ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Lactobacillus İZOLATLARININ PROBİYOTİK FONKSİYONLARI REFERANS ALINARAK RAPD-PCR İLE AYRIMININ YAPILMASI
Kemal KAYAŞLI
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2019
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
Lactobacillus İZOLATLARININ PROBİYOTİK FONKSİYONLARI REFERANS ALINARAK RAPD-PCR İLE AYRIMININ YAPILMASI
Kemal KAYAŞLI
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Özlem OSMANAĞAOĞLU
Laktik asit bakterileri (LAB); bakteriyosin üretimleri ile gıda raf ömrünün uzatılmasındaki biyolojik güvenilirliği, birçok fermente üründe başlangıç kültürleri olarak kullanılmaları, intestinal mikrobiyotanın düzenlenmesi ve geliştirlmesi yoluyla bireyin daha sağlıklı bir yaşam sürmesini sağlamaları ve en önemlisi potansiyel probiyotik özellikler taşımalarından dolayı gıda ve sağlık alanlarında hem bilimsel hem de endüstriyel açıdan önemli bir yere sahiptir. Bu özelliklerden dolayı LAB’nin suş düzeyinde güvenilir tanımlamalarının yapılması oldukça önemlidir.
Çalışmamızda Ankara Üni. Fen Fak. Biyoloji Böl. Mikrobiyal Genetik Laboratuvarı kültür koleksiyonumuzda mevcut Lactobacillus cinsine ait 36 adet suş’n RAPD-PCR tekniği ile genotipik ayrımının yapılması hedeflenmiştir. 36 adet Lactobacillus suşu OPA01, OPA10, OPD03 primerleri üzerinden RAPD-PCR analizine tabi tutulmuştur.
Bant profillerine ait jel görüntülerinden PAST programı kullanılarak her bir primer için ayrı ayrı UPGMA analizi ile dendogramlar oluşturulmuştur. Dendogramlar incelendiğinde kullanılan primerlere bağlı olarak tür ve suş düzeyinde birbirine yakın LAB’nin ayrımında teknik biraz yetersiz kalmıştır.
Ocak 2019, 36 sayfa
Anahtar Kelimeler: Lactobacillus, RAPD-PCR, probiyotik, laktik asit bakterileri
iii ABSTRACT
Master Thesis
DISCRIMINATION BY RAPD-PCR AMONG LACTOBACILLUS ISOLATES WITH REFERENCE TO THEIR PROBIOTIC FUNCTIONALITIES
Kemal KAYAŞLI
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Ozlem OSMANAGAOGLU
Lactic acid bacteria (LAB); The biological safety of bacteriocin production and elongation of food shelf life are used as starting cultures in many fermented products. It has an important place both in scientific and industrial terms in the field of food and health, because it enables the individual to live a healthier life through the regulation and development of intestinal microbiota, and most importantly they have potential probiotic properties. Because of these properties, it is very important to make reliable definitions of LAB at strain level.
Ankara Uni. Faculty of Science Department of Biology Microbial Genetic Laboratory in our culture collection of the genus Lactobacillus strains of 36 strains genetically determined by RAPD-PCR technique. 36 Lactobacillus strains were subjected to RAPD-PCR analysis on OPA01, OPA10 and OPA03 primers. Dendograms were generated by using UPGMA analysis for each primer by using PAST program from gel images of band profiles. When the dendograms were examined, depending on the primers used, the technique was somewhat inadequate in differentiating LAB close to each other at the species and strain levels.
January 2019, 36 pages
Key Words: Lactobacillus, RAPD-PCR, probiotic, lactid acid bacteria
iv
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAY SAYFASI ... 2
ETİK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
SİMGELER DİZİNİ ... vi
ŞEKİLLER DİZİNİ ... vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... viii
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3
2.1 Laktik Asit Bakterileri ... 3
2.2 Laktik Asit Bakterilerinin Önemi... 4
2.2.1 Gıdaların Biyokorunumu (Bakteriyosin) ... 4
2.2.2 Starter kültür olarak kullanımları ... 5
2.2.3 Sağlık üzerine etkileri ... 5
2.2.4 Probiyotik olarak kullanımları ... 6
2.3 Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler ... 7
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 11
3.1 Materyal ... 11
3.1.1 Bakteri kültürleri ... 11
3.1.2 Bakteri kültür ortamı ... 12
3.1.3 Kimyasallar ... 13
3.1.4 Tampon ve çözeltiler ... 13
3.1.5 DNA analizinde kullanılan moleküler marker ... 13
3.1.6 Primerler ... 13
3.1.7 Çözelti ve malzemelerin sterilizasyonu ... 13
3.1.8 Bakteri kültürlerinin saklanması ... 14
3.2 Yöntem ... 14
3.2.1 Bakteri stok kültürlerinin aktifleştirilmesi ... 14
3.2.2 Kromozomal DNA izolasyonu ... 14
3.2.3 Saflık (kalite) ve miktar tayini ... 14
v
3.2.4 RAPD-PCR amplifikasyonu ... 15
3.2.5 Agaroz jel elektroforezi ... 15
3.2.6 Sonuçların Değerlendirilmesi ... 16
4. BULGULAR ... 17
4.1 Kromozomal DNA İzolasyonu ve Miktar Tayini ... 17
4.2 RAPD-PCR Uygulaması ... 18
4.3 Dendogram İndekslerinin Oluşturulması ... 20
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 22
KAYNAKÇA ... 24
EKLER ... 30
EK 1 Bakteri Kültür Ortamlarinin Gelşimi için Kullanilan Besiyeri ... 31
EK 2 Tampon ve Çözeltiler ... 32
EK 3 DNA Analizinde Kullanilan Moleküler Marker... 34
EK 4 Kimyasallar ... 35
ÖZGEÇMİŞ ... 36
vi
SİMGELER DİZİNİ
Dk Dakika
Kg Kilogram
Ml Mililitre
Mg miligram
Nm Nanometre
Rpm Rotations per minute
(Dakika Dönüş)
Sn Saniye
µl Mikrolitre
µm Mikrometre
Kısaltmalar
ATCC American Type Culture Collection
(Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu)
FTS Fizyolojik Tuzlu Su
GİS Gastro İntestinal Sistem
LAB Laktik Asit Bakterileri
MRS De Man, Rogosa and Sharpe
PCR Polimerase Chain Reaction
(Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
RAPD Random amplified polymorpfic DNA
(Rastgele Çoğaltışmış Polimorfik DNA)
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 4.1 LAB’lerinin OPA01 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri... 19 Şekil 4.2 LAB’lerinin OPA10 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri... 19 Şekil 4.3 LAB’lerinin OPD03 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri... 20 Şekİl 4.4 LAB’lerinin OPA01 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden
oluşturulan dendogram... ... ...21 Şekil 4.5 LAB’lerinin OPA10 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden
oluşturulan dendogram ... 21 Şekil 4.6 LAB’lerinin OPD03 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden
oluşturulan dendogram ... 21
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan Lactobacillus türleri ve gelişim koşulları... 11
Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan RAPD-PCR primerleri ... 13
Çizelge 3.3 Çalışmada kulanılan RAPD-PCR reaksiyon bileşimi ... 15
Çizelge 4.1 Çalışmada kullanılan LAB’lerinin miktar ve saflık değerleri... 17
1 1. GİRİŞ
Laktik asit bakterileri (LAB) karbonhidrat fermentasyonu sonucu laktik asit oluşturan, gram pozitif, katalaz negatif, anaerobik veya mikraaerofilik, asit dirençli ve spor
oluşturmayan kok veya çubuk şeklinde olan bakteriler olarak tanımlanmaktadır (Orla-Jensen 1919).
LAB, süt ve süt ürünleri, tahıl ürünleri, meyve, bira, şarap, turşu suyu gibi gıdalara ilaveten insan; ağız, solunum sistemi genital yolları ve gastrointestinal sistemi olmak üzere çok geniş bir yayılım alanına sahiptirler (Horvarth vd. 2009).
LAB, ürettikleri bakteriyosinler sayesinde gıdalarda bozunmalara yol açan patojen organizmaların gelişimlerini inhibe etmekte ve böylece gıdaların raf ömürlerini uzatmaktadır. Ayrıca starter kültür olarak kullanılan LAB, fermente ürünlerde tat, koku gibi organoleptik özellikler katmaktadır (Stiles1997).
