LİMB-GİRDLE KAS DİSTROFİSİ 2R (LGMD2R)'DE MEKANOTRANSDÜKSİYONUN ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI

T.C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

LİMB-GİRDLE KAS DİSTROFİSİ 2R (LGMD2R)'DE MEKANOTRANSDÜKSİYONUN ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI

Şeyda ÜNSAL

Tıbbi Biyoloji Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ

ANKARA 2019

T.C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

LİMB-GİRDLE KAS DİSTROFİSİ 2R (LGMD2R)'DE MEKANOTRANSDÜKSİYONUN ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI

Şeyda ÜNSAL

Tıbbi Biyoloji Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ

TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Pervin DİNÇER

ANKARA 2019

ONAY SAYFASI

YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI

ETİK BEYAN

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans eğitimim süresince bana yol gösteren, cesaret veren ve her zaman destek olan değerli hocam ve danışmanım Prof. Dr. Pervin Dinçer’e,

Tez çalışmamı okuyarak değerli yorumlarını benimle paylaşan tez jüri üyeleri Prof. Dr. Nuhan Puralı’ya, Prof. Dr. Mutlu Hayran’a, Prof. Dr. Can Akçalı’ya, Doç. Dr.

Bala Gür Dedeoğlu’na, Dr. Öğr. Üyesi Beril Talim’e, Dr. Öğr. Üyesi Gamze Bora’ya, Tıbbi Biyoloji Anabilim dalındaki hocalarıma, Tıbbi Biyoloji A.D.’de eğitimlerini tamamlamış olan ve hala devam eden tüm çalışma arkadaşlarıma, en içten teşekkürlerimi sunarım.

Akademik hayatın yanı sıra, bana her zaman güç veren ve daima arkamda olduğunu hissettiğim canım anneme teşekkürümü, sevgisini her zaman hissettiğim ve aramızda olmasa dahi eğitimime katkıda bulunan canım babama derin özlemimi sunarım.

ÖZET

Ünsal, Ş., Limb-Girdle Kas Distrofisi 2R (LGMD2R)'de Mekanotransdüksiyonun Rolünün Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. LGMD2R (MIM 601419) geç başlangıçlı ve yavaş ilerleyen ultra-nadir bir hastalık olup desmin proteininin lamin B bağlanma domaininin bozulmasına neden olan bir splice site mutasyonu ile özdeşleşmiştir.

Hücrelere gelen mekanik iletinin biyokimyasal sinyale dönüşme işlemine mekanotransdüksiyon denir. Bozulan mekanotransdüksiyon sinyalinin etkileri kas distrofileri de dâhil olmak üzere birçok hastalıkta gözlenmektedir. LGMD2R’de ortaya çıkan mekanotransdüksiyon hasarını göstermek için kontrol ve hastaya ait hücreler, Flexcell Tension System kullanılarak mekanik yükleme uygulanmıştır. Öncelikle MAPK yolağı incelenmiştir. ERK1/2 aktivitesinde ve ERK1/2 hedef genlerinde anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Sadece mekanosensitif bir gen olan EGR1 ifadesinde hastada azalış

olduğu görülmüştür. Devamında iskelet kası mekanotransdüksiyonunda kilit rolü olan YAP incelenmiştir. YAP stres koşullarında çekirdekte yerleştiğinden, kontrol iskelet kasında çekirdeklerinin %37,5’i YAP içerirken bunun LGMD2R’de %15,1’e düştüğü

gösterilmiştir. Bununla birlikte statik durumda hastada p-YAP miktarında 1,5 kat artış

gözlenmiştir. Hastada mekanik yüklemeden sonra ise hem p-YAP hem de t-YAP miktarında eş zamanlı azalış olduğu bulunmuştur. Ek olarak YAP tarafından kontrol edilen genlerin ifade düzeyleri araştırıldığında, hepsi hastada mekanik yükleme ile artarken kontrol ile karşılaştırıldığında CTGF ve C-MYC’de azalış olduğu, DIAPH1 ve MYL9’da ise değişim olmadığı gözlenmiştir. Özetle, hastada bazal seviyede YAP aktivitesinin düşmesi ile birlikte, hasta hücrelerinin mekanik yüklemeye yeterli düzeyde cevap veremediği gösterilmiştir. İlginç olarak ANKRD1 ve ANKRD2’nin S izoformunun ifadelerinde artış bulunmuştur. Bu artışın nedeninin LGMD2R’de bozulan mekanotransdüksiyon sinyaline karşılık gelişen koruyucu bir mekanizma olabileceği düşünülmektedir. Bu tez TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir (214S174).

Anahtar Kelimeler: Mekanotransdüksiyon, LGMD2R, desmin, lamin B, iskeler kası

ABSTRACT

Ünsal, Ş., Investigation of the Role of Mechanotransduction in Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2R (LGMD2R). Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Medical Biology Programme Master of Science Thesis, Ankara, 2019. Ultra- rare LGMD2R (MIM 601419) is a late onset disease with slow progression caused by a splice site mutation on desmin protein leading to interruption of laminB binding domain. Mechanotransduction is a process which cells use to sense and convert mechanical stimuli into biochemical signals. Defective mechanotransduction signal effects several disease pathogenesis including muscular dystrophies. To determine impaired mechanotransduction signaling due to loss of desmin-laminB interaction, mechanosensitive pathways and genes were investigated. In order to study the effect of loss of mechanosensitivity, control and patient cells were subjected to cyclic stretch (mechanical load) by using Flexcell Tension system. Firstly, MAPK pathway was investigated and no significant change was observed both in ERK1/2 and its downstream genes. Only EGR1 expression which is a mechanosensitive gene was found to be downregulated in LGMD2R. Secondly, YAP as key regulator of skeletal muscle mechanotransduction was investigated. Since YAP translocates to nucleus under stress conditions, it was found that 37.5% of myonuclei were YAP positive in control skeletal muscle tissue while in patient it is reduced to 15.1%. Furthermore, in resting state, patient’s myotubes have 1,5 times higher p-YAP which is the inactive form. After application of cyclic stretch, the amount of p-YAP and t-YAP were declined simultaneously in the patient. Moreover, the expression levels of some YAP target genes were analyzed. They all responded to mechanical stretch by means of upregulation in the patient. However, when control and patient compared, CTGF and C-MYC expression was downregulated while DIAPH1 and MYL9 were not changed.

Taken as a whole, the data suggested reduced basal YAP activity in the patient, reduced ability of LGMD2R cells to challenge mechanical load although patient cells were still able to respond to a mechanical load. Interestingly, ANKRD1 and S isoform of ANKRD2 were upregulated in the patient. Hence, elevation of ANKRD1 and S isoform of ANKRD2 may also reflects defense against loss of mechanosensitivity in LGMD2R. This thesis was funded by TÜBİTAK (214S174).

Keywords: Mechanotransduction, LGMD2R, desmin, lamin B, skeletal muscle

İÇİNDEKİLER

ONAY SAYFASI iii

YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv

ETİK BEYAN v

TEŞEKKÜR vi

ÖZET vii

ABSTRACT viii

İÇİNDEKİLER ix

SİMGELER VE KISALTMALAR xii

ŞEKİLLER xv

TABLOLAR xviii

1. GİRİŞ 1

2. GENEL BİLGİLER 4

2.1. Mekanotransdüksiyon 4

2.2. İskelet Kasında Mekanotransdüksiyon 6

2.3. İskelet Kasında Mekanosensitif Genler ve Yolaklar 8

2.3.1. IGF1-PI3K-Akt Yolağı 8

2.3.2. MAPK Yolağı 8

2.3.3. Hippo Yolağı ve Yes – Associated Protein (YAP) 10

2.3.4. Muscle Ankryn-Repeat Proteins (MARPs) 13

2.4. Kas Distrofileri ve Mekanotransdüksiyon 15

2.5. Limb-Girdle Kas Distrofisi 2R (LGMD2R) 17

2.6. Hipotez ve Amaç 19

3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 20

3.1. Gereçler 20

3.1.1. Hücre Kültürü 20

3.1.2. İmmünfloresan Boyama 20

3.1.3. Mekanik Yükleme Uygulaması 21

3.1.4. RNA İzolasyonu ve cDNA Sentezi 21

3.1.5. Protein İzolasyonu 21

3.1.6. Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) 21

3.1.7. Western Blot Analizi 21

3.2. Yöntemler 23

3.2.1. Hücre Kültürü 23

3.2.2. Kontrol ve LGMD2R Hastasına Ait Ölümsüz Myoconverted Fibroblastlara

Mekanik Yükleme Uygulaması 24

3.2.3. Hücre Kültüründen RNA İzolasyonu 24

3.2.4. cDNA Sentezi 25

3.2.5. Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) 26

3.2.6. Hücre Kültüründen Protein İzolasyonu 28

3.2.7. Protein Miktar Tayini 29

3.2.8. SDS-PAGE 30

3.2.9. Western Blot 31

3.2.10. Mild Stripping 32

3.2.11. İskelet Kası Dokusunda İmmünfloresan Eş Boyama 33

3.2.12. Fibroblastlarda İmmünfloresan Boyama 35

3.2.13. Verilerin Değerlendirilmesi ve İstatistiksel Analizler 36

4. BULGULAR 37

4.1. Primer Fibroblastların Ölümsüzleştirilmesi ve MyoD Gen Tansferi 37 4.2. Kontrol ve Hasta Hücrelerinde MyoD İfadesinin İncelenmesi 37 4.3. Kontrol ve Hasta Hücrelerinde Desmin İfadesinin İncelenmesi 39 4.4. LGMD2R Patogenezinde MAPK Yolağının ve Mekanosensitif Genlerin

