MATERYAL VE METOD
Haziran 2006 – Ocak 2008 tarihleri arasında Haydarpaşa Numune Hastanesi’ nde çeşitli kliniklerden izole edilen ve CDC kriterlerine göre nozokomiyal infeksiyon etkeni olduğu düşünülen 100 Pseudomonas aeruginosa kökeni çalışmaya alınmıştır.
Nonfermantatif, oksidaz pozitif, hareketli, Brain-Heart infüzyon broth’ da 42º C’ de ve 37º C’ de üreyen, + 4º C’de üremeyen, karakteristik kokusu olan ve mavi-yeşil pigment yapan suşlar Pseudomonas aeruginosa olarak değerlendirilmiştir. Bu suşlar -20º C’de saklama besiyerinde saklandı.
Buyyonda mikrodilüsyon : İmipenem ve seftazidimin Pseudomonas aeruginosa’ ya duyarlılığı standart olarak buyyonda mikrodilüsyon yöntemiyle belirlendi. İn vitro antimikrobiyal testlerinin tümünün uygulaması ve sonuçlarının yorumlanması " Clinical and Laboratory Standars Institue (CLSI) " M7-A2’ ye uygun olarak gerçekleştirildi (90). İmipenem (Merck Sharp & Dohne) ve seftazidim (Glaxo Welcome A. Ş.) üretici firmalarından potensi bilinen toz olarak temin edildi. İmipenem için solvent ve dilüent olarak fosfat buffer solusyonu (0.01 mol/ L, pH: 7.2), seftazidim için solvent olarak sodyum karbonat, dilüent olarak distile su kullanıldı. Antibiyotiklerden potenslerine göre 256 µg/ml’den başlayan ve 0.5 µg/ml’ ye kadar devam eden çözeltiler hazırlandı. Logoritmik faza getirilen bakteri süspansiyonlarının bulanıklığı spektrofotometrede 546 dalga boyunda (100-110 arası değerleri) 0.5 McFarland’ a uyan değerlere göre ayarlandı. Test final bakteri konsantrasyonu 5x105 CFU/ml olarak gerçekleştirildi. İmipenem için ≥ 16 µg/ml dirençli, 8 µg/ml orta duyarlı, ≤ 4 µg/ml duyarlı olarak kabul edildi. Seftazidim için ≥ 32 µg/ml dirençli, 16 µg/ml orta duyarlı, ≤ 8 µg/ml duyarlı kabul edildi.
Broth mikrodilüsyon yönteminde kontrol kökeni olarak P.aeruginosa ATCC 27853 kullanıldı. Bu köken için kabul edilebilir minimum inhibitör konsantrasyon
IMP-EDTA Kombine disk difüzyon testi : Öncelikle EDTA stok solüsyonu hazırlandı. Bunun için, 1000 mL distile suda 186.1 g disodyum EDTA.2H2O (Sigma chemicals) çözdürülerek 0.5 M EDTA solusyonu elde edildi ve NaOH ile pH 8.0’e ayarlandı. Otoklavlanarak sterilize edildi. Test suşları CLSI’ nin önerdiği disk difüzyon yönteminde olduğu gibi Müller-Hinton agar plağının yüzeyine ekildi. Plağa ikişer adet IMP (Oxoid) (10 µg) diskleri yerleştirildi.
Disklerinin birinin üzerine 4 µl (750 µg) 0.5 M EDTA solüsyonu eklenerek kombine diskler (10 µg/750 µl) oluşturulmuş oldu. Besiyerleri 37 ºC’de bir 16-18 saat inkübe edildi. İmipenem ve EDTA içeren diskin inhibisyon zon çapında 7mm ve üzerinde genişleme olması pozitif olarak değerlendirildi.
İmipenem-EDTA çift disk sinerji testi : Test suşları CLSI’ nin önerdiği disk difüzyon yönteminde olduğu gibi Müller-Hinton agar plağının yüzeyine ekildi. Besiyerinin kurumasını takiben imipenem diski (10 µg) besiyeri yüzeyine yerleştirildi. İmipenem diskinin bir ucundan 10 mm uzağa boş bir kağıt disk yerleştirildi. Boş kağıt diskin üzerine 10 µl EDTA (0.5M, pH 8) eklendi. Plaklar 35ºC’da 18 saat inkübe edildi. İmipeneme karşı oluşan inhibisyon zon çapının EDTA’ya doğru genişlemesi metallo-beta-laktamaz varlığı açısından pozitif sonuç olarak değerlendirildi.
BULGULAR
Hastane infeksiyonları etkeni olarak izole edilen 100 Pseudomonas aeruginosa kökeninin klinik örneklere göre dağılımı; % 54 trakeal aspirat, %19 yara, %11 idrar, % 4 abse, % 3 kan, % 3 balgam, % 2 safra, % 2 BOS, %1 katater, % 1 periton olup kliniklere göre dağılımı ise % 53 reanimasyon, % 10 beyin cerrahisi, % 8 ortopedi, % 7 genel cerrahi, % 5 nöroloji, % 4 dahiliye, % 1 KBB ve % 14 diğer klinikler idi.
P. aeruginosa kökenlerinin izole edildiği klinik örneklere ve kliniklere göre dağılımı Tablo 8’ de gösterildi.
Tablo 8. P. aeruginosa kökenlerinin izole edildiği klinik örneklere ve kliniklere göre dağılımı
Pseudomonas aeruginosa kökenlerinin broth mikrodilüsyon yöntemi ile imipeneme % 74’ ünün duyarlı, % 16’ sının orta duyarlı, % 10’ unun dirençli;
seftazidime % 56’ sının duyarlı, % 4’ ünün orta duyarlı, % 40’ ının dirençli olduğu tespit edildi.
