Kromatografi – Genel Bilgi

(1)

Kromatografi – Genel Bilgi

T.C.

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ

FARMAKOLOJİ VE TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI

(2)

Ayırma

• Analiz

• Tanımlama

• Saflaştırma

• Hesaplama

Bileşenler Karışım

Kromatografi Nedir?

• Kromatografi karışım halindeki maddeleri analiz etmek, tanımlamak, saflaştırmak ve karışım

içerisindeki miktarını ölçmek amacı ile bileşenlerine ayırmak için kullanılan bir tekniktir.

(3)

Kromatografi Nedir?

• Kromatografi bilimsel anlamda ilk defa 1906 yılında bir Rus botanikçi olan Mikhail S. Tswett tarafından bitkilerin renk verici bileşenlerinin ayrılmasında

kullanılmıştır.

• Tswett renkli maddelerin ayrı bandlarını elde ettiği için metodunu “kromatografi” olarak isimlendirmiştir.

• Yöntemler renksiz maddelere tatbik edildiğinde bu yanlış bir isim olsa da kati bir şekilde

yerleşmiş olan kromatografi terimi yerini başka bir isme bırakamamıştır.

(4)

Kromatografi Nedir?

• Kromatografi bir karışım içerisindeki bileşenleri hareketli ve sabit faz içinden geçirirken bu fazlara

değişik ilgilerinden yararlanarak ayrımlarını sağlayan bir laboratuvar tekniğidir.

• Kromatografi yönteminde;

• Bileşikler öncelikle sabit fazda tutulur.

• Hareketli faz sabit faz boyunca geçirilir.

• Hareketli faz sabit fazdan geçerken bileşikleri çözer.

• Hareketli faz her bileşiği sabit fazdan alarak belli aralıklarla ilgisi dolayısı ile taşır ve karışım

içerisindeki bileşenlerin ayrımı gerçekleşir.

(5)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1850’li yıllarda Schönbein ilk defa kağıt kromatografisini uygulamıştır.

• 1903 yılında Goppelsroeder kağıt parçacıklarını kullanarak alkaloid, boya, süt, yağ ve şarapta analizler yapmıştır.

• 1906 yılında Rus botanikçi M.Tswett bitki

ekstraklarından klorofili saflaştırarak kromatografiyi ilk defa bilimsel olarak kullanan kişi olarak tarihe

geçmiştir.

• 1913 yılında zeolitler ilk defa suyun yumuşatılması amacı ile kullanılmıştır.

(6)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1922 yılında Palmer karotenoidleri yağlardan ayırmayı başarmıştır.

• 1937 yılında Taylor ve Urey lityum izotoplarını iyon değişim kromatografisi ile ayrımını sağlamışlardır.

• 1938 yılında Izmailov ve Sharaiber ince tabaka kromatografisine temel oluşturan, yatay ince

kağıtlara damla kromatografisini keşfetmişlerdir.

• 1941 yılında Martin ve Synge aminoasitleri silika- jelden geçirirken sıvı-sıvı dağılım kromatografisini keşfetmişlerdir.

(7)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1945 yılında Gaz-katı adsorbsiyon kromatografisi kömür kolon kullanılarak oksijen ve karbondioksitin ayrımı yapılarak tanımlanmıştır.

• 1948 yılında Boldingh uzun zincirli yağ asitlerinin

ayrımını yaparken ters (reverse) faz kromatografisini keşfetmiştir.

• 1952 yılında Çalışmalarından dolayı Martin ve Synge NOBEL KİMYA ÖDÜLÜNE layık

görülmüşlerdir.

• 1953 yılında Wheaton ve Baurman iyon-değişim kromatografisini keşfetmiştir.

(8)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1955 yılında ABD’de Burrel Corp., Perkin-Elmer ve Podbielniak Şirketleri tarafından gaz kromatografi ilk kez tanıtılmıştır.

• 1958 yılında Stein, Moore ve Spackma iyon değişim kromatografisinde otomize aminoasit analizlerini

gerçekleştirmişlerdir.

• 1960 yılında Desty ilk kez kapillar kolonu gaz kromatografide kullanmıştır.

• 1966 yılında Green iyon değişim kromatografisinde otomize karbonhidrat analizlerini gerçekleştirmiştir

(9)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1966 yılında Horvath ve Lipsky Yale Üniversitesinde Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisini (HPLC)

keşfetmişlerdir.

• 1974 yılında Virtanen ticari kapillar elektroforezi geliştirmiştir.

• 1975 yılında Small, Stevens ve Bauman katyon değişimli iyon kromatografisini keşfetmişlerdir.

• 1981 yılında Novotny ve Lee kapillar süper krtik kromatografi içeren mikrokolon likit kromatografi yöntemini keşfetmilerdir.

(10)

Kromatografinin Tarihçesi

• 1985 yılında Dionex Şirketinde araştırmacı olan Pohl iyon kromatografide mikromembran supressorları

keşfetmiştir.

• 1990 yılında Perkin-Elmer Şirketi perfüzyon kromatografisini tanıtmıştır.

(11)

Kromatografinin Kullanım Alanları

Kromatografinin bilimsel amaçlarla kullanıldığı alanlar

• Analiz: Bir karışımı, karışımı oluşturan bileşenleri ve birbirlerine oranını incelemedir.

• Tanımlama: Bilinen bileşikler kullanılarak karışım

içerisindeki bilinmeyen bileşenlerin tanımlanmasıdır.

• Saflaştırma: Karışım içerisindeki bileşenlerden

birisini daha ileri araştırmalarda kullanmak amacı ile ayrılmasıdır.

• Miktar Tayini: Karışımda bulunan bileşenlerin

ayrımından sonra referans standartlar kullanarak miktarlarının belirlenmesidir.

(12)

Kromatografinin Kullanım Alanları

Kromatografinin günlük yaşamda kullanımı

• Hastaneler: Hastalardan elde edilen biyolojik örneklerde ilaç seviyelerinin belirlenmesi ve zehirlenmelerin teşhisi amacı ile kullanılır.