İncelenmesi 39

4.5. LGMD2R Patogenezinde Hippo Yolağının İncelenmesi 42

5. TARTIŞMA 50

6. SONUÇ VE ÖNERİLER 58

6.1. Sonuçlar 58

6.2. Öneriler 59

7. KAYNAKLAR 61

8. EKLER

EK-1. Tez Çalışması İle İlgili Etik Kurul İzni EK-2. RNA konsantrasyon ve saflık değerleri EK-3. qPCR optimizasyonları

EK-4. Protein konsantrasyon değerleri

EK-5. Western Blot deneylerinin ham verilerine ait fotoğraflar

EK-6. qRT-PCR ve Western Blot deneylerinden elde edilen kat değişim değerleri (Mekanik yükleme uygulanan (+) ve uygulanmayan (-))

EK-7. Orjinallik Ekran Çıktısı EK-8. Dijital Makbuz

9. ÖZGEÇMİŞ

SİMGELER VE KISALTMALAR AF488/ 568 Alexa Fluor 488/ 568

Akt Protein kinaz B

ALS Amyotrophic Latheral Sclerosis ANKRD1/2 Ankryn repeat domain protein 1/2

APS Amonyum per sülfat

ARPP Ankryn Repeat Domain Protein 2 BCA Bicinchoninic acid

bç/bp Baz çifti

BSA Dana Serum Albümini

CARP Cardiac Ankryn Repeat Proteins

CM Konjenital miyopati

cm Santimetre

C-MYC MYC proto-onkogen

CTGF Connective tissue growth factor DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DARP Diabetes Ankryn Repeat Domain DGC Distrofin glikoprotein kompleksi DIAPH1 Diaphanous Related Formin 1 DMD Duchenne Müsküler Distrofi DNA Deoksiribonükleik asit EDMD Emery-Dreifuss Kas Distrofisi EGR1 Early growth response - 1

ERK Extracellular signal regulated kinase

FAK Fokal adezyon kinaz

FBS Fetal dana serumu

g Gram

GAPDH Gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz HRP Horseradish Peroksidaz

IER-3 Immediate early response 3

IGF-1 İnsülin Büyüme Faktörü

JNK c-Jun N-terminal kinaz

kDa Kilo Dalton

LAD Lamina Associated Domains

Lats Large Tumor Supressor Homolog LGMD2R Limb Girdle Kas Distrofisi 2R

LINC Linkers of the nucleoskeleton to cytoskeleton

LMNA Lamin A/C

M Molar

MAPK Mitojen aktive protein kinaz MCAT Kasa özgül promotör bir element

mg Miligram

ml Mililitre

Mst Mammalian STE-20 like

mTOR Mammalian target of rapamycin MYL9 Miyozin hafif zincir 9

NaCl Sodyum klorür

NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NLS Çekirdek lokalizasyon sinyali

oC Derece santigrat

PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi PBS Phosphate buffered saline

PFA Paraformaldehit

PI3K Fosfotidil İnositol-3-Kinaz PLA Proximity ligation assay RNA Ribonükleik asit

rpm Rounds per minute

Sav1 Protein Salvador homolog 1 SDS Sodyum dodesil sülfat SMA Spinal müsküler atrofi

SUN Sad1p ve UNC-84

TAZ Transcriptional co-activator with PDZ binding motif

TBS Tris buffered saline

TBS-T Tris buffered saline-Tween20 TEAD TEA domain family member

TEMED N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine UCMD Ullrich Konjenital Kas Distrofisi

V Volt

YAP Yes Associated Protein

μl Mikrolitre

ŞEKİLLER

Şekil Sayfa

2.1. Hücre dışı matriks ile çekirdek arasındaki mekanik iletiyi taşıyan proteinler 5 2.2. BioFlex® kültür kabına ekilen hücrelere eşit-çift yönlü gerilim uygulaması. (A)

Flexcell Tension System’in vakum yardımı ile hücrelere gerilim uygulamasının yandan görünümü. (B) Silikon membran üzerinde tek katman olarak ekilen hücrelerin gerilim yokken uzunluğu l iken (üst) gerilim uygulandıktan sonra membran gerilmesi ile uzunluğu l + ε olmuştur (alt). 7 2.3. Mekanosensitif olan PI3K-AKT ve MAPK yolaklarının hücre içerisindeki

gösterimleri. 10

2.4. Hippo yolağının hücre içerisindeki gösterimi. Yolak aktif iken YAP

fosforillenerek sitoplazmada tutulur veya proteozomda degredasyona uğrar.

Yolak etkisiz iken YAP çekirdeğe girerek TEAD transkripsiyon faktörü ile kompleks oluşturur ve transkripsiyon koaktivatörü görevini gerçekleştirir. 11 2.5. Hücre şekli (A), ECM (B) veya yüzey (C) sertliği, membran gerilimi (D) veya sıvı

kayma gerilimi (E) gibi mekanik stres durumlarında YAP çekirdekte

bulunurken stres faktörleri ortadan kalktığında sitoplazmaya geçmektedir . 12 2.6. İskelet kas fiberinde bulunan hücre iskeleti proteinleri arasındaki

etkileşimlerin şematik gösterimi. Z çizgisi üzerinde kuvvet taşıyıcı proteinler olan desmin – MARP ve MARP – titin etkileşimleri gösterilmektedir. 14 2.7. (A) Desmin proteininin yapısı, organizasyonu ve hastalığa neden olan

tanımlanmış mutasyonların molekül üzerindeki gösterimi. (B) Desmin ile ilişkili mutasyonlar sonucunda bozularak patolojiye neden olan

mekanizmalar. 18

4.1. Kontrol ve hasta hücrelerinde yapılan MyoD ve DAPI boyamalarının

görüntüleri. 38

4.2. Doksisiklin uygulaması yapılmayan fibroblastlarda görüntülenen MyoD ve

DAPI boyamaları. 38

4.3. Kontrol ve hasta miyotüplerinde 6 günlük farklılaştırma sonrasında desmin ifadesinin (A) transkript düzeyinde ve (B) protein düzeyinde incelenmesi. 39 4.4. EGR1 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde

mekanik yüklemenin EGR1 ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 40

4.5. Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yükleme öncesinde ve sonrasında ERK1/2 için yapılan Western Blot sonuçları. (A) Western Blot görüntüsü (EK Şekil 4,5,6). (B) Üç tekrar sonucunda elde edilen bantların Image J yazılımı ile kantitasyonu sonrası GAPDH housekeeping proteinine göre oranlanarak kat

değişiminin hesaplanması. 41

4.6. C-JUN geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin C-JUN ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 41

4.7. COX2 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin COX2 ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 42

4.8. Herhangi bir iskelet kası hastalığı taşımayan kontrole ait taze dondurulmuş kas kesitinde total-YAP proteininin immünfloresan boyama ile yerleşiminin

incelenmesi. (A) Kas fiberi sınırları dışında kalan YAP pozitif satelit hücre çekirdeği. (B) Kas fiberi sınırı içinde kalan YAP pozitif çekirdek. 43 4.9. LGMD2R hastasına ait taze dondurulmuş kas kesitinde total-YAP proteininin

immünfloresan boyama ile yerleşiminin incelenmesi. (A) Kas fiberi

sarkolemmasında yoğun olarak gözlenen YAP boyaması. (B) Kas fiberi sınırı

içinde kalan YAP pozitif çekirdek. 44

4.10. Herhangi bir iskelet kası hastalığı taşımayan kontrol ve LGMD2R hastasına ait taze dondurulmuş kas kesitinde immünfloresan boyama deneyinin sekonder antikor kullanılarak yapılan negatif kontrol sonuçları. 45 4.11. Herhangi bir iskelet kası hastalığı taşımayan kontrol ve LGMD2R hastasına ait

taze dondurulmuş kas kesitinde YAP pozitif kas çekirdeklerinin

karşılaştırılması. 45

4.12. Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yükleme öncesinde ve sonrasında YAP için yapılan Western Blot sonuçları. (A) Western Blot deneyinin temsili

görüntüsü (EK Şekil 7,8,9). (B) 3 tekrar sonucunda elde edilen bantların Image J yazılımı ile kantitasyonu sonrası GAPDH housekeeping proteinine göre

oranlanarak kat değişiminin hesaplanması. 46

4.13. CTGF geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin CTGF ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 47

4.14. C-MYC geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin C-MYC ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 47

4.15. MYL9 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin MYL9 ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 48

4.16. DIAPH1 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin DIAPH1 ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 48

4.17. ANKRD1 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin ANKRD1 ifadesi üzerindeki etkisi, (B) Mekanik yükleme

öncesinde. 49

4.18. M-ANKRD2 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin M-ANKRD2 ifadesi üzerindeki etkisi, (B)

Mekanik yükleme öncesinde. 49

4.19. S-ANKRD2 geni için yapılan qRT-PCR çalışması. (A) Kontrol ve hasta hücrelerinde mekanik yüklemenin S-ANKRD2 ifadesi üzerindeki etkisi, (B)

Mekanik yükleme öncesinde. 49

TABLOLAR

Tablo Sayfa

3.1. Genomik DNA wipeout reaksiyonu 26

3.2. Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımı 26

3.3. Tez kapsamında qRT-PCR deneyi için kullanılan primer dizileri 27 3.4. EGR1, JUN, C-MYC, COX2, CTGF, DIAPH1, MYL9, ANKRD1, S-ANKRD2, M-

ANKRD2 ve GAPDH genleri için kullanılan reaksiyon karışımı 27 3.5. EGR1, JUN, C-MYC, COX2, CTGF, DIAPH1, MYL9, ANKRD1, S-ANKRD2, M-

ANKRD2 ve GAPDH genleri için kullanılan reaksiyon koşulları 28 3.6. Protein izolasyonu için hazırlanan karışımın içeriği. 28 3.7. Protein miktar tayini için hesaplanan kör, standart ve örnek çözeltilerin

hesaplamaları. 29

3.8. %13 ayırıcı ve %6 toplayıcı poliakrilamid jel hazırlanışı 30 4.1. Kontrole ve hastaya ait hücrelerin biyopsi bilgileri 37

1. GİRİŞ

Hücrelerin fiziksel çevrelerine uyum sağlayabilmek için dışarıdan gelen mekanik iletiyi tanımasına ve bu iletiye karşı oluşturduğu biyokimyasal cevaba mekanotransdüksiyon denir (1). Doku ve organların işlev görebilmesi için biyokimyasal sinyallerin yanı sıra çevrelerinden gelen mekanik sinyallere de ihtiyaçları vardır. Hücresel düzeyde motilite, apoptoz, görme, farklılaşma gibi işlemler mekanik sinyallerden etkilenirler. Evrimsel süreç içerisinde tek hücrelilerden memelilere kadar tüm hücrelerde mekanotransdüksiyon aktif bir mekanizma olarak işlemektedir. Buna bağlı olarak, hücrelerin mikro-çevresinde meydana gelen tüm mekanik değişiklikler hücre içinde etkisini gösterir. Örneğin iskelet kası, kalp kası, kemik, kıkırdak, damar gibi sürekli olarak mekanik strese maruz kalan dokularda homeostazinin sağlanabilmesi için mekanik yükleme var olması gereken bir etkendir (2).

İskelet kası ve mekanotransdüksiyon arasındaki ilişki, kas kütlesinin korunmasının mekanik yüklemeye bağlı olmasından doğar. Yapılan çalışmalarda, mekanik yüklemenin sürekliliğinin kas kütlesini arttırdığı ve tersi durumda ise kas kütlesinin azaldığı gözlenmiştir. Kas kütlesinin artması veya azalması kastaki protein sentezinin veya yıkımının hızına bağlı olduğundan hem in vitro’da hem in vivo’da mekanik yüklemenin iskelet kasındaki protein sentezini arttırdığı ve yıkımını azalttığı gösterilirken buna karşılık olarak mekanik yükleme olmadığı durumda protein sentez hızının azaldığı gösterilmiştir (3-5). İskelet kasında kas kütlesinin artması için gerekli olan en önemli faktörlerden birinin mekanik yükleme olduğu kesin olarak bilinmekle beraber hangi moleküler yolakların bu süreçte görev aldığı tam olarak aydınlatılamamıştır (6). Mekanosensitif yolaklar ve proteinler kas kütle artışında protein sentezini arttıran, kas farklılaşmasını indükleyen (örneğin; PI3K, MAPK, Hippo, vb.) veya gelen mekanik yükü taşıyıcı (load bearing) proteinlerdir (örneğin; aktin, titin, ankyrin, vb.) (7). Hippo yolağının en alt basamağında bulunan YAP (Yes-Associated Protein), iskelet kası mekanotransdüksiyonunda kilit görev üstlenmektedir. YAP, fosforillendiğinde sitoplazmada etkisiz durumda iken hücreye mekanik yükleme geldiğinde fosforilasyonu kalkar ve çekirdeğe geçerek transkripsiyon koaktivatör rolü

üstlenerek aktif formunu kazanmış olur (8).

Mekanotransdüksiyonun çalışılabilmesi için doğrudan hücreye uygulanabilecek indükleyici bir mekanik stres gerekmektedir. Bu mekanik stresin uygulanma şekli veya şiddeti çalışılacak hücre tipine veya dokuya göre farklılık gösterebilir (9). İskelet kasında yapılan mekanotransdüksiyon çalışmaları membran gerilmesi tekniğini temel alır. Bu teknikte kas hücrelerinin doğal ortamının modellenmesi için hücreler elastik bir membran yüzeyine ekilir. Hücreler membrana tutunduktan sonra membran bir piston veya vakum sistemi ile belirli şiddette gerdirilerek hücre zarında gerilme stresi oluşturulur. Bu gerilim tek eksenli veya çift eksenli olabilmekle beraber iskelet kasında çift eksenli gerilme tercih edilir.

Uygulanan stresin sonucunda, stres öncesi ve sonrası mekanosensitif genlerin ifade düzeyleri karşılaştırılır (10, 11).

2013 yılında Çetin ve ark. tarafından yapılan çalışmada, DES geninde homozigot c.1289-2A>G mutasyonunun ultra-nadir Limb-Girdle Kas Distrofisi 2R (LGMD2R)’ye neden olan Desmin proteininin kuyruk domainine karşılık gelen bölgede meydana gelen splicing mutasyonu sonucunda, desminin lamin B bağlanma bölgesine 16 amino asitin katıldığı ve buna bağlı olarak desmin üzerindeki lamin-B bağlanma domaininin bozulduğu gösterilmiştir. Çalışmada hasta kasında mutant desmin proteini normal düzeyde ifade edilmesine rağmen kas dejenerasyonu gözlenmiştir.

Ayrıca, sağlıklı bireyden ve hasta bireyden alınan dondurulmuş kas kesitlerinin immünfloresan boyama sonuçları incelendiğinde sağlıklı bireyin iskelet kasında desmin ve lamin B’nin eş yerleşimi gözlenirken hasta iskelet kasında ise bu eş

yerleşimin olmadığı konfokal mikroskobu kullanılarak gösterilmiştir. Çalışma sonucunda çekirdek ile hücre iskeleti elemanları arasındaki etkileşimin olmamasının mekanotransdüksiyon hasarına ve kas dejenerasyonu oluşmasına neden olduğu öngörülmüştür (12). Desmin mutasyonun mekanotransdüksiyon üzerindeki etkilerinin araştırılması için TÜBİTAK desteği ile yürütülen bir (Proje No: 214S174) projede, zebra balığı model organizma olarak kullanılmıştır. Proje kapsamında yabanıl zebra balıklarında desmin-lamin-B etkileşiminin varlığı birlikte immün çökürme ve in- situ proximity ligation assay ile gösterilmiştir (13).

Bu tez çalışmasının hipotezi, hastada desminin lamin-B ile etkileşiminin olmaması durumunda hücrede mekanotransdüksiyonun bozularak mekanik yüklenmeye bağlı kas dejenerasyonun oluştuğudur. Tez çalışması kapsamında kontrol ve LGMD2R hastasına ait ölümsüz myoconverted fibroblast hücreleri 6 gün boyunca miyotüpe farklılaştırıldıktan sonra Flexcell Tension System (FX-4000) kullanılarak eşit- çift yönlü gerilime maruz bırakılmıştır. Mekanik yükleme uygulaması 6 saat boyunca her 2 saniyede bir %10 gerilim uygulaması ile gerçekleştirilmiştir. 6 saatin sonunda RNA ve protein örnekleri toplanarak mekanosensitif genler ve yolaklardaki değişimler araştırılmıştır. Mekanik yükleme öncesinde ve sonrasında toplanan kontrol ve hasta örneklerinde öncelikle mekanosensitif bir gen olan EGR1 ifadesi incelenmiştir.

Çalışmanın devamında MAPK yolağındaki değişiklikler araştırılmış, ERK1/2 ve fosfo- ERK1/2 ifadeleri Western Blot ile, bu yolağın hedef genlerindeki değişiklikler ise (C- JUN ve COX2) transkript düzeyinde qRT-PCR ile incelenmiştir. İskelet kası mekanotransdüksiyonunda anahtar rolü olan YAP proteininin fosforilasyon ve ifade düzeyi Western Blot ile lokalizasyonu ise kontrol ve LGMD2R hastasına ait dondurulmuş kas kesitlerinde gerçekleştirilen immünfloresan boyamalar ile incelenmiştir. YAP’ın hedef genlerinden bazılarının (CTGF, C-MYC, DIAPH1, MYL9, ANKRD1) transkript düzeyindeki araştırması qRT-PCR ile gerçekleştirilmiştir.

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Mekanotransdüksiyon

Mekanotransdüksiyon kaskadı hücre membranına kuvvet gelmesi ile başlar ve sitoplazmadan geçerek çekirdeğe ulaşır. Mekanokimyasal dönüşüm sürecinin başlamasında hücreyi hücre dışı matrikse bağlayan hücre yüzey reseptörleri (integrin, kaderin, vb.), membrana bağlı adaptör proteinler (talin, vinkülin, vb.) mekanosensitif iyon kanalları, heteromerik G proteinler, protein kinazlar (fokal adezyon kinazlar, vb.), ve hücre-hücre bağlantılarının (konneksin, desmosom, vb.) rolü vardır (14). Hücre zarından gelen kuvvet hücre içerisinde hücre iskeleti aracılığı ile yayılır. Yapısal olarak bulunan aktin filamentleri, mikrotübüller ve ara filament proteinleri hücre membranından gelen mekanik kuvvetin çekirdek membranına iletilmesini sağlar.

