ĐÇĐNDEKĐLER
Sayfa
ĐÇĐNDEKĐLER...i
ÖZET...iii
ABSTRACT ...iv
TEŞEKKÜR ... v
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ ...vi
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ...viii
SĐMGELER VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ...ix
1. GĐRĐŞ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERĐ... 5
2.1. Pseudomonasların Genel Özellikleri... 6
2.2. Pseudomonas’ın Virülens Faktörleri... 8
2.3. P. aeruginosa’nın Etkeni Olduğu Hastalıklar ... 16
2.3.1.Kistik Fibrozisli Hastalarda Pseudomonas... 18
2.3.2. Pseudomonas Enfeksiyonlarının Kontrolü... 18
2.4. P. aeruginosa’da Antibiyotik Direnci ... 19
2.4.1. Biyofilm Oluşumundan Dolayı Direnç ... 19
2.4.2. Beta Laktamaz Enzimlerinin Sağladığı Direnç ... 19
2.4.3. Đlaç Pompalarının Sağladığı Direnç ... 20
2.5. Pseudomonaslarda Salgılama Sistemi... 20
2.6. Gram-Negatif Bakterilerde Çevreyi Algılama ... 21
2.6.1. LuxI-LuxR Tip Çevreyi Algılama Sistemi... 24
2.6.2. Pseudomonaslarda Çevreyi Algılama ... 29
2.6.3. P. aeruginosa’da LasI/LasR-RhlI/RhlR Çevreyi Algılama Sistemi ... 29
2.6.4. P. aeruginosa’da Çevreyi Algılama Sisteminin Önemi ... 33
2.7. Bitki Patojeni Olarak Pseudomonaslar... 34
2.7.1. Bitki Patojeni Olan Pseudomonasların Salgıladığı Toksinler ve Sakkaritler. 35 2.8. Pseudomonasların Çevresel Yönü... 35
2.8.1. Pseudomonas Suşlarının Parçaladığı Diğer Çevresel Kirleticiler ... 36
2.9. Pseudomonaslarda Metal Direnci... 37
2.10. Tez Konusu ile Đlgili Yapılmış Çalışmalar... 38
3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 42
ii
Sayfa 3.1. Deneyler Sırasında Kullanılan Bakteriyal Suşlar, Besiyerleri ve Çözeltiler
Kimyasal Maddeler, Aletler ve Cihazlar ... 42
3.1.1. Bakteriyal Suşlar ... 42
3.1.2. Kimyasal Maddeler ... 44
3.1.3. Besiyeri ve Çözeltiler ... 45
3.1.3. Aletler ve Cihazlar... 47
3.2. AHL Moleküllerinin Tespiti... 48
3.2.1. Ahl Moleküllerinin Tespiti Đçin Çapraz Doğrulama Testi ... 49
3.3. Piyosiyanin Testi ... 49
3.4. Stafilolitik LasA testi... 49
3.5. Ramnolipid Üretimi Testi... 50
3.6. rhlI, lasI, lasR ve rhlR Genlerinin PCR Analizi... 50
3.7. Kayma Testi ... 52
3.8. Yüzme Testi ... 52
3.9. Titreme Testi ... 52
3.10. Elastaz Testi ... 53
3.11. Proteaz Testi ... 53
3.12 Antibiyotik Hassasiyeti ... 54
3.13 Đnce Tabaka Kromatografisi ile BHL Sinyal Moleküllerinin Tespiti... 54
3.14. rhlR-rhlI ve lasR-lasI Genlerinin Dizi Analizi... 55
3.15. Đstatistik ... 55
4. BULGULAR ve TARTIŞMA ... 56
5. SONUÇLAR ... 83
6. KAYNAKLAR... 87
ÖZGEÇMĐŞ……….……….….99
ÖZET
Doktora Tezi
YOĞUN BAKIM ÜNĐTELERĐNDEN ĐZOLE EDĐLEN PSEUDOMONAS. AERUGĐNOSA SUŞLARINDA N-AÇĐL HOMOSERĐN LAKTON ÜRETĐMĐNĐN ARAŞTIRILMASI
Seyhan ULUSOY
Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Jüri: Prof. Dr. Yaşar AKSOYLAR Prof. Dr. Aynur Gül KARAHAN
Prof. Dr. M. Lütfü ÇAKMAKÇI