• Hukuki Uygulamalar: Elde edilen delillerden suç

teşkil edilecek şüpheli materyalin tespit edilmesi için kullanılır.

• Çevre Uygulamaları: Su, hava, toprak ve bitki

örneklerinden kirletici maddelerin belirlenmesi için kullanılır.

• Bitkisel Ekstraksiyon: Bitkisel üründen elde edilecek maddenin saflaştırılması işlemidir.

(13)

Kromatografi Yöntemi Seçimi

• Kromatografi yöntemlerinden GC ve HPLC seçimi için aşağıda özellikler dikkate alınır:

• Örneğin uçuculuğu dikkate alındığında HPLC’de uçucu olması gerekmez. Ancak analiz edilecek maddenin hareketli fazda çözünmesi gerekir.

• GC yönteminde ise numuneler analiz sıcaklık derecelerinde uçucu olmalıdır.

• Örneklerin yüksek sıcaklığa dayanıklılıkları dikkate alındığında HPLC yönteminde analizler oda

sıcaklığında yapılabilirken GC yönteminde yüksek sıcaklık uygulamaları söz konusu olduğu için örnek bu derecelerde dayanıklı olmalıdır.

(14)

Kromatografi Yöntemi Seçimi

• Örneklerin polar ya da polar olmaması GC veya HPLC’de analiz edilmelerini kısıtlayıcı bir etken değildir.

• Örneğin molekül ağırlığı dikkate alındığında HPLC yönteminde hareketli fazda çözünebilen herhangi

bir madde için molekül ağırlığı üst sınırlaması yoktur. GC yöntemde ise molekül ağırlığı < 500 dalton’dan (amu, atomic molecular unit) küçük olmalıdır.

• Örnek ve örnek çözücüleri dikkate alındığında

HPLC yöntemde çözücünün örneği çözmesi yeterli iken, GC yöntemde ek olarak çözücünün örnekten daha fazla uçucu özellikte olması gerekir.

(15)

Gaz Kromatografisi (GC)

(16)

23.03.2020

GC Sistemi & Temel Çalışma Prensipleri 16

Gaz Kromatografisi Sistemi

• Gaz Kromatografisi sisteminin temel

amacı; gaz fazına geçirilebilen bir

karışımdaki bileşiklerin ayrıştırılması,

tespiti ve miktarlarının ölçülmesidir.

(17)

23.03.2020

A

C B D

E

Numune: uçucu sıvı madde karışımı (~1L)

Kromatogram

0 5 10 15 20

Zaman (Dakika)

Miktar

A

B

C

D

E Gaz Kromatograf

(18)

23.03.2020 18

HPLC ve GC’nin Karşılaştırılması

Uçucu karboksilik asitler

Sülfonamidler

Nitrozamin Nitriller

Şekerlerin TMS türevleri

Epoksitler

C₂/C₇ hidrokarbonlar Aldehitler Ketonlar

Glifosat

Amino asitler Sentetik gıda boyaları

Glikoller

antioksidanlar

fenoller

Yağ asitleri

Organik fosforlu pestisidler

Esensiyal yağlar

PCB’ler Alkol

Aromatik aminler

Polimer monomerleri

Yağ asitlerinin metil esterleri

Aromatik esterler

Trigliseridler Fosfolipitler

Yağda çözünen vitaminler Anabolikler

PAH’lar

Aflatoksinler Enzimler

Şeker alkolleri

İnorganik iyonlar Şekerler

Antibiyotikler

Flavonoidler Doğal gıda boyaları

GC HPLC Hidrofilik

Hidrofobik Polarite

Uçucu Uçuculuk Uçucu olmayan

(19)

23.03.2020

Temel Kromatografi Prensibi

• Kromatografi sisteminde ayrıştırma

işlemi bir veya daha fazla analitin

sabit ve hareketli faz olarak

tanımlanan iki faz ile etkileşimleri

sonucu gerçekleşir.

(20)

23.03.2020

Temel Kromatografi Prensibi

• Hareketli Faz ; Analizi

gerçekleştireceğimiz kolondan analiz

süresince geçen gaz veya sıvıdır.

• Sabit Faz ; Hareket etmeyen sıvı veya

katıdır.

(21)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Teorisi

• Gaz kromatografisi sisteminde numune bileşenleri hareketli faz yardımıyla kolon boyunca hareket ederler.

• Numunedeki analitler sabit faz ve hareketli faz arasında bir

dağılıma (partisyon) uğrarlar.

• Sabit fazda çözünen analit molekülleri alıkonduklarından dolayı kolon boyunca hareket etmezler.

• Haraketli fazda olanlar ise kolon boyunca dedektöre doğru hareket ederler.

• Analitlerin her iki fazdaki dağılımları ve dolayısıyla her iki fazda geçirdikleri süreler birbirinden farklı olacağı için , kolon boyuncaki hareket hızlarıda birbirlerinden farklıdır.

(22)

23.03.2020

make-up (Azot/He)

H₂ Air septum purge

Dedektör

Taşıyıcı gaz split gaz çıkısı

Gaz Kromatografisi Sistemi

Yapısı

(23)

23.03.2020

Enjeksiyon Bloğu

• Enjeksiyon bloğunun görevi numuneyi

gaz fazına geçirmek ve kolona doğru

ilerlemesini sağlamaktır.

• Enjeksiyon septumdan yapılır.

• Septum enjeksiyon bloğu sıcaklığına

dayanıklı olmalıdır

• Gaz kaçağı ve kontaminasyona karşı

düzenli olarak değiştirilmelidir.

(24)

23.03.2020

Enjektör

Tekrarlanabilir sonuçlar alabilmek için hızlı ve tutarlı enjeksiyon yapmak gerekir.

(25)

23.03.2020

Enjeksiyon Metodları

• Sonuçların tekrarlanabilir olmamasının en

büyük nedeni kötü enjeksiyon tekniğidir.

