T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
YENİ AZOMETİN FENOL TÜREVİ MONOMERLERİN HORSERADİSH PEROKSİDAZ ENZİMİ İLE OKSİDATİF POLİMERİZASYONU VE TERMAL
KARARLILIĞININ İNCELENMESİ
ESRA DEMİRCİ KARATAŞ
Eylül 2019 E. DEMİRCİ KARATAŞ, 2019DE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜYÜKSEK LİSANS TEZİ
T.C.
NİĞDE ÖMER HALİSDEMİR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
YENİ AZOMETİN FENOL TÜREVİ MONOMERLERİN HORSERADİSH PEROKSİDAZ ENZİMİ İLE OKSİDATİF POLİMERİZASYONU VE TERMAL
KARARLILIĞININ İNCELENMESİ
ESRA DEMİRCİ KARATAŞ
Yüksek Lisans Tezi
Danışman
Doç. Dr. Ersen TURAÇ
Eylül 2019
1 TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin bilimsel ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Esra DEMİRCİ KARATAŞ
2 ÖZET
YENİ AZOMETİN FENOL TÜREVİ MONOMERLERİN HORSERADİSH PEROKSİDAZ ENZİMİ İLE OKSİDATİF POLİMERİZASYONU VE TERMAL
KARARLILIĞININ İNCELENMESİ
DEMİRCİ KARATAŞ, Esra Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
Danışman : Doç. Dr. Ersen TURAÇ
Eylül 2019, 46 sayfa
Bu çalışmada, öncelikle fenoksi imin türevli 4-(benzilamino)fenol monomeri kondenzasyon reaksiyonu ile sentezlenmiş ve monomerin kimyasal yapısı UV–Vis, FT- IR, 1H-NMR, 13C-NMR spektroskopileriyle karakterize edilmiştir. (2-[(4–
metoksifenilimino)metil]fenol)’ün enzimatik oksidatif polimerizasyonu oksitleyici ajan ve katalizör olarak hidrojen peroksit varlığında HRP kullanılarak oda sıcaklığında değişik çözücü ve fosfat tamponlarında (pH=3, 4, 5, 6, 7, 8) gerçekleştirilmiştir. Optimum şartlar belirlenmiştir. Çalışmalar koyu kahve renkli polimerin, çözücü olarak sulu etanolün kullanıldığı pH=3 fosfat tamponunda başarılı bir şekilde sentezlendiğini göstermiştir.
Poli[2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)]’ün karakterizasyonu UV–Vis, FT-IR, 1H- NMR, TGA/DTA, GPC analiz teknikleri ve tarama hızı çalışması yoluyla gerçekleştirilmiştir.
Anahtar Sözcükler: Enzimatik oksidatifpolimerizasyon, oligofenol türevi, horseradishperoksidaz, 2-[(4–
metoksifenilimino)metil]fenol)
3 SUMMARY
INVESTIGATION OF OXIDATIVE POLYMERIZATION AND THERMAL STABILITY OF NEW AZOMETINE PHENOL DERIVATED MONOMERS BY
HORSERADISH PEROXIDASE ENZYME
DEMİRCİ KARATAŞ, Esra Nigde Ömer Halisdemir University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Ersen TURAÇ
September 2019, 46 pages
In this study, phenoxy imine derivative of 4-(benzylamino)phenol monomer was synthesized by condensation reaction and the chemical structure of the monomer has been characterized by UV–Vis, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR spectroscopies. Enzymatic oxidative polymerization of (2-[(4-metoksifenilimino) methyl]phenol) using horseradish peroxidase (HRP) in the presence of hydrogen peroxide as catalyst and oxidizing agent was carried out in various solvents and phosphate buffers (pH=3, 4, 5, 6, 7, 8) at room temperature. The optimum conditions were determined. Studies have shown that a dark brown polymer was successfully synthesized by utilizing aqueous ethanol as the solvent at pH=3 phosphate buffer. Characterization of Poly[(2-[(4-metoksifenilimino)methyl]
phenol)] was carried out via UV–Vis, FT-IR, 1H-NMR, TGA/DTA, GPC analysis techniques and study of scan-rate.
Keywords: Enzymaticoxidativepolymerization, oligophenolderivative, horseradishperoxidase, (2-[(4-
4 ÖN SÖZ
Son yıllarda, polifenollerin enzimatik sentezi oldukça ilgi çekmiş ve kapsamlı olarak araştırılmıştır. Enzim katalizine olan bu ilginin nedeni ise sağladığı avantajlardan kaynaklanmaktadır. Enzimatik polimerizasyon yöntemi, reaksiyon koşullarının ılımlı olması, toksik reaktifler kullanılmadığı için çevre dostu olması, polimerin yapısı ve çözünürlüğünün reaksiyon koşulları değiştirilerek kontrol edilebilmesi gibi avantajlara sahiptir. Bu yüksek lisans çalışmasında, yeni tip fenoksi imin türevli monomer sentezlenmiş ve monomerin karakterizasyon işlemleri yapılmıştır.
Bu çalışmanın tez konusu olarak seçilmesinde, planlanmasında ve yürütülmesinde bana yön veren, her konuda desteğini esirgemeyen, danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ersen TURAÇ’a ve yüksek lisans eğitimim boyunca, her konuda yardımlarını esirgemeyen hocam Sayın Prof. Doç. Dr. Ertuğrul ŞAHMETLİOĞLU’na saygı ve teşekkürlerimi sunarım.
Monomerin sentez aşamasında yardımlarını gördüğüm ve diğer aşamalarda da fikirlerinden yararlandığım hocam Sayın Doç. Dr. H. Ökkeş DEMİR’e teşekkürlerimi sunarım.
Lisans ve Yüksek lisans öğrenimim süresince yetişmemde söz sahibi olan Niğde Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünün Öğretim Üyesi hocalarıma teşekkür ederim.
Ayrıca, tüm hayatım boyunca maddi, manevi desteğini esirgemeyen, beni her zaman destekleyen babam Sadık DEMİRCİ’ye, annem Gülfidan DEMİRCİ’ye, ablam Güldane ODABAŞ’a, kardeşim Büşra DEMİRCİ’ye ve eşim Emre KARATAŞ’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
5 İÇİNDEKİLER
ÖZET ... iv
SUMMARY ... v
ÖN SÖZ ... vi
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... ix
ŞEKİLLER DİZİNİ ... x
SİMGE VE KISALTMALAR ... xii
BÖLÜM I GİRİŞ VE ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ... 1
1.1 Giriş ... 1
1.2 Önceki Çalışmalar ... 2
1.3 Çalışmanın Amacı ... 14
BÖLÜM II GENEL BİLGİLER ... 15
2.1 Basamaklı Polimerizasyon ... 15
2.2 Katılma Polimerizasyonu ... 19
2.3 Enzimler ... 23
2.3.1 Enzimlerin sınıflandırılması ... 24
2.4 Horseradish Peroksidaz (HRP) ... 25
BÖLÜM III MATERYAL VE METOT ... 27
3.1 Materyal ... 27
3.1.1 Kullanılan kimyasal maddeler ... 27
3.1.2 Kullanılan alet ve cihazlar ... 27
3.1.2.1 1H ve 13C Nükleer manyetik rezonans (1H ve 13C NMR ) ... 27
3.1.2.2 Infrared spektrumları (FT-IR) ... 27
3.1.2.3 Ultraviyole görünür bölge spektrumları (UV-Vis) ... 27
3.1.2.4 GPC analiz çalışması ... 28
3.1.2.5 TGA/DTA ... 28
3.2 Metot ... 28
3.2.1 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol (MPIMP) sentezi ... 28 3.2.2 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol (MPIMP)’ün enzimatik oksidatif
BÖLÜM IV BULGULAR VE TARTIŞMA ... 30
4.1 Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün Yapı ve Özellikleri ... 30
4.1.1 Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün molekül ağırlığı çalışması ... 31
4.1.2 (2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün ve Poli-(2-[(4–metoksifenilimino) metil]fenol)’ün çözünürlük özellikleri ... 32
4.1.3 (2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol) ile Poli-(2-[(4–metoksifenilimino) metil]fenol)’ün FT-IR spektrumları ... 32
4.1.4 (2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol) ile Poli-(2-[(4–metoksifenilimino) metil]fenol) UV-Vis spektrumları ... 33
4.1.5 Monomer ve polimerin 1H-NMR ve 13C-NMR spektrumları ... 34
4.1.6 Polimerin termogravimetrik analiz eğrisi ... 37
4.1.7 Monomer ve polimerin diferansiyel taramalı kalorimetri eğrileri ... 38
4.1.8 Polimerin tarama hızı çalışması ... 39
BÖLÜM V SONUÇLAR VE ÖNERİLER ... 40
KAYNAKLAR ... 41
ÖZ GEÇMİŞ ... 46