Çekirdek memranında yerleşen nesprin 1 ve nesprin 2 proteinleri aktin filamentlerine bağlanırken ara filamentlerden gelen mekanik ileti nesprin 3 proteininin plektin ile olan etkileşimi sonucunda çekirdeğe iletilir. Kuvvet iletiminin devamlılığı çekirdek membranı lümeninde yerleşen ve çekirdek membranının dış yüzeyi ile iç yüzeyini bağlayan SUN proteinleri ile sağlanır. Son aşamada ise SUN proteinlerinin çekirdek membranının iç yüzeyinde bulunan laminler ve emerin ile etkileşmesi sonucunda mekanik ileti kromatine kadar iletilmiş olur. Bu bileşenlerin herhangi birinde meydana gelen mutasyon hücrenin yapı ve organizasyonunu bozacağı gibi mekanotransdüksiyon kaskadının da aksamasına neden olur ve hücre işlevleri bozulur (Şekil 2.1) (15, 16). Hücre içerisinde motor proteinler ile sağlanan translokasyon veya difüzyon ile gerçekleşen sinyal iletiminin cevap oluşturması ortalama 5-10 saniye sürerken hücre membranında algılanan mekanik sinyalin çekirdekte gen ifadesini değiştirmesi 5000 kat daha hızlı gerçekleşir (yaklaşık 1 milisaniye) (Şekil 2.1) (17).

Şekil 2.1. Hücre dışı matriks ile çekirdek arasındaki mekanik iletiyi taşıyan proteinler (MT: Mikrotübül, IF: Ara filament proteinleri, LINC: Linkers of the

nucleoskeleton to cytoskeleton) (17).

Hücrenin mekanotransdüksiyon sinyalinin bozulması (kalıtsal veya sonradan kazanılan mutasyonlar ile olabilir) birçok hastalığın oluşumuna katkıda bulunabilir veya sebep olabilir (15). Mekanotransdüksiyon bozukluğunun sebep olduğu gösterilmiş en önemli örnek işitme kaybıdır. Mekanosensitif proteinlerin kodlandığı işitme ile ilgili genlerde meydana gelen mutasyonlar işitme kaybına neden olur (18).

Literatürde diğer doku ve organlarda yapılan çalışmalara bakıldığında; kemik dokusunda bulunan osteosit hücrelerinin mekanosensitif hücreler olduğu ve mekanik yükleme durumunda aktifleştiğini gösteren (19), normal akciğer gelişiminde ve işlevinin devamlılığında mekanik kuvvetlerin gerekliliğini inceleyen (20), arterioskleroz hastalığında sıvı kayma geriliminin (fluid shear stress) eksikliğinin fenotipe olan etkilerini açıklayan (21), immün sistemde monositlerin göç ve makrofaja farklılaşma süreçlerinde membran üzerindeki gerilim sayesinde morfolojik transformasyonu gerçekleştirdiğini gösteren (22) çalışmalar olmakla birlikte insan vücudunda sürekli olarak mekanik yüklemeye maruz kalan iskelet kası dokusunda da araştırmalar yapılmıştır.

2.2. İskelet Kasında Mekanotransdüksiyon

İskelet kası insan vücudunun en dinamik ve elastik dokularından biridir ve vücut ağırlığının yaklaşık olarak %40’ını oluşturur. Genel olarak kas kütlesi, protein sentezi ve yıkımı arasındaki dengeye bağlıdır. Bu süreçler ise beslenme düzeyi, hormon dengesi, fiziksel aktivite, yaralanma veya hastalık gibi birçok faktörden etkilenir. Mekanik açıdan bakıldığında iskelet kasının temel işlevi kimyasal enerjiyi mekanik enerjiye çevirerek kuvvet üretmek ve vücut aktivitesini sağlamaktır (23).

İskelet kası dokusu gelen mekanik iletiyi hissedebilmekle birlikte gelen kuvvetin tipine göre vereceği cevabı da değiştirebilmektedir. Örneğin, boyuna olarak gelen kuvvetler kas lifinin boyuna uzamasını sağlar, kas lifinin çapını değiştirmez. Enine olarak gelen kuvvetlerin ise uzama üzerinde değil genişleme üzerinde etkisi vardır (24).

Kas hücresinde mekanotransdüksiyon çalışmak için mekanik kuvvet uygulaması yapılması gerekmektedir. Bu uygulamanın kontrollü yapılması ve homojenliğin sağlanması için in vitro’da gerilim uygulamayı sağlayan sistemler tercih edilmektedir. İn vitro sistemlerin temeli membran gerilmesi ile mekanik yükleme uygulamasına dayanır. Tek yönlü ve çok yönlü olmak üzere iki tipe ayrılırlar. İskelet kasında hem tek yönlü hem de çok yönlü gerilmenin protein sentezini arttırdığı ve miyoblastları farklılaşmaya götürdüğü gösterilmiştir (24, 25). İskelet kasında yapılan mekanotransdüksiyon çalışmalarında ticari olarak satılan Flexcell Tension System tercih edilmektedir. Bu sistemde hücreler tabanı silikon membran olan bir kültür kabına ekilir. Sistem, bilgisayar tabanlı bir biyoreaktördür ve hücrelere vakum yardımı ile statik veya döngüsel (cyclic) gerilimi eşit-çift yönlü (equibiaxial) olarak uygular (Şekil 2.2) (25, 26). Kasın fizyolojik aktivitesini daha iyi yansıttığı için iskelet kası hücreleri ile çalışılırken döngüsel gerilim uygulaması tercih edilmektedir.

Şekil 2.2. BioFlex® kültür kabına ekilen hücrelere eşit-çift yönlü gerilim uygulaması.

(A) Flexcell Tension System’in vakum yardımı ile hücrelere gerilim uygulamasının yandan görünümü. (B) Silikon membran üzerinde tek katman olarak ekilen hücrelerin gerilim yokken uzunluğu l iken (üst) gerilim uygulandıktan sonra membran gerilmesi ile uzunluğu l + ε olmuştur (alt) (26).

İskelet kasında mekanik sinyallerin çoğu hücre membranında yerleşen distroglikan kompleksi aracılığı ile gerçekleşir. Distroglikan kompleksi, hücre dışı matrikste yerleşen α-distroglikan ve transmembran proteini olan β-distroglikandan oluşmaktadır (27). Hücre dışı matrikste bulunan laminin proteini aracılığı ile gelen kuvvet α-distroglikandan geçerek β-distroglikana iletilir. Β-distroglikan, kas hücresi içerisinde yapısal olarak bulunan distrofin proteini ile etkileşim halindedir ve kuvvet distrofin aracılığı ile aktin iskeletine, aktin iskeletinden LINC kompleksi ile çekirdeğe kadar iletilir (15). İskelet kasında bulunan distroglikan kompleksi integrinlerden bağımsız olarak kuvvet iletimini sağlarken sarkolemmada yerleşen α7β1-integrin de hücre dışı matriksi aktin iskeletine bağlar. α7β1-integrin kas – tendon kavşağı, nöromüsküler kavşak ve kostamerlerde yoğun olarak bulunur ve mekanik sinyal

iletimini sağlar (28). Hücre dışı matriksten gelen mekanik yüklemenin hücre içinde biyokimyasal sinyale dönüşmesinin başka bir yolu da sinyal yolaklarının aktivasyonu veya inhibisyonudur. Mekanik yükleme; kas gelişimi, protein sentezi, satelit hücre aktivasyonu, büyüme faktörü salınımı gibi işlemleri harekete geçirir. IGF1-PI3K-Akt (İnsülin Büyüme Faktörü – Fosfotidil İnositol-3-Kinaz – Protein Kinaz B), MAPK (Mitojenle Aktive Edilmiş Protein Kinaz), Hippo gibi mekanosensitif yolakların yanı sıra MARPlar (Muscle Ankryn-Repeat Proteins), titin gibi iskelet kasında hem yapısal hem de transkripsiyon faktörü görevi olan proteinler de mekanosensitif proteinler olarak adlandırılmaktadır (7).

2.3. İskelet Kasında Mekanosensitif Genler ve Yolaklar 2.3.1. IGF1-PI3K-Akt Yolağı

İskelet kasında mekanik yükleme sonucunda gözlenen kütle artışı düşünüldüğünde rapamisine duyarlı mekanizmaların önemli rolü olduğu öngörülmekteydi. Bu öngörüye dayanarak yapılan çalışmalarda mTORC1 yolağının mekanik yükleme ile aktifleştiği gösterilmiştir. Mekanik yüklemeye bağımlı mTORC1 aktivasyonunun IGF1-PI3K-Akt yolağı üzerinden olduğu farklı çalışmaların ortak sonucu olarak ortaya çıkmıştır (5). Öncelikle, mekanik yükleme sonucunda iskelet kasındaki IGF1 miktarının arttığı, bununla beraber IGF1’in PI3K-Akt yolağı ile iskelet kasında protein sentezini arttırdığı gösterilmiştir (29). Devamında iskelet kasında mekanik yüklemenin PI3K-Akt yolağını aktifleştirdiği gösterilmiştir (30). Son olarak, PI3K-Akt yolağının sürekli aktivasyonunun mTORC1’i sürekli aktif kıldığı ve kas kütlesinin artışını sağladığı gösterilmiştir (31). Tüm çalışmalar bir araya getirildiğinde,

“IGF1PI3KAktmTOR kaskadı iskelet kasında mekanik yükleme durumunda kas kütlesini arttırır” hipotezi doğrulanmaktadır.