• Otomatik enjektör mevcut ise

kullanılmalıdır.

• Mevcut değil ise farklı manuel enjeksiyon

teknikleri kullanılabilir.

(26)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

(27)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

(28)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

(29)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

(30)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

• Kapiler Kolon Temel Farklılıklar;

1. Daha küçük iç çap (ID) 2. Uzunluk

3. Dolgu maddesinin olmaması 4. Daha küçük numune kapasitesi

• Bu etkenler, analitin kolonda daha fazla süre kalmasını sağlarken, yüksek plaka sayısından dolayı pikin şeklinde bozulma olmaz.

(31)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

• Piklerin darlaştırılması hassasiyetin artmasına neden olur

Her iki pik aynı alana sahip olmasına rağmen, kapiler kolon sisteminde S/N oranı daha büyük olduğu için

hassasiyet artmıştır.

(32)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi Kolon

Türleri

(33)

23.03.2020

Kolon Parametreleri

Parametreleri:

• Sabit faz

• Kolon iç çapı

• Sabit faz film kalınlığı (d_f)

• Kolon uzunluğu

Özellikleri:

• Ayrıştırma

• Thermal kararlılık/

çalışma sıcaklığı

• Kolon kapasitesi

• Ömrü

• Numuneye karşı aktivitesi ve inert olması

• Kimyasal kararlılık d_f

i.d.

(34)

23.03.2020

Kolon ve Ayrıştırma

• Ayrıştırma

– Sabit faz seçiciliği

Sabit fazın kimyasal kompozisyonu karışımdaki bileşenleri ayırabilecek (alıkoyabilecek) şekilde olmalıdır.

• Ayrıştırma Gücü

– Uzunluk

– Film Kalınlığı

– Kolon İç çapı ile ilişkilidir.

(35)

23.03.2020

Sıcaklık Programı

• Gaz Kromatografisi sisteminde analiz

boyunca kolon fırını sıcaklığı

istenildiği doğrultuda

değiştirilebilir.Bu işlem sıcaklık

programı uygulaması olarak

adlandırılır.

(36)

23.03.2020

Sıcaklık Programı

• Alıkonma zamanı karbon sayısı arttıkça

artar.

• Alıkonma zamanı arttıkça piklerin

yüksekliği azalarak genişlikleri artar.

• Bu da geç gelen piklerin tespitini

güçleştirir.

• Sıcaklık programı sayesinde sıcaklık

yükseldikçe gazların sıvı içindeki

çözünürlükleri azaldığı için analitin

alıkonma zamanı azalır.

(37)

23.03.2020

Sıcaklık Programı

(38)

23.03.2020

Sıcaklık Programı

(39)

23.03.2020

Kolon Kanaması

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

100 °C 270 °C

300 °C 300 °C de 12 dk

kanama

• Kolon kanaması sabit fazın parçalanması

sonucu oluşanların elüsyonu sebebiyle

gerçekleşir.

(40)

23.03.2020

Kolon Kanaması

• Kolon kanaması düşük analit

konsantrasyonlarında interferanslara

sebeb olur.

• Yüksek hassasiyet ve yüksek sıcaklık

gerektiren analizler için düşük kolon

kanama özelliğine sahip kolonlar seçilir.

• Düşük kolon kanama özelliğine sahip

kolonlarda çarpraz bağ sabit fazlar

bulunur.

(41)

SE30, 30 m, 0.32 mm, 1,0 µm, -60/350 °C

Kolon numarası

Uzunluk (Metre)

İç çap

Film tabakası Kalınlığı (mikron)

Isı aralığı Kapiller Kolon Parametreleri

(42)

23.03.2020

Kolon iç çapı (i.d.)

• Kolon iç çapının etkileri:

Kolon verimliliği (rezolüsyon)

Analitlerin alıkonması

Kolon kapasitesi

Kolon içi basıncı

Taşıyıcı gaz akış hızı

i.d.

(43)

23.03.2020

Kolon iç çapı (i.d.)

• Kolon verimliliği (N/m) kolon iç çapı ile

ters orantılıdır.

– Küçük çaplı kolon , daha çok plaka sayısına sahip olduğu için kolon verimliliği daha iyidir.

– Küçük çaplı kolonlar piklerin iyi ayrıştırılması ve yüksek kolon verimliliği(dar pikler)

istenirse tercih edilirler.

(44)

23.03.2020

Kolon iç çapı (i.d.)

• Analitlerin alıkonmaları iç çapı ile

ters orantılıdır.

– Bu etki izotermal analizlerde oldukça belirgindir.

– Sıcaklık programının kullanıldığı analizlerde ise , alıkonma değeri izotermal analiz değerinin 1/3’ü kadardır.

(45)

23.03.2020

1.5 2.0 2.5 2.0 2.5

0.32 mm i.d.

15 m, 0. 25 m

0.25 mm i.d.

15 m, 0. 25 m

Kolon iç çapının çözünürlüğe

etkisi

(46)

23.03.2020

Kolon iç çapı

• Kolon kapasitesi , kolon iç çapı

arttıkça artar

– Bununla birlikte kolon kapasitesi aynı zamanda kolon film kalınlığına da

bağlıdır.

(47)

23.03.2020

Kolon iç çapı

• Kolon içi basıncı, kolon iç çapı

değiştikçe belirgin olarak değişir.

• Ör: 0.25 mm i.d. Kolon 0.32 mm i.d

kolonun ~1.7 katı kolon içi basıncına

sahiptir.

– GC analizlerinde daha küçük çaplı

kolonlar için oldukça yüksek basınçlar gerektiği için genelde 0.18 mm veya daha büyük çaplı kolonlar tercih

edilmektedir.

(48)

23.03.2020

Kolon iç çapı

• Taşıyıcı gaz akış hızı kolon iç

çapı arttıkça artar.