6 ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Basamaklı ve katılma polimerizasyonu arasındaki farklar ... 23 Çizelge 2.2. Enzimlerin sınıflandırılması ... 25 Çizelge 4.1. Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün kullanılan çözücülerdeki
EOP şartları ve ürünler ... 30 Çizelge 4.2. Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün farklı sıcaklıklardaki
polimerleşme tepkimesi sonucu oluşan ürünler ... 31 Çizelge 4.3. (2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol) ile Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)
metil]fenol)’ün çözünürlük özellikleri... 32
7 ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1. o-PHP sentezi için önerilen mekanizma ... 3
Şekil 1.2. Katekol’ün oksidasyonunun gösterimi ... 7
Şekil 1.3. PGA’nın enzimatik polimerizasyon ile sentezlenme şeması ... 8
Şekil 1.4. PHBBA’nın enzimatik polimerizasyon ile sentezlenme şeması ... 10
Şekil 1.5. HRP dendrozim ile DMA’nın enzimatik polimerizasyonu ... 11
Şekil 1.6. PP-N-Pd sentezi ... 13
Şekil 1.7. Poli(tiramin)’in sentezi ... 14
Şekil 2.1. Kondenzasyon tepkimesi ile etil asetat oluşumu ... 15
Şekil 2.2. İki adımda ilerleyen kondenzasyon tepkimesi ... 16
Şekil 2.3. Yüksek mol kütleli poliesterin sentezinin genel gösterimi ... 17
Şekil 2.4. Kondenzasyon tepkimesi ile poli(etilen tetraftalat) sentezi ... 17
Şekil 2.5. Kondenzasyon tepkimesi ile naylon 6,6 sentezi ... 18
Şekil 2.6. İki farklı fonksiyonel grubu birlikte taşıyan monomerin kondenzasyon tepkimesi ile polimer oluşumu ... 18
Şekil 2.7. Katılma polimerizasyonu ve basamaklı polimerizasyonda mol kütlesinin zamanla değişimi ... 19
Şekil 2.8. Benzoil peroksit’in bozulması ile oluşan benzoil oksi radikali ... 20
Şekil 2.9. Radikalik katılma polimerizasyonunun ilerleyişi ... 21
Şekil 2.10. Katyonik polimerizasyon ... 22
Şekil 2.11. Anyonik polimerizasyon ... 22
Şekil 2.12. Enzimatik reaksiyon mekanizması ... 24
Şekil 2.13. HRP enziminin üç boyutlu molekül yapısı ... 26
Şekil 2.14. Dinlenme durumunda heme grubu ... 26
Şekil 3.1. 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol’ün sentez şeması ... 28
Şekil 3.2. 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol’ün EOP reaksiyonu için önerilen yapısı ... 29
Şekil 4.1. Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün GPC kromatogramı ... 31
Şekil 4.2. (2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün FT-IR spektrumu ... 32
Şekil 4.3. Poli-(2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol)’ün FT-IR spektrumu ... 33
Şekil 4.4. Monomer ve polimerinUV-Vis spektrumu ... 34
Şekil 4.5. Monomerin 1H-NMR spektrumu ... 35
Şekil 4.6. Polimerin 1H-NMR spektrumu ... 35
Şekil 4.7. Monomerin13C-NMR spektrumu ... 36
Şekil 4.8. Polimerin13C-NMR spektrumu ... 37
Şekil 4.9. Polimerin önerilen yapısı ... 37
Şekil 4.10. Polimerin termogravimetrik analizi eğrisi ... 38
Şekil 4.11. Monomer ve polimerin diferansiyel taramalı kalorimetri eğrisi ... 38
Şekil 4.12. Polimerin tarama hızı çalışması grafiği ... 39
8 SİMGE VE KISALTMALAR
Simgeler Açıklama
m- Meta
o- Orto
p- Para
R* Radikal
π Pi
Kısaltmalar Açıklama
AFM Atomik Güç Mikroskobu
AIBN Azobisizobütironitril
BPO Benzoil Peroksit
13C-NMR Karbon Nükleer Magnetik Rezonans
CV Dönüşümlü Voltametri
Dp Polimerizasyon Derecesi
DCM Diklorometan
DMF Dimetilformamit
DMSO Dimetilsülfoksit
DSC Diferansiyel Taramalı Kalorimetri
EN Erime Noktası
EOP Enzimatik Oksidatif Polimerizasyon
FT–IR Fourier Transform Infrared Spektrometresi
GOX Glikoz Oksidaz
GPC Jel Geçirgenlik Kromatografisi
GRE Grafit Çubuk Elektrot
HC 2-hidroksikarbazol
HI Heterojenlik Indisi
1H-NMR Hidrojen Nükleer Magnetik Rezonans
HOMO En Yüksek Dolu Moleküler Orbital
HRP Horseradish Peroksidaz
H2O2 Hidrojen Peroksit
H2SO4 Sülfürik Asit
IR Infrared Spektrometresi
KOH Potasyum Hidroksit
LUMO En Düşük Boş Moleküler Orbital
Mm Monomerin Mol Kütlesi
MO Yinelenen Birimin Mol Kütlesi
Mp Polimerin Mol Kütlesi
M̅n Sayıca- Ortalama Molekül Ağırlığı
M̅w Kütlece-Ortalama Molekül Ağırlığı
𝑀̅v Viskozite-Ortalama Mol Kütlesi
𝑀̅z Z-Ortalama Mol Kütlesi
NMR Nükleer Manyetik Rezonans
PDI Polidisperslik Indeksi
PDMA Poli(2,5-dimetoksianilin)
PHC Poli(2-hidroksikarbazol)
PTP Politiyofen
SBP Soybean Peroksidaz
SDBS Sodyum Dodesil Benzen Sülfonat
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
SEM Taramalı Elektron Mikroskobu
TBATFB Tetra-n-bütilamonyumtetrafloroborat
Te Polimerin Erime Sıcaklığı
Tg Polimerin Camsı Geçiş Sıcaklığı
TGA Termogravimetrik Analiz
THF Tetrahidrofuran
UV-Vis Ultraviyole Görünür Bölge
XPS X-ışını Fotoelektron Spektrumu
1 BÖLÜM I
1 GİRİŞ VE ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 1.1 Giriş
“Doğa bizim öğretmenimiz” Aslında, kimya alanındaki bu söz, kimyasal reaksiyonlar için kullanılan enzim katalizörünün durumunu yansıtıyor. Enzimler, canlı sistemleri sürdürmek için vazgeçilmez olan tüm in vivo reaksiyonları katalize eden doğal katalizörlerdir. Diğer yandan, in vitro olarak, yalnızca doğal substratlar değil, bazıları gıda, farmakoloji, tıp, tekstil alanları vb. gibi endüstriyel imalatlar için nadiren kullanılan doğal olmayan substratların çeşitli dönüşüm reaksiyonlarını katalize edebilmektedirler (Kobayashi vd., 2019).
Keşfedilen ilk enzim, 1833'te Payen ve Persoz tarafından malt çözeltisinden ekstrakte edilen diastaz (amilaz) idi (Payen ve Persoz, 1833). Gizemli ve derin doğası gereği, enzimler ve enzimatik fonksiyonlar bilimde en aktif olarak çalışılan konulardan biri olarak büyük ilgi görmüştür. Organik kimya alanında, 1930'larda ilk kez ester sentezi için esteraz katalizi kullanıldı (Sym, 1936). Daha sonra, 1980'lerden bu yana organik kimya alanında ester üretmek için in vitro enzimatik esterleşmeler veya transesterifikasyonlar çalışılmıştır (Jones, 1986; Wong ve Whitesides, 1994).
Polimer kimyası alanında “enzimatik polimerleşme”, bu otuz yıl boyunca yeni bir polimer sentezi yöntemi olarak kapsamlı bir şekilde çalışılmış ve geliştirilmiştir. Enzimatik polimerizasyon, katalizör olarak enzim kullanan bir polimerizasyon reaksiyonudur ve
“izole edilmiş bir enzim tarafından katalize edilen biyosentetik olmayan yollar yoluyla in vitro kimyasal polimer sentezi” olarak tanımlandı. Enzimatik polimerleşmeyle ilgili araştırmalardaki gelişmeler çok hızlı olduğundan ve çok dikkat edildiğinden, zaman zaman gözden geçirilip odaklanmıştır (Kobayashi vd., 2019).
Burada, polimer sentezinin ve ilgili çalışmaların ilerlemesinin, yenilikçi çalışmaların kronolojik olarak gösterilmesi ile aşağıdaki şekilde verildiği belirtilmelidir.
1920’lerde makromolekül kavramı H. Staudinger tarafından kurulmuştur (Shoda, 2017; Staudinger vd., 1927).
1930’da organik kimyada radikal zincir mekanizması önerildi (Taylor ve Jones, 1930).
1930'larda Naylon, polikondensasyonla açıklanmıştır (Carothers vd., 1930).
1937 ‘de tetrahidrofuranın katyonik halka açma polimerizasyonu (Meerwein vd., 1955).
1940’da iyonik zincir mekanizması önerildi (Williams, 1940).
1953 ve 1955’de Ziegler-Natta katalizörlerinin keşfi (Boor, 1979; Natta vd., 1955;
Ziegler vd., 1955).