Yrd. Doç. Dr. Gülgün TINAZ (Danışman) Yrd. Doç. Dr. F. Filiz ARI
Bu çalışmada, Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Yoğun Bakım Servisi hastalarından izole edilmiş 100 adet P. aeruginosa klinik izolatı kullanılmıştır. Bu izolatlar, Chromobacterium violaceum CV026 ve Agrobacterium tumefaciens NT1 indikatör suşları kullanılarak, AHL sinyal moleküllerinin üretimleri açısından test edilmiştir. C. violaceum CV026 suşu kullanılarak yapılan testlerde yirmi adet izolatın BHL sinyal molekülünü üretemediği tespit edilmiştir. Đnce Tabaka Kromatografisi kullanılarak BHL sinyal molekülünün bu izolatlarda bulunmadığı doğrulanmıştır. Bu izolatlar proteaz, ramnolipid, piyosiyanin, elastaz, lasA gibi virülens faktörleri ayrıca; yüzme, titreme ve kayma hareketleri gibi kontrolü çevreyi algılama sistemi tarafından gerçekleştirilen özellikler bakımından analiz edilmiştir. Bu izolatlar çevreyi algılama sistemi lasR, lasI, rhlR ve rhlI genlerinin varlığı açısından analiz edilmiştir. Sonuçta dört adet klinik izolat rhlR ve rhlI genleri için dizi analizi yaptırılmıştır. Ve dört suşun ikisinde rhlR ve rhlI genlerinde, diğer iki suşta ise sadece rhlI geninde mutasyon tespit edilmiştir. Bu mutasyonlar daha önce rapor edilmemiştir. Bu mutasyonlar izolatlarda, BHL sinyal molekülü üretimindeki bozukluğun yanı sıra virülens faktörlerinin üretilmesindeki bozuklukları da açıklamaktadır. Bu klinik P. aeruginosa izolatları çevreyi algılama sistemlerinde bozukluk bulunmasına rağmen, farklı enfeksiyonları oluşturabilmektedir.
Anahtar kelimeler: P. aeruginosa, Çevreyi Algılama, N-Açil- Homoserin lakton.
2007, 100 sayfa
iv ABSTRACT Ph.D. Thesis
INVESTIGATION OF N-ACYL HOMOSERINE LACTON PRODUCTION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLATED FROM INTENSIVE CARE
UNITS Seyhan ULUSOY
Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Biology
Thesis Committee: Prof. Dr. Yaşar AKSOYLAR Prof. Dr. Aynur Gül KARAHAN
Prof. Dr. M. Lütfü ÇAKMAKÇI Asst. Prof. Gülgün TINAZ (Supervisor) Asst. Prof. F. Filiz ARI
Hundred P. aeruginosa strains isolated from Intensive Care Units at Süleyman Demirel University Hospital were used in this study. These isolates were tested for production of AHLs using indicator strains the Chromobacterium violaceum strain CV026 and the Agrobacterium tumefaciens strain NT1. Twenty isolates had no BHL activity by using bioassay strain C. violaceum CV026. We confirmed BHL production deficiency in these isolates by using thin-layer chromatography (TLC).
These isolates were analysed for the production of several virulence factors such as protease, rhamnolipids, pyocyanine, elastase, LasA and swimming, twitching, and swarming, motility controlled via N-acylhomoserine lactone (AHL)-mediated quorum sensing. These isolates were also analysed for presence of quorum sensing genes lasR, