Reprod Biomed Online, 2011; 23: 207-212
IVF sırasında Hepatit B virusun sperm motilitesi ve fertilizasyona olumsuz etkileri
Pierre Oger, Chadi Yazbeck, Anne Gervai, Beatrice Dorphin, Clemence Gout, Laetitia Jacquesson ve ark.
Özet
Hepatit B virus enfeksiyonunun fertilite sonuçlarına etkisi halen açık değildir. Daha önceki yayınlarda HBV ile enfekte hastalarda spermatozoalarda azalmış motilite bildirilmiştir. HBV S proteinlerinin in vitro ortamda insan sperm fonksiyonlarına ve fertilizasyon sonuçlarına etkisi gösterilmiştir. Bu vaka- kontrol çalışmasında, erkekte HBV enfeksiyonu olan hastaların 32 siklusu ile, enfeksiyonu olmayan hastaların 64 siklusu karşılaştırıldı. Gruplar arasındaki yaş, zaman periodu, siklus aşaması ve oosit toplama günündeki sperm parametreleri eşleştirilmiştir. HBV grubunda şeçilimden önce sperm motilitesi belirgin olarak düşük saptanmıştı (%36.3±11.6’ye karşılık
%45.3±14.4, p=0.003). HBV grubunda daha düşük fertilizasyon hızları(LFR) görülmüştü (%34.4’e karşılık %15.6, p=0.036) ve her ne kadar 2. ve 3. gün embriyo kaliteleri arasında fark olmasada, transfer için uygun embriyo sayıları düşük bulunmuştu. Implantasyon ve gebelik hızları iki grup arasında karşılaştırılmıştır. Bu çalışma in vivo olarak HBV’nin sperm motilitesine zararlı etkilerinin olduğunu ve erkek partnerde enfeksiyon varlığında IVF sonrası LFR için artmış risk varlığı görülmüştür.
Anahtar kelimeler: Fertilizasyon, hepatit B virus, IVF, sperm motilitesi
Giriş
Hepatit B virusu akut ve kronik hepatit, siroz ve hepatoselluler karsinoma için bilinen major epidemiyolojik bir ajandır. Dünya çapında yaklaşık 2 milyar insan bu virus ile enfekte olmuştur, bunlarında 350 milyonu kronik enfeksiyonla yaşamaktadır ve bunlar sürekli bir viral geçişe neden olmaktadır (Liaw ve Chu, 2009). Kuzey Avrupa’da prevalans %1’ın altındadır ve erkekler kadınlardan 2 kat fazla etkilenmişlerdir (Honeck va ark., 2006).
Hepatit B’nin bulaşıcılığı onun infekte insanların çoğu vücut salgısında bulunmasından kaynaklanmaktadır: kan, semen, vajinal sekresyonlar ve tükrük gibi (Heatcote ve ark., 1974; Jenison ve ark., 1987). Sonuç olarak, HBV seksual temas ile de geçmektedir ve partnerler kondomsuz cinsel ilişkiye müsade etmeden önce mutlaka aşılanmalıdırlar (Scott ve ark., 1980). HBV karaciğerde bir hastalık tesbit edildiğinde tedavi edilmektedir, ancak IVF teknolojisinde bile enfeksiyonun kendisi tedavinin bir göstergesi değildir. Yardımcı üreme teknikleri uygulannırken, amaç diğer partnere ve diğer hastalara enfeksiyonu bulaştırmadan sağlıklı bir bebek vermektir.
Bakterial ve viral enfeksiyonların insan fertilitesi üzerine zararları net bilinmemektedir (Collodel ve ark., 2005; Durazzo ve ark., 2006;Figura ve ark., 2002).
HBV’nin sperm fonksiyonları üzerindeki olumsuz etkileri (progressif /non-linear motilite ve cumulus-free hamster oosit penetrasyonunu azaltmak gibi) yakın zamanda rapor edilmiştir (Zhou ve ark., 2009). Dahası HBV insan sperm DNA’sına integre olmakta ve mutagenik etkilere neden olmaktadır; sonuç olarak, kabul edilmiştir ki HBV genler aracılığıyla vertikal olarak sonraki nesillere aktarılabilmektedir(Ali ve ark., 2006; Huang ve ark., 2003; Wang ve ark., 2003).
HBV ile enfekte hastalar değişmiş sperm parametrelerine sahiptir (Huret ve ark., 1986; Moretti ve ark., 2008; Vicari ve ark., 2006). Ancak bu raporlar özelliklede IVF sonuçları için, HBV’nin sperm kalitesi üzerine in-vivo etkilerine ilişkin olarak kesinleşmiş değildir (Lam ve ark., 2010; Pirwany ve ark., 2004).
Bu retrospektif vaka-kontrol çalışması, HBV’nin sperm parametreleri ve fertilasyon hızları, embrio kalitesi ve standart IVF sonrası gebelik oranlarını incelemek için yapılmıştır.
Maternal Metod
Hasta populasyonu: Bu 1:2 eşleştirilmiş vaka-kontrol çalışması, enfeksiyon geçmişi
hakkındaki bilgileri de kapsayan, çalışma merkezindeki kayıtlar kullanılarak yapılmıştır. Vakalar, erkekte hepatit B yüzey antijeni (HBsAg) pozitif olan, Ocak 2005 ve Mart 2008 tarihleri arasında IVF siklusu için Bichat-Claude Bernard Üniversite hastanesi yardımlı üreme teknikleri merkezine başvuran çiftlerden oluşuyordu (n:32).
Eşler HBV enfeksiyonunu atlatmış veya aşı olmuşlardı. İmmun enzimatik assay ile bakılan HBsAg konsantrasyonunun 10 mIU/ml’e eşit veya bu değerden fazla olması koruyucu cevap olarak düşünüldü.
Aynı zaman periyodu içerisinde çalışma merkezine başvuran ancak viral enfeksiyon hikayesi olmayan çiftler arasından, her vaka için iki adet kontrol rastgele olarak seçildi (n:64). Kontroller ve vakalar, yaş (kadınlar arasında 2 yaş; erkekler 40 yaşından daha genç veya yaşlı) ve oosit toplanma günündeki motil spermatozoa sayısı (vaka grubunda ortanca değerlerin değişkenlerinin dağılımına karşılık gelen 24.25 milyon az veya fazla) açısından eşleştirildi. Sadece ilk iki IVF denemesi değerlendirildi. Oosit toplama gününde hiç oositi ve uygun spermatozoası olmayanlar veya erkekte genetik anormalliği olan vaka ve kontroller çalışmadan çıkarıldılar.
HBV enfeksiyonu olan hastalar Batı Afrika(n:18), orta Amerika (n:5), Asya (n:5), Hindistan (n:1), Akdeniz bölgesi (n:3) veya doğu Avrupa’dan (n:2) gelmişlerdi.
25 hasta log 1.92 ve 7.14 /ml arasında viral yüke sahipti, 7 hastada bu değer saptanmamıştı. Hastaların hiç birinde siroz veya hepatit D enfeksiyonu yoktu.
Sadece bir hasta yardımlı üreme tedavisi öncesinde antiviral tedavi almıştı.
Semen analizi:Semen örnekleri 3-5 günlük cinsel perhiz sonrası, steril kaplara
laboratuar ortamında masturbasyon ile elde edildi. Semen WHO (Dünya Sağlık Örgütü, 1992) kriterlerine göre incelenmeden likefaksiyon olması için 37 ’de 30⁰ dakika tutuldular. Ejakulatın volumu derecelendirilmiş pipet ile ölçüldü. Semen pH’ı , pH kağıdı ile okundu ( aralık pH6.1-10.0). yoğunluk normal, düşük ve yüksek olarak sınıflandırıldı. Sperm motilitesi, 37 ’de 22 mmX22mm’lik lamel üzerine konan 10 µl⁰ semen ile X400 faz-kontrast büyütmede yapıldı. Motilite WHO kriterlerine göre şu şekilde derecelendirildi: (i) hızlı progresif hareketli, (ii) yavaş progresif hareketli, (iii)non-progresif hareketli; ve (iv) hareketsiz. Sperm canlılığı eosin-nigrosin uygulandıktan sonra smear yapılarak değerlendirildi. Spermatozoa ve sperm dışı hücrelerin konsantrasyonu hemocytometre ile katlanarak 1/10- 1/40 formalin dilatasyonu örneklerinde incelendi. Sperm morfolojisi modifiye David klasifikasyonuna göre (Auger ve ark., 2001) shorr-stained smearler ile 1000’lik büyütmede incelendi. Motilite, canlılık ve normal morfoloji, yüzde olarak verildi.
Semen bakterial analizi her erkeğe yapıldı. Sık karşılaşılan bakteriler, mikoplazma ve klamidyaya bakıldı.
Stimulasyon protokolleri:Gonadotropin agonistleri (GnRH-a; triptorelin acetate,
decapeptyl;Ipsen, Fransa) ile hipofiz supresyonu yapıldı, bunlar subkutan olarak 0.1 mg/gün dozunda, spontan menstrual siklusun 21. Günü olmak üzere ve 10-14 gün süresince, tam hipofizer aktivite supresyonu (long protokol) veya rFSH
başlanmasında 1-3 gün öncesine kadar (short protokol) uygulandı. Rekombinant FSH’ın ( Gonal F;Merck, Fransa; veya Puregon;Shering-Plough, Fransa) veya human menopausal gonadotropin (Menopur; Ferring, Fransa) başlangıç dozu 150 ve 300 IU/gün arasında değişiyordu. GnRH antagonist sikluslarda, GnRH antagonist (ganirelix, Orgalutran, 0.25 mg/gün, shering-Plough, Fransa; veya Cetrotide, Merck, 0.25 mg/gün, Fransa) dominant follikül en geniş çapı 14 mm olunca başlandı ve human chorionic gonadotropin gününe kadar yapıldı. Folliküler büyüme ve maturasyon kriterler uygun olarak ultrason takibi ve serum E2 bakılarak her hastaya uygulanacak süreç ve doz belirlendi. Tek doz recombinant human chorionic gonadotropin (0.5 ml Ovitrelle 250, Merck) en az 3 adet 17 mm’lik follikül geliştiğinde yapıldı. Oosit toplama 36-38 saat sonra ultrason –guided igne ile yapıldı. Luteal faz supresyonu oosit toplama işleminden sonra 400 mg/gün vajinal progesteron (utrogestan, Besins Laboratory, Montrouge, Fransa) ile gebelik testine ( embrio transferinden 12 gün sonrası) kadar başlandı ve gebelik testi pozitifse gebeliğin 10.
Haftasına kadar eğer mümkünse devam edildi.
IVF prosedürü: Semen örnekleri labaratuar ortamında masturbasyonla steril kaba 3-5
günlük cinsel perhiz sonrası toplandı. Taze ejakule olan semen WHO’nun kriterlerine uygun olarak iki-tabaka gradiente (90/45, v/v) ( PureSperm; Origio, Limonest, Fransa) hazırlandı. Son pelletler bir kez yıkandı, Universal IVF Mediuma (Origio) resuspende edildi ve 37⁰C’de saklandı. Universal IVF Medium (Origio) içinde hazırlanan spermatozoalar oosit toplanmasından 2 saat sonra inseminasyon için kullanıldı. Embriolar ISM1 mediumda 3-5 güne kadar kültüre edildiler. Sperm inseminasyonundan 25 saat sonra erken klivaj için embriolar incelendi. İkinci gün embrioları sperm inseminasyonundan 40-44 saat sonra görülmeye başlandı.
Fertilizasyon oranı, 2 pronükleuslu (2PN) oosit oranı olarak ifade edilir. 1’den 3’e
kadar iyi kalite embrio, uterin kaviteye oosit toplamadan(retrieval) 2, 3 veya 5 gün sonra transfer edildi. Tüm transferler ultrason kılavuzluğunda yumuşak kateter ile (Elliocath, Prince Medikal, ercuis, Fransa) yapıldı. Ekstra embriolar, sonraki transferler için donduruldu. Noci et al. (2005) ve Gardner et al. (2000) embrio ve blastokist derecelendirilmesini için embrioklasifikasyonunda kullanıldı.
IVF sonuçlarının ölçülmesi: Hasta karakterleri kaydedildi, yaş, tip, period ve infertilite
etyolojisi; over rezervi (siklusun 3. Günü FSH ve anti-müllerian hormon konsantrasyonu; antral follikül sayımı); ve sperm parametreleri. Tedavi sikluslarındaki bilgilerde kaydedildi: gonadotropin doz ve tipi; human chorionic gonadotropin günündeki E2 konsantrasyonu, toplanan oosit sayısı; ve oosit toplanma günündeki semen parametreleri. Fertilizasyon oranı, iyi kalite embrioların (tip A ve B) sayısı, implantasyon ve gebelik oranı kayıt edildi ve iki grup arasında karşılaştırıldı. Primer sonuç olan fertilizasyon oranları, düşük fertilizasyon oranı (LFR) (oosit fertilizasyonun
≤%33, değişkenlerin dağılımında %10’luk percentile denk gelen) veya yüksek fertilizasyon oranı (HFR) (oosit fertilizasyonun >%33). Klinik gebelik tanısı 7 haftada gestasyonel sac içerisinde fetal kalp atımlarının izlenmesi ile kondu. İmplantasyon oranı transfer edilen embrio başına düşen gestasyonel sac sayısına göre tanımlandı.
İstatistiksel analiz: SAS versiyon 9.1.3 (SAS kurumu Cary, NC, USA) ile tüm istatistiksel analizler yapıldı.
Sonuç
Tablo 1 ve 2 temel karakterleri, IVF prosedurunu ve seçilmiş hastalardaki sonuçları özetlemektedir. Gruplar arasında hastaların özelliklerinde fark yoktu (yaş, over rezervi, infertilite faktörleri ve oosit derecesi) (Tablo 1). Her ne kadar sperm
motilitesinde sperm seçiliminden önce HBV- pozitif hastalarda anlamlı oranda düşüklük mevcuttu. (36.3±11.6’ya karşılık 45.3±14.4, p=0.003).
Siklus karakterleri ile ilişkin anlamlı fark yoktu. Tüm fertilizasyon oranları gruplar arasında karşılaştırıldı (%55’e karşın %65.6), ancak (LFR) HBV grubunda kontrollere göre daha sıklıkla karşılaşıldı (%34.4’e karşılık %15.6, p=0.036)(Tablo 2).
HBV ve kontrol gruplarının siklusları arasında total fertilizasyon başarısızlığı sırasıyla
%9.4’e karşılık %4.7 oranında görüldü, ancak istatistiksel fark izlenmedi. Embrio transferi yapılmayan siklus sayısı, vaka ve kontrol grupları arasında benzerdi (%15.6’a karşılık %10.9). bunun sebepleri tam fertilizasyon başarısızlığı (n:6), kötü embrio kalitesi (n=4), ovarian hiperstimulasyon sendromu (n=1) ve kültür kabının kontaminasyonu (n=1). Embrio kaliteleri ve frozen embrio sayıları arasında belirgin fark izlenmedi.
Tablo 3 iki grup arasındaki IVF siklus sonuçlarını özetlemektedir. Implantasyon oranı (%13.5’e karşılık %20), siklus başına klinik gebelik oranı (%18.8’e karşılık
%31.3) ve transfer için (%23.1’e karşılık %35.1) iki grup için karşılaştırıldı.
Tüm faktörlerin değerlendirilmesi sonucunda erkek HBV enfeksiyonu artmış düşük fertilizasyon oranlarına (LFR) neden olduğu izlenmiştir (OR=5.1;%95 Cl1.03- 96.23);(Tablo 4).
Tartışma
Bu çalışma göstermiştir ki, semen hazırlamasından önce HBV ile enfekte erkeklerin spermatozoalarının motiliteleri düşüktür. Bu gözlem 15 HBV pozitif hastada daha önceki bir çalışmada gösterilmiştir: kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bunların 2 tanesi azospermik ve 12 tanesi orta düzey ama anlamlı olarak asthenozoospermikti. Bu bozuk motilite, spermatozoaların artmış nekroz ve
apopitozisi ile ilişkilidir. (moretti ve ark., 2008). Bu çalışmada, sperm canlılığı gruplar arasında karşılaştırıldı ve ancak düşük motiliteyi açıklayamadı. Bu konudaki in-vivo gözlemler sonucu önerilen bir hipoteze göre HBV’nın glikoprotein reseptör ASGP-R’e bağlanması sperm mitokondrial membran potansiyelinin kaybına yol açarak, insan sperm motilitesinin azalmasından sorumlu olabilir (Zhou ve ark., 2009). Zhou ve ark.
(2009) viral yükün fazla olmasının, sperm motilitesinin bozukluğu ile ilişkili olduğunu düşünmüşlerdir. Plazma viral yükünün fazla olması, semende virus saptanma riskini arttırır (Jenison ve ark., 1987), aynı zamanda plazmada önemli bir viral replikasyon olmamasına rağmen, semende virus varlığının saptanması mümkündür (Davison ve ark.). in-vivo plasma viral yükü ve sperm şeçim öncesi sperm motilitesi arasında hiçbir korelasyon saptanmamıştır (bilgi gösterilmemiştir), IVF günündeki seminal ve plasma viral yükünün dozuna bağlı olarak direkt değerlendirilir.
Bu çalışma aynı zamanda çiftlerin, HBV kronik enfeksiyonu olan erkeklerin, IVF sonrası daha yüksek LFR riski olduğunu, belirgin total embrio sayısı düşüklüğüne neden olduğunu göstermiştir. Bilindiği kadarıyla, bu çalışma erkek HBV infeksiyonunun, fertilizasyon üzerindeki kötü etkilerini gösteren ilk klinik çalışmadır, daha öncekiler in vivo sonuçları onaylamaktadır (Zhou ve ark., 2009). Böylece, gebelik oranlarında anlamlı bir düşüş gözlenmedi, çünkü LFR, transfer için uygun iyi- kalite embrio sayısını anlamlı olarak düşürmemiştir.
Pirwany ve ark. (2004), HBsAg pozitif erkeklerin IVF veya intrasitoplasmik sperm injection(ICSI) sonuçları üzerinde çalışmış ve fertilizasyon ve klivaj hızlarında vakalar ve kontroller arasında hiç fark saptamamışlardır: 13 hepatit B ile enfekte çift, 12 hepatit C pozitif çift ve 27 kontrolle eşleştirilmiştir. Daha geniş bir karşılaştırmalı çalışmada (sadece erkeğin infekte olduğu 102 HBV çiftine karşılık 204 kontrol çifti), Zhao ve ark. (2007) IVF tedavi sonuçlarını kronik HBV enfeksiyonunun etkilemediğini
rapor etmişlerdir. Yakın zamanda, Lam ve ark. (2010) kadında HBV olan ancak erkekte infeksiyon olmayan (n=14) bir grupta IVF ve ICSI sonrası gebelik ve implantasyon hızlarının daha iyi olduğunun bulmuştur.
Eğer uygun data bulunabilirse HBV’nin sperm fonksiyonları üzerindeki in-vivo etkilerini netleşebilir, o zamana kadar HBV enfeksiyonunun IVF sonuçlarına etkisi halen araştırılmalıdır. Bilinmektedir ki, HBV virusu semen sıvısında serbest bulunabilir ama aynı zamanda germ ve somatik hücrelerin genomuna integrede olabilir ve sonra mutajenik olabilir (Davison ve ark., 1987;Hadchouel ve ark., 1985;
Huang ve ark., 2003; lang, 1993). Ama bu virus direkt olarak hücre lezyonlarında sorumlu değildir, immun sistemi düşürür, bu karaciğer hasarına ve virus kontrolune neden olan temel mekanizmadır (Liaw ve Chu, 2009). Dahası, bazı virusler, prematur kromozom kondensasyonuna neden olur (Aula, 1973). LFR bu çalışmada IVF’den sonra seçilmemiş spermatozoaların motilitesinin düşmesi ile açıklanamaz, iki grupta oosit toplanma gününde seçilmiş spermatozoaların progresif motilitesi ile eşleştirilmiştir. Diğer bakterilerin ve lökositlerin potansiyel rolleri dışlandı, ovarian stimulasyon öncesi tüm bakteri analizleri kontrol edildi. HBV ile arttırılan persistan inflamatuar cevap sperm nuklear dekondensasyonu sonuçu spermatozoaya zararlı olabilir.
Çoğu çalışma hastalar genotip E’in predominant olduğu Afrikadandı, diğer çalışmalarda ise genotip B ve C ile enfekte Asyalı hastalar vardı (Liaw ve Chu, 2009).
Bu farklarda gene bu çalışmanın sonuçlarını açıklayabilir. Bu genotip etkisi hipotezi daha çok çalışma ile doğrulanmalı veya dışlanmalıdır.
Eğer HVB’nin genoma integrasyonu mümkünse de, ICSI sonrası vertikal geçiş saptanan hiçbir vaka bildirilmemiştir. Bir makalede Afrikalı babadan çocuklarına
doğal konsepsiyon sonrası HBV geçişi bildirilmiştir (Wang et al., 2003). Her ne kadar, hepatit B e antijeni (HBeAg) Asya’lı taşıyıcılarda daha yükseksede, HBeAg-pozitif hastalar çoğunlukla daha yüksek viral yüke sahiptir (Liaw ve Chu, 2009).
Sonuçta, bu çalışmada HBV ile enfekte erkeklerin spermatozoasında progresif motilitenin düştüğü ve IVF sonrası yüksek LFR riski olduğu gösterilmiştir. Bu çiftlere, ilk stimulasyon siklusunda, mixed teknik (yarım ICSI, yarım IVF) yapılması önerilebilir. HBV’nin in-vitro blastokist aşamasına ve gebelik oranlarına etkisi, HBV ile enfekte olmuş erkeklerin anormal sperm parametreleri ile iişkileri, ve genotip ve/veya kan ve semendeki viral yük, bunlar halen araştırılmaktadır.