1956’da yaşayan polimerizasyon yöntemi keşfedildi (Szwarc vd., 1956).
1963’de polipeptitlerin katı faz sentezi yöntemi geliştirilmiştir (Merrifield, 1963).
1960’lar da supramoleküler kimya kavramı ve supramoleküler polimer (Lehn, 2002).
1977’de iletken polimerlerin bulunması (Shirakawa vd., 1977).
1950’lerden bu yana da metaez katalizörleri geliştirilmiştir (Schrock, 2002; Trnka ve Grubbs, 2001).
1.2 Önceki Çalışmalar
Kolcu ve arkadaşları, Farmasötik kimyada azo boyası olarak kullanılan fenazopiridinhidroklorür (PHP)’yi HRP enzimi ile o-PHP’yi sentezlemişlerdir. PHP'nin enzimatik oligomerizasyonu yoluyla biyolojik olarak elde edilen bir azo boyasının karakteristik özellikleri incelemişlerdir. HRP enzimini kullanan oligomer oluşumu, o- PHP üretimi için yöntemde toksik kimyasallar kullanmaya gerek kalmadan alternatif bir fırsat sağladığı görülmüştür. Paralel olarak, enzimatik olarak oligomerize edilmiş o-PHP, dengeli termal ve fotoluminesans özellikleri ile sentezlenen oligomerin moleküler yapısının aydınlatılması FT-IR, 1H- NMR ve 13C-NMR teknikleri ile yapıldı. Enzimatik oligomerizasyon, fotoluminesans analizinde, sırasıyla UV uyarısı ve görünür uyarma üzerine mavi ve yeşil ışık yaymasıyla o-PHP'yi indüklemiştir. o-PHP'nin moleküler karakterizasyonu UV-vis, kızılötesi, 1H-NMR ve 13-C NMR teknikleri ile belirlendi. o- PHP'nin elektronik olarak emiliminde çözücü etkisi araştırılmıştır. Fotoluminesans (PL), termal analiz (TG-DTA ve DSC) ve elektrokimyasal (CV) ölçümleriyle daha fazla analiz
yapıldı. PL ölçümleri, Sırasıyla UV ve görünür ışığa bağlı olarak bikolor ışık emisyonlu o-PHP'nin verdiği sonuçlarla sonuçlandı. Monomer ve oligomerin HOMO-LUMO enerji seviyelerini ve elektrokimyasal (Eg) bant boşluklarını değerlendirmek için CV yöntemi kullanılmıştır. o-PHP'nin optik ve elektrokimyasal bant boşlukları, PHP'ninkinden daha düşüktü ve p-konjuge yapının o-PHP yapısının sentezini doğruladı. o-PHP'nin yüzey morfolojisini incelemek için Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) tekniği uygulandı. Ek olarak, TGA-DTA ve DSC tekniklerinin ısıl çalışmalarının sonuçları, o-PHP'nin termal olarak kararlı bir bileşik olduğunu göstermiştir. Sentezlenen polimerin karakterizasyonu için UV-Vis, FT-IR, 1H-MNR, TGA ve GPC analizlerini kullanmışlardır. Önceki açıklamalara dayanarak, enzimatik olarak sentezlenmiş oligomer, malzemenin optik, elektrokimyasal ve termal özelliklerini açıklamak için UV-Vis, PL, TGA-DTA, DSC, CV ve GPC yöntemleri kullanılarak analiz edildi. Oligomer, optoelektronik ve fotovoltaik uygulamalarda kullanım için ve biyolojideki flüoresan etiketlemede ilham veren, güneş hücrelerinin üretiminde mavi ve yeşil ışık yayıcı olarak malzeme için çok umut verici bir adaydır (Kolcu, 2019).
Şekil 1.1. o-PHP sentezi için önerilen mekanizma (Kolcu, 2019)
Kumar ve arkadaşları, Tanik asidin (TA) HRP katalizli polimerizasyonunu ve p (TA) 'nın çeşitli elektrot yüzeylerinde biyomoleküllerin kovalent immobilizasyonu için çok yönlü bir platform olarak poli (Tannik asit) (p (TA))' nin uygulandığını göstermişlerdir. Daha sonra biyomoleküller ile oksidatif eşleşme reaksiyonları ile bu yöntemin ayrıca kanser
hücrelerini bir bağlayıcı molekül olan folik asit (FA) yoluyla yakalamak için de kullanmışlardır. p(TA) ile modifiye edilmiş yüzeyin gelişmiş elektrokatalitik etkinliğinin, askorbik asit (AA), dopamin (DA) ve ürik asit (UA) gibi biyolojik olarak önemli elektroaktif moleküllerin eşzamanlı elektrokimyasal tespiti için kullanılabileceğini kanıtlamışlardır. TA ve p(TA) esaslı yüzey modifikasyon yönteminin bu HRP katalizörlü polimerizasyonu, biyomoleküllerin kovalent eklenmesi ve hassas elektrokimyasal algılama cihazlarının geliştirilmesi için çok fonksiyonlu platformlar oluşturmak için basit ve yeni bir çerçeve sağlayabilir. Burada, TA'nın enzim ile hızlandırılmış polimerizasyonuna dayanan yeni bir yöntem, birkaç dakika içinde ince bir p(TA) tabakası oluşturarak farklı biyomoleküllerin malzemeden bağımsız elektrot yüzeyleri üzerinde etkili bir şekilde bağlanmasına olanak sağlayan tarif edilmiştir. TA'nın HRP katalize polimerizasyonu, daha sonra metal, metal ve metal oksit elektrot yüzeyleri üzerine kaplanan p(TA) üretti. Ayrıca, p(TA) kaplı yüzey, reseptör biyomoleküllerinin veya küçük moleküllerin konjugasyonu için çok işlevli bir platform ve biyolojik olarak alakalı elektroaktif küçük moleküllerin elektrokatalitik tespiti için kullanıldı. Bu yöntem aynı sensör çipindeki spesifik elektrot yüzeyleri üzerindeki çoklu reseptör moleküllerini modellemek için de kullanılmıştır. Moleküllerin kovalent konjugasyonu, P(TA) 'nın elektrokimyasal oksidasyonuna ve ardından Michael tipi ekleme/Schiff baz reaksiyonu yoluyla biyomoleküllerin oksidatif bağlanmasına dayandırılmıştır. Konseptin bir kanıtı olarak, bu çok yönlü yöntem, bir antikorun immobilizasyonu ve daha sonra interlökin-6 (IL-6), bir tekli DNA sekansı ve bağlayıcı molekül, folik asit (FA) 'nin seçici yakalanması için tespit edilmesi için kullanıldı. kanser hücreleri. p(TA) ile modifiye edilmiş yüzeyin arttırılmış elektrokatalitik etkinliği, askorbik asit (AA), dopamin (DA) ve ürik asit (UA) gibi biyolojik olarak alakalı elektroaktif moleküllerin eşzamanlı tespiti için kullanılmıştır.
Sonuç olarak, TA'nın hızlı polimerizasyonu ve metal, metal ve metal oksit elektrot yüzeyleri üzerindeki hızlı kaplanması için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. P (TA) kaplı elektrot yüzeyinin, biyomoleküllerin ve küçük moleküllerin kovalent konjügasyonu için çok işlevli bir platform olarak kullanılabileceği ve farklı yerlerde elektrot yüzeyleri üzerindeki çoklu reseptör moleküllerinin yanı sıra spesifik konumlardaki biyomoleküllerin modellenmesi için kullanılabileceği gösterilmiştir. P(TA) 'nın arttırılmış elektrokatalitik aktivitesi, biyolojik olarak ilgili birkaç elektroaktif molekülün eşzamanlı elektrokimyasal tespiti için kullanılmıştır. Bu enzim ile güçlendirilmiş polimerizasyon ve elektrokimyasal yüzey aktivasyon ve işlevselleştirme metodu, multipleks elektrokimyasal biyosensörlerin geliştirilmesi için farklı elektrot yüzeylerinde
çok işlevli platformlar oluşturmak için basit, hızlı ve çok yönlü bir çerçevedir (Singh vd., 2019).
Wasak ve arkadaşları, bir manyetik alanın (RMF) horseradish peroksidaz (HRP) ve katalize edilmiş enzimatik işlemin etkinliği ve stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. RMF'ye 8 saat maruz kalmanın HRP'nin operasyoel stabilitesini etkilemediği bulundu. Aynı zamanda, RMF'nin daha geniş bir pH aralığında HRP aktivitesini iyileştirdiği gözlendi: pH=6,5 ve pH=7'de sırasıyla %49 ve %68’dir. Bu çalışmada, yaban turpu peroksidaz aktivitesini kontrol etmek ve antrakinon sentetik boya enzimatik renk açma işlemini dönen bir manyetik alan destekli reaktör kullanarak arttırmak için bir araç olarak RMF araştırıldı. HRP aktivitesi, hidrojen peroksit varlığında o-dianisidin oksidasyonu nedeniyle 460 nm'de absorbanstaki değişikliklerle belirlendi.