2.3.2. MAPK Yolağı

MAPK sinyal yolağının mekanik yükleme ile aktifleştiği fibroblast, endotel hücreler, düz kas hücreleri gibi birçok hücre ve organda gösterilmiştir (32). MAPK’lar türler arasında yüksek oranda korunmuş serin/treonin kinazlardır. Aktif hale

gelebilmeleri için Thr-X-Tyr motiflerinden fosforillenmeleri gerekmektedir.

Extracellular-signal Regulated Kinases (ERK1/2), C-JUN N-terminal kinases (JNK1/2) ve p38 kinazlar olmak üzere üç sınıfa ayrılırlar (33, 34). 2001 yılında sıçan iskelet kasında yapılan bir çalışmada üç tip MAPK yolağının da gerilim bağımlı olarak fosforillenme düzeylerinde artış olduğu gösterilmiştir. Aynı çalışmada JNK ve ERK MAPK’larının farklı genlikteki gerilim düzeylerine cevap vermesi bu iki kinaz ailesinin mekanik yolla indüklenen cevabın oluşmasında farklı roller üstlendiğini düşündürmüştür (34). Literatürde mdx fareler ile yapılan Duchenne Kas Distrofisi (DMD) örneğinde ise kas hasarına neden olan önemli etkenlerden birinin gerilme kaynaklı kalsiyum kanallarında işlev bozulması olduğu gösterilmiştir. Kalsiyum kanallarında işlev bozulması sonucunda mdx farelerde iskelet kası hücrelerinin içine anormal kalsiyum alımına bağlı hasar oluşmaktadır. Bunun yanı sıra, mekanik yükleme durumunda MAPK’lardan ERK1/2’nin hiperfosforilasyonuna neden olurken JNK ve p38 üzerinde etkisi olmadığı gösterilmiştir. İskelet kasında yapısal bir protein olan distrofin eksikliğinin sonucu olan mekanotransdüksiyon bozukluğu değişen kalsiyum ve ERK1/2 sinyali üzerinden açıklanmıştır (35). Emery-Dreifuss Kas Distrofisi (EDMD) örneğinde lamin A/C (-/-) ve emerin (-/-) farelerin embriyonik fibroblast hücrelerinde çekirdek hasarına bağlı apoptoz gözlenmiştir. Yabanıl tip hücrelerde mekanik yükleme durumunda ifadesi arttığı gösterilen mekanosensitif genlerden EGR1 (Early Growth Response 1) ve IER-3’ün (Immediate Early Response 3) lamin A/C (-/-) ve emerin (-/-) hücrelerde mekanik yükleme durumunda ifadelerinde azalma olduğu gösterilmiştir. IER-3 geni NF-κB bağımlı olduğundan NF-κB yolağında olabilecek bozukluklar incelenmiştir. ERK1/2 mekanotransdüksiyonda önemli bir düzenleyici ve NF-κB aktivasyonu ile ilişkili olduğundan ERK1/2 fosforilasyonu mekanik yükleme durumunda incelenmiş fakat yabanıl tipten farklı bir sonuç elde edilmemiştir. Lamin ve emerin gibi çekirdeğe gelen kuvvetin iletiminde önemli rol oynayan proteinlerin yokluğu patogenezin oluşmasında birincil etken olarak, mekanotransdüksiyon hasarı ise ikincil etken olarak gösterilmiştir (36, 37).

Şekil 2.3. Mekanosensitif olan PI3K-AKT ve MAPK yolaklarının hücre içerisindeki gösterimleri (15).

2.3.3. Hippo Yolağı ve Yes – Associated Protein (YAP)

Mekanotransdüksiyon ile indüklenen hücre proliferasyonu ve organogenez gibi süreçlerin düzenlenmesinde en yoğun çalışılan sinyalizasyon faktörlerinden biri YAP (Yes – Associated Protein) ve onun paraloğu TAZ (Transcriptional co-activator with PDZ binding motif, WWTR1)’dır (38). YAP’ın en önemli özelliği WW domaini içermesidir. WW domaini türler arasında yüksek oranda korunmuş iki triptofan amino asiti içermektedir ve protein – protein etkileşimleri bu domainden düzenlenmektedir.

YAP’ın YAP1 ve YAP2 olmak üzere iki izoformu vardır. Bu iki izoform alternative splicing ile oluşmaktadır ve aralarındaki fark YAP1’in bir, YAP2’nin ise iki adet WW domaini taşımasıdır. Karboksil ucunda bulunan transaktivasyon domaini sayesinde transkripsiyon koaktivatörü görevi üstlenmiştir (39).

YAP, Hippo sinyal yolağının en alt basamağında bulunur. Hippo sinyal yolağının esas bileşenleri Mst (Mammalian STE-20 like) ve Lats (Large Tumor Supressor Homolog)’dir (38). Hippo yolağı aktif olduğunda Mst1/2 kinaz Sav1 (Protein Salvador Homolog 1) ile bir kompleks oluşturarak Lats1/2 kinazları fosforilleyerek aktifleştirir.

Lats1/2 kinazlar ise YAP’ı fosforilleyerek etkisiz hale getirir. Fosforillenen YAP’ın sitoplazmada tutulması 14-3-3 proteinine bağlanması ile gerçekleşir. YAP’ın proteozomda degredasyonu ise β-TRCP E3 ligazının ubikutin takması ile gerçekleşir.

Hippo yolağı etkisiz iken YAP çekirdekte bulunur ve TEAD1-4, Smad gibi transkripsiyon faktörlerine bağlanarak transkripsiyon koaktivatörü görevini yerine getirir (Şekil 2.3) (8, 40).

Şekil 2.4. Hippo yolağının hücre içerisindeki gösterimi. Yolak aktif iken YAP fosforillenerek sitoplazmada tutulur veya proteozomda degredasyona uğrar. Yolak etkisiz iken YAP çekirdeğe girerek TEAD transkripsiyon faktörü

ile kompleks oluşturur ve transkripsiyon koaktivatörü görevini gerçekleştirir (Ub: Ubikutin, pS127: 127. pozisyondaki serin amino asitinden gerçekleşen fosforilasyon) (41-43).

YAP’ın mekanotransdüksiyonda kilit bir düzenleyici olduğuna dair yapılan çalışmalar son yıllarda hız kazanmıştır. YAP’ın döngüsel gerilim, sıvı kayma gerilimi, sert hücre dışı matriks gibi farklı mekanik stres koşullarında çekirdeğe girerek strese transkripsiyon düzeyinde cevap oluşturduğu ve stres ortadan kalktığında ise sitoplazmaya çıktığı gösterilmiştir (Şekil 2.4) (44).

Şekil 2.5. Hücre şekli (A), ECM (B) veya yüzey (C) sertliği, membran gerilimi (D) veya sıvı kayma gerilimi (E) gibi mekanik stres durumlarında YAP çekirdekte bulunurken stres faktörleri ortadan kalktığında sitoplazmaya geçmektedir (44).

YAP’ın iskelet kası açısından önemi ise TEAD ailesi transkripsiyon faktörleri ile birlikte kasa özgül promotör bir element olan MCAT taşıyan genlerin ifadesini düzenlemesidir. YAP tarafından kontrol edilen genler beta-miyozin ağır zincir, iskelet kası alfa-aktin, Myf5, Mrf4, miyogenin gibi genlerdir (8). Miyogenez ve kas rejenerasyonunda görev aldığı ve kas distrofilerinde anormal işlev gösterdiğine yönelik çalışmalar bulunmaktadır. YAP’ın en önemli görevlerinden bir tanesi kök hücrelerinde hücre akıbetinin (stemness) belirleyicisi olmasıdır. Örneğin; bağırsak öncü hücrelerinde, nöral tüpte bulunan nöral öncü hücrelerinde ve iskelet kasında bulunan satelit hücrelerinde proliferasyonu tetiklediği ve farklılaşmayı durdurduğu gösterilmiştir (44). Bu özelliği ile YAP’ın iskelet kası rejenerasyonunda görev alabileceği öngörülmektedir. Terminal olarak farklılaşmış iskelet kas fiberlerinde ise YAP açısından çelişkili sonuçlar elde edilmiştir. Kas fiberlerine mekanik yükleme

uygulandığında MCAT aracılığı ile hipertrofiye; YAP sürekli olarak aktif olduğunda ise atrofiye neden olduğu gösterilmiştir (45, 46). LMNA ilişkili konjenital kas distrofisi (Lamin A/C mutasyonları) hastalarından elde edilen miyoblast hücrelerinde yapılan çalışmada YAP sinyalinin anormal aktivasyonu ve mekanotransdüksiyon hasarında rol aldığı ilk kez gösterilmiştir (43).

2.3.4. Muscle Ankryn-Repeat Proteins (MARPs)

Desmin ile etkileştiği maya-2-hibrit sistemi ile gösterilmiş olan MARP’lar; CARP (Cardiac Ankryn Repeat Proteins), DARP (Diabetes Ankryn Repeat Domain) ve ARPP (Ankryn Repeat Domain Protein 2) olmak üzere üç farklı homolog genden (sırası ile ANKRD1, ANKRD23, ANKRD2) kodlanan proteinlerdir (47). Üçü de hem iskelet kasında hem kalp kasında yüksek oranda ifade olurken, CARP ve DARP daha yoğun olarak kalp kasında ARPP ise iskelet kasında ifade olmaktadır (48). İskelet kasında yüksek oranda ifade olan ANKRD2 geninin ise S-ANKRD2 (37,5 kDa), M-ANKRD2 (40 kDa) ve L- ANKRD2 (50 kDa) olmak üzere üç izoformu bulunmaktadır. S ve M izoformları hem kalp hem iskelet kasında ifade olurken, L izoformu sadece kalp kasında ifade olmaktadır (49). ANKRD2’nin kas farklılaşmasında rol aldığı ve inflamasyon, oksidatif stres, egzersiz, denervasyon gibi farklı stres durumlarına cevap oluşturduğu bilinmektedir. ANKRD2 proteini yoğun olarak tip 1 yani yavaş kasılan kas fiberlerinde ifade olmaktadır (50). İskelet kasında I-bandındaki sarkomerik lokalizasyonunun yanı sıra, stres durumunda çekirdekte transkripsiyon kofaktörü görevi olduğu da gösterilmiştir. MARP’ların çekirdeğe taşınması için gerekli olan çekirdek lokalizasyon sinyali (nuclear localization signal - NLS) taşıdıkları biyoinformatik araçlar kullanılarak gösterilmiştir (51). Özellikle mekanik yükleme sırasında çekirdeğe girerek strese cevap oluşturmaktadır. I-bandında MARPlar, titinin N2A bölgesi ve kalpain-3 bir araya gelerek elastik bir kompleks oluştururlar ve iskelet kasına gelen mekanik yüklemenin algılanmasında ve cevap oluşmasında görev alırlar (Şekil 2.5) (49). 2011 yılında yapılan bir çalışmada düz kasta DES geni siRNA yöntemi ile baskılandığında ANKRD1 ifadesinde artış gözlenirken tam tersi yani desminin yüksek oranda ifade edildiği durumda ANKRD1 ifade düzeyinde baskılanma olduğu ve bu mekanizmanın Akt-NF-

κB sinyal yolağı tarafından tetiklendiği gösterilmiştir (52). Ayrıca ALS (Amyotrophic Latheral Sclerosis) hastalığında yapılan bir çalışmada CARP proteininin normal olmayan bir dağılımda ifade olduğu gösterilmiştir. ALS olmayan kas liflerinde CARP dağılımı dama tahtası modeli gösterirken ALS hastalarının kas liflerinin tamamının CARP ifade ettiği gözlenmiştir. Ayrıca normal kas kesitlerinde çoğunlukla yavaş kasılan kas liflerinde gözlenen CARP ifadesinin ALS hastalarında bu özelliğini kaybettiğini ve hızlı kasılan liflerde ifade olduğu gösterilmiştir. CARP’ın myopalladin, desmin gibi sarkomerik proteinler ile etkileşimde olması, miyofiberlerin sarkomerik yapısının korunmasında görev alacağı fikrini doğurmuş ve hastalardaki ifade artışının nedeni koruyucu bir etki şeklinde yorumlanmıştır (53). 2003 yılında müsküler distrofi (MD), konjenital miyopati (CM) ve spinal müsküler atrofi (SMA) hastalarında yapılan bir çalışmada ise ARPP ifadesinin CM ve SMA’da artarken farklı kas distrofisi hastalarında azaldığı hastaların iskelet kası dokusunda yapılan immünfloresan boyamalarda gözlenmiştir (54).

Şekil 2.6. İskelet kas fiberinde bulunan hücre iskeleti proteinleri arasındaki etkileşimlerin şematik gösterimi. Z çizgisi üzerinde kuvvet taşıyıcı proteinler olan desmin – MARP ve MARP – titin etkileşimleri

gösterilmektedir (DGC: Distrofin-Glikoprotein Kompleksi, LIM: Kas LIM proteini) (55).

2.4. Kas Distrofileri ve Mekanotransdüksiyon

Kas distrofileri ilerleyen kas kaybı, farklı kas gruplarında gözlenen güçsüzlük ve farklı şiddette hastalık seyri gözlenen kalıtsal hastalıklardır. En çok kas kaybının gözlendiği kas grubuna göre; Duchenne ve Becker, Emery-Dreifuss, Distal miyopatiler, Fasiyo Skapulo Humeral, Okulofaringeal ve en heterojen grup olan Limb-Girdle olmak üzere sınıflandırılırlar. Birçok kalp distrofisinde kalp tutulumu gözlenir. Kas distrofisine neden olan genler ve gen ürünlerinin çoğu tanımlanmıştır (56).

Mekanotransdüksiyon hasarının görüldüğü hastalık gruplarına bakıldığında ateroskleroz, osteoporoz, kanser, miyopati ve kas distrofileri gibi mekanik kuvvetlerin hücre gelişiminde önemi olan hastalık grupları ön plana çıkmaktadır.

Mekanotransdüksiyon hastalıklarından kas distrofileri göz önüne alındığında adezyon, hücre iskeleti veya hücre dışı matriks proteinlerini kodlayan ve mekanik iletide rolü olan genlerde mutasyon gözlenmektedir (57).

Hücre dışı matriks proteinlerinin mekanotransdüksiyon hasarına bağlı olarak sebep olduğu kas distrofisine örnek olarak Ullrich Konjenital Kas Distrofisi (UCMD) verilebilir. UCMD hücre dışı matriks proteini olan kolajen VI’da meydana gelen mutasyonlar sonucu meydana gelir. 2013’te yapılan çalışmada, Col6a1 (-/-) farelerde insan kolajen VI miyopatisi modellenmiştir. Fareden alınan üç farklı kas tipinde (gastroknemius, tibialis anterior ve diyafram) bu mutasyona bağlı olarak gelişen mekanotransdüksiyon hasarı araştırılmıştır. Çalışmanın sonunda üç kas tipinde de farklı oranlarda kalsiyum regülasyonunda bozukluk, gelen kuvvet iletiminde azalma, kas kasılma süresinde uzama ve kas fiberi hasarı gözlenmiştir. Bu çalışmanın literatüre kattığı en önemli bilgi, tüm kas türlerinde mekanotransdüksiyon hasarı sonucu ortak yolla etkilenen bazı proteinlerin (FAK, troponin, aldolaz, enolaz 3, trioz fosfat izomeraz, kreatin kinaz, adenilat kinaz, parvalbümin ve izositrat dehidrogenaz) tanımlanması ve bu proteinlerin farmakolojik araştırmalar için potansiyel belirteçler veya hedefler olabilmesidir (58).

Hücre dışı matriks ve hücre iskeletini bağlayarak mekanik iletinin aktarılmasını sağlayan distroglikan kompleksinde meydana gelen mutasyonların mekanotransdüksiyon hasarına sebep olacağı öngörülmektedir. Bu zamana kadar

yapılan çalışmalar bu hipotezi desteklemek için yeterli değildir. Glikozil transferaz enzimi olmayan (LARGE^myd) ve α7β1 integrin (-/-) farelerde yapılan çalışmalarda LARGE^myd farelerin kasının α7β1 integrin (-/-) farelerin kasına göre gerilime bağlı hasara daha yatkın olduğu söylenirken bunun kas tipine özgül bir durum olabileceği;

hızlı kasılan ve yavaş kasılan liflerin oranına göre değişiklik gösterebileceği yorumu yapılmıştır (59).

Hücre iskeleti elemanlarında meydana gelen işlev bozukluğu ile oluşan mekanotransdüksiyon hasarına örnek olarak DMD verilebilir. Kas distrofileri arasında en ağır seyirli olan ve en sık gözlenen DMD’dir. 2019 yılında mdx farelerde yapılan bir çalışmada bozulan mekanotransdüksiyon sinyalininin mekanosensitif bir protein olan YAP aracılığı ile gösterilmesi amaçlanmıştır. In vivo’da gerçekleştirilen mekanik yükleme deneyinin sonucunda yabanıl tip farelerde beklendiği üzere yükleme ile YAP’ın ifadesi ve çekirdek lokalizasyonu artarken mdx farelerde de sürekli olan YAP aktivasyonu gözlenmiştir. YAP’ın hiperaktivasyonu, hedef genlerinin ifade düzeyindeki artışı ile de desteklenmiştir. Farelerden izole edilen kas fiberlerini sert hücre dışı matriks ortamına maruz bırakarak in vitro deneyler de yapılmış ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. Sonuç olarak distrofin eksikliğinin YAP sinyalini bozmadığı fakat distrofik kasta bozulan mekanotransdüksiyondan ötürü kas liflerinin yüklemeye karşı tepkisiz kaldığı yorumu yapılmıştır (60).

Mekanik sinyalin çekirdeğe ulaşarak hücre içinde cevap oluşmasında ise çekirdek zarfı proteinleri görev alır. Çekirdek zarfı proteinlerinden emerin (emd) ve lamin A/C (lmna)’de meydana gelen mutasyonlar Emery-Dreifuss Kas Distrofisi (EDMD)’ne neden olur (61). Lamin A/C, LAD (Lamina Associated Domains)’ları organize ederek ve PcG (Polycomb Group of Proteins)’ler ile etkileşerek epigenetik olarak gen düzenlenmesinde rol oynar. Mekanik yükleme durumunda PcG-bağımlı histon belirteci olan H3K27me’nin arttığının gösterilmesi, çekirdek laminasının mekanosensitif özelliği ve epigenetik arasındaki ilişkiyi kurmuştur. Bu durum aynı EDMD’de olduğu gibi; mekanik ileti bozukluğunun epigenetik faktörleri etkilemesi ve son noktada gen regülasyonunun bozulması ile dokuya özgül patoloji gözlenmesine neden olmaktadır (62).

2.5. Limb-Girdle Kas Distrofisi 2R (LGMD2R)

Kas hücreleri desmin, vimentin, nestin, laminin sitokeratin gibi birçok arafilament proteinlerini yapılarında bulundururlar. Bunların arasından desmin, iskelet kasına özgül temel ara filament proteinidir (63). Moleküler ağırlığı 53,5 kDa (470 amino asit) olmakla beraber temel olarak baş, alfa-heliks, rod ve kuyruk olmak üzere üç domain taşımaktadır. Türler arası korunmuşluğu yüksek olan rod domaini içerisinde 1A, 1B, 2A ve 2B olmak üzere sıralı alfa-heliks segmentleri ve aralarında heliks olmayan bağlayıcılar bulunmaktadır. Desmin filament oluşumu için önemli olan YRKLLEGEE motifi ise 2B heliksinin karboksil ucunda bulunmaktadır (64). Günümüzde gelişen yüksek ölçekli RNA dizileme ve proteomik teknikler ile çoğunlukla üç tip kas hücresi (düz, iskelet ve kalp) tarafından ifade edilen desmin proteininin nötrofil, merkezi sinir sistemi, üreme sistemi ve iç organlar gibi farklı hücre gruplarında ifadesi olduğu verileri elde edilmiştir (ProteomicsDB, PaxDb, MOPED ve MaxQB) (65).

Desmin mutasyonlarının çoğunluğu ara filament oluşumu için önemli olan 2B heliksinde bulunmaktadır (Şekil 2.6) (66). Desminopati hastalarında desminin alfa heliks domainlerinde meydana gelen mutasyonlar filament ağının oluşmasını engelleyerek protein birikimine neden olur. Desmin proteininin kuyruk domaininde meydana gelen mutasyonlar alfa-heliks rod domaininde meydana gelen mutasyonlardan farklı sonuç doğurmaktadır. Heliks şeklinde olmayan kuyruk domaini diğer hücre iskeleti proteinleri ile etkileşim halindedir ve sitoplazmik ara filament ağının kurulmasına yardımcı olur. Bu nedenle bu mutasyonlar desminin filamet ağını bozmaz (67-69).

Şekil 2.7. (A) Desmin proteininin yapısı, organizasyonu ve hastalığa neden olan tanımlanmış mutasyonların molekül üzerindeki gösterimi. (B) Desmin ile ilişkili mutasyonlar sonucunda bozularak patolojiye neden olan

mekanizmalar (66).

Desmin sadece sitoplazmik ara filament proteinleri ile değil çekirdek ara filament proteinleri ile de etkileşim halindedir. Desminin kuyruk domaininde 413. ve 434. amino asitleri arası çekirdek zarfında bulunan lamin B bağlanma bölgesi olarak tanımlanmıştır (70). 2013 yılında yapılan çalışmada desmin proteininin 428. amino asit pozisyonuna denk gelen bölgesinde oluşan splice site mutasyonu sonucunda DES geninin 7. intronundan 48 baz 8. eksona eklenerek 16 amino asitlik bir insersiyon gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu mutasyon desminin lamin B bağlanma bölgesine denk gelmektedir. Ultra – nadir olarak ortaya çıkan bu DES c.1289-2A>G mutasyonu (Şekil 2.6) otozomal resesif kalıtım modeline sahip LGMD2R olarak tanımlanmıştır (MIM 601419). LGMD2R geç başlangıçlı ve yavaş ilerleyen bir kas distrofisidir. Hastada ifade olan desmin protein miktarının kontrol ile aynı oranda olmasına rağmen kas dejenerasyonunun görülmesi bu fenotipin yıllar boyunca maruz kalınan mekanik

yüklemeye bağlı olabileceğini düşündürmüştür. Desminopatilerde genel olarak gözlenen protein birikimi veya kas fiber organizasyonunun bozulması hastadan elde edilen kas biyopsisinde gözlenmezken yine desminopatiler ile ilişkilendirilen kardiyomiyopati de iki kardeş hastada yoktur. LGMD2R’de desmin lamin B etkileşimi taze dondurulmuş kontrol ve hastaya ait kas kesitlerinde immünfloresan eş boyama yapılarak araştırılmıştır. Konfokal mikroskobu ile alınan görüntülerde kontrolde desmin ve lamin B’nin birlikte yerleşimi gözlenirken hastada bu iki proteinin eş

yerleşimi gözlenmemiştir (12). Desmin – lamin B etkileşiminin varlığını pekiştirmek için yabanıl tip zebra balığında birlikte-immünçöktürme ve Duolink-PLA (Duoink- Proximity Ligation Assay) yapılmıştır. Birlikte-immünçöktürme sonucunda hem desmin ile çöktürülen lizatta lamin B hem de lamin B ile çöktürülen lizatta desmin bandı gözlenmiştir. Duolink-PLA deneyinde ise kas çekirdeklerinin yaklaşık %30’unda desmin – lamin B etkileşimi olduğu gösterilmiştir (13). LGMD2R’de olduğu gibi hücre iskeleti ve çekirdek arasındaki kuvvet iletimini sağlayan iki proteinin etkileşiminin kaybı, çekirdek ve hücre iskeleti arasındaki mekaniğin bozulmasına ve kas dejenerasyonuna neden olabilir (12).

2.6. Hipotez ve Amaç

LGMD2R’de desminin lamin-B ile etkileşiminin olmaması durumunda hücrede mekanotransdüksiyonun bozularak mekanik yüklenmeye bağlı kas dejenerasyonun oluştuğu bu tez çalışmasının hipotezidir.

Gerçekleştirilen yüksek lisans tez çalışması kapsamında, LGMD2R’de desmin ile lamin-B etkileşiminin olmaması nedeni ile oluşmuş “mekanotransdüksiyon hasarı”

fenotipinin mekanosensitif genlerin veya gen ürünlerinin ifadesinin in vitro mekanotransdüksiyon modeli geliştirilerek kontrole göre nasıl etkileneceğinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Tezin sonucunda, hastada bazal seviyede YAP aktivitesinin düşmesi ile birlikte, hasta hücrelerinin mekanik yüklemeye cevap verebildiği fakat bu cevabın hasta hücrelerinin mekanik yüklemeye karşı durabilmesi için yeterli olmadığı gösterilmiştir.

3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 3.1. Gereçler

3.1.1. Hücre Kültürü

 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM (Gibco, ABD)

 Fetal Dana Serumu (Gibco, ABD)

 Tripsin (Gibco, ABD)

 PBS (Phosphate Buffered Saline) (Gibco, ABD)

 Matrigel^® (Corning, ABD)

 Gentamisin (Gibco, ABD)

 Doksisiklin (ThermoFischer Scientific, ABD)

 İnsülin (ThermoFischer Scientific, ABD)

3.1.2. İmmünfloresan Boyama

 1X PBS (Sigma, ABD)

 Triton X-100 (Sigma, ABD)

 Tween 20 (Sigma, ABD)

 %4 Paraformaldehit (Sigma, ABD)

 %100 Ethanol (J.T. Baker, ABD)

 Fetal Dana Serumu (Capricorn, Almanya)

 Dana Serum Albumin (BSA) (Sigma, ABD)

 Primer Antikorlar

o Fare monoklonal Anti-MyoD M3512 Klon 5.8A IgG1 (DAKO) o Tavşan poliklonlal Anti-YAP (Cell Signaling Technology, #4912) o Fare monoklonal Anti-Laminin (DAKO)

 Sekonder Antikorlar

o Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (Molecular Probes, ABD) o Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (Molecular Probes, ABD) o Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (Molecular Probes, ABD)

 DAPI (4’,6-diaminodino-2-fenilindol) (Sigma, ABD)

 Prolong^® Gold antifade reagent (Molecular Probes, ABD)

3.1.3. Mekanik Yükleme Uygulaması

 Flexcell Tension System FX-4000 (Flexcell International Cooperation, ABD)

 BioFlex^® Culture Plates (Flexcell International Cooperation, ABD)

3.1.4. RNA İzolasyonu ve cDNA Sentezi

 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Almanya)

 NanoDrop One (ThermoFischer, ABD)

 QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Almanya)

3.1.5. Protein İzolasyonu

 Hücre Liziz Tamponu (Cell Signaling Technology, ABD)

 10X Proteaz inhibitörü (Cell Signaling Technology, ABD)

 25X Fosfataz inhibitörü (Cell Signaling Technology, ABD)

 Santrifüj (Hettich, Almanya)

 Sonikatör (Sonics Vibra Cell, ABD)

 Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, ABD)

3.1.6. Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR)

 SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline, İngiltere)