LAB’nden özellikle Lactobacillus cinsi insanların ve hayvanların gastrointestinal sistemlerinde bulunur ve mikrofloranın düzenlenmesi, bağışıklığın gelişmesi ve regülasyonu ile patojenler nedeniyle ortaya çıkan bariyer bozunmasına karşı koruma sağlamaktadır (Wells vd. 2008).
LAB’nin, doğal asit toleransı, gastrik yolda hayatta kalabilme kabiliyetleri ve insan tüketimindeki güvenilirlikleri göz önüne alındığında, bu bakterilerin tanımlanması endüstriyel ve bilimsel açıdan önemlidir.
Geleneksel olarak, LAB fenotipik özelliklerine (morfoloji, glikoz fermentasyon yolağı, farklı sıcaklıklarda büyüme, laktik asit konfigürasyonu, çeşitli karbonhidratların fermantasyonu, yağ asitlerinin metil esterleri ve protein modeli) göre sınıflandırılmaktadır (Lambert 1991). Bu sınıflandırma yöntemlerinin zayıf tekrarlanabilirliği, ve büyük ölçekli araştırmalar için zayıf ayrım gücü gibi doğal sınırlamaları mevcuttur.
2
Fenotipik yöntemlerin getirdiği dez avantajları nedeniyle günümüzde DNA tabanlı tanımlama teknikleri daha çok ilgi görmektedir. DNA tabanlı genotipik tanımlama yöntemlerinin başlıca avantajları, yüksek ayrım gücü ve evrensel uygulanabilirliklerine dayanmaktadır (Farber 1996). Genotipik tanımlama teknikleri arasında; Moleküler Ribotiplendirme, Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (PFGE, Pulsed-field gel electrophoresis), Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism), Çoğaltılmış Ribozomal DNA Restiriksiyon Analizi (ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism), Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD, Random Amplifield Polymorphic DNA) ve Tekrarlayan palindrom element PCR (rep-PCR, Repetitive element palindromic-PCR) gibi teknikler yer almaktadır.
Çalışmamızda laktik asit bakterilerinden Lactobacillus cinsine ait 36 suş arasındaki genotipik farklılıkların ortaya konulmasında, RAPD-PCR tekniği sonucu elde edilen bant profillerinin taksonomik potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
3 2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1 Laktik Asit Bakterileri
LAB; fonksiyonel bir solunum zincirine sahip olmadıkları için substrat düzeyinde fosforilasyon ile enerjilerini elde etmektedirler. 2 temel hekzos fermente edici yol kullanan LAB, kullandıkları fermentasyon yolağına göre homofermentatif ve heterofermentatif olmak üzere 2 gruba ayrılmaktadır. Homofermentatif yol Embden- Meyerhof-Parnas (glikoliz) yolunu içermekte ve son ürün olarak neredeyse sadece laktik asit üretmektedir. Heterofermentatif veya heterolaktik (pentoz fosfoketlaz, hekzos monofosfat) yolak ise son ürün olarak laktik asidinin yanı sıra önemli miktarda CO2, etanol veya asetat üretmektedir (Kandler 1983, Lahtinen vd. 2011).
LAB’nden düşük guanin sitozin oranına (% 31-49) sahip olan Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus ve Weissella cinsleri Lactobacillaceae ailesine aitken, Bifidobacterium cinsi Actinobacteria ailesine aittir (Horvath vd. 2009).
LAB, karbonhidratı substrat olarak kullanabilecekleri her yerde bulunabilmektedirler.
Süt ve süt ürünleri, tahıl ürünleri, bira, şarap, meyve, turşu, silaj gibi gıdalara ilaveten insanlarda; ağız, solunum sistemi, genital yolları ve gastrointestinal sistemde bulunmaktadırlar (Horvath vd. 2009, Klaenhammer vd. 2002).
Lactobacillus cinsi; ilk olarak 1901 yılında Beijerinck tarafından tanımlanmıştır. En büyük LAB grubudur, gıda mikrobiyolojisi ve insan beslenmesinde yer alan en önemli türlerden bazılarına ev sahipliği yapmaktadır. Çeşitli Lactobacillus türleri fermente gıda üretiminde başlangıç kültürleri veya gıda koruyucuları olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, bazı insan kaynaklı türleri ise probiyotik olarak kullanılmaktadır (Seegers 2002).
4 2.2 Laktik Asit Bakterilerinin Önemi
Laktik asit bakterilerinin varsayımsal ilk nişi toprak ve bitki olarak kabul edilmektedir.
LAB’nin daha sonra herbivor kayvanların bağırsaklarına geçişi söz konusudur (Morelli vd. 2012). Sağlıklı bir yaşam için memeli bağırsağı yaklaşık 100 trilyon mikroorganizma tarafından kolonize edilmektedir (Hooper ve Macpherson. 2010). Söz konusu laktik asit bakterilerinin hayvan bağırsağına geçişleri 3 kromozomal adaptasyon ile ilişkilendirilmiştir (Lebeer vd. 2008). Bunlar; konakçı bariyerlerine karşı direnç, bağırsak hücrelerine tutunma ve bağırsaktaki bazı substratların fermentasyonu olarak öne sürülmüştür.
2.2.1 Gıdaların Biyokorunumu (Bakteriyosin)
LAB'nin görünüşte basit metabolizması, tarih boyunca tarımın kökenine uzanan neredeyse tüm toplumlarda yiyecek ve içeceklerin korunması için kullanılmalarını sağlamıştır (Miller vd. 2000 ).
Geleneksel olarak fermente edilmiş gıdalardan izole edilen saf kültürler, endüstriyel başlatıcılar olarak kullanılan benzer soy hatlarından farklı çeşitli metabolik aktiviteler sergilemektedir (Klijn vd. 1995). Bunlar, karışık kültürlerde büyüme oranındaki ve rekabetçi büyüme davranışlarındaki farklılıklar, belirli bir substrat veya hammaddeye adaptasyon, antimikrobiyal özellikler, lezzet aroma ve kalite özelliklerini içermektedir.
Yabani suşların, diğer mikroorganizmalarla rekabete dayanan doğal ortamlarında hayatta kalmaları için çaba göstermeleri gerektiğinden bakteriyosin adı verilen antimikrobiyal maddeler üretmektedirler (Wouters vd. 2002).
Bakteriyosinler, gıdalarda bozulma ve patojen bakterilerinin büyümesini engelleyen LAB tarafından üretilen ribozomal olarak sentezlenmiş küçük proteinlerdir; dahası, bakteriyosinojenik LAB gıda endüstrisinde başlangıç kültür olarak tercih edilmektedirler (Hoover ve Steenson 1993).
5
Gıda koruma teknolojisinde nitrit, sülfit, propionik asit, sorbik asit ve benzoik asit gibi kimyasal gıda katkı maddeleri yaygın olarak kullanılmaktadır (Smith 1993). Alternatif olarak, laktik asit bakteri suşları tarafından gösterilen antimikrobiyal aktivite, mikrobiyal kontaminasyonla mücadele etmeye yardımcı olabilmektedir (Lücke 2000).
2.2.2 Starter kültür olarak kullanımları
Starter kültür, fermentasyon sürecini hızlandırarak ve yönlendirerek fermente bir gıda üretmek üzere bir ham maddeye eklenecek olan en az bir mikroorganizmanın çok sayıda hücresinin mikrobiyal preparasyonu olarak tanımlanmaktadır. LAB bu süreçte merkezi bir rol oynamakta, fermente gıda ve içecek üretiminde güvenilir uygulama ile tüketim geçmişine sahiptir (Caplice ve Fitzgerald 1999).
Birçok çalışma başlangıç kültürlerinin üretebildiği bakteriyosinler sayesinde gıda bozulmasına sebep olan patojenik bakteriyel suşlara karşı inhibitör aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir (Callewaert ve De Vuyst 2000).
2.2.3 Sağlık üzerine etkileri
İnsanların da dahil olduğu omurgalıya ait GİS, bağırsak mikrobiyotası olarak adlandırılan mikrobik, çoğunlukla bakteriyel, birçok tür mikroorganizmaya ev sahipliği yapmaktadır (Berg 1996).
GİS’de bulunan LAB, bağışıklık fonksiyonunun gelişmesi ve düzenlenmesinde, enerji metabolizması, hormonal denge, bağırsak mukozal bariyerlerin regülasyonu, sindirilmemiş besinlerin fermentasyonu ve kısa zincirli yağ asitlerinin (Short Chain Fatty Acid; SCFA) sentezinde rol oynamaktadır (Morrison vd. 2016).
