _ 1 10 10
ORTOPEDİ _ 1 6 _ _ 1 _ _ _ 8 8
NÖROLOJİ 4 _ _ _ _ _
_ _ _ 1 5 5
KBB _ _ _ _ _ 1 _ _ _ _ 1 1
DİĞER 1 3 7 _ _ _ _ 1 _ _ 12 12
TOPLAM N %
54 11 19 2 3 4 2 1 1 3 100 100
54 11 19 2 3 4 2 1 1
3 100
Pseudomonas aeruginosa kökenlerinin broth mikrodilüsyon yöntemi ile imipeneme % 74’ ünün duyarlı, % 16’ sının orta duyarlı, % 10’ unun dirençli;
seftazidime % 56’ sının duyarlı, % 4’ ünün orta duyarlı, % 40’ ının dirençli olduğu tespit edildi.
Pseudomonas aeruginosa kökenlerinin broth mikrodilüsyon yöntemiyle imipenem ve seftazidim için elde edilen MİK değerlerinin duyarlılık dağılımı Tablo 9’ da gösterilmiştir.
Tablo 9 : İmipenem ve seftazidimin broth mikrodilüsyonda MİK duyarlılık dağılımı.
Direnç durumu
İmipenem MİK Seftazidim MİK
N
%
N
% Duyarlı 74 74.0 56 56.0 Orta duyarlı 16 16.0 4 4.0 Dirençli 10 10.0 40 40.0 Toplam 100 100.0 100 100.0
Kökenler broth mikrodilüsyon sonuçları çerçevesinde imipenem ve seftazidim duyarlılıklarına göre değerlendirildiğinde, 10 köken IMP ve CAZ dirençli, 18 köken IMP hassas CAZ dirençli, 4 köken IMP hassas CAZ orta duyarlı, 12 köken IMP orta duyarlı CAZ dirençli, 5 köken IMP orta duyarlı CAZ hassas, 51 köken ise her iki antibiyotiğe hassas bulunmuştur.
Metallo-beta-laktamazlar için seftazidim iyi bir substrat olduğundan ve bu kökenlerin yüksek düzeyde seftazidim direnci göstermesinden yola çıkılarak seftazidim MİK’i 64 µg/ml’nin üzerinde olan Pseudomonas aeruginosa kökenleri (10’ u IMP’ e dirençli, 10’u IMP’ e orta duyarlı, 10’ u IMP’e hassas) seçilmiştir. Bu kökenlerde iki fenotipik yöntemle MBL varlığı araştırılmıştır (91).
Metallo-beta-laktamaz Tayininde Kullanılan Fenotipik Testler A ) Çift Disk Sinerji Testi
Çift disk sinerji testi ile 30 P. aeruginosa kökeninin 12’ sinde (% 40) metallo-beta-laktamaz fenotipik olarak pozitif bulunmuştur. IMP’ e hassas CAZ’ e dirençli 4 kökende, IMP’e orta duyarlı CAZ’ e dirençli 5 kökende, IMP ve CAZ dirençli 3 kökende çift disk sinerji yöntemiyle MBL varlığı tespit edilmiştir.
Çift disk sinerji testi ile pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımları Tablo 10’ da verilmektedir
Tablo 10 : Çift disk sinerji testi (ÇDST) ile fenotipik olarak metallo-beta- laktamaz pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımı.
B ) Kombine disk sinerji testi (KDST)
Çalışmaya alınan kökenlerde fenotipik olarak metallo-beta-laktamaz üretiminin gösterilmesi amacıyla uygulanan ikinci fenotipik test kombine ÇDST Çocuk Beyin cerrahisi Nöroloji Reanimasyon Ortopedi Pozitif
_ _ _ 11 1 Negatif
1 4
1 12 _
IMP EDTA
kökeninin 23‘ ünde (% 76.6) fenotipik olarak metallo-beta-laktamaz üretildiği, 7’ sinde (% 23.4) ise üretilmediği saptanmıştır. IMP’ e hassas CAZ ‘ e dirençli 6 kökende, IMP’ e orta duyarlı CAZ’ e dirençli 9 kökende, IMP ve CAZ dirençli 8 kökende kombine disk sinerji yöntemiyle MBL varlığı tespit edilmiştir. Kombine disk sinerji testi ile pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımları Tablo 11’de verilmektedir.
Tablo 11 : Kombine disk sinerji testi (KDST) ile fenotipik olarak metallo- beta-laktamaz pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılım
Bu fenotipik yöntemler arasında da çift disk sinerji testi daha iyi görünmekle birlikte, diskler arasındaki mesafenin doğru ayarlanması gerekmektedir .Diskler arası mesafe imipenem disk çapının yarısı kadar uzatıldığında sonuçlar negatif olarak değerlendirilebilmektedir. Bu nedenle bir çok çalışmada kombine disk yöntemi tercih edilmektedir (92).
KDST Çocuk Beyin cerrahisi Nöroloji Reanimasyon Ortopedi Pozitif
_ 3 1 18 1 Negatif
1 _
_ 6 _
IMP+EDTA IMP