 Rotor – Gene 6000 (Corbett Life Science, Avusturalya)

 Forward ve Reverse Primerler (PRZ Bio Technology, Türkiye)

3.1.7. Western Blot Analizi

 %30 Akrilamid / Bisakrilamid (Sigma, ABD)

 1,5 M Tris, pH: 8,8 (Sigma, ABD)

 1 M Tris, pH: 6,8 (Sigma, ABD)

 %10 SDS (Carlo Erba, İtalya)

 %10 amonyum persülfat (APS) (Sigma, ABD)

 TEMED (Sigma, ABD)

 Mini Protean II elektroforez seti (Bio-Rad, ABD)

 Laemmli yükleme tamponu (4x)

 Precision Plus Protein™ Dual Color Standarts (Bio-Rad, ABD)

 Yarı kuru elektroforetik transfer cihazı (Bio-Rad, ABD)

 Nitroselüloz membran (0,45μm) (Thermo Scientific, ABD)

 Whatmann filtre kâğıdı

 Ponceau S çözeltisi (Sigma, ABD)

 Coomassie Blue çözeltisi (Sigma, ABD)

 Dana Serum Albumin (BSA) (Capricorn, Almanya)

 Yağsız süt tozu

 Tavşan poliklonal Anti-Desmin (Sigma, D8281)

 Fare poliklonal Anti-YAP (Santa Cruz, sc101199)

 Tavşan poliklonal Anti-fosfo YAP (Ser127) (Cell Signaling Technology,

#4911)

 Tavşan monoklonal Anti-ERK1/2 (Cell Signaling Technology, #4695)

 Tavşan monoklonal Anti-fosfo ERK1/2 (Thr202/Thr204) (Cell Signaling Technology, #4377)

 Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) HRP konjuge (Invitrogen, ABD)

 Keçi Anti-Fare IgG (H+L) HRP konjuge (Invitrogen, ABD)

 SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, ABD)

 GeneGnome5 kemilüminesans görüntüleme cihazı (Syngene, Hindistan)

3.2. Yöntemler 3.2.1. Hücre Kültürü

Kontrol olarak kullanılacak sağlıklı insan fibroblast hücreleri TÜBİTAK destekli 116S307 no’lu, “LAP1B Proteinin Kas Hücrelerinin Transkripsiyon Regülasyonundaki Rolünün Araştırılması” başlıklı proje kapsamında ticari olarak temin edildi (Coriell Cell Repositories, New Jersey, 08103, USA). Hasta fibroblast hücreleri, DES geninde homozigot c.1289-2A>G mutasyonuna sahip kas distrofisi hastası bireyin kas biyopsisinden elde edilmiş, sıvı azotta arşivlenmiş hücre materyalidir. Hücrelerinin kullanılması için Hacettepe Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan alınan 12 Haziran 2018 tarihli ve GO 18/496-10 karar no’lu izin mevcuttur.

Primer fibroblastlar kültür kaplarında DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, 4,5 g/mL D-Glukoz) içerisinde %10 Fetal Dana Serumu (FBS), %1 L-Glutamin,

%1 Gentamisin, %1 Amphotericin B içeren çoğalma besiyerinde %5 CO2, 37°C etüv içerisinde çoğaltıldı.

Primer fibroblast hücreleri öncelikle lentiviral vektör trandsüksiyonu ile telomeraz (hTERT) geni transfer edilerek ölümsüz hale getirildi. Miyojenik hücrenin elde edilmesi ise MyoD geninin yine lentiviral vektör kullanılarak transdüksiyonu ile sağlandı. Kontrol ve hasta hücrelerinin lentiviral vektörler ile ölümsüz kılınması ve miyojenik özellik kazandırılması (myoconversion) Pierre and Marie Curie University, Institute of Myology, Paris’te Dr. Anne Bigot tarafından gerçekleştirildi.

Koşullu şekilde indüklenebilir halde verilen MyoD, ölümsüz fibroblast hücrelerini doksisiklin antibiyotiği varlığında miyotüpe farklılaştırmaktadır. Tez kapsamında 6 gün boyunca DMEM içerisinde 1:1000 doksisiklin (1 mg/ml stok) ve 1:1000 insülin (10 mg/ml stok) uygulanarak miyotüpe farklılaştırılan kontrol ve LGMD2R hastasına ait hücreler kullanıldı.

3.2.2. Kontrol ve LGMD2R Hastasına Ait Ölümsüz Myoconverted Fibroblastlara Mekanik Yükleme Uygulaması

Mekanik gerilim uygulaması için Pierre and Marie Curie University, Institute of Myology, Paris’te bulunan ve bilgisayar tabanlı bir biyoreaktör olan Flexcell Tension System (FX-4000) cihazı kullanılmıştır.

Kontrol ve hasta ölümsüz myoconverted fibroblast hücreleri BioFlex® 6-kuyulu kültür kaplarına kuyu başına 300,000 hücre olacak şekilde aşağıdaki dört koşul için ekildi. Hücreler ekilmeden önce BioFlex® kaplar Matrigel® ile kaplandı. Kaplama işleminde Matrigel® soğuk DMEM içerisinde 1:100 oranında seyreltilerek kullanıldı.

Kuyu başına 1 mL Matrigel® karışımı eklendikten sonra 30 dakika boyunca %5 CO2, 37°C etüv içerisinde bekletilerek polimerizasyon sağlandı. 30 dakika sonunda Matrigel® uzaklaştırılarak hücre ekimi gerçekleştirildi.

 Kontrol; gerilim uygulanmamış

 Kontrol; gerilim uygulanmış

 Hasta; gerilim uygulanmamış

 Hasta; gerilim uygulanmış

6 gün boyunca farklılaştırılan hücreler membran gerilmesine maruz bırakılarak kontrollü mekanik yükleme uygulaması yapıldı. Hücrelere döngüsel (cyclic) eşit-çift yönlü (equibiaxial) gerilme uygulandı. 6 saat boyunca yapılan mekanik yüklemenin sonunda gerilim uygulanan ve uygulanmayan hücrelerden RNA ve protein izolasyonu yapılarak mekanosensitif genlerin ve proteinlerin ifade farklılıkları Hacettepe Üniversitesi Tıbbi Biyoloji A.D. Prof. Dr. Altan Günalp Moleküler Biyoloji Laboratvarı’nda araştırıldı.

3.2.3. Hücre Kültüründen RNA İzolasyonu

6 kuyulu BioFlex® kültür kabına ekilmiş olan hücrelerden Qiagen RNeasy Mini Kit ile kit protokolü izlenerek RNA izolasyonu yapıldı. Protokol boyunca RNazdan arındırılmış sarf malzemeler kullanıldı.

 Hücrelerin üzerindeki besiyeri uzaklaştırıldı.

 Hücreler 2 kere soğuk 1X PBS çözeltisi ile yıkandı.

 Her kuyuya 300 µL %10 β-merkaptoethanol içeren RLT tampon çözeltisi eklendi ve hücreler scraper ile kazındı.

 Lizatlar 1,5 mL’lik ependorf tüplere aktarıldı ve pipetaj yapılarak hücrelerin parçalanması sağlandı.

 Lizatların üzerine 300 µL %70 ethanol eklendi ve pipetaj yapıldı.

 Örnekler kit içerisinde bulunan kolonlara transfer edildi ve 25 saniye +4^oC ve 10,000 rpm’de santrifüj yapıldı.

 Süpernatan atıldı ve kolonlara 350 µL RW1 tampon çözeltisi eklenerek 25 saniye +4^oC ve 12,000 rpm’de santrifüj yapıldı.

 Kolona tutunan DNA’nın yıkılması için 80 µL DNaz çözeltisi (bir kolon için 70 µL RDD tampon çözeltisi + 10 µL DNaz) eklendi ve kolonlar 15 dakika oda sıcaklığında beklemeye alındı.

 Kolonlara 350 µL RW1 tampon çözeltisi eklenerek 25 saniye +4^oC ve 12,000 rpm’de santrifüj yapıldı.

 Yıkama amaçlı olarak kolonlara 500 µL RPE tampon çözeltisi eklenerek 25 saniye +4^oC ve 12,000 rpm’de santrifüj yapıldı. Bu adım 2 kere tekrarlandı.

 Kolonlarda fazladan kalabilecek tampon çözeltisini uzaklaştırmak için hiçbir çözelti eklenmeden 2 dakika +4^oC ve 12,000 rpm’de santrifüj yapıldı.

 RNA’yı elde etmek üzere kolonlar temiz 1,5 mL ependorf tüplerine takıldı ve 20 µL RNazdan arındırılmış su eklendi ve 1 dakika oda sıcaklığında bekletildi.

 1 dakika +4^oC ve 12,000 rpm’de santrifüj yapılarak RNA elde edildi.

 NanoDrop One cihazı ile konsantrasyon ve saflık tayini yapıldıktan sonra - 80^oC’de saklandı (EK-4).

3.2.4. cDNA Sentezi

Hücrelerden RNA izolasyonundan sonra qRT-PCR reaksiyonunda kullanılmak üzere Qiagen QuantiScript Reverse Transcription Kit ile cDNA sentezi yapıldı. Her örnekten 500 ng RNA ile cDNA sentezi gerçekleştirildi.

Öncelikle genomik DNA kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki reaksiyon 5 dakika 42^oC’de gerçekleştirildi (Tablo 3.1).