Bağırsakta yaşayan LAB konağa yararlı etkileri çok kez belirlenmiştir (Gordon 2005).
LAB konakçı immün fonksiyonlarını ile mukozal bariyeri güçlendirmekte ve patojenlere karşı koruma sağlamaktadır (Tappenden ve Deutsch 2007).
6
Lactobacillus cinsine ait suşlar, intestinal epitelyal hücrelerde, aktive NF-κB, interlökinler (ILs), tümör nekroz faktörleri (TNF'ler), büyüme faktörleri ve uyarılabilir beta-defensinler (BD'ler) dahil olmak üzere geniş bir dizi kemokin ve sitokin üretimini uyarabilmektedir. Bunlar bariyer fonksiyonlarının ve homeostazın korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Yine birçok Lactobacillus türünün bariyer fonksiyonunu arttırdığı ve/veya in vitro patojenler tarafından bariyer bozulmasına karşı koruma sağladığı bildirilmiştir (Wells 2011).
Lactobacillus türlerinin in vitro proinflamatuar sitokinlerin neden olduğu bariyer disfonksiyonunu da tersine çevirdiği bildirilmiştir (Resta-Lenert 2006).
2.2.4 Probiyotik olarak kullanımları
Probiyotikler, yeterli miktarlarda uygulandığında konakçıya yararlı etkiler sağlayan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmaktadır. Lactobacillus ve Bifidobacterium cinslerine ait LAB sıklıkla probiyotik olarak kullanılmaktadır (Salminen vd. 2010).
LAB suşlarının bakteriyel patojenlere karşı etkinliğinin altında yatan mekanizmaların multifaktöriyel olduğu bilinmekte ve hidrojen peroksit, laktik asit, bakteriyosin benzeri moleküllerin üretimi, bağışıklık sisteminin uyarılmasını ve bağırsak mikrobiyotasının modülasyonunu içermektedir. LAB, bağırsak epitel hücreleri üzerindeki bağlanma bölgeleri için patojen mikroorganizmalar ile de rekabet ederek patojenlerin yapışmasını önleyebilmekte ve sonuç olarak patojen kolonizasyonu azaltabilmektedir (Campana vd.
2012). Bir mikroorganizmanın probiyotik olarak adlandırılması için bir takım kriterler taşıması gerekmektedir. Bunlar; bağırsak mukozasına tutunabilme, antimikrobiyal madde üretimi, safra tuzu, asit ve bazı enzimlere karşı stabilite, insan gastrointestinal kanalına kolonizasyon potansiyeli, kanıtlanabilir etkinlik ve güvenlik gibi özelliklerdir.
Sonuç olarak, gastrointestinal sistemde yaşayan LAB’nin potansiyel probiyotik özellikler taşıdıkları ve probiyotik seçimleri için bu otokron suşların önemi her geçen gün artan çalışmalar ile desteklenmektedir.
7
2.3 Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanmasında Kullanılan Yöntemler
Genellikle cins-tür düzeyinde tanımlamada kullanılan fenotipik yöntemler; morfolojik, metabolik, biyokimyasal özellik, farklı sıcaklık, farklı tuz ve ph konsantrasyonlarında gelişme gibi kriterlere dayanmaktadır (Falsen vd. 1999).
Fenotipik analizlerin; zaman alıcı ve düşük ayrım gücüne sahip olması, analizi yapılan genomun tüm tüm bilgi potansiyelinin asla riifade edilememesi (gen eksperesyonunun çevresel koşullarla değişiklik göstermesi) gibi dezavantajlar yaratması cins ya da tür seviyesindeki kültür tanımlamalarında güvenilirliği olumsuz yönde etkilemektedir (Babalola 2003)
Genotipik yöntemler ise organizmanın genomunu hedef almaktadır. Kullanılan tekniğe göre organizmanın cins seviyesinden tür hatta suş seviyesine kadar tanımlanmasına olanak sağlamaktadır. Bu teknikler nükleotid sekansları ile alakalı olduğundan gelişim ortamı değişikliklerinden etkilenmemeleri ile fenotipik yöntemlere göre önemli avantajlar taşımaktadır (Moschetti 1998, Bush 1999). Benzer fenotipik özelliklere sahip yakından ilişkili suşların, genotipik tanımlamaları için kullanılan bazı yöntemler şunlardır;
Moleküler Ribotiplendirme,
PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis),
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis),
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Rep-PCR ( Repetitive Element Palindromic PCR)
16S Tabanlı rRNA Sekans Analizi
RAPD (Random Amplifield Polymorphic DNA)
Moleküler ribotiplendirme: basitçe ribozomal genleri tanımlamak için nükleik asit problarının kullanılmasını ifade etmektedir. Uygulamada, kromozomal DNA izole
8
edilmekte ve bir 23S ve 16S rRNA gen probu ile hibridizasyon işlemi uygulanmaktadır.
Hibridasyon ardından oluşan hibritlerin özel membranlara aktarılıp görüntüleme yapıldığı Southern Blot yöntemi uygulanmaktadır.
PFGE analizinde, restriksiyon sonucu elde edilen büyük DNA fragmanlarının, çalışma boyunca değişken elektrik akımları ile hareket ederek ayrılmasına olanak veren alternatif bir elektroforez alanı kullanılmaktadır (Schillinger Vd. 2001). Bu nedenle, teknik diğer parmak izi stratejilerinden daha fazla zaman almaktadır. Bununla birlikte, PFGE tarafından oluşturulan profil, bütün genomu temsil etmekte ve üstün bir ayrım gücüne sahiptir (Kimura 1999).
RFLP analizi, DNA fragmanlarının uygun restriksiyon enzimleri ile kesilmesinden ve elektroforez ile ayrılmasından sonra ortaya çıkan bant desenleri, DNA parmak izi olarak adlandırılmaktadır. Restiriksiyon enzimlerinin yüksek özgüllüğü ve kromozomal DNA'nın stabilitesi bu yöntemin tekrarlanabilirliğini arttırmaktadır. Suşlar arasındaki bantlama desenlerindeki varyasyonlar, incelenen organizmanın DNA baz bileşimindeki temel farklılıkları ortaya koymaktadır. Bu yöntemle ilgili genel bir eleştiri ise bant deseninin karmaşıklığıdır (Mohania 2008).
ARDRA yöntemi; 16S rRNA bölgesi, 16S-23S rRNA ara bölgesi veya 23S rRNA'nın amplifikasyonu, ardından bir veya daha fazla seçilmiş restiriksiyon enzimi ile kesim yapılması işlemlerinin ardından elektroforez sonrası oluşan bant profillerinin değerlendirilmesine dayanmaktadır. Bakteri türlerini ayırma potansiyeline sahiptir (Heyndrickx 1996).
AFLP analizi; organizmanın DNA'sından yüzlerce, yüksek oranda replike edilebilir fragman üretmekte, bu sayede parmak izi kalitesinin yüksek çözünürlüklü genotiplemesine izin vermektedir. AFLP'nin zaman alıcı bir teknik ve yüksek maliyet gibi dezavantajlarının aksine tekrarlanabilirliği ve çözünürlüğü yüksek kalitededir (Mohania 2008).
9
Rep-PCR; çeşitli bakteri genomlarında bulunan korunmuş dizilere uyacak şekilde tasarlanmış özel primerler yardımı ile tekrarlayan diziler arasında yer alan Kromozomal bölgelerin çoğaltılması esasına dayanmaktadır. Yine çoğaltılan ürünlerin elektroforez sonrası yorumlaması yapılmaktadır. Mikrobiyal çeşitlilik çalışmasında son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır (Sillma vd. 2015).
16S tabanlı rRNA sekans analizleri; mikroorganizmanın evrimsel süreçler içerisinde korunmuş 16S rRNA bölgesinin uygun primerler ile çoğaltılarak sekans sonuçlarına göre tanımlama yapılan çok kullanışlı bir tekniktir. DNA sekanslama için kullanılan en popüler yöntemler ꞌꞌSanger Sekanslamaꞌꞌ veya ꞌꞌShotgun Sekanslamaꞌꞌ yöntemleridir (Ehrmann 2005).
RAPD tekniği, kısa rastgele primerlerin DNA zinciri üzerinde rastgele hedef sekanslara bağlandığı ve tanısal değerin bant profilleri ile sonuçlandığı PCR tabanlı bir moleküler tanımlama yöntemidir. RAPD analizinde, kalıp olarak kullanılacak DNA’nın nükleotid dizisinin bilinmesine gerek duyulmamaktadır ve yaklaşık 10 nükleotid uzunluğunda bir primer kullanılmaktadır. Bu primerlerin PCR işlemi sırasında düşük bağlanma sıcaklıklarına sahip olmaları, rasgele boyutlarda DNA fragmanlarının amplifikasyonu ile sonuçlanmaktadır. PCR işlemi sonrası jel elektroforezi uygulanmakta olup oluşan bant profilleri üzerinden tanımlama yapılabilmektedir. Bu teknik; az miktarda DNA kullanımı, kullanılan DNA’nın nükleotid sekansının bilinmesine gerek duyulmaması ve spesifik primerlerin kullanılmasına gerek olmadan, agaroz jel üzerinde algılanabilir, düşük maliyetli ve hızlı sonuç alınabilen bir tekniktir. Bu sayede pek çok araştırmacı için genetik çeşitliliği ayırt etmede sıkça tercih edilen bir yöntemdir (Tingey 1994).
RAPD profilleri, geniş bir organizma yelpazesi için geçerli bir taksonomik ve filogenetik araç olarak kabul görmektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile bağlantılı olarak RAPD, birçok organizmanın suş düzeyine tanımlanması ve tüm genom DNA profilleri oluşturmak için kullanılmaktadır (Welsh 1990).
10
RAPD yöntemi L. acidophilus ve yakından ilişkili L. crispatus, L. amylovorus, L.
gallinarum, L. gasseri ve L. johnsonii suşları arasında ayrım yapmak için başarıyla kullanılmıştır (Du Plessis 1995).
RAPD-PCR’ın probiyotik süt ürünlerinde yaygın olarak kullanılan L. acidophilus ve L.
casei suşlarının hızlı tanımlanması için değerli bir teknik olduğunu göstermektedir.
(Schillinger vd. 2003).
Lactobacillus cinsinin farklı suşlarının, RAPD-PCR ile tür ve alt tür seviyesinde çok başarılı bir şekilde karakterize edildiği de gösterilmiştir (Kwon 2000).
11 3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1 Materyal
3.1.1 Bakteri kültürleri
Çalışmamızda 36 adet Lactobacillus cinsine ait tür kullanılmıştır. Kullanılan kültürler A.Ü.F.F. Biyoloji Böl. Mikrobiyal Genetik Lab. Kültür Koleksiyonu’ndan temin edilmiştir. Kültürlerin gelişme koşulları ve suşların isimleri çizelge 3.1’de gösterilmiştir.
Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan Lactobacillus türleri ve gelişim koşulları
Bakteri Gelişim Koşulları
1. Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 37 ºC 24 saat 2. Lactobacillus acidophilus CG 37 ºC 24 saat 3. Lactobacillus brevis NRLL-B 21 37 ºC 24 saat 4. Lactobacillus brevis OZH10 37 ºC 24 saat 5. Lactobacillus buhnerii B1837 37 ºC 24 saat 6. Lactobacillus caseii RSSK 708 37 ºC 24 saat 7. Lactobacillus cremoris RSSK 708 37 ºC 24 saat 8. Lactobacillus delbrueckii supsp. Bulgaricus 37 ºC 24 saat 9. Lactobacillus delbrueckii supsp. bulgaricus OZZ2 37 ºC 24 saat 10. Lactobacillus delbrueckii supsp. bulgaricus OZZ3 37 ºC 24 saat 11. Lactobacillus fermentum Y4-1 37 ºC 24 saat 12. Lactobacillus fermentum NCDO 1750 37 ºC 24 saat 13. Lactobacillus fermentum NRLL B585 37 ºC 24 saat 14. Lactobacillus fermentum OZH4 37 ºC 24 saat 15. Lactobacillus fermentum Y2-2 37 ºC 24 saat 16. Lactobacillus fermentum Y5-2 37 ºC 24 saat
12
Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan Lactobacillus türleri ve gelişim koşulları (devam) 17. Lactobacillus helveticus CG 37 ºC 24 saat
18. Lactobacillus helveticus CNRZ32 37 ºC 24 saat 19. Lactobacillus helveticus OZH12 37 ºC 24 saat 20. Lactobacillus pentosus CG 37 ºC 24 saat 21. Lactobacillus plantarum 1193 37 ºC 24 saat 22. Lactobacillus plantarum 37 37 ºC 24 saat 23. Lactobacillus plantarum 73 37 ºC 24 saat 24. Lactobacillus plantarum BF2 37 ºC 24 saat 25. Lactobacillus plantarum CG 37 ºC 24 saat 26. Lactobacillus plantarum DSM 20246 37 ºC 24 saat 27. Lactobacillus plantarum MLR 37 ºC 24 saat 28. Lactobacillus plantarum NCDO 995 37 ºC 24 saat 29. Lactobacillus plantarum OZ1 37 ºC 24 saat 30. Lactobacillus plantarum OZF 37 ºC 24 saat 31. Lactobacillus plantarum OZH8 37 ºC 24 saat 32. Lactobacillus plantarum OZT 37 ºC 24 saat 33. Lactobacillus plantarum Şal6 37 ºC 24 saat 34. Lactobacillus plantarum Z111 37 ºC 24 saat 35. Lactobacillus rhamnosus Y14-2 37 ºC 24 saat 36. Lactobacillus rhamnosus Y20-1 37 ºC 24 saat
3.1.2 Bakteri kültür ortamı
Çalışmada kullanılan Lactobacillus cinsine ait türlerin gelişimleri için MRS sıvı besiyeri kullanılmıştır. Kullanılan besiyeri içeriği EK 1’de verilmiştir.
13 3.1.3 Kimyasallar
Çalışmada kullanılan kimyasallar ve üretici firmaları EK 2’de verilmiştir.
3.1.4 Tampon ve çözeltiler
Çalışmada kullanılan tampon ve solüsyonların hazırlanışları EK 3’te verilmiştir.
3.1.5 DNA analizinde kullanılan moleküler marker
Çalışmada kullanılan marker ve üretici firması EK 4’te verilmiştir.
3.1.6 Primerler
Çalışmada OPA01, OPA10 ve OPD03 evrensel primerler kullanılmış olup sekansları çizelge 3.2’de gösterilmiştir.
Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan RAPD-PCR primerleri
Primer Sekans
OPA 01 3-CAGGCCCTTC-5
OPA 10 3-GTGATCGCAG-5
OPD03 3-GTCGCCGTCA-5
3.1.7 Çözelti ve malzemelerin sterilizasyonu
Çalışma süresince kullanılan tüm cam malzemelerin sterilizasyonu için pastör fırını (Nüve, Türkiye; (185 ºC, 3 saat)), solüsyon ve besi ortamlarının sterilizasyonu için ise otoklav (Nüve, Türkiye) kullanılmıştır (121, 15 dk.).
14 3.1.8 Bakteri kültürlerinin saklanması
Çalışmada kullanılan izolatlar besiyerlerinde 37 ºC’de 24 saat geliştirildikten sonra ependorf tüplere 1 ml aktarılmış 22 ºC, 10.000 rpm’de 2 dakika boyunca santrifüj edilmiştir. İşlem sonrası pellet üzerine 1 ml steril FTS eklenmiş ve aynı koşullarda tekrar santrifüj işlemi uygulanmıştır. Daha sonra pellet % 50’lik steril gliserol çözeltisinde içerisinde çözünmüş halde -20 ºC ve -86 ºC saklanmıştır.
3.2 Yöntem
3.2.1 Bakteri stok kültürlerinin aktifleştirilmesi
Çalışmada kullanılan Lactobacillus genusuna ait bakteriyal türler ana stoklardan, MRS (de Man, Rogosa and Sharpe; Merck, Darmstadt, Germany) sıvı besiyerinde 37 ºC’de 24 saat geliştirilmiştir.
3.2.2 Kromozomal DNA izolasyonu
Çalışmada kullanılan Lactobacillus türlerinin kromozomal DNA izolasyonu için sıkça tercih edilen kaynatma yöntemi kullanılmıştır (Abdulla A.A. 2014). Gece boyunca gelişim gösteren kültürlerden numuneler alınıp 4 ºC, 12.000rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Elde edilen pellet üzerine 1 ml distile su ilave edilmiş ve vorteksleme işlemi yapıldıktan sonra örnekler 15 dakika boyunca 100 ºC’de kaynamaya bırakılmıştır.
Kaynama işleminin hemen ardından numuneler 20 dakika boyunca -20 ºC’de soğutulmuş ve 4 ºC, 12.000rpm’de 5 dakika santrifüj işlemini takiben DNA’yı içerecek olan supernatant PCR için kalıp olarak kullanılmıştır.
3.2.3 Saflık (kalite) ve miktar tayini
Kromozomal DNA izolasyonu sonucu elde edilen DNA numunelerinin saflık ve miktar tayinleri NANODROP spektrofotometrede ölçüm yapılarak belirlenmiştir. DNA
15
örneklerinin okunması için distile su kontrol olarak kullanılmıştır. Örneklerin 260nm/280nm değerleri ölçülerek DNA konsantrasyonları ng/µl olarak belirlenmiştir.
3.2.4 RAPD-PCR amplifikasyonu
200 µl’lik PCR tüplerine toplam hacim 50 µl olacak şekilde çizelge 3.3’te verilen reaksiyon bileşimi hazırlanmıştır. PCR işlemi ‘Gradient PCR thermocyler/Eppendorf’
cihazında 94 ºC’de 5 dakika ön denatürasyon basamağı ardından her biri kendi içerisinde 94 ºC’de 30 saniye denatürasyon, 40 ºC’de 1 dakika primer bağlanması ve 72 ºC’de 1 dakika 45 saniye uzama basamaklarından oluşan toplam 40 döngüde gerçekleştirilmiştir. Son olarak 72 ºC’de 8 dakika ilave bir uzama basamağı yer almıştır.
Çizelge 3.3 Çalışmada kulanılan RAPD-PCR reaksiyon bileşimi
Reaksiyon Bileşimi (µl)
10X Hot Start Buffer 5
10mM dNTP Mix 1
Primer (10 µmol) 1
MgCl2 (25 mM) 4
Kalıp DNA 1,5
Taq DNA polimeraz (5U) 1
Distile su 36,5
Toplam Hacim 50
3.2.5 Agaroz jel elektroforezi
Elektroforez işlemi için % 1,5 agaroz konsantrasyonu içeren jeller kullanılmıştır. Yatay jel elektroforezi uygun miktarda agaroz tartılmış yine ugun miktarda 1xTBE (Tris-Borik Asit EDTA) tamponu içerisinde mikrodalga fırın yardımı ile çözülmüştür. Yaklaşık 40 ºC’ye kadar soğutulan jele % 5 oranında Etidyum Bromit solüsyonu eklenmiş ve homojen karışım sağlanınca elektroforez plakalarına aktarılarak taraklar yerleştirilmiş
16
ve yaklaşık 1 saat jelin donması beklenmiştir. Süre sonunda elektroforez tanklarına, jelin yüzeyini kapatacak şekilde tampon çözelti (1XTBE) ilave edilerek jelin hasar görmemesine dikkat edilerek tarak ortamdan uzaklaştırılmıştır. RAPD-PCR işlemi uygulanan örneklerden 5 µl, 2 µl yükleme boyası ile karıştırılarak mikropipet yardımıyla kuyucuklara yüklenmiştir. Elektroforez işlemi 120 V’da 2,5 saat süreyle yapılmıştır. Elektroforez işlemiş bittikten sonra agaroz jel Kodak Jel Görüntüleme (Gel Logic 200 Imaging System) cihazına yerleştirilerek 365 nm dalga boyunda UV ışık altında incelenmiş ve fotoğraf çekimleri yine bu cihaz ile yapılmıştır.
3.2.6 Sonuçların Değerlendirilmesi
Bu amaç doğrultusunda elektroforezi yapılan jeller KODAK Görüntüleme Sisteminde görüntülenip TIFF formatında depolanmıştır. Elde edilen bant görüntüleri PAST istatistik programında Jaccard benzerlik indeksi kullanılarak UPGMA analizi ile değerlendirilmiştir.
17 4. BULGULAR
4.1 Kromozomal DNA İzolasyonu ve Miktar Tayini
Çalışmanın temel materyelini oluşturan aşama, kromozomal DNA molekülünün izolasyonudur. Başarılı geçen izolasyon sonunda elde edilen DNA molekülü ileriki basamaklar için temel oluşturmaktadır. Çalışmada kullanılan 36 Lactobacillus cinsine ait suşun DNA molekülleri kaynatma yöntemi kullanılarak izole edilmiştir (Abdulla A.A. 2014). Elde edilen DNA’ların miktarları ve saflıklarının ölçümlerinde NANODROP spektrofotometre kullanılmıştır. DNA saflığı için 260nm/280nm oranından yararlanılmış olup DNA miktarı ng/µl cinsinden ölçülmüştür. Ölçülen DNA konsantrasyonları çizelge 4.1’de verilmiştir.
Çizelge 4.1 Çalışmada kullanılan LAB’lerinin miktar ve saflık değerleri
Bakteri Konsantrasyon
ng/µl
Saflık (OD) 260nm/280nm Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 138,4 1,83
Lactobacillus acidophilus CG 155,1 1,64 Lactobacillus brevis NRLL-B 21 188,1 1,74 Lactobacillus brevis OZH10 129,6 2,02 Lactobacillus buchneri B1837 201,4 1,81 Lactobacillus caseii RSSK 708 271,1 1,80 Lactobacillus cremoris RSSK 708 114,5 1,61 Lactobacillus delbrueckii supsp.
Bulgaricus
159,7 1,83
Lactobacillus delbrueckii supsp.
bulgaricus OZZ2
146,3 1,68
Lactobacillus delbrueckii supsp.
bulgaricus OZZ3
172,1 1,89
Lactobacillus fermentun Y4-1 161,1 1,87 Lactobacillus fermentum NCDO 1750 120,0 1,70 Lactobacillus fermentum NRLL B585 101,6 1,70
18
Çizelge 4.1 Çalışmada kullanılan LAB’lerinin miktar ve saflık değerleri (devam) Lactobacillus fermentum OZH4 200,2 1,98
Lactobacillus fermentum Y2-2 136,8 1,77 Lactobacillus fermentum Y5-2 244,8 1,76 Lactobacillus helveticus CG 114,4 1,67 Lactobacillus helveticus CNRZ32 127,2 1,71 Lactobacillus helveticus OZH12 114,0 1,61
Lactobacillus pentosus CG 103,6 1,66
Lactobacillus plantarum 1193 174,5 1,90 Lactobacillus plantarum 37 138,1 1,72 Lactobacillus plantarum 73 115,7 1,61 Lactobacillus plantarum BF2 166,5 1,68 Lactobacillus plantarum CG 164,2 1,87 Lactobacillus plantarum DSM 20246 108,1 1,70 Lactobacillus plantarum MLR 104,2 1,67 Lactobacillus plantarum NCDO 995 119,7 1,74 Lactobacillus plantarum OZ1 140,7 1,76 Lactobacillus plantarum OZF 199,8 1,69 Lactobacillus plantarum OZH8 128,6 1,99 Lactobacillus plantarum OZT 215,8 1,76 Lactobacillus plantarum Şal6 126,4 1,69 Lactobacillus plantarum Z111 197,2 1,76 Lactobacillus rhamnosus Y14-2 235,4 1,80 Lactobacillus rhamnosus Y20-1 138,5 1,83
4.2 RAPD-PCR Uygulaması
RAPD-PCR tekniği, kısa rastgele primerlerin düşük bağlanma sıcaklıklarında DNA’ya bağlanmaları sonucu oluşturdukları bant profilleri sayesinde pek çok organizmanın tür ve alt-tür düzeyinde tanımlanması ve tüm genomun DNA profillerinin oluşturulması için sıkça kullanılan bir moleküler tekniktir. Çalışmamızda 36 adet Lactobacillus
19
suşundan izole edilen DNA’lar OPA01 (3ꞌ-CAGGCCCTTC-ꞌ5), OPA10 (3ꞌ- GTGATCGCAG-ꞌ5) ve OPD03 (3ꞌ- GTCGCCGTCA-ꞌ5) primerleri kullanılarak ayrı ayrı PCR işlemine tabi tutulmuştur. PCR ürünleri % 5 Etidyum bromür içeren, % 1,5’luk agaroz jellerde yürütülmüş ve farklı sayılarda ve büyüklüklerde DNA fragmentleri gözlenmiştir (Şekil 4.1 - 4.3).
Şekil 4.1 LAB’lerinin OPA01 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri
Şekil 4.2 LAB’lerinin OPA10 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri
Şekil 4.3 LAB’lerinin OPD03 primerine ait RAPD-PCR bant profilleri
20 4.3 Dendogram İndekslerinin Oluşturulması
RAPD-PCR uygulaması sonucu elde edilen bant profilleri PAST programı aracılığıyla UPGMA analizi ile her bir primer için ayrı ayrı dendogramlar oluşturulmuştur (Şekil 4.4 - 4.6).