Deney %1 metanolik o-dianisidin çözeltisi ve 0,1 mM H2O2 ile 100 mM asetat tamponu pH=4,5 içinde 30 ℃'de gerçekleştirildi. Aktivite ve stabilite üzerindeki pH etkisi, 4 ila 7 arasında bir pH aralığında asetat ve fosfat tamponlarında (100 mM) incelenmiştir.
Peroksidaz için optimum katalitik pH'ı belirlemek için, o-dianisidin oksidasyonunun reaksiyonu doğrudan RMF altında yapıldı ve inkübasyondan hemen sonra spektrofotometrik olarak ölçüldü. Bu arada, pH stabilitesi, pH=4, 6 ve 8'de RMF'ye maruz bırakılarak HRP çözeltisinin 8 saat boyunca her saat izleme aktivitesi ile inkübe edilmesiyle incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar ayrıca, HRP tarafından katalize edilen, RMF'ye maruz bırakılmış geniş bir pH aralığında katalize edilen, verimli, birkaç saatlik reaksiyonların gerçekleştirilebilme ihtimalinin olduğunu da göstermiştir. Yapılan araştırmalar, RMF'nin sıklığına bağlı olarak, HRP'nin etkinliğini değiştiren bir faktör olabileceğini göstermiştir. Dönen bir manyetik alana maruz kalma, geniş bir pH aralığında HRP aktivitesinde önemli artışlarla pH bağımlı enzim aktivitesini değiştirir.
Ayrıca, RMF'ye maruz kalmanın enzim stabilitesinin kaybı üzerinde bir etkisi olmamıştır.
RMF'nin HRP katalitik hareketi üzerindeki doğrudan etkisini doğrulayan enzimsiz boyanın yapısal değişiklikleri bildirilmedi. Yukarıda açıklanan katalitik özelliklerin geliştirilmesi ve ayrıca sentetik boya renk açma oranı, HRP enzim bazlı işlemin değiştirilmesi ve kontrolü için yeni, alternatif bir araç olarak RMF'yi gösterir (Wasak vd., 2019).
Su ve arkadaşları; myceliophthora thermophila'dan elde edilen lakkaz, katekol’ün yüksek basınçlı homojenizasyonu altında tekstil substratlarının yeşil renklenmesi için
polimerizasyonunu katalize etmek için kullanmışlardır. Yüksek basınçlı homojenizasyon altında PEG ile ve epoksi-PEG lakkaz kullanılan enzimatik katalizin, partikül büyüklüğü 30 ile 60 nm arasında olan daha uzun polimerlere yol açtığını tespit etmişlerdir.
Oksidasyon reaksiyonları, bir epoksi reçinesi üzerinde immobilize edilmiş farklı lakaz formlarını pH=5 fosfat tamponu içerisinde 48 saat 4 ℃ sentezlemişlerdir. Katekol oksidasyonunun tekstil sanayisine renklendirilmede kullanılabileceği etkili bir metod olduğunu kanıtlamışlardır. Bu metodoloji ile üretilen polimerler tekstil kabını kuvvetle lekelemiş, bu deneysel düzenlemeyi tekstil işlemlerinde normal olarak kullanılandan daha ılıman koşullar içeren gelecek vaat eden daha yeşil bir renklendirme/kaplama metodolojisi olarak ortaya koymaktadır. Farklı lakaz formlarının, yüksek enerjili/basınçlı ortamlarda katekolü polimerize etme konusundaki katalitik yeteneğini değerlendirmektir.
Kataliz bu nedenle yüksek basınçlı homojenleştirici (HPH) altında bir epoksi reçinesi Epoksi-PEG ile edilmiş lakkaz üzerine immobilize edilmiş doğal lakkaz, PEG ile edilmiş lakkaz kullanılarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada, çözünmeyen enzim formu bir polietilen tereftalat (PET) torbasının yanı sıra kontrol amaçlı diğer formlarda da yer almıştır. Polimerizasyon zaman içerisinde renk değişimini izlemek için UV-Vis spektrum analizi ile takip edildi. Üretilen polimerler ağırlık ölçümü, 1H-NMR ve TGA ile karakterize edildi. Polimer tozların parçacık büyüklüğü dinamik ışık saçılımı analizi ile analiz edildi. Genel olarak, kumaş boyama işlemleri, yüksek sıcaklıklar ve/veya yüksek asidik veya alkali pH'lar gibi aşırı koşulların kullanımını belirtir. Lakaz reaksiyonlarından polifenolik bileşenler daha yumuşak koşullarda üretilir ve yeşil renklendirme için kullanılabilir. Yüksek basınçlı homojenizasyon, katekolün enzim destekli polimerizasyonu için etkili bir teknik olduğunu ortaya koydu. Diğer işleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, yüksek basınçlı homojenleştirici tarafından teşvik edilen katekol oksidasyonu için daha yeşil bir yaklaşım sağlar, çünkü enerji tasarrufludur, düşük maliyetlerle kimyasal tasarruf sağlar. Sonuç olarak düşük sıcaklıklarda liflerin yeşil renklenmesi için enzimatik olarak değerli araçlar olarak elde edilen polimerleri sunmaktadır. Lakaz ve yüksek basınçlı homojenizasyon tekniği arasındaki sinerjizmin daha fazla kullanılması, farklı fenolik monomer konsantrasyonlarınn oksidasyonu yoluyla geniş bir renk paleti elde edilmesini sağlayacaktır (Su vd., 2018).
Şekil 1.2. Katekol’ün oksidasyonunun gösterimi (Su vd., 2018)
Topal ve arkadaşları, Orto-imin ikameli fenol, (E)-2-((p-tolilmino)metil)fenol (PTIMP), sulu organik çözücüler içinde yabanturpu peroksidaz (HRP) enzimi ve bir oksidan olarak hidrojen peroksit (H2O2) kullanılarak enzimatik polimerizasyonunu sentezlemişlerdir.
Polimerizasyonda farklı parametreler (solvent sistemi, pH ve reaksiyon sıcaklığı) araştırmışlardır. Havada 24 saat 25 ℃'de EtOH/pH=6 tamponu (%50:50 hacim) %65 verimle optimum polimerizasyon koşulu ve Mn=6100 g/mol (DP≈29, PDI: 1,09) bulmuşlardır HRP enzim katalizörünün mevcudiyetinde PTIMP'nin polimerizasyonu, bir oligophenol içeren fenilen ve oksifenilen tekrar birimlerinin oluşumuna yol açar. Elde edilen oligophenol, organik çözücülerin çoğunda çözünür. Oligo'nun (PTIMP) karakterizasyonu NMR, UV-Vis, CV, FT-IR spektroskopisi ve termogravimetrik analiz ile elde edildi (Topal vd., 2017).
Taresco vd. (2016) yılında yaptıkları çalışmada; lipaz (Novozym 435) enzimi ile divinil adipat ile gliserolün enzimatik polimerizasyonu ile oluşan gliserol adipat (PGA) polimerini elde etmişlerdir ve sadece reaksiyon sıcaklığını (40, 50, 60, 70 ℃) değiştirerek elde edilen polimein dallanma miktarını incelemişlerdir. PGA’nın suda çözünür hidrofilik karakter kazandıran hidroksil gruplarının olduğunu bulmuşlardır. Sentez sırasında dikkatli sıcaklık kontrolü ile tekrarlanabilir molekül ağırlığına sahip polimer elde etmişlerdir ve bunu NMR ile kanıtlamışlardır. Polimerin sentez sıcaklığı FT-IR, 1H- NMR, 13C-NMR, yüzey ve termal analiz özellikleri incelemişlerdir. Bir katalizör olarak lipaz enziminin kullanılması aktif merkezde sterik engelleme yoluyla gliseril hidroksil
çapraz bağlanmış polimer elde etmişlerdir. Enzmatik yollarla elde edilen polimerin yararlı bir biyobozunur polimer olarak sağlık uygulamalarında, mühendislik uygulamalarında nanopartiküller olarak kullanabileceğini belirtmişlerdir (Taresco vd., 2016).
Şekil 1.3. PGA’nın enzimatik polimerizasyon ile sentezlenme şeması (Taresco vd., 2016)
Gustini ve arkadaşlarının 2015 yılında yaptıkları çalışmada; biyolojik bazlı monomerlerin bir bileşimini kullanarak yeni bir sorbital bazlı poliesterlerin Candida antarctina lipaz B (Novozym 435) enzimi kullanarak immobilize solventsiz enzimatik polikondenzasyon ile gerçekleştirmişlerdir. Amaçları polimer omurgası boyunca doğrusal poliester üzerinde hidroksil gruplarının varlığıdır. Bunu başarmak için poliesterin molekül ağırlığını reaksiyon süresi, enzim miktarı ve reaksiyon stokiyometrisini kontrol ederek yapmışlardır. Elde edilen poliesterin geniş moleküler ve ısı karakterizasyonu, düşük Tg sahip yarı-kristal malzeme olduğunu göstermişlerdir. Poliesterlerde sorbitol varlığı, MALDI-TOF-MS kullanılarak nitel incelenmesi yoluyla teyit etmişlerdir. 31P-NMR birincil, ikincil hidroksil grupları ve CALB’in seçiciliği ile ilgili bilgi verirken ise polimer sorbitol içeriğinin ölçümü, ters-geçiş ayrıştırma 13C-NMR spektroskopisi ile elde edildiğini söylemişlerdir. Ayrıca, 31P-NMR ve potansiyometrik titrasyonunu karboksilik grupları ve polyesterler içinde mevcut hidroksil fonksiyonel grupların miktarının kantitatif tayini için kullanmışlardır. Elde edilen hidroksil fonksiyonlu poliesterlerin özellikler molekül ağırlığı, işlevsellik ve termal özellikleri açısından solvent bazlı kaplamalar içinde uygulanması gerektiğini söylemişlerdir. Çapraz-bağlanmış kaplamalar, iki yenilenebilir diizosiyanat (etil ester L-lisin diizosiyanat ve dimer yağ asidi bazlı diizosiyanat) dâhil olmak üzere farklı geleneksel sertleştirme maddeleri kullanılarak hazırlamışlardır. Elde edilen poli (ester üretan) kaplama, ağ oluşumu uygulanan
sorbitolün yararlı bir etki gösterdiği, solvent direnci, sertlik ve hızlı deformasyona karşı direnci açısından test etmişlerdir (Gustini vd., 2015).
Kümbül vd. (2016) yılında yaptıkları çalışmada; 2-[(4-nitrofenilimino)metil]fenol (NPIMP)’ün orto-imin işlevselleştirilmiş oligofenolü enzimatik polimerizayonu sentezlemişlerdir. Enzimtik polimerizayonu ile yan zincir üzeindeki iminin işlevselliği Horseradish peroksidaz (HRP) enzimi ve hidrojen peroksit (H2O2) kullanılarak oligofenolü sentezlemişlerdir. Polimerizasyon işlemi için pH, reaksiyon sıcaklığı ve çözücü sistemi olmak üzere çeşitli faktörlerin etkisini araştırmışlardır. Optimum reaksiyon şartları olarak hava altında 24 saat 35 ℃ pH=7 fosfat tamponunda aseton ortamında en yüksek verimle %96 elde etmişlerdir. Polimerin sayıca ortalama molekül ağırlığı (Mn): 7300 g/mol, polimerizasyon derecesi DP≈30 olarak bulmuşlardır. Elde edilen oligomer UV-Vis, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR, Termogravimetrik analiz (TGA), diferansiyel tarama kalorimetri (DSC), CV ve GPC ile karakterize etmişlerdir. Elde edilen oligomerin tekrar birimlerinin fenilen ve oksifenilen kısımlardan oluştuğu tespit etmişledir. Optik bant boşluğunu (Eg) (NPIMP) için 3,21 eV, oligo(NPIMP) için 3,39 eV olarak tespit etmişlerdir. Oligo(NPIMP)’in termogravimetrik analiz sonucu T%5 kütle kayıp sıcaklığı 175 ℃, T%50 kütle kayıp sıcaklığı 600 ℃ olarak bulunmuş ve termooksidatif bozunmaya karşı dirençli olduğunu kanıtlamışlardır (Kümbül vd., 2016).
Kümbül vd. (2015) yılında yaptıkları çalışmada; enzimatik oksidatif polimerizasyonunu, çeşitliorganik çözücüler (aseton, metanol, etanol, diklorometan, 1,4-dioksan ve tetrahidrofuran) ve farklı pH’larda fosfat tanponları (pH=6, 7, 8, ve 9) içinde yaban turpu peroksidazı (HRP) katalizörü ve reaksiynu başlatması için H2O2 kullanmışlardır. Elde edilen polimer, oligo(HBBA), UV-Vis, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR, Termogravimetrik analiz (TGA) ve GPC ile karakterize etmişlerdir. Polimerizasyon çözücü sistemi reaksiyon sıcaklığı ve pH etkileri polimerin molekül ağırlığı verimi üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Optimum reaksiyon koşulları 35 ℃’de 1,4-dioksan çözücüsü içinde pH=5 fosfat tamponu eşdeğer hacimde en yüsek %81 verimle elde edilen polimerin sayıca ortalama molekül ağırlığını (Mn)=3000 g.mol-1, DP≈15 olduğunu tespit etmişlerdir.
Analizler sonucu polimerin fenolik hidroksil (-OH) gruplarına sahip uçlar taşıdığını kanıtlamışlardır. FT-IR ve 1H-NMR çalışmaları sonucunda, polimer zincirinde fenilen ve oksifenilen birimlerinin varlığını doğrulamışlardır. Ürünün termal analiz sonucu
polimerin 1000 ℃ ısıtıldıktan sonra %35 kalmıştır ve bu sonuç oligo(HBBA)’in termooksidatif bozunmaya dirençli olduğunu göstermiştir (Kümbül vd., 2015).
Şekil 1.4. PHBBA’nın enzimatik polimerizasyon ile sentezlenme şeması (Kümbül vd., 2015)
Yıldırım vd. (2016) yılında yaptıkları çalışmada; 4-(benzilamino)fenol (BAP)’ın enzimatik oksidatif kondenzasyonu yöntemi ile elde etmişlerdir. Polimerizasyon sek- amin (benzilamin) grubuna oksitleyici olmayan fenolik parça içerdiğini gözlemlemişlerdir. HRP enzimi kullanarak BAP monomerlerinin kemoselektif polikondenzasyonla yan zincir üzerinden sek-aminin işlevselliği ile polifenol elde etmişlerdir. Reaksiyon şartlarında çözücü sistemi, pH ve sıcaklık gibi çeşitli faktörlerin etkisini araştırmışlardır. Polimerizasyonu, çözücü olarak etanol ve pH=5 fosfat tamponu içerisinde en yüksek verimle (%63) elde etmişler ve moleküler ağırlığını Mn: 5000 g/mol, polimerizasyon derecesini DP≈25 civarında 25 ℃’de 24 saaat hava altında HRP enzimi kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Oligomerlerin karakterizasyonu için UV-Vis, CV, FT- IR, TGA, GPC, 1H-NMR ve 13C-NMR gibi yöntemleri kullanmışlardır. 1H-NMR ve FT- IR sonuçları ile oligo(BAP)’ın fenolik –OH uç grupları içerdiğini tespit etmişlerdir.
Oligomerin fenilen ve oksifenilen tekrar birimlerinden oluştuğu ve CHCl3, 1,4-dioksan, DMF, THF ve DMSO gibi yaygın organik çözücülerde yüksek derecede çözünür olduğunu gözlemlemişlerdir. Oligo(BAP)’ın termogravimetrik analiz sonucu T%5 kütle kayıp sıcaklığı 247 ℃, T%50 kütle kayıp sıcaklığı 852 ℃ olarak bulunmuş ve termooksidatif bozunmaya karşı dirençli olduğunu kanıtlamışlardır (Yıldırım vd., 2016).
Khosravi ve arkadaşları, dendritikmakromolekül ile HRP enzimini yeniden yapılandırmış ve katalizör olarak kullanarak, poli(2,5-dimetoksianilin) (PDMA)’nın sentezini gerçekleştirmişlerdir. PDMA’nın fiziksel özelliklerini, reaksiyon ortamındaki bileşenlerinnasıl etkilediğini açıklamak için UV-Vis, GPC ve iletkenlik ölçümleri gibi
analiz yöntemlerini kullanmışlardır. FT-IRve UV-vis analizleri sonucunda PDMA’nın emeraldintuz formunun oluştuğunu doğrulamışlardır. Nano yapılı PDMA’yı HRP ve demir klorür çift katalizörlü sistemi kullanılarak oksidatifpolimerizasyon yöntemi ile sentezlemişlerdir. Taramalı elektronmikroskobu görüntüleri (SEM) incelenerek reaksiyon sıcaklığının artmasıyla çubuk benzeri nano yapıların sentezlendiğini tespit etmişlerdir (Khosravi vd., 2013).
Şekil 1.5. HRP dendrozim ile DMA’nın enzimatik polimerizasyonu (Khosravi vd., 2013)
Krikstolaityte vd. (2013) yaptıkları çalışmada, çevre dostu olan “yeşil” enzimatik reaksiyon ile iletken polimer politiyofeni (PTP) sentezlemişlerdir. PTP’nin oksidatif polimerizasyonu için glikozoksidazın (GOX), glikoz varlığında nötr pH değerin dehidrojen peroksitte etkili bir katalizör olduğunu gözlemlemişlerdir. GOX modifiye edilmiş grafit çubuk elektrot (GRE) ile üzerinde PTP tabakasının enzimatik olarak indüklenmiş oluşumunu göstermişlerdir. PTP tabaka ile GOX modifiye edilmiş elektrotların kaplama için kullanılan polimerizasyon çözeltisini üç ana bileşenden:
Tiyofen, glikoz ve çözünmüş oksijenden oluşturmuşlardır. GOX-modifiye elektrot üzerinde PTP tabakanın enzimatik olarak indüklenen oluşumunu amperometri, ATR-FT- IR ve AFM ile karakterize etmişlerdir. Sonuç olarak, GOx/PTP-modifiye edilmiş GRE’nin görünür kinetik Michaelis sabitinin (KM(app.)) polimerizasyon reaksiyon süresini arttırdığını tespit etmişlerdir. Enzimatik PTP polimerizasyonunun, KM(app.) ve GOX
temelli glikoz biosensörlerdeki diğer kinetik parametrelerde de uygulanabileceğini tespit etmişlerdir (Krikstolaityte vd., 2013).
