400100710011-Bitki Hücre Biyolojisi
Prof. Dr. Ali ERGÜL
Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü
http://biotek.ankara.edu.tr/
HAFTA-1 Bitki Hücre Biyolojisine Giriş-Bitki Hücre Biyolojisinde Temel Kimya Prensipleri HAFTA-2 Biyomoleküller
HAFTA-3 Hücresel Membranların Yapısı ve Fonksiyonları, Subcellular (Hücre içi) Organellerin Yapısı ve Fonksiyonları
HAFTA-4 Biyomoleküllerin Membranlar Arası Hareketi-I HAFTA-5 Biyomoleküllerin Membranlar Arası Hareketi-II HAFTA-6 Bitkilerde Mitoz-Mayoz Bölünme
HAFTA-7 Mendel Genetiği-I HAFTA-8 Mendel Genetiği-II HAFTA-9 Protein Sentezi-I HAFTA-10 Protein Sentezi-II
HAFTA-11 Kloroplast, Mitokondriyal Protein Sentezi HAFTA-12 Fotosentez
HAFTA-13 Bitki Hormonları HAFTA-14 Sinyal İletimi
HAFTA 11: KLOROPLAST,
MİTOKONDRİYAL PROTEİN
SENTEZİ
Bitki Organelleri Genomlarının Ekspresyonu
• Bitkilerde kloroplast ve mitokondri kendi genomlarını içermekte olup genomları ile ilişkili polipeptidleri kodlamaktadırlar.
• Her iki genom da yarı bağımsız olup nüklear genom tarafından
kodlanan polipeptidlerin birçoğu organellerin yapısı için gereklidir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Yüksek bitkilerde kloroplast genomu halkasal yapıda 120-160 kbp büyüklüğünde olup yaklaşık 130 gen içermektedir. Bu genlerin ürünlerinin yaklaşık yarısı kloroplast genom ekspresyonu (transkripsiyon/translasyon) ile ilişkili iken 30’u 5 fotosentez alt ünite kompleksleri (fotosistem I, fotosistem II, sitokrom b6F kompleks, ATP sintaz ve ribüloz bifosfat karboksilaz/oksijenaz kompleksi) ile ilişkilidir.
• Kloroplast genomunda büyük intergenik bölgeler bulunmakta ve 20- 21 ORF tarafından kodlanan polipeptidlerin fonksiyonu bilinmemektedir. Parazitik bitki olan ‘Epifagus virginiana’ en küçük kloroplast genomuna (71kbp) sahip olup fotosentez ile ilşkili genleri içermemektedir.
• Kloroplastın transkripsiyon ve translasyon makinesi prokaryotlara
benzer birçok özellik taşımaktadır.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Örneğin kloroplast ribozomları 70S büyüklüğünde olup, kloroplast rRNA ve tRNA sekansları E.coli deki yapılarla benzerdir. Kloroplast mRNA’sı 5’ ucunda trifosfatları içerirken poli (A) kuyruğu içermemektedir.
• Kloroplast transkripsiyon ve translasyon komponentlerinin çoğu
nüklear genom tarafından kodlanmaktadır. Kloroplastın genetik
sistemi ile ilgili bilgiler nüklear genom ve kloroplastik genlerin
koordinasyonunu gerektirmektedir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Kloroplast DNA daki ifade arttırıcı bölgelerin sekansları E.coli’ deki ‘- 10’ ve ‘-35’ bölgesindeki korunmuş sekanslar ile benzerdir. Bu promotor sekanslar plastid kodlayan plastid (plastid encoded plastid
=PEP) tarafından tanınmakta ve korunmuş 2 hekzamerik sekanstan (TTGACA ve TATAAT) oluşmaktadır.
• In vitro transkripsiyon sistemlerinde promotorlarında delesyon ya da mutasyona tabi tutulmuş örneklerle yapılan çalışmada ‘-10’ ve ‘-35’ in birçok genin transkripsiyonu için gerekli olduğunu doğrulamıştır.
Kloroplast genlerinin transkripsiyonu DNA bağımlı RNA polimeraz tarafından katalizlenmektedir.
• Kloroplastta çoklu RNA polimeraz aktiviteleri saptanmıştır. Öte yandan
tRNA ları da içeren bazı genler transkripsiyon başlama bölgelerinde
genel prokaryotik promotor sekanslarından yoksundur. Örneğin rps16
geninde ‘-10’ daki motif bulunurken ‘-35’ teki motif bulunmamaktadır.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Ayrıca ‘-10’ ve ‘-35’ ten başka promotor sekansları NEP promotorları (nüclear encoded chloroplastic RNA polymerases) da belirtilmektedir.