Şekil 4.4 LAB’lerinin OPA01 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden oluşturulan dendogram
21
Şekil 4.5 LAB’lerinin OPA10 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden oluşturulan dendogram
Şekil 4.6 LAB’lerinin OPD03 primeri ile RAPD-PCR jel görüntüsünden oluşturulan dendogram
22 5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Laktik asit bakterilerinin gıda ve sağlık endüstrisindeki önemleri göz önüne alındığında bu mikroorganizmaların doğru ve güvenilir tanımlaması, kullanılacak suşların seçiminde oldukça önemlidir. Fenotipik tabanlı tanımlama yöntemleri cins bazende tür düzeyinde tanımlamaya olanak sağlasa da araştırmacılar açısından yorumlamak bir hayli zor olmaktadır. Ayrıca fenotipik tabanlı tanımlama yöntemleri zaman alıcı ve daha az ayrım gücüne sahiptir. Genotipik tabanlı tanımlama yöntemlerin daha hızlı, kolay ve kesin sonuç vermesi araştırmacıları, fenotipik yöntemlerin yerine genotipik yöntemleri kullanmaya yöneltmiştir.
Çalışmada Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Mikrobiyal Genetik Lab. kültür koleksiyonumuza ait farklı biyokimsayal ve fenotipik testler ile cins seviyesine, API CHL50 tanımlama test kitleri ile de tür ve alt-tür seviyesinde tanımlamaları önceden yapılmış Laktik Asit Bakteri grubundan Lactobacillus cinsine ait 36 suş kullanılmıştır. LAB arasındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesi ve değerlendirilmesi için 36 suş üzerinde moleküler düzeyde tanımlama tekniklerinden RAPD-PCR yöntemi uygulanmış ve değerlendirilmiştir.
MRS besiyerlerinde geliştirilen Laktik asit bakterilerinden, kromozomal DNA izolasyonu için kaynatma yöntemi kullanılmıştır. Kromozomal DNA izolasyonu ardından 36 suşa OPA01 (3ꞌ-CAGGCCCTTC-ꞌ5), OPA10 (3ꞌ-GTGATCGCAG-ꞌ5) ve OPD03 (3ꞌ- GTCGCCGTCA-ꞌ5) primerleri ile ayrı ayrı RAPD-PCR işlemiş uygulanmıştır. RAPD-PCR ürünleri % 1,5 agaroz içeren jellerde elektroforez işlemine tabi tutulmuştur. Elektroforez işlemi sonrası agaroz jel Kodak Jel Görüntüleme (Gel Logic 200 Imaging System) cihazına yerleştirilerek 365 nm dalga boyunda UV ışık altında incelenmiş fotoğraf çekimleri yine bu cihaz ile yapılmıştır. Elde edilen görüntüler uygun formatlarda PAST analiz programına yüklenip Jaccard benzerlik indeksi dahilinde UPGMA dendogramları oluşturulmuştur.
Sonuçlar farklı primerlerin farklı boyutlarda ve farklı sayılarda bantlar ile birlikte farklı UPGMA dendogramlari oluşturduğunu göstermiştir.
23
LAB’nin OPA01 primeri ile verdiği bant profillerinden yola çıkılarak oluşturulan dendogramda, Jaccard benzerlik indeksi altında % 81,95 kofenetik korelasyon göstermiştir. Suşlar genel olarak monomorfik bant paternleri verirken 3 ana grup altında gruplaşmıştır. Birinci grup kendi içerisinde Lb. helveticus CG suşu hariç % 65’ten fazla benzerlik oranına sahiptir. Lb. helveticus CG ise tek başına birinci grup içerisinde ayrı bir grup oluşturmuştur. İkinci ana grup ise kendi içerisinde % 65 ile % 70 arası benzerlik oranına sahip iken Lb. fermentum NCDO 1750 suşu ayrı grup oluşturmuştur.
3. Ana grupta ise yaklaşık % 40 benzerlik oranına sahip 4 plantarum suşu (Lb.
plantarum OZT, Lb. plantarum OZF, Lb. plantarum 1193, Lb. plantarum MLR) yer almaktadır.
LAB’nin OPA10 primeri ile verdiği bant profillerinden oluşturulan dendogramda % 76,31 kofenetik korelasyon göstermiştir. Dendogram oluşturulurken yine Jaccard benzerlik indeksi kullanılmıştır. Suşlar kısmi monomorfik bantlar vermiştir. Suşlar 2 ana grup altında toplanmıştır. Lb. acidophilus CG suşu tek başına bir grubu oluştururken diğer suşlar diğer bir grubu oluşturmuştur. İkinci ana grup kendi içerisinde 3 alt gruba ayrılmış olup ilk ve ikinci grup kendi içerisinde % 65’ten % 85’e kadar farklı benzerlik oranlarına sahip suşları içermektedir. Lb. plantarum 1193 suşu ise 2 ana grup altında tek başına üçüncü alt grubu tek başına oluşturmaktadır.
LAB’nin OPD03 primeri ile verdiği bant profillerden oluşturulan dendogram % 67,88 kofenetik korelasyon oranını vermiştir. Suşlar yine kısmi monomorfik bantlar verirken tü suşlar 400bp civarında ortak bantlar vermiştir. Suşlar yaklaşık % 50 ile % 60 arası benzerlik gösterirken Lb. plantarum Z111, Lb. plantarum NCDO 995, Lb. plantarum 37 ve Lb. brevis OZH10 suşları diğer suşlardan % 20 gibi düşük bir benzerlik oranına sahip olarak ayrılmaktadır.
Çalışmadaki tüm veriler göz önüne alındığında farklı primerler ile çalışılan RAPD-PCR uygulamalarının farklı dendogramlar ile kısmen başarılı sonuçlar verdiği, gelecekteki çalışmalar için RAPD-PCR reaksiyonlarında birden fazla primer karışımlarının kullanılmasının daha doğru ve kesin sonuçlar ile ayrımın daha net yapılabileceği öngörülmektedir.
24 KAYNAKLAR
Abdollahniya, D., Hosseini, S.M., Baghbaderani, B.K., Mordadi, A. and Arabestani M.R. 2017. Identification of Lactobacillus Species Isolated From Traditional Dairy Products Using RAPD-PCR. Avicenna Journal of Clinical Microbiology and Infection, 5; 7-13.
Abdulla, A.A. 2014. Optimization of DNA extraction of lactobacillus spp. for Identification by tuf B gene–based polymerase chain reaction. J Biol Agric Healthcare.; 4(8):122–6.
Andrighetto, C., Zampase, L. and Lombardi, A. 2001. RAPD-PCR characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of Veneto region (Italy). Letters in Applied Microbiology, 33; 26-30 Andrighetto, C., Zampese, L. and Lombardi, A. 2001. RAPD-PCR Characterization of
lactobacilli isolated from artinasal meat plants and traditional fermented sausages of Veneto region (Italy). Letters in Applied Microbiology, 33; 26-30 Babalola, O.O. 2003. Molecular techniques: An overview of methods for the detection
of bacteria, African J. of Biotechnol., 2(12), 710- 713.
Backhed, F.R.E., Ley, J.L., Sonnenburg, D.A. Peterson, and Gordon, J.I. 2005. Host- bacterial mutualism in the human intestine. Science 307:1915-1920.
Berg, R.D. 1996. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol.4:430- 435.
Bonomo, M.G., Ricciardi, A., Zotta, T., Parente, E. and Salzano, G. 2008. Molecular and technological characterization of lactic acid bacteria from traditional fermented sausages of Basilicata region (Southern Italy). Meat Science, 80;
1238-1248
Bush, U. and Nitschko, H. 1999. Methods for differentiation of microorganisms, J. of Chromat. B, 722, 263-278.
Campana, R., Federici, S., Ciandrini, E. and Baffone, W. 2012. Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 on the growth and adhesion/invasion characteristics of human Campylobacter jejuni. Curr Microbiol.; 64(4):371–
378. doi: 10.1007/s00284-012-0080-0.
Cocconnelli, P.S., Porro, D., Galandini, S. and Senini, L. 1995. Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and enterococci. Applied Microbiology, 21; 376-379
Daud Khaled, A.K., Neilan, B.A., Henriksson, A. and Conway, P.L. 1997 Identification and phylogenetic analysis of Lactobacillus using multiplex RAPD-PCR, FEMS Microbiol. Lett., 153, 191-197.