– Büyük çaplı kolonlar genelde

headspace veya purge and trap gibi cihazların gerektiği uygulamalarda kullanılır. (0.45 mm veya 0.53 mm)

– Küçük çaplı kolonlar ise (0.25~0.32 mm) GCMS

gibi düşük akış hızları gerektiren uygulamalarda kullanılır.

(49)

23.03.2020

Kolon iç çapı seçimi

özet

• 0.18~0.25 mm i.d. kolonlar

– Yüksek kolon verimliliği gerektiğinde

– Düşük gaz akış hızı gerektiren uygulamalarda

• 0.32 mm i.d. kolonlar yüksek kolon kapasitesi (numune yüklemesi) gerektiğinde

• 0.45~0.53 mm i.d. kolonlar

– Yüksek taşıyıcı gaz gerektiren uygulamalarda

– Daha büyük kolon kapasitesi gerektiren uygularda kullanılır.

(50)

23.03.2020

Film kalınlığı (d

_f

)

• İzotermal analizlerde , analitin

alıkonması film kalınlığı ile doğru

orantılıdır.

– Sıcaklık programı kullanılan analizlerde ise , alıkonmadaki değişim izotermal

değerinin 1/3’ü kadardır.

(51)

23.03.2020

Film kalınlığı (d

_f

)

• Oldukça uçucu analitlerin

analizlerinde yüksek alıkonma

sağlayabilmek için daha kalın film

kalınlığı olan kolonlar kullanılır.

– Daha yüksek kolon sıcaklıklarında daha büyük alıkonma sağlanır

• İnce film sahip kolonlar ise kolonda

oldukça iyi alıkonan analitlerin

alıkonma sürelerini azaltmak amaçlı

kullanılırlar.

– Düşük sıcaklıklarda daha hızlı elüsyon

(52)

23.03.2020

1. butanol 2. benzene 3. 2-pentanone 4. C7

5. 1-nitropropane 6. pyridine

7. C8 8. C9 9. C10

30 m, 0.32 mm i.d., Rtx-1, 70C isothermal

Film kalınlığı etkisi

(53)

23.03.2020

Film kalınlığı etkisi

30 m, 0.32 mm i.d., Rtx-1, 70C isothermal

(54)

23.03.2020

Film kalınlığı

• Pik çözünürlüğü film kalınlığı arttırılarak

büyüyebilir.

– Analit alıkonmasında artış sağlanarak

– Çözünürlüğün gelişmesi, analitin ilk kolondaki k değerine (alıkonma süresi) bağlıdır.

• Eğer analit k  5 değerine sahipse çözünürlük film kalınlığının arttırılması ile sağlanabilir.

(55)

23.03.2020

Film kalınlığı

• Kolon kanaması film kalınlığı arttıkça

büyür.

• Film kalınlığı arttırıldıkça olan pikler kolon

kanamasının büyük olduğu noktalarda

elue olabilirler.

• Yüksek sıcaklık limitleri yüksek kolon

kanama değerlerinden dolayı düşürülebilir.

(56)

23.03.2020

Film kalınlığı

• Sabit faz film kalınlığı arttırılarak kolonun

analit kapasitesi arttırılabilir.

– Kalın filme sahip kolonlar aşırı yükleme

sonucu oluşan pik yayılmasını engellerler – Buda piklerin ayrıştırılmış bir şekilde kolona

ulaşmasını sağlar.

(57)

23.03.2020

Kolon film kalınlığı seçimi

• Kalın film kolonlar

– Uçucu bileşikler için – Yüksek kapasiteye

sahiptirler

– Yüksek kolon kanamasına sahiptirler

– Düşük sıcaklık limitleri vardır.

• İnce film kolonlar

– Yüksek kaynama noktasına sahip bileşikler

– Düşük kapasiteye sahiptirler

– Düşük kolon kanamasına sahiptirler

(58)

23.03.2020

Kolon uzunluğu

• Uzun kolonlar aynı zamanda

– Alıkonma (analiz ) sürelerini arttırır

– Daha pahalıdırlar

(59)

23.03.2020

Kolon uzunluğunun etkileri

Izotermal analiz

4 8 12 16 20 24 28 32 36

1

2

3 4

5

6 7 8 9

10 12

11

13

1. phenol 2. o-cresol 3. 2,6-xylenol

4. p-cresol 5. m-cresol

6. o-ethylphenol

7. 2,4-xylenol 8. 2,5-xylenol 9. 2,3-xylenol

10. p-ethylphenol 11. m-ethylphenol 12. 3,5-xylenol

13. 3,4-xylenol

4 8 12 16

60 metre 30 metre

1 2

3 4

5

6 7 8

9 10

11 12

13

(60)

23.03.2020

Kolon uzunluğunun etkileri

Sıcaklık programlı analiz

• Kolon boyu iki katı olursa alıkonma

süreleride iki katına çıkar

• Alıkonma süreleri (analiz süresi)

daha çok sıcaklık bağımlıdır.

(61)

23.03.2020

Kolon uzunluğunun etkileri

Sıcaklık programlı analiz

(62)

23.03.2020

Kolon uzunluğu seçimi

özet

• 25 ~ 30 m kolonla başlanır

• Kısa kolonlar

– Düşük sayıda analit

bulunduran numuneler için

• Uzun kolonlar

– Kompleks numuneler için – Yapısında bir çok analit

bulunduran numuneler için – Uzun analizler,yüksek

maliyet

(63)

(64)

(65)

23.03.2020

Gaz Kromatografisi

Dedektörleri

(66)

23.03.2020

GC Dedektörler

• İyi bir dedektörün sahip olması gereken

özellikler;

1. Yüksek hassasiyet ve seçicilik

2. Konsantrasyon değişikliklerine kolay cevap

verme

3. Geniş lineer range

4. Akış, basınç ve sıcaklık değişimlerinde

düşük hassasiyet değişimi

(67)

23.03.2020 67

GC Dedektörler

(68)

23.03.2020 GC Sistemi & Temel Çalışma Prensipleri 68

Alev İyonlaştırma Detektörü(FID)

Flame Ionization Detector)

• Spesifiktir; analitler yanıcı olmalıdır

• Analit üzerinde yıkımlayıcı etkisi vardır

• Dedeksiyon Şekli : Alevde oluşan iyonlar ölçülebilen akım oluştururlar.