Zhang vd. (2013) fenolün enzimatik polimerizasyonunu sodyum dodesilsülfat (SDS) içeren pH=7 fosfat tamponunda, HRP enzimi katalizörlüğünde gerçekleştirmişlerdir.
Elde edilen polimerin kısmen aseton, THF ve DMF gibi çözücüler içinde çözündüğünü gözlemlemişlerdir. IR analizleri sonucunda polimerin fenilen ve oksifenilen birimlerinden oluştuğunu belirlemişlerdir. Makalede fenol polimerini epoksi kloropropan ve trietilen-tetramin ile fonksiyonlandırarak çözünmeyen amin fenol polimeri elde etmişlerdir. Aminlenmiş fenol polimerini, Heck reaksiyonu için yeni bir taşıyıcı olan paladyumkatalizörünü (PP-N-Pd) hazırlamak için gerekli olduğunu tespit etmişlerdir. PP- N-Pd, akrilik asit ya da stiren ile ariliyodürlerin Heck reaksiyonu için katalitik etki gösterdiğini ve trans-ürün veriminin %90’dan daha yüksek olduğunu gözlemlemişlerdir.
Uygun koşullarda, arilbromürler ve aktive edilmiş arilkloritleri de aklenler ile reaksiyona sokmuşlar ve %80'in üzerinde birverimgösterdiğini bulmuşlardır. XPS analizleri sonucunda, PP-N-Pd içinde ana koordinasyon atomunun N ve PP-N-Pd içinde paladyumun kimyasal değerinin Pd2+ olduğunu göstermişlerdir. Bunların sonucunda yeni geliştirilen katalizörün, Heck reaksiyonu için iyi bir geri dönüşüm gösterdiğini tespit etmişlerdir (Zhang vd., 2013).
OH
O
O
O O
CH2Cl
NaOH
H2C O
O
O H2C C
H OH
CH2 HN(CH2CH2NH)3H
H2N(CH2CH2NH)3H
(PP-N)
O
O H2C C
H OH
CH2 HN(CH2CH2NH)3H
(PP-N-Pd) Pd
PdCl2
Şekil 1.6. PP-N-Pd sentezi (Zhang vd., 2013)
Kawakita (2012) yaptığı çalışmada; paladyum, platin, altın gibi değerli metalleri geri kazanmak için fenol türevlerinin HRP kataliziyle enzimatik polimerizasyonu yöntemini kullanmıştır. HPR katalizli polimerizasyon ile iyi çözünebilen, oksidasyon ve iyon değişim yeteneğine sahip poli(tiramin)’i sentezlemiştir. Ardından paladyum ve platinyum iyonlarını poli(tiramin) üzerinde, altın iyonlarını ise pH=2-5 aralığında hidroksil grupları üzerinde adsorbe etmiştir (Kawakita, 2012).
OH OH O
n H2O2 H2O
n HRP
NH2 NH2 NH2
Şekil 1.7. Poli(tiramin)’in sentezi (Kawakita, 2012)
1.3 Çalışmanın Amacı
Bu çalışmada ilk önce literatürde enzimatik oksidatif polimerizasyon yöntemi olarak bilinen yöntem için yeni tip fenol türevi bir monomer sentezlenmiştir. Bu monomerin enzimatik oksidatif polimerizasyon yöntemiyle polimerleşme şartları araştırılmış ve optimum şartları belirlenmiştir. Elde edilen ürünlerin karakterizasyon işlemleri FT-IR, UV-Vis, 1H-NMR, 13C-NMR, TGA, DSC ve GPC cihazlarıyla yapılmış ve literatüre enzimatik oksidatif polimerizasyon yöntemiyle yapılmış malzemeler olarak kazandırılmıştır.
Bunun yanı sıra üretim sırasında H2O2 ve enzim katalizör kullanılacak olması ortamda atık olarak sadece su açığa çıkacağından reaksiyonu çevre dostu hale getirmektedir. Bu bağlamda çevre dostu bir polimerleşme gerçekleştirerek toksik ve kanserojen etkili kimyasal malzemelerin polimer sentezlerinde katalizör olarak kullanımını azaltılmış olacaktır.
2 BÖLÜM II
2 GENEL BİLGİLER 2.1 Basamaklı Polimerizasyon
Basamaklı polimerler; kondensasyon, üretan oluşumu, Diels-Alder katılması, Friedel- Crafts tepkimeleri gibi tepkimelerle sentezlenebilir. Kondensasyon polimerizasyonu basamaklı polimerlerin laboratuarlarda sentezine veya ticari üretimine en uygun polimerleşme tepkimelerdir. Bu nedenle basamaklı polimer yerine çoğu zaman kondensasyon polimeri, basamaklı polimerizasyon yerine ise kondensasyon polimerizasyonu denilmektedir (Saçak, 2010).
Basamaklı polimerleşme reaksiyonunun gerçekleşmesi için tepkimeye giren monomer veya monomerlerde en az iki farklı fonksiyonel grup bulunmalıdır. Kondensasyon tepkimesi; OH, COOH, NH2 gibi fonksiyonel gruplar taşıyan iki ayrı molekülün birleşmesi sonucunda H2O, HCl, NH3 gibi küçük moleküllerin ayrılmasıdır. Fonksiyonel grup ise bir molekülün kimyasal tepkimelerde yer alan kısmıdır (Basan, 2001; Saçak, 2010).
Monofonksiyonel bir alkol olan etil alkol ve yine monofonksiyonel bir asit olan asetik asit,
CH3 CH2 O H + HO C
O
CH3 CH3 CH2 O C
O
CH3
etanol asetik asit etil asetat
-H2O
Şekil 2.1. Kondenzasyon tepkimesi ile etil asetat oluşumu (Saçak, 2010)
şeklinde ilerleyen kondensasyon tepkimesiyle etil asetat oluşur (Şekil 2.1.). Tepkime sırasında bir su molekülü açığa çıkar. Ürün olan etil asetatın üzerinde tepkimeye girebilecek fonksiyonel grup kalmadığı için tekrardan etanol veya asetik asitle etkileşime girmez.
Alkol veya karboksilik asitten birisi bifonksiyonel seçilirse, örneğin etil alkol yerine etilen glikol kullanılırsa, yukarıda verilen kondenzasyon tepkimesi bir adım daha ilerler (Şekil 2.2.).
HO CH2 CH2 OH
HO C CH3
O
-H2O
HO CH2 CH2 O C CH3
O
HO C CH3
O -H2O
CH3 C O
O
CH2 O C CH3
O
etilen glikol
etilen glikol diasetat
Şekil 2.2. İki adımda ilerleyen kondenzasyon tepkimesi (Saçak, 2010)
Tepkimeyle daha yüksek mol kütleli bir ester olan etilen glikol diasetat elde edilmiştir.
Ancak, etilen glikol diasetatta da ileri kondenzasyon tepkimesine girebilecek fonksiyonel grup bulunmamaktadır ve tepkime bu adımdan öteye gidemez.
Çıkış maddelerinin her ikisinin de bifonksiyonel seçilirse (diol ve dikarboksilik asit gibi) her bir tepkime adımında oluşan yeni molekül iki fonksiyonel grup taşıyacaktır. Bu fonksiyonel grupların her ikisi OH veya COOH olabileceği gibi birisi OH diğeri
COOH olabilir. Böyle bir molekül kondensasyonu sürdürebilir ve sonuçta yüksek mol kütleli polimer (poliester) sentezlenir (Şekil 2.3.).
n HO R OH + n HO C O
R' C
O
OH
- (2n-1) H2O
H O R O C R' C OH
O O
diol
dikarboksilik asit
poliester
n
Şekil 2.3. Yüksek mol kütleli poliesterin sentezinin genel gösterimi (Saçak, 2010)
Etilen glikol ve teraftalik asit (veya dimetil teraftalat) arasındaki polikondensasyon tepkimesinin ürünü, önemli bir ticari poliester olan poli(etilen teraftalat) dır (Şekil 2.4.).