Decallone, J., Delmee, M., Wauthoz, P., El lioul, M. and Lambert, R. 1991. A rapid procedure for the identification of lactic acid bacteria based on the gas chromatographic analysis of cellular fatty acids.J. Food. Prot.; 54: 217–24.
25
Devi, S.M. and Halami, P.M. 2016. Discrimination and divergence among Lactobacillus plantarum-group (LPG) isolates with reference to their probiotic functionalities from vegetable origin. Systematic and Applied Microbiology, 39; 562-570
Dheeraj, M., Ravinder, N., Manoj, K., Aarti, B., Mukesh, Y., Shalini, J., Francesco, M., Vinod, S., Om P. and Hariom, Y. 2008. Molecular approaches for identification and characterization of lactic acid bacteria, Journal Of Digestive Diseases, 39.
Di Cagno, R., Surico, R.F., Paradiso, A., De Angelis, M., Salmon, J.C., Buchin, S., De Gara, L. and Gobbetti, M. 2009. Effect of autochthonous lactic acid bacteria starters on healt-promoting and sensory properties of tomato juices.
International Journal of Food Microbiology, 128; 473-483
Du Plessis, E.M. and Dicks, L.M.T. 1995. Evaluation of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a Method to Differentiate Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus johnsonii. Current Microbiology, 31; 114-118
Du Plessis, E.M. and Dicks, L.M.T. 1995. Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a method to differentiate Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus johnsonii. Curr. Microbiol. 31,114–
118.
Duary, R.K., Grover, S., Mohanty, A.K., Kaushik, J.K. and Batish, V.K. 2009.
Randomly amplified polymorphic dna profiles of lactobacillus isolates from human faecal samples. International Journal of Probiotics and Prebiotics, 4; 55- 64
Ehrmann, M.A. and Vogel, R.F. 2005. Molecular taxonomy and genetics of sourdough lactic acid bacteria, Food Sci. and Techn., 20, 1-12.
Elegado, F.B., Guerra, M.A.R.V., Macayan, R.A., Mendoza, H.A. and Lirazan, M.B.
2004. Spectrum of bacteriocin activity of Lactobacillus plantarum BS and fingerprinting by RAPD-PCR. International Journal of Food Microbiology, 95;
11-18
Falsen, E., Pascual, C., Sjöden, B., Ohlen, M. and Collins, M.D. 1999. Phenotypic and phylogenetic characterization of a novel Lactobacillus species from human sources: description of Lactobacillus iners sp. nov. Int J Syst Bacteriol.;49 Pt 1:217-21.
Farber, J.M. 1996. An introduction to the hows and whys of molecular typing. J. Food Prot.; 59: 1091–101.
Galanis, A., Kourkoutas, Y., Chrysoula, C. Tassou, and Chorianopoulos, N. 2015.
Detection and Identification of Probiotic Lactobacillus plantarum Strains by Multiplex PCR and Using RAPD-Derived Primers. International Journal of Molecular Sciences, 16(10); 25141-25153
26
Gatti, M., Fornasari, E. and Neviani, E. 1993. Cell‐wall protein profiles of dairy thermophilic lactobacilli. Lett. Appl. Microbiol.; 25:345–8.
Gill, S.R., Pop, M., DeBoy, R.T., Eckburg, P.B., Turnbaugh, P.J., Samuel, B.S., Gordon, J.I., Relman, D.A., Fraser-Liggett, C.M. and Nelson, K.E. 2006.
Metagenomic Analysis of the Human Distal Gut Microbiome. Science.
312;1355–1359. doi: 10.1126/science.1124234,
Giraffa, G. and Rossetti, L. 2004. Monitoring of the bacterial composition of dairy starter cultures by RAPD-PCR. FEMS Microbiology Letters, 237; 133-138 Gordon, H.A. and Pesti, L. 1971. The gnotobiotic animal as a tool in the study of host
microbial relationships. Bacteriol. Rev. 35:390-429.
Gosiewski, T., Chmielarczyk, A., Strus, M., Brzychczy-Włoch, M. and Heczko, P.B.
2012. The application of genetics methods to differentiation of three Lactobacillus species of human origin. Ann Microbiol, 62; 1437-1445
Hayford, A.E., Petersen, A., Vogensen, F.K. and Jakobsen, N. 1999. Use of Conserved Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Fragments and RAPD Pattern for Characterization of Lactobacillus fermentum in Ghanaian Fermented Maize Dough. Applied and Environmental Microbiology, 65; 3213- 3221
Heyndrickx, M., Vauterin, L., Vandamme, P., Kersters, K. and De Vos, P. 1996.
Applicability of combined amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) patterns in bacterial phylogeny and taxonomy J. Microbiol. Meth., pp.247-259.
Holzapfel, W.H., Haberer, P., Geisen, R., Bjorkroth, J. and Schillinger, U. 2001.
Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. Am J. Clin. Microbiol. 73: 365S–73S.
Hooper, L.V. and Macpherson, A.J. 2010. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol., 10(3):159-69.
doi: 10.1038/nri2710.
Hoover, G. and Steenson, L.R. 1993. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Academic Press Inc., New York.
Horvath, P., Coute-Monvoisin, A.C., Romero, D.A., Boyaval, P., Fremaux, C. and Barrangou, R. 2009. Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid bacteria genomes. Int J Food Microbiol. 30;131(1):62-70. doi:
10.1016/j.ijfoodmicro.2008.05.030.
Johansson, M.L., Quednau, M., Molln, G. and Ahrne, S. 1995. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for rapid typing of Lactobacillus plantarum strains. Letters in Applied Microbiology, 21; 155-159
Kandler, O. 1983. Carbohydrate Metabolism in Lactic Acid Bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 49, 209-224. doi.org/10.1007/BF00399499.
Kimura, K., McCartney, A.L., McConnell, M.A. and Tannock, G.W. 1997. Analysis of fecal populations of bifidobacteria and lactobacilli, and investigation of the immunological responses of their human hosts to the predominant strains.
Appl Environ Microbiol.; 63:3394–8.
27
Kranenburgab, R., Kleerebezemab, M., Hylckama, J., Björn, V. and Boekhorstc, J.
2002. Flavour formation from amino acids by lactic acid bacteria: predictions from genome sequence analysis. International Dairy Journal volume 12, Issues 2–3, pages 111-121.
Kwon, O.S. 2000. Characterization of isolated Lactobacillus spp. and classification by RAPD-PCR analysis. Journal of MicrobiologySeoul.;38(3):137-44.
Lahtinen, S., Ouwehand, A.C., Salminen, S. and von Wright, A. 2011. Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Fourth Edition
Morrison, D.J. and Preston, T. 2016. Formation of short chain fatty acids by the gut microbiota and their impact on human metabolism. Gut Microbes.;7:189–200.
doi: 10.1080/19490976.2015.1134082.
Oneca, M., Irigoyen, A., Ortigosa, M. and Torre, P. 2003. PCR and RAPD identi¢cation of L. plantarum strains isolated from ovine milk and cheese.
Geographical distribution of strains. FEMS Microbiology Letters, 227; 271- 277
Orla-Jensen, S. 1919. The Latic Acid Bacteria. Andr. Fred. Host and Son, Copenhagen.
O'Sullivan, D.J. and Kullen, M.J. 1999. Tracking of probiotic bifidobacteria in the intestine.Int Dairy J; 8: 513–25.
Palomino, J.M., Arbol, J.T., Benomar, N., Abriouel, H., Canamero, M.M., Pulido, A.G.R.P. 2015. Application of Lactobacillus plantarum Lb9 as starter culture in caper berry fermentation. LWT-Food Science and Technology, 60; 788-794 Resta-Lenert, S. and Barrett, K.E. 2006. Probiotics and commensals reverse TNF- alpha- and IFN-gamma-induced dysfunction in human intestinal epithelial cells. Gastroenterology.;130(3):731–746. doi: 10.1053/j.gastro.2005.12.015.
Rossetti, L. and Giraffa, G. 2005. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprints databases, 2005. Journal of Microbiological Methods, 63; 135-144
Saarela, M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. and Mattila-Sandholm T. 2000.
Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J.
Biotechnol.84:197-215.
Salminen, S., Nybom, S., Meriluoto, J., Collado, M.C., Vesterlund, S. and El-Nezami, H. 2010. Interaction of probiotics and pathogens—benefits to human health Curr Opin Biotechnol.;21(2):157–167. doi: 10.1016/j.copbio.
Samarzija, D., Sikora, S., Redzepovic, S., Antunac, N. and Havranek, J. 2002.
Application of RAPD analysis for identification of Lactococcus lactis subsp.
cremoris strains isolated from artisanal cultures. Microbiological Research, 157; 13-17
Sanchez, I., Sesena, S. and Palop, L.L. 2004. Polyphasic study of the genetic diversity of lactobacilli associated with ‘Almagro’ eggplants spontaneous fermentation, based on combined numerical analysis of randomly amplified polymorphic DNA and pulsed-field gel electrophoresis patterns, 97; 446-458
28
Schillinger, U., Nuha, M.K., Sesar Y.L. and Franz, C.M.A.P. 2003. Use of Group- Specific and RAPD-PCR Analyses for Rapid Differentiation of Lactobacillus Strains from Probiotic Yogurts. Current Microbiology Vol. 47, pp. 453–456 DOI: 10.1007/s00284-003-4067-8.
Scihilinger, U., Yousif, N.M., Sesar, L. and Franz, C.M. 2003. Use of group-specific and RAPD-PCR analyses for rapid differentiation of Lactobacillus strains from probiotic yogurts. Current Microbiology, 47; 453-6
Seegers, F.F.M.L. 2002. Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects. Trends in Biotechnology volume 20, Issue 12, pages 508-515.
Sesena, S., Sanchez, I. and Palop, L. 2005. Characterization of Lactobacillus straiıns and monitoring by RAPD-PCR in controlled fermentations of ‘Almagro’
eggplants. International Journal of Food Microbiology, 104; 325-335
Sillma, R., Daneshwar, P. and Subhasisa, B. 2015. Repetitive element palindromic PCR (rep-PCR) as a genetic tool to study interspecific diversity in Euphorbiaceae family. Electronic Journal of Biotechnology Volume 18, Issue 6, pages 412- 417.
Spano, G., Beneduce, L., Tarantino, D., Zapparoli, G. and Massa, S. 2002.
Characterization of Lactobacillus plantarum from wine must by PCR species- specific and RAPD-PCR. Letters in Applied Microbiology, 35; 370-374
Stiles, M.E. and Holzapfel, W.H. 1997. Lactic Acid Bacteria of Foods and Their Current Taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36, 1-29.
Tappenden, K.A. and Deutsch, A.S. 2007. The physiological relevance of the intestinal microbiota: contributions to human health. J. Am. Coll. Nutr. 26:679S-683S.
Tingey, S.V and del Tufo, J.P. 1993. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers. Plant Physiol.;101(2):349- 52.
Torriani, S., Clementi, F., Vancanneyt, M., Hoste, B., Dellaglio, F. and Kersters, K.
2001. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus and L.
paraplantarum Species by RAPD-PCR and AFLP. Systematic and Applied Microbiology, 24; 554-560
Tsafrakidou, P., Bozoudi, D., Pavlidou, S., Kotzamanidis, C., Hatzikamar, M., Zdragas, A. and Litopoulou-Tzanetaki, E. 2016. Technological, phenotypic and genotypic characterization of lactobacilli from Graviera Kritis PDO Greek cheese, manufactured at two traditional dairies. LWT - Food Science and Technology, 68; 681-689.
Van Reenen, C.A. and Dicks, L.M.T. 1996. Evaluation of Numerical Analysis of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a Method to Differentiate Lactobacillus plantarum and Lactobacillus pentosus. Current Microbiology, 32; 183-187
Weising, K., Nybom, H., Pfenninger, M., Wolff, K., Nybom, H., Pfenninger, M., Wolff, K. and Meyer, W. 1994. DNA Fingerprinting in Plants and Fungi. CRC press, DNA Fingerprinting in Plants and Fungi.
Wells, J.M., Konstanino S., Koning I. and Karczewsk, J. 2008. Effects of probiotic and commensals on epithelial barrier function. International Journal of Probiotics
29
and Prebiotics. International Journal of Probiotics and Prebiotics. 3(3):127–
132.
Wells, J.M. and Mercenie A. 2008. Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria. Nat. Rev. Microbiol.;6(5):349-62. doi:
10.1038/nrmicro1840.
Wells, J.M., Rossi, O., Meijerink, M. and Van-Baarlen, P. 2011. Epithelial crosstalk at the microbiota-mucosal interface. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 108:4607–
4614.
Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18, 7213 7218.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafaliski, J.A. and Tingey, S.V. 1990.
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as geneticmarkers. Nucleic Acids Res.18, 6531–6535.
30 EKLER
EK 1 Bakteri Kültür Ortamlarının Gelşimi için Kullanılan Besiyeri EK 2 Tampon ve Çözeltiler
EK 3 DNA Analizinde Kullanılan Marker EK 4 Kimyasallar
31
EK 1 Bakteri Kültür Ortamlarinin Gelşimi için Kullanilan Besiyeri
MRS Besiyeri (52.2gr/l)
Bileşen Miktar (g/L)
Kazein pepton 10
Et Ekstraktı 8
Maya ekstraktı 4
Glukoz 20
Dipotasyum hidrojenfosfat 2
MgSO4.7H20 0,5
MnSO44H20 0,2
Tween 80 1
Triamonyum sitrat 2
Sodyum asetat 5
Ph: 6,8± 0,2
100 ml’de 5.22 gr hazır besiyeri içeriği çözülerek hazırlanmış olup sterilizasyon 121°C’de 15 dakikada yapılmıştır.
32 EK 2 Tampon ve Çözeltiler
TBE TAMPONU (Tris-Borik Asit-EDTA) 10X (pH: 8,3)
İçerik Miktar
Tris Baz 108,0 gr
Borik asit 55,0 gr
EDTA (0.5M pH: 8,0) 40 ml
Distile su 1 lt
Hazırlanan solüsyon otoklavda sterilize edilir (121°C, 15 dakika). Çalışmada kullanılan 1X konsantrasyon; 10X stoktan 100 ml alınıp üzeri 900 ml distile su ile tamamlanarak hazır hale getirilmiştir.
EDTA (0.5M, pH: 8,0)
18,6 gr EDTA hassas terazide tartılarak son hacim 100 ml olacak şekilde distile su içerisinde çözülerek pH: 8,0’e ayarlanır.
ETİDYUM BROMİT ÇÖZELTİSİ
İçerik Miktar
Etidyum Bromi 1,0 gr
Distile su 100 ml
Hazırlanan solüsyon 0.22 µm çapındaki membran filtreden geçirilerek koyu renk, ışık almayan bir şişede +4°C’da muhafaza edilir.
33 FTS ÇÖZELTİSİ (Fizyolojik Tuzlu Su)
İçerik Miktar
NaCl 0,85 gr
Distile su 100 ml
Hazırlanan solüsyon otoklav kullanılarak sterilize edilir (121°C, 15 dakika).
% 50’lik GLİSEROL ÇÖZELTİSİ
İçerik Miktar
Gliserol 25 ml
Distile su 25 ml
Hazırlanan solüsyon otovlav kullanılarak sterilize edilir ( 121°C, 15 dakika).
% 1.5’lik AGAROZ JEL
İçerik Miktar
Agaroz 1,5 gr
1X TBE Tamponu 100 ml
Agaroz 1,6 gr olacak şekilde hassas terazi ile tartılarak 100 ml 1X TBE Tamponu içerisinde mikrodalga fırında yüksek sıcaklıkta homojen hale getirilir. Jel soğuduktan sonra 5 µl etidyum bromit çözeltisi eklenir.
34
EK 3 DNA Analizinde Kullanilan Moleküler Marker
Marka: Bio Basic 100-1000bp DNA Marker; CAT.#: GM343
35 EK 4 Kimyasallar
Kimyasal Adı Marka
1000bp DNA Ladder BIO BASIC INC.
Agaroz SIGMA
Borik Asit ISOLAB
EDTA ISOLAB
Etidyum Bromit SIGMA
Gliserol FISHER SCIENTIFIC
MRS MERCK
NaCl FISHERSCIENTIFIC
Tris-Base FISHER SCIENTIFIC
36 ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Kemal KAYAŞLI Doğum Yeri : Gazimağusa / K.K.T.C.
Doğum Tarihi : 03.11.1993 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise : Namık Kemal Lisesi (K.K.T.C), (2011)
Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, (2015) Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı, (Eylül 2015- Şubat 2019)