Bu promotorlar transkripsiyon başlama bölgeleri çevresinde kısa korunmuş sekanslara sahiptir.Çoklu transkripsiyon başlama bölgeleri özellikle kloroplast genleri psbD, atpB’da bilinmektedir.
• PEP faktörleri çekirdek tarafından kodlanmakta ve PEP in yanısıra kloroplast çekirdek tarafından kodlanan RNA polimeraz (nuclear encoded RNA polymerases =NEP) içermektedir.
• Arabidospsis kloroplastında en az 2 NEP bulunmaktadır. NEP’ ler mitokondriyal RNA polimerazlar ile ilişkilidir.
• Genellikle çekirdek tarafından kodlanan RNA polimerazlar plastid
gelişiminin erken döneminde bulunurken, fotosentez ile ilişkili genlerin
transkripsiyonunda ise kloroplast tarafından kodlanan RNA
polimerazlar bulunmaktadır.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Birkaç kloroplast geni monositronik olarak transkripsiyona uğrasa da, polisitronik olan pre-RNA lar fotosentez, transkripsiyon ve translasyon gibi fonksiyonlarla ilişkili proteinler ya da tRNA ile ilgili mesajları içermektedir. Kloroplast polisitronik pre-RNA ları üst üste çakışan kısa RNA lar içerisinde işlenmiştir.
• Kloroplasttaki transkripsiyon seteri çoklu 5’ sonlarını içerebilmektedir. Aynı mRNA üzerinde farklı 5’ sonlanmalar mRNA’
nın farklı stabilizasyonunu ve translasyon kontrolünün sağlamaktadır. Arpada 5’ ucunda 35 ek nükleotid içeren rbcl’ye alternatif transkript birikmektedir.
• Bu ilave sekans 16S RNA’nın 3’ ucundaki komplementer sekansa
homoloji göstermektedir. rbcl ve 16S RNA arasındaki intramoleküler
kompleksin farklı formları ile rbcl’nin translasyonu
engellenebilmektedir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Birkaç kloroplast geni intronlarla bölünmektedir. Tütün kloroplast genomunda 18 gen intron içeriyor olup (503-2526 bp uzunluğunda) bu genlerin 6’sı tRNA, 12’si ise protein kodlama ile ilişkili genlerdir.
• Çoğu intron karakteristik olarak grupII intron sınıfına benzer evrimsel olarak korunmuş ikincil yapıya sahiptir. Kloroplast grupII intronları korunmuş 5’ GTGYGRY... RYCNAYYYYTAY-3’
sekanslarını içermekte ve kısmen çekirdek pre-RNA intronlarına benzemektedirler.
• GrupII intronlarında kendi siplayzing (self-splyzing) gözlenmemiştir.
Bu durum kloroplastik transkritlerin splayzing mekanizması için
nüklear transkriptlerde olduğu gibi RNA-protein interaksiyonlarının
varlığının gerektiğini göstermektedir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Yüksek bitki organellerinin mRNA ları RNA düzenlemesi (RNA editing) olarak bilinen başka bir posttranskripsiyonel prosese tabi tutulurlar.
Kloroplastta bu durum ilk olarak mısır rpl2 transkriptinde tanımlanmıştır.
Rpl2 transkriptinde AUG (Met) başlama kodu ACG(Thr) kodonundan oluşturulmaktadır (C den U ya geçiş ile). Plastidlerde RNA düzenleme pre-mRNA proseslerinin erken bir evresinde gerçekleşmektedir.
• Bir türde RNA düzenlemesi yapılan transkript farklı bir türdeki doğru DNA nükleotidini içerebilmektedir. Örneğin; psbF mRNA sı ıspanak plastidlerinde serin kodonunun fenilalanine değiştirilmesiyle düzenlenirken tütünde ise DNA düzeyinde fenilalanin kodunu bulunmaktadır.
• Düzenleme mekanizmasında düzenlenecek bazların nasıl özelleştirildiği henüz tam olarak bilinmemekle birlikte düzenleme yapılacak bölgedeki sınır sekanslarının oldukça önemli olduğu belirtilmektedir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Kloroplast RNA larının kararlı durumu büyüme dönemlerinde, çevresel uyarıcılar ve sirkadiyan ritimlerle dalgalanarak değişir.