HO CH2 CH2 OH
etilen glikol
n + n HO C C OH
O O
- (2n-1) H2O
teraftalik asit
O CH2 CH2 O C C OH
O O
H
n
poli(etilen teraftalat) (PET) (poliester)
Şekil 2.4. Kondenzasyon tepkimesi ile poli(etilen tetraftalat) sentezi (Saçak, 2010) Naylon olarak bilinen poliamitler, diaminlerle dikarboksilik asitlerin kondensasyonundan elde edilir. Naylon 6–6 adı verilen poli(hekzametilen adipamit), hekzametilen diamin ve
adipik asit arasındaki polikondensasyonundan sentezlenir. Naylon 6–6 ilk sayı diaminin, ikincisi dikarboksilik asitin karbon sayısını gösterir (Şekil 2.5.).
n H2N (CH2)6 NH2 + n HO C (CH2)4 C OH
O O
- (2n-1) H2O
(CH2)6 NH C (CH2)4 C OH
O O
H NH
n hekzametilen diamin
adipik asit
poli(hekzametilen adipamit) (naylon 6-6)
(poliamit)
Şekil 2.5. Kondenzasyon tepkimesi ile naylon 6,6 sentezi (Saçak, 2010)
Yukarıdaki poliester ve poliamit sentez tepkimelerinde, farklı fonksiyonel gruplar taşıyan iki ayrı molekülden polimere geçilmiştir. Polikondensasyon tepkimeleri, kondensasyon tepkimesine girebilecek iki fonksiyonel grubu birlikte taşıyan bir molekülle de gerçekleştirilebilir.
Amino asitlerin bir türü olan glisinin üzerinde karboksil ve amin grupları bulunur. Glisin, bu grupların katıldığı kondensasyon tepkimesiyle polimerleşerek poliglisin verir.
n H2N CH2 C OH O
- (n-1) H2O
HN CH2 C OH
O H
glisin n
poliglisin
Şekil 2.6. İki farklı fonksiyonel grubu birlikte taşıyan monomerin kondenzasyon tepkimesi ile polimer oluşumu
Kondenzasyon polimerizasyonda zincir büyümesi adım adım ve yavaştır. Glisinin polimerizasyonundaki ilk tepkime, iki glisin molekülünün birleşmesidir. Ardından bu molekül glisin molekülü veya kendisi gibi bir başka molekül ile tepkimeye girebilir. Buna
kısa bir süre sonra ortamda monomer kalmaz fakat yüksek mol kütleli ürün ancak polimerizasyonun sonlarına doğru elde edilir (Saçak, 2010).
Şekil 2.7. Katılma polimerizasyonu ve basamaklı polimerizasyonda mol kütlesinin zamanla değişimi (Saçak, 2010)
Kondenzasyon polimerizasyonunda zincir boyunca bazı temel kimyasal bağlar yinelenmektedir. Örneğin poli(etilen teraftalat)’ta ester, naylon 6,6 ve poliglisinde amit bağları yinelenen kimyasal bağlardır.
2.2 Katılma Polimerizasyonu
Katılma polimerizasyonunda monomer molekülleri, polimer zincirlerine birer birer ve hızla katılırlar. Hızlı zincir büyümesinden dolayı tepkimeninher aşamasındaortamda yüksek mol kütleli polimer ve tepkimeye girmemiş monomer bulunur (Saçak, 2010).
Katılma polimerizasyonunun gerçekleşmesi için monomerin en az bir çift bağ içermesi gerekir. Bu çift bağ herhangi bir dış etki ile kırılarak monomer serbest radikal veya iyona dönüşür. Bu serbest radikal veya iyonlar birbirleriyle tepkimeye girerek katılma polimerizasyonu tepkimesini verirler (Basan, 2001).
Polimerizasyon ortamında farklı kimyasal ya da fiziksel yöntemler kullanılarak serbest radikaller oluşturulabilir. Örneğin, benzoil peroksit (BPO) ve azobisizobütironitril
(AIBN) gibi bazı organik maddeler ısı etkisiyle serbest radikaller verecek şekilde bozunurlar.
Ticari polimerlerden polistiren, radikalik katılma polimerizasyonuna yatkın bir monomer olan stirenin katılma polimerizasyonundan elde edilir. Stirenin toluende hazırlanan çözeltisine az miktarda benzoil peroksit katılır (monomere göre kütlece yaklaşık %1) ve karışım 70–80 ℃ sıcaklıkta ısıtılırsa; benzoil peroksit parçalanır ve iki benzoil oksi radikali verir (Şekil 2.8.).
C O O C
O O
C O
O 2
benzoil peroksit benzoil oksi radikali
Şekil 2.8. Benzoil peroksit’in bozulması ile oluşan benzoil oksi radikali (Saçak, 2010)
Benzoil oksi radikali (R) monomerin -elektronlarının birisi üzerinden monomerle birleşerek ilk monomerik radikali oluşturur. Bu yeni radikalik aktif merkez ikinci bir monomeri benzer şekilde yapısına katar ve polimerizasyon monomerlerin radikalik aktif zincire art arda katılmasıyla ilerler.
Basamaklı polimerizasyonda polimerizasyon ortamında bulunan her boydaki molekül birbirleri ile tepkimeye girerek zinciri büyütebilir. Katılma polimerizasyonunda ise büyüme yalnızca aktif zincirler ve monomer molekülleri arasındadır.
Polimerizasyon ortamındaki bazı tepkimeler aktif zincirlerin sonlanmasına neden olabilir.
Örneğin, aktif iki zincir radikaller üzerinden birleşerek sonlanabilir böylece monomer katma yeteneği bulunmayan ölü polimer zincirine dönüşebilir. Bir zincirden diğerine bir atomun aktarılması (genelde hidrojen atomu) bir başka sonlanma türüdür.
Doymamış bağlar bulunduran olefinler (alkenler), asetilenler, aldehitler veya diğer benzeri bileşikler katılma polimerizasyonuyla polimerleşmeye yatkın kimyasallardır.
R.
CH CN
R CH2 C .
H
Serbest CN
radikal Monomer (Akrilonitril)
CH2 C
CN H
C H
CN CH2 H2C
R
CH2 C CN H
CH2 C H
CN
CH2 C. CN H
Büyümekte olan polimer zinciri (Radikalil aktif zincir)
C H
CN H2C
n Polimer (poliakrilonitril) H2C
C H
CN
R
ilk monomerik aktif merkez
Şekil 2.9. Radikalik katılma polimerizasyonunun ilerleyişi (Akrilonitrilin polimerizasyonu örnek alınmıştır) (Saçak, 2010)
Katılma polimerizasyonu iyonik karakterdeki aktif merkezler üzerinden deilerleyebilir.
Bu tür polimerleşmeye iyonik katılma polimerizasyonu adı verilmektedir. İyonik katılma polimerizasyonu zincir büyümesini sağlayan aktif merkezin türüne görekatyonik ve anodik katılma polimerizasyonu olarak ikiye ayrılır.
Katyonik polimerizasyon (Şekil 2.10.), zincir büyümesinin katyonik merkez (genellikle karbonyum) üzerinden yürüdüğü iyonik polimerizasyon türüdür.
H2C C R
R
+ HA H3C C
R
R A
Şekil 2.10. Katyonik polimerizasyon (Saçak, 2010)
Anyonik polimerizasyon (Şekil 2.11.) zincir büyümesinin anyonik merkez (genellikle karbanyon) üzerinden yürüdüğü iyonik polimerizasyon türüdür. Anyonik polimerizasyonu başlatabilen bileşiklerden birisi n-bütil lityumdur. n-bütil lityumun bütil kısmı, monomer molekülüne katılarak ilk anyonik aktif merkezi oluşturur.
H2C C
H
R
+ n-C4H9 Li C4H9 CH2 C
H
R
n- Li
Şekil 2.11. Anyonik polimerizasyon (Saçak, 2010)
İyonik polimerizasyon tepkimesine giren monomer molekülleri katyonik ve anyonik aktif merkezlere art arda katılırlar ve aktif polimer zincirlerine dönüşürler (Saçak, 2010).
Basamaklı ve katılma polimerizasyonu arasındaki farklar Çizelge 2.1.’de verilmiştir.
Çizelge 2.1. Basamaklı ve katılma polimerizasyonu arasındaki farklar Basamaklı polimerizasyon Katılma polimerizasyon Ortamda bulunan herhangi iki molekül
tepkimeye girerek zinciri büyütür.
Yalnız aktif polimer zincirlerine monomer katılırsa zincir büyür.
Önce iki molekül tepkimeye girer ve dimer oluşturur; dimer, monomerlerle tepkimeye girerek trimeri oluşturur ve zincirler bu şekilde büyümeye devam eder.
Monomerler hızla aktif merkezlere art arda katılır.
Polimerizasyon süresince polimerin mol kütlesi sürekli artar.
Yüksek mol kütleli polmer polimerizasyonun ilk adımlarında oluşur.
Tepkime süresice polimerin mol kütlesi fazla değişmez.
Yüksek mol kütlesi için uzun polimerizasyon süresi gerekir.
Yüksek dönüşümler için uzun polimerizasyon süresi gerekir, ancak bu sürenin polimerin mol kütlesi üzerine etkisi önemsizdir.
Polimerizasyon süresince polimerizasyon ortamında her büyüklükte polimer zinciri vardır.
Polimerizasyon süresince ortamda monomer, yüksek mol kütleli polimer ve büyüyen aktif zincirler bulunur.
Polimerizasyon ortamındaki her molekül
türü birbiriyle tepkimeye girebilir. Yalnız radikalik türler birbirleriyle veya diğer moleküllerle tepkimeye girebilir.
Polimerizasyon belli bir süre ilerledikten sonra ortamda çıkış maddesi (veya monomer) kalmaz ve Dp=10 olduğunda başlangıçta alınan çıkış maddesinin ancak
%99’u harcanır.
Monomer her zaman ortamda bulunur ve derişimi tepkime süresince azalır.
2.3 Enzimler
Enzimler kendileri değişime uğramadan bir reaksiyonu hızlandıran biyokimyasal katalizörlerdir. Enzimlerin hemen hepsi protein yapısındadır. Ancak, proteinlerin hepsi enzim değildirler. Ayrıca her enzim sadece bir çeşit reaksiyonu katalizleyebilir (Geçkil, 2012).
Enzimin tanımını oluşturan önemli özelliklerini maddeler halinde özetlersek;
1. Canlı hücreler tarafından sentezlenen maddelerdir.
2. Etki gösterebilmek için hücreye gereksinim duymazlar, in vitro ortamda da etki gösterirler.
3. Isıya dayanıksız maddelerdir, yüksek ısı ile bozulurlar.
4. Protein yapısındadırlar ve proteinler gibi primer, sekonder, tersiyer ve kuarterner yapıları vardır.
5. Biyolojik reaksiyonu hızlandırırlar (Güneş vd., 2013).
Enzimler biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen özel proteinlerdir. Reaksiyon hızını 106-1010 kat hızlandırırlar. Bütün biyolojik reaksiyonlar enzimler tarafından katalizlenir, bu nedenle farklı amaçlar için çok sayıda enzim görev yapar. Enzimle katalize olan bir reaksiyonda, enzimin etki edip bir ürüne (P) çevirdiği maddeye substrat (S) denir (Şekil 2.12.). Her enzimin spesifik bir substratı vardır. Enzim ile substrat arasındaki komplekseenzim-substrat kompleksidenir (Geçkil, 2012).
Şekil 2.12. Enzimatik reaksiyon mekanizması
2.3.1 Enzimlerin sınıflandırılması
Enzimler, Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Birliği tarafından katalizledikleri reaksiyon tipine göre altı grupta sınıflandırılmıştır (Miletić vd., 2012).
Enzimlerin sınıflandırılması Çizelge 2.2.’de gösterilmiştir.
Çizelge 2.2. Enzimlerin sınıflandırılması Enzim sınıfı
Canlı sistemlerdeki biyokimyasal
fonksiyonu
Tipik
enzimler Tipik polimerler
Oksidoredüktazlar
Oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarını
katalizlerler
Peroksidaz, Lakkaz
Polianilinler, Polifenoller, Polistiren,
Polimetil metakrilat
Transferazlar
Fonksiyonel bir grubun bir molekülden diğer bir moleküle transferini katalizlerler
PHA sentetaz, Hiyalüronik asit sentetaz, Fosforilaz
Poliester
Hiyalüronik asit Amiloz
Hidrolazlar Suyla hidroliz
reaksiyonunu katalizler
Selülaz, Kitinaz, Ksilanaz, Papain, Lipaz
Selüloz, Kitin, Ksilan,
(oligo)peptitler, Poliesterler, Polikarbonatlar Liyazlar Çift bağ yapar veya
kırarlar İzomerazlar Molekülleri
izomerlerine çevirirler Ligazlar ATP ile bağ oluşumunu
katalizlerler
Cyanophycin
sentetaz Cyanophycin
Biokatalitik radikalik polimerizasyonda genellikle iki enzim sınıfı kullanılmaktadır.
Bunlar peroksidazlar ve lakkazlardır. Bugüne kadar radikalik polimerizasyonun başlatılmasında özellikle yaban turpu peroksidaz (HRP) ve soya fasulyesi peroksidaz (SBP) sık sık kullanılmıştır (Hollmann ve Arends, 2012).
2.4 Horseradish Peroksidaz (HRP)
Horseradish ya da yabanturpu dünyanın ılıman bölgelerinde yetiştirilen çevre şartlarına dayanıklı bir bitkidir. Yabanturpu peroksidaz ise bu bitkinin kökünden elde edilen, yüzyılı aşkın bir süredir üzerinde çalışılan ve heme-içeren önemli bir enzimdir.
Yabanturpu peroksidaz terimi genel olarak kullanıldığı halde bitkinin kökü birkaç tane farklı peroksidaz izoenzimi içermektedir. Bunlardan en yaygın olanı HRP C izoenzimidir.
Şekil 2.13.’de HRP enziminin üç boyutlu molekül yapısı gösterilmiştir (Veitch, 2004).
Şekil 2.13. HRP enziminin üç boyutlu molekül yapısı (Veitch, 2004)
HRP enzimi, bir heme grup (demir(III) protoporfirin IX) ve iki kalsiyum atomundan oluşan iki farklı metal merkeze sahiptir. Heme grup, dört pirol halkasından oluşan bir porfirin halkasının ortasında sıkıca tutulan demir atomuna sahip düzlemsel bir yapıdır.
Şekil 2.14.’de dinlenme durumunda heme grubunun yapısı gösterilmiştir (Veitch, 2004).
Şekil 2.14. Dinlenme durumunda heme grubu (L genellikle histidin ligandıdır) (Veitch, 2004)
Demir, heme grup düzleminin altında ve üstünde iki açık bağlanma yerine sahiptir. Heme grup, histidin yan zincirinde bulunan azot atomu ve demir atomu arasındaki koordinasyon bağı ile enzime bağlanmıştır (Azevedo vd., 2003; Veitch, 2004). Diğer kısım dinlenme durumunda boştur ve aktivasyon sırasında oksijen atomu bu boş yere bağlanabilmektedir.
Demir atomunun altıncı oktahedral pozisyonu enzimin aktif merkezi olarak kabul
3 BÖLÜM III
3 MATERYAL VE METOT
3.1 Materyal
3.1.1 Kullanılan kimyasal maddeler
Çalışmada kullanılan bütün kimyasallar analitik saflıkta olup Merck firmasından temin edilmiştir.
DMF, DMSO, DCM, THF, aseton, metanol, etanol, su, kloroform ve 1,4-dioksan sentezlenen polimerin çözünürlük testinde kullanıldı.
3.1.2 Kullanılan alet ve cihazlar
3.1.2.1 1H ve 13C Nükleer manyetik rezonans (1H ve 13C NMR )
Erciyes Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezinde Bruker 400 cihazıyla gerçekleştirildi.
3.1.2.2 Infrared spektrumları (FT-IR)
Erciyes Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezinde Perkin Elmer Spectrum 400 cihazıyla gerçekleştirildi. Spektrum çekimlerinde ATR özellikli cihaz iledirekt çekim yapıldı.
3.1.2.3 Ultraviyole görünür bölge spektrumları (UV-Vis)
Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Polimer Kimyası Araşırma Laboratuvarında kullanılan Shimadzu MultiSpec 1501 UV cihazıyla gerçekleştirildi.
3.1.2.4 GPC analiz çalışması
GPC analizleri Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü polimer araştırma laboratuarında bulunan Perkin Elmer Marka cihaz ile yapılmıştır.
3.1.2.5 TGA/DTA
Termogravimetrik analiz (TGA) ve diferansiyel termal analizler (DTA) Pamukkale Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünde bulunan Shimadzu DTG–60 cihazında gerçekleştirildi. Analizler 100 ml/dak akış hızında gerçekleştirilmiştir. DTA ve TGA ölçümleri için 10oC/dak. ısıtıma hızı ile 1000 ℃’ye kadar ısıtma sağlanmış ve alümina kroze kullanılmıştır.
3.2 Metot
3.2.1 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol (MPIMP) sentezi
Monomerin sentezi magnetik iki boyunlu 250 mL’lik balonda geri soğutucu altında karıştırıcılı ısıtıcı üzerinde yağ banyosu içinde yapıldı. 1,23 g (10 mmol) 4-metoksianilin ve 1,22 g (10 mmol) 2-hidroksibenzaldehit 50’şer mL etanol içerisinde çözülerek reaksiyon ortamına ilave edilmiştir. Daha sonra karışım oda sıcaklığında 5 saat reflaks edilmiştir. Ürünü saflaştırmak için hekzan/aseton (9:1) çözücü sisteminde flash kolon kromatografisi (SiO2 kolon, diklorometan çözücü) uygulanmıştır. Daha sonra ürün etüvde 60 ℃ kurutulmuştur. (MPIMP)’ün reaksiyon şeması Şekil 3.1.’de verilmiştir (Turaç ve Şahmetlioglu, 2010).
Şekil 3.1. 2-[(4–metoksifenilimino)metil]fenol’ün sentez şeması