Pseudomonas aeruginosa kökenlerinin broth mikrodilüsyon yöntemiyle imipenem ve seftazidim için elde edilen MİK değerlerinin duyarlılık dağılımı Tablo 9’ da gösterilmiştir.
Tablo 9 : İmipenem ve seftazidimin broth mikrodilüsyonda MİK duyarlılık dağılımı.
Kökenler broth mikrodilüsyon sonuçları çerçevesinde imipenem ve seftazidim duyarlılıklarına göre değerlendirildiğinde, 10 köken IMP ve CAZ dirençli, 18 köken IMP hassas CAZ dirençli, 4 köken IMP hassas CAZ orta duyarlı, 12 köken IMP orta duyarlı CAZ dirençli, 5 köken IMP orta duyarlı CAZ hassas, 51 köken ise her iki antibiyotiğe hassas bulunmuştur.
Metallo-beta-laktamazlar için seftazidim iyi bir substrat olduğundan ve bu kökenlerin yüksek düzeyde seftazidim direnci göstermesinden yola çıkılarak seftazidim MİK’i 64 µg/ml’nin üzerinde olan Pseudomonas aeruginosa kökenleri (10’ u IMP’ e dirençli, 10’u IMP’ e orta duyarlı, 10’ u IMP’e hassas) seçilmiştir. Bu kökenlerde iki fenotipik yöntemle MBL varlığı araştırılmıştır (91).
Metallo-beta-laktamaz Tayininde Kullanılan Fenotipik Testler A ) Çift Disk Sinerji Testi
Çift disk sinerji testi ile 30 P. aeruginosa kökeninin 12’ sinde (% 40) metallo-beta-laktamaz fenotipik olarak pozitif bulunmuştur. IMP’ e hassas CAZ’ e dirençli 4 kökende, IMP’e orta duyarlı CAZ’ e dirençli 5 kökende, IMP ve CAZ dirençli 3 kökende çift disk sinerji yöntemiyle MBL varlığı tespit edilmiştir.
Çift disk sinerji testi ile pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımları Tablo 10’ da verilmektedir
Tablo 10 : Çift disk sinerji testi (ÇDST) ile fenotipik olarak metallo-beta- laktamaz pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımı.
B ) Kombine disk sinerji testi (KDST)
Çalışmaya alınan kökenlerde fenotipik olarak metallo-beta-laktamaz üretiminin gösterilmesi amacıyla uygulanan ikinci fenotipik test kombine ÇDST Çocuk Beyin cerrahisi Nöroloji Reanimasyon Ortopedi Pozitif
_ _ _ 11 1 Negatif
1 4
1 12 _
IMP EDTA
kökeninin 23‘ ünde (% 76.6) fenotipik olarak metallo-beta-laktamaz üretildiği, 7’ sinde (% 23.4) ise üretilmediği saptanmıştır. IMP’ e hassas CAZ ‘ e dirençli 6 kökende, IMP’ e orta duyarlı CAZ’ e dirençli 9 kökende, IMP ve CAZ dirençli 8 kökende kombine disk sinerji yöntemiyle MBL varlığı tespit edilmiştir. Kombine disk sinerji testi ile pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılımları Tablo 11’de verilmektedir.
Tablo 11 : Kombine disk sinerji testi (KDST) ile fenotipik olarak metallo-beta-laktamaz pozitif ve negatif bulunan kökenlerin kliniklere göre dağılım
Bu fenotipik yöntemler arasında da çift disk sinerji testi daha iyi görünmekle birlikte, diskler arasındaki mesafenin doğru ayarlanması gerekmektedir .Diskler arası mesafe imipenem disk çapının yarısı kadar uzatıldığında sonuçlar negatif olarak değerlendirilebilmektedir. Bu nedenle bir çok çalışmada kombine disk yöntemi tercih edilmektedir (92).
KDST Çocuk Beyin cerrahisi Nöroloji Reanimasyon Ortopedi Pozitif
_ 3 1 18 1 Negatif
1 _
_ 6 _
IMP+EDTA IMP
Tablo 12 : İmipenem ve IMP+EDTA diskleri ile oluşan inhibisyon zon çaplarının kökenlere göre dağılımı
15-16
13-14 11-12 9-10 7-8
6
11-12 13-14 15-16 17-18 19-20 21-22 İMP+EDTA diski ile oluşan inhibisyon zonları (mm)
İMP ile oluşan inhibisyon zonları Pseudomonas spp.
1
3 5 1 1 4 1 1
3 4 3 3
MBL varlığını araştırmada kullandığımız iki fenotipik yöntemin sonuçları Tablo 13’ de gösterilmiştir.
Tablo 13 :Fenotipik yöntem sonuçları
Köken No IMP+EDTA Kombine disk yöntemi Çift Disk Sinerji Yöntemi 9 Pozitif Negatif
Çift disk sinerji testi ile kombine disk sinerji testinin uyumu:
Uygulanan iki test arasında sonuçların uyum oranı her iki testle pozitif ve her iki testle negatif bulunan köken sayısının toplam çalışılan köken sayısına bölünmesiyle saptanmıştır. Buna göre;
Pozitif köken sayısı : 12 Negatif köken sayısı : 6
UYUM: [( 12+6 ) / 30] x 100 = % 60