Genel olarak fotosentez ile ilişkili proteinler yeşil dokularda depolanmakta iken plastidlerde ve fotosentetik olmayan dokularda (aminoplast–kromoplast) depolanma oranları düşüktür. Kloroplast transkriptlerinin kararlı durumu transkripsiyonel aktivite ve ya belirli transkriptlerin stabilizasyonuyla düzenlenmekte ve büyük ölçüde ışıktan etkilenmektedir.
• Kloroplastta degredasyon için transkriptlerin poliadenilasyon ile
işaretlendiği gösterilmektedir. Poliadenilasyon transkriptleri kararsız
kılmaktadır. Bunun sonucunda belirli transkriptlerin kararlı durumları
kloroplasttaki transkripsiyon oranından ziyade stabiliteyi sağlayan
transkripsiyon faktörleriyle düzenlenmektedir.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Kloroplast RNA larının kararlılığı türden türe değişmekle birlikte kloroplast gelişimi ve çevresel koşullara bağlıdır. Kloroplast mRNA’
larının çoğu 3’ UTR bölgelerinde katlanıp ilmek şekli verebilen ters tekrar bölgeleri içermektedir.
• Bu ters çevrilmiş tekrar bölgelerinin prokaryotlarda transkripsiyonu durdurucu fonksiyonları bilinmektedir.
• Fakat bu sekansların transkripsiyonu durdurucu özelliğinden öte işleme sinyalleri olarak görev yaptıkları gösterilmiştir.
• Ters çevrilmiş tekrar bölgesi içeren pre-RNA 3’ ekzonükleazlar ile 3’5’ yönünde işlenmektedir.
• Çekirdek tarafından kodlanan farklı polipeptidlere bağlanabilen 3’
uçtaki ilmek yapısının işlenmesi transkripte kararlılık sağlamaktadır.
Kloroplast Genom Ekspresyonu
• Bu çekirdek faktörleri RNA bağlanma proteinleri (RNA bindig proteins=RNPs) olup pre-RNA nın siplayzing ve/veya işlenmesini içermektedir.
• Tütünde bu şekilde 5 protein izole edilmiş ve bu proteinlerin ilmeğe bağlanması için 4 domaini olduğu belirlenmiştir. Bu domainler, transit peptid, asidik amino terminal domain ve korunmuş 2 RNA bağlanma domainidir. RNA bağlanma domainin 80 aminoasidi RNA bağlanma domaini korunmuş sekans tipi (consensus sequence type RNA binding domain=CS-RBD) ailesine ait olup RNA bağlayıcı özelliktedir.
• Çekirdek tarafından kodlanan RNA bağlayıcı proteinler farklı birçok
bitkiden izole edilmiş 5’ veya 3’ UTR ye olan bağlayıcı özellikleri
belirlenmiştir. Bu polipeptidler sadece transkriptin dayanıklılığını
sağlamayıp 5’ UTR ye bağlandıktan sonra translasyon aktivatörü
olarak görev yapmaktadırlar.
Mitokondriyal Genom Ekspresyonu
• Bitki mitokondriyal genomu insan ve maya mitokondriyal genomu ile karşılaştırıldığında oldukça büyük ve ve çok çeşitli büyüklüklerde olabilmektedir. Büyüklüğü 200 kbp (Solanum tuberosum)’den 2400 kbp (Cucumis melo) ya kadar değişebilmektedir. Bu büyüklükte olan genom da çok yerde bulunan kodlanmayan sekansların varlığı fazladır.
• Kloroplast genomuna kıyasla mitokondriyal genom oldukça komplekstir.
Mitokondriyal genomun kompleksliği kısaca ‘ana daire (master circle’
olarak ifade edilmektedir.
• Ana daire rekombinasyonda aktif olan tekrar bölgeleri içermektedir. Direk tekrarlar arasındaki rekombinasyonlar delesyonlarla sonuçlanmaktadır.
• Bu delesyonlar sonucunda da ‘subgenomic’ moleküller üretilmektedir. Bu moleküllerin bolluğu ise değişkenlik göstermektedir. Çoğu düşük kopya sayısı içermekte ve ‘sublimon’ olarak adlandırılmaktadırlar.