• Karbon-Hidrojen bağı içeren bileşiklere karşı hassastır.

• O₂, H₂, N₂, He, Ar gibi gazlar ile azot oksit

bileşikleri (NO, NO₂, N₂O₂) ve Sülfür bileşikleri, CO₂, CO ve su bu detektörle analiz edilemez.

(69)

23.03.2020

Termal İletkenlik Detektörü (Thermal

Conductivity Detector, TCD)

• Genel amaçlı

• Analit üzerinde yıkımlayıcı etkisi yoktur

• Dedeksiyon Şekli: Kolondan çıkan gazın

termal iletkenliği ölçümü prensibine

dayanır.

• FID ile analiz edilemeyen bileşikler bu

dedektörler analiz edilebilir.

(70)

23.03.2020

Elektron Yakalama Detektörü

(Electron Capture Detector, ECD)

• Spesifiktir; numune elektronegatif madde

içermelidir.

• Analit üzerine yıkımlayıcı etkisi yoktur

• Dedeksiyon şekli : Halojen, nitril,nitrat ve

konjuge çift bağ içeren bileşiklerin beta

parçacık absorbsiyonu sayesinde olmaktadır.

(71)

23.03.2020

Azot-Fosfor Detektör(Nitrogen

Phosphorus Detector, NPD)

• Spesifiktir; numune azot veya fosfor

içermelidir.

• Yıkımlayıcıdır

(72)

23.03.2020

Alev Fotometrik Detektör(Flame

Photometric Detector, FPD)

• Spesifiktir; numune fosfor veya kükürt

içermelidir.

• Analit üzerinde yıkımlayıcı etkisi vardır

(73)

23.03.2020 73

Kütle Spektrometresi nedir?

• GC ve MS in bir arada bulunduğu

gelişmiş bir analiz cihazıdır.

Ayrıştırma Tanımlama Miktar tespiti

GC bbb bbb

MS r

bbb

bb

GCMS bbb bbb bbb

(74)

23.03.2020 74

GC-MS

(75)

23.03.2020 75

(1)GC (2) Iyon Kaynağı

Vakum Sistemi

(3) Kütle

Filtresi (4) Dedektör Numune

Kütle Spektrometresi nasıl çalışır?

• Numune molekülleri iyon kaynağına girer

• İyon kaynağında moleküller iyonlaşır

• Oluşan iyonlar kütle filtresine doğru ilerlerler ve burada birbirlerinden ayrışırlar

• Farklı M/Z değerlerine sahip iyonlar dedektör tarafından tespit edilirler

(76)

23.03.2020 76

• Veriler MS tarafından toplanır

• Bileşikler kütle spektrumlarının değerlendirilmesi sonucu analiz edilebilir.

Kütle Spektrometresi nasıl çalışır?

Kütle numarası (M/Z)

Sinyal intensitesi

(77)

23.03.2020 77

Kütle Spektrometresi

Gaz Kromatografisi

Interface İyon Kaynağı

GCMS Konfigurasyonu

(78)

23.03.2020 78

GCMS ile neler analiz

edilebilir ?

• GCMS ile analizi yapılamayanları

listelemek daha kolaydır

• İnorganik metaller

• ör Fe, Cu, Ni & vb. Buna rağmen organokalay &

organo civa bileşikleri analiz edilebilir.

– Termal kararsız/uçucu olmayan bileşikler

• Bunların bazıları türevlendirme sonucu analiz edilebilir.

(79)

23.03.2020 79

GCMS İyonizasyon Modları

• EI : Elektron Çarpma (Electron Impact)

– Kuvvetli iyonizasyon, yüksek enerji – Yapısal bilgi sağlar

• CI : Kimyasal İyonizasyon Zayıf

iyonizasyon, düşük enerji

– M.A. İle ilgili bilgi sağlar – Seçici ve hassastır

(80)

23.03.2020 80

Ölçüm Modları

• Tarama Modu(Scan mode)

• SIM Modu (Selected Ion Monitoring)

Kütle numarası

Time

[Tarama]

(Kalitatif)

Kütle numarası

Time

[SIM]

(Kantitatif)

(81)

23.03.2020 81

Tarama Verilerine Göre Yapılan Kütüphane

Araması

• Bilinmeyen bir pik kütle spektrumu sayesinde tanımlanabilir

(82)

23.03.2020 82

Alıkonma Zamanı

m/z=72 m/z=152 m/z=54

İntensite

SIM modu

• Scan Moduna göre çok daha hassas

• Kantitasyon amaçlı kullanılır

• Sadece belirlenen fragmanlar M/Z ölçülür

(83)

23.03.2020 83

SIM Modu Verileri

• Sadece belli kütle

numaraları izlenir

• Kalitatif veri elde

edilmez

(84)

23.03.2020 84

GC-MS

• Kütüphaneler

– NIST/EPA/NIH database (~75K spectra) – WILEY database (~229K spectra)

– Pflegar/Maurer/Weber Drugs &

metabolites database (~1.4K spectra) – Pesticides database (~205 spectra) – Pyrolysis database (~100 polymers) – Flavor & Fragrance database

(~1.2Kspectra)

(85)

23.03.2020

85

Verilerin Değerlendirilmesi

(86)

23.03.2020

86

İnternal standart

• Kimyasal olarak analizi yapılan maddeyle

benzer kimyasal yapıya sahip olmalıdır.

• Analit ile kimyasal reaksiyona girmemesi

gerekir

• Örnek ve İnternal standart ayrı ayrı analiz

edilebilmelidir.

• Saf olmalı

• En ideal internal standart?

(87)

23.03.2020

87

Ne kadar İnternal standart eklemek

gerekir?

• Örnekte analiz edilmesi beklenen düzeyin

en az 3 katı olması gerekir.

• Örnek:

– Örnekte beklenen konsantrasyon 5 ünite ise – İnternal standardın konsantrasyonu 15 ünite

olarak eklenmesi gerekir.

(88)

23.03.2020

88

Kalbirasyon eğrisi

• Kantitaif analiz için en önemli basamaktır.

• Yoğunluk için piklerin yüksekliği değil alanlarının hesaplanması daha doğru sonuç verir.

• En az 6 noktalı kalibrasyon grafiği çizmek gerekir.

(0, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 700, 1000 gibi)

• R² değeri kalibrasyon eğrisi değerlendirilmesinde her zaman için güvenilir bir değer değildir.

(89)

23.03.2020

89

Hangisi doğru?

R² = 0.9990

0 1 2 3

R² = 0,982

-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9 3,4 3,9

-5 45 95 145 195

SIGNAL RATIO : (cis-RA)/I.Std.

(90)

23.03.2020 90

Türevlendirme (Derivitizasyon)

• Gaz kromatografi ile uçucu (volatile) özelliğe sahip bileşikler analiz edilebildiğinden, dolayısıyla ısıya dayanıklı veya çok çabuk parçalanabilen ve yüksek molekül ağırlığına sahip maddelerin analizinde

zorluklarla karşılaşılır..

• Yukarıda sayılan özeliklere sahip bileşiklerim analizi

kimyasal türevlendirme ile mümkün hale gelebilmektedir.

• Türevlendirme işlemi ile analitlerin uçuculuğu artarken, polariteleri ise azalmaktadır.

• Çok çabuk parçalan bileşiklerin ise ısıya karşı dayanıklıkları arttırılabilmektedir.

• Substrat spektrumu genişletilebilmektedir.

(91)

23.03.2020 91

Türevlendirme metodları

• Sililasyon (Silylation)

• Asilayon (Acylation)

• Alkilasyon (Alkylation)

• Esterifikasyon (Esterification)

(92)

(93)

(94)

(95)

(96)

(97)

Kromatografik Analizlerde

Kullanılan Çeşitli

Parametreler

(98)

Geçerlilik (Validasyon)

• Geçerlilik/Validasyon, metodun veya ölçüm

yönteminin belirlenen amaçlara uygunluğunun

objektif olarak test edilerek yazılı delillerle

kanıtlanmasıdır .

• Bir metodun performansını belirlemek için

yapılan bir takım değişkenlere göre test ve

ölçme işlemleridir.

(99)

Geçerlilik (Validasyon)

• Çeşitli alanlarda pek çok karar , yapılan

ölçümlerin sonucuna dayanılarak verilir.

• Doğru karar verebilmek için analitik ölçüm

sonucunun doğru ve güvenilir (tekrarlanabilir)

olması gerekir.

(100)

Geçerlilik (Validasyon)

• Bir metotla yapılan ölçümün sonuçları

• Laboratuvar koşulları,

• Cihaz,

• Kullanılan kimyasallar ,

• Deney yapanın deneyimi gibi faktörlere

bağlıdır.

• Bu nedenle metodun ölçüm sonucuna etki eden

parametreleri tek tek ölçerek ölçüm sonucuna

etkileri belirlenmeli ve ölçülmelidir.

(101)

Validasyon çalışmaları

• Standart bir metot bir laboratuvarda ilk defa

(application) uygulanacağı zaman,

• Bir analiz için yeni metot (development)

geliştirildiği zaman,

• Kullanılan metotta değişiklik yapıldığında

(102)

Validasyon çalışmaları

• Geçerliliği belirlenmiş bir metot başka bir

laboratuvarda (adaptation) kullanılacağı zaman

veya farklı bir kişi veya farklı bir cihazla

kullanılacağı zaman,

• İki metodu karşılaştırmak için,

• Kalite kontrol testleri sonunda metodun

performansında zamanla bir değişme olduğu

anlaşıldığında yapılmalıdır.

(103)

Geçerlilik (Validasyon)

• Uluslar arası kabul edilen çeşitli geçerlilik

(validasyon) kriterleri mevcuttur.

• Performans karakteristikleri için öncelikle

aşağıdaki temel geçerlilik (validasyon)

parametreleri belirlenmelidir .

• Uygulanamayan parametreler varsa

“uygulanamaz” ifadesi kullanılır.

• Yönteme özel farklı parametrelerin de

değerlendirilmesi gerekiyorsa onlar da eklenir .

(104)

Validasyon Parametreleri

• Doğruluk (Accuracy)

• Geri alım (Recovery)

• Kesinlik (Precision):

• Tekrarlanabilirlik (Repeatibility),

• Ara Kesinlik

• Tekrar Üretilebilirlilik (Reproducibility)

(105)

Validasyon Parametreleri

• Özgünlük/Belirlilik (Specifity)

• Seçicilik (Selectivity)

• Doğrusallık (Linearity)

• Tespit Limiti/Bulma Sınırı (LOD; Limit of

Detection)

• Tayin sınırı ( LOQ; Limit of Quantification)

• Değer Kümesi/Çalışma Aralığı (Working Range)

• Sağlamlık (Robustness)

(106)

Doğruluk (Accuracy)

• Ölçülen değerin doğru ya da doğru kabul edilen

değere yakınlığını gösterir.

• Mutlak hata ya da bağıl hata ile verilir.

• Uluslar arası bağımsız laboratuvarlar tarafından

tayin edilmiş değerleri doğru değer olarak kabul

edilen Standart Referans Maddelerin tayininden

elde edilen sonuç ile aynı maddenin kullanılan

yöntemle elde edilen sonuçları karşılaştırılır .

(107)

Doğruluk (Accuracy)

• Gerçek değer bir hedefin merkezi olarak

düşünülürse, vurulan yerler de hedefin

merkezine kurulu bir dağılımı tanımlandığında;

bu dağılım merkezin sağında ya da solunda ise

doğruluk düşüktür .

• Ancak kromatografide analitik teknikle gerçek

değer belirlenemez ve bu nedenle doğruluk

standart bir örneğe bağlı olarak hesaplanır .

(108)

Doğruluk (Accuracy)

• Kuramsal olarak standart değer biliniyorsa yada

üzerinde anlaşılan, onaylanmış bir değer varsa

doğruluk bu değerlerin ölçümlerinin ortalaması

ile karşılaştırılarak değerlendirilir.

• Doğruluğu bilinen başka bir analitik teknik varsa

doğruluk bu teknikle elde edilen değerlerle

karşılaştırılarak değerlendirilir.

(109)

Doğruluk (Accuracy)

• Bunun yanı sıra doğruluk kurtarma testi ile de

ölçülebilir . Bu amaçla hedef maddenin belli bir

miktarı örneğe eklenir . Örnek hedef madde

içermeyen diğer örnekle birlikte incelenir . Elde

edilen farkın örneğe eklenen hedef madde

miktarına uyup uymadığı kontrol edilir.

• Her durumda ölçüm birçok kez yapılır ve hem

ortalama değer , hem de % 95’lik güven aralığı

hesaplanır.

• Gerçek (yada gerçek olduğu düşünülen) değerin

hesaplanan bu güven aralığında yer alıp

almadığı kontrol edilir.

(110)

Geri Alım (Recovery)

• Analizi yapılan bir maddenin geri alım değeri

analiz sonucu elde edilen değerin teorik olarak

umulan değere oranını ifade eder.

• Çoğu metot validasyon çalışmaları için yüksek

geri alım değerlerine gereksinim duyulur.

(111)

Geri Alım (Recovery)

• Alt, orta ve üst bilinen derişimdeki standart

çözeltiler , matrikse eklenir; ayırma metodu

işlemi ile geri elde edilir ve tayin edilip, bilinen

miktarla karşılaştırılarak sonuç yüzde hata ile

verilir.

• Geri alım değeri (R)’nin hesaplanmasında;

R = Analizle elde edilen değer / Umulan değer x

100 formülü kullanılır.

(112)

Kesinlik (Precision)

• Ölçümlerdeki tutarsızlık yada rastgele hatadır .

Hedef merkezinden (gerçek değer) mesafeye

bakılmaksızın vurulan yerler birbirine yakınsa

kesinlik yüksek; geniş bir alana yayılmışsa

kesinlik düşüktür .

(113)

Kesinlik (Precision)

• Bir metodun kesinliği örnek hazırlama, analiz ve

değerlendirme aşamalarının kesinliği ile

şekillenir. Kesinlik tekrar şartları bakımından üç

aşamada tarif edilir:

• Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)

• Ara kesinlik (Intermediate)

• Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)

(114)

Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)

• Bir örneğin bir analist tarafından bir cihazda

tekrar eden analizler sonucu aynı değerde

ölçülmesidir.

• Aynı laboratuvar , aynı araştırmacı, aynı cihaz ile

5-6 paralel tayin 3 farklı matriksde, 2-3 farklı

derişimle yapılır.

• Aynı şartlar altında kısa süre içinde yapılır.

Sadece rastgele hatalara dayalı kesinlik

ölçümüdür.

• Ancak belli bir analiz süresi gerektiren HPLC gibi

enstrümantal analizlerde gecikme zamanı da

değişken bir faktördür.

(115)

Ara kesinlik

• Bir laboratuvarda birden fazla günde birden çok

cihaz kullanarak birçok analist tarafından

analizin yapılması ile ortaya çıkan kesinliktir.

(116)

Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)

• Analiz sonucu elde edilen değerin tekrar eden

analizlerde, analistler ve laboratuvarlar arasında

yeniden elde edilmesidir.

• Farklı şartlarda kesinliği ifade eder.

• Diğer bir ifade ile bunlar rastgele hatanın yanı

sıra diğer değişken faktörlerin dahil olduğunda

alınan kesinlik sonucudur.

(117)

Kesinlik (Precision)

• Değişken faktörlerin incelenmesini içeren ara

kesinlik ve tekrar üretilebilirliliğin ayrıntılı

incelemesini yapabilmek için;

• Faktörlerin sayısına bağlı değişkenlerin çok

yönlü analizi,

• Standart sapma ve

• Toplam varyans için güven aralıkları belirlenir.

• Bu durumda çok sayıda değişken faktör varsa

çok sayıda deney ve hesaplama yapmak gerekir.

• Bu nedenle deneyler uygun bir tasarım

çerçevesinde gerçekleştirilmelidir.

(118)

Özgünlük/Belirlilik (Specifity)

• Analitik yöntemin sadece amaçlanan bileşen

veya bileşenleri tayin edebilme yeteneğidir,

sayısal değeri yoktur .

• Kromatografide eğer analiz edilecek hedef

madde iyi ayrılır ve bulma sınırı yüksekse,

belirlilik de yüksek olur.

(119)

Özgünlük/Belirlilik (Specifity)

• Örnek karışımı içinde bir arada bulunan

bileşenler biliniyorsa ve bunların referans

standartları mevcutsa, belirlilik hesaplaması;

• Yalnızca hedef maddeyi içeren,

• Yalnızca bileşenleri içeren ve

• Hem hedef madde hem de diğer bileşenleri

içeren solüsyon hazırlanarak analiz

sonuçlarının karşılaştırılması ile yapılabilir.

(120)

Özgünlük/Belirlilik (Specifity)

• Şayet karışımın içerisindeki safsızlıkların

referans standartları mevcut değilse uzun süre

kalmasına izin verilen ve aşırı şartlara maruz

bırakılıp safsızlık içeriği düşürülen örnekleri

kullanarak aynı türden karşılaştırma yapılabilir .

• Belirlilik ayırmayı (seperasyon) geliştirerek yada

bulma seçiciliğini artırarak geliştirilebilir . Ayırma

ile ilgili olarak belirlilik çözünürlük kullanarak

değerlendirilir.