Mitokondriyal Genom Ekspresyonu
• Çeşitli mitokondriyal DNA ların konfigürasyonlarının çeşitliliğinde nüklear genlerin rollerinin olabileceği belirtilmektedir. Mısır rekombinasyonda etkili olan 5 farklı tekrar bölgesi içermektedir. Bu da mısır genomunda çok sayıda ve birbirinden farklı subgenomic ürüne neden olmaktadır. Eğer bu moleküller aktif tekrar bölgelerini de içeriyorsa intra ve inter moleküler rekombinasyona uğrayacaklarıdır. Bu özelliklerden dolayı farklı farklı bitki türleri mitokondriyal genomlarında çok az sayıda korunmuş bölge bulunacaktır.Hatta türlerin içerisinde bile az korunmuşluk veya korunmama durumu mevcuttur.
• Arabidopsiste mt-genomunda 366924 nükleotid sadece 57 tanımlanmış geni kodlamaktadır. Bunlar solunum kompleksi komponentleri olup çoğu bitkinin mitokondriyal genomunda ortak olarak bulunmaktadır.
• Marchantia polymorpha (kızıl yapraklı-vasküler olmayan bitki) da kodlanan peptidler özellikle ribozomal proteinleri içeriyor olup Arabidopsisten daha fazladır.
Mitokondriyal Genom Ekspresyonu
• Mitokondriyal genomun sadece 3’te 1’inde stabil transkriptler görülmektedir. Geri kalanı ise gerekli olmayan, kloroplasttan köken alani kısmen çekirdek ve mitokondriyal sekansların duplikasyonunun bir parçası olarak gösterilmektedir.
• Geniş ölçüde yapılan rekombinasyonlarla mitokondri genomunda intergenik bölgelerde birçok varyasyon olabilmektedir. Mitokondri için gerekli olan birçok gen bağımsız promotorlardan monositronik olarak ifade olmaktadır (atp6, atp9, cytb, cox1, cox2 ve cox3).
• Mitokondriyal transkriptlerin çoğu geni asıl kodlayan bölgenin
uzunluğundan daha fazladır. Transkriptlerin çoğu 3’ ve 5’ uçlarında
yüzlerce nükleotitten oluşan kodlanmayan bölgeler içermektedir.
Mitokondriyal Genom Ekspresyonu
• Transkripsiyon başlama bölgelerinde yapılan çalışmalarla yazılan ilk nükleotid çevresinde korunmuş sekansların varlığı gösterilmiştir. Bitki mitokondriyal promotoru (yaklaşık 18 nükleotid uzunluğunda) kısa ve korunmuş sekans göstremekte (CRTA) ve transkripsiyonun başlama bölgesi üzerine çakışmaktadır.
• Birçok çalışmada bitki mitokondri yapısında farklı promotorların olduğunu göstermiştir. Bazı protein kodlayan genlerin promotorları korunmuş CRTA motifinden farklıdır. Örneğin; monokotil ve dikotillerdeki rRNA genlerinin transkripsiyonunun farklı tipteki tanıma bölgeleri sekansları ile başlatılmaktadır.
• Mitokondriyal genom RNA polimeraz için herhangi bir gen içermemekte çekirdek genomu tarafından kodlanan polimeraz ihtiyaç duyulmaktadır.
Son zamanlarda yapılan çalışmalarda mitokondriyal hedefleri kodlayan genlerden faj T7 tip polimerazın mitokondriye yönlendirildiği gösterilmiştir.
Mitokondriyal Genom Ekspresyonu
• RNA düzenlenmesi (RNA editing) bitki mitokondriyal genleri için karakteristik bir özelliktir. RNA düzenlenmesi ile doğru ORF’ler için gerekli olan C’den U’ya ve U’dan C’ye değişimi içeren motifler düzenlenmektedir.Bu sebeple RNA editing aşaması gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir basamaktır. Buğday mitokondrisinde 19 mRNA'nın 364 pozisyonda RNA editing’e tabi tutulduğu belirlenmiştir.
• Bu zamana kadar en az düzenlenen transkript nad5 (1000 nükleotit başına 5.5 düzenleme bölgesi) iken c-tip sitokrom biyogenezinde görevli orf206 ise en çok düzenlenen (1000 nükleotit başına 67.9 düzenleme bölgesi) transkripttir. Rekombinasyon çalışmaları doğru düzenleme için 5’ uçtan düzenleme bölgesine kadar olan sekansın çok önemli olduğunu göstermiştir.
• Örneğin; mısır rps12 geninde spesifik düzenleme için 5’uçtan düzenleme bölgesine kadar en az 20 nükleotidin bulunması gerekmektedir. Genel olarak bakıldığında ise bu bölgede en az 25 nükleotidin bulunması gerekmektedir.