(121)

Özgünlük/Belirlilik (Specifity)

• Japon Farmakopesinde HPLC için hedef

maddede çözünürlük değerinin 1.5, ilgili

maddeler için 1.2 olması istenir.

• Bulma ile ilgili olarak belirliliği artırmak için de

mümkün olduğunca yüksek seçiciliği olan

yöntem kullanılmalıdır.

(122)

Seçicilik (Selectivity)

• Beklenen fiziksel / kimyasal girişimler /

engelleyiciler (interferences) varlığında söz

konusu analitin doğru şekilde ölçülmesi

yeteneğidir.

• Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan

maddeler standart üzerine eklenerek girişime

neden olup olmadığı kontrol edilir.

• Referans madde geçerliliği belirlenen metotla

analiz edilerek bulunan sonuçlar sertifika değeri

ile karşılaştırılır .

(123)

Değer Kümesi/Çalışma Aralığı (Working Range)

• Kalibrasyon eğrisinde tayin edilebilen en düşük

derişimden, doğrusallıktan sapma gösterdiği

derişime kadar olan derişim aralığını kapsar.

• Doğrusal analitik bir işlemle doğrusallık bu değer

kümesi boyunca sürdürülmelidir .

• Genelde doğruluk ve keskinlik doğrusallığın

olduğu değer kümesinin merkezinde en yüksektir .

(124)

Değer Kümesi/Çalışma Aralığı (Working Range)

• Bu değer yoğunlukların alt ve üst sınırlarına

yaklaşıldıkça düşer .

• Bu nedenle doğruluk ve keskinlik değer

kümesinin üst ve alt sınırlarına yakın elde edilir.

• Genellikle doğruluk ve keskinlik tüm değer

kümesi boyunca sağlanır.

(125)

Tespit Limiti/Bulma Sınırı (Limit of Detection, LOD)

• Zemin gürültüsünden farklı olarak tespit edilen

fakat miktarı belirlenemeyen en küçük analit

yoğunluğudur.

• Diğer bir ifade ile tespit edilebilen hedef

maddenin asgari miktarı yada yoğunluğudur .

• Bulma sınırı yöntem yanıtlarının (üst sınır

alanlarının) standart sapmasına ve kalibrasyon

eğrisinin eğimine bağlıdır.

(126)

• Buna göre aşağıdaki formülle hesaplanır:

LOD= 3.3 x /Eğim

: Yanıtların (üst sınır alanlarının) standart

sapması

Eğim: Kalibrasyon eğrisinin eğimi

(127)

• Kromatografide genellikle sinyalin (Signal, S)

sese – gürültü -, (Noise, N)’ye oranı kullanılarak

bulma sınırı hesaplanır.

• Kromatogram, bulma sınırına yakın yoğunlukta

olan hedef maddeyi içeren örnek için alınır ve

ortalama ses genişliğine sinyal yüksekliğinin

oranı (S/N) hesaplanır.

• Sonuçtan 3 (yada 2) S/N değerine düşen

yoğunluk hesaplanır ve bu değer bulma sınırı

olarak kullanılır.

(128)

Hesaplama Limiti/Miktar Sınırı (Limit of Quantification, LOQ)

• Uygun doğruluk ve kesinlikle miktarı

saptanabilen en küçük yoğunluktur .

• Diğer bir ifade ile nicelenebilen hedef maddenin

asgari miktar yada yoğunluğudur .

• Doğal olarak uygun derecede bir doğruluk yada

keskinlik ile ölçülebilir değer alma ön şarttır .

• Genellikle nispi standart sapma (RSD)

değerinin % 10’dan daha fazla olmaması istenir.

(129)

• Miktar sınırını hesaplama yöntemi bulma sınırını

hesaplama yöntemine benzerdir .

• Bunun için aşağıdaki eşitlik kullanılabilir:

LOQ: 10 x /Eğim

: Yanıtların (üst sınır alanlarının) standart

sapması

Eğim: Kalibrasyon eğrisinin eğimi

(130)

• Miktar sınırına yakın yoğunluktaki hedef

maddeyi içeren bir örnekten ve boş bir örnekten

alınan yanıtların standart sapması “” olarak

kullanılır.

• Sinyalin sese oranı bakımından 10 x S/N

değerine denk düşen yoğunluk hesaplanır ve bu

değer miktar sınırı olarak kullanılır.

(131)

Sağlamlık (Robutness)

• Sağlamlık daha çok metot geliştirme safhasında

ve işleme bağlı olarak değerlendirilebilir.

• Metodun küçük değişmelerle etkilenmeden

kalabilme kabiliyetine sağlamlık denir.

• Kullanılan ayırma (separasyon) metodu,

• Final solüsyonun bileşimi ve pH’sı,

• Sıcaklık,

• Bulma parametreleri gibi değişken faktörlerin

(analitik şartların) değiştirilmesi ile ölçüm

dengeleri araştırılarak değerlendirilir.

(132)

Sağlamlık (Robutness)

• Analitik şartlarda küçük değişiklikler yapıldığında

ölçümler büyük oranda dalgalanırsa sağlamlık

testinin sonuçları, not edilecek nihai analitik

yöntem için analitik şartları gösteren bu değer

anlamlı rakamlara yansıtılır .

• Düşük seviyedeki bir analitik yöntemin kullanımı

daha sonraki aşamalarda büyük hatalara yol

açabilir .

(133)

Sağlamlık (Robutness)

• Farklı bir seriye ait analitik ayırma kolonu

kullanıldığında büyük oranda değişen ayırma

durumları ve final solüsyon pH’sının iki ondalık

hane olacak şekilde sağlanamadığı sürece

ayırmanın tekrar üretilemediği (reproductivity)

durumlar vardır.

• Bu durumda olası tüm değişken faktörlerin bir

listesi hazırlanmalı ve her bir faktör

araştırılmalıdır .

(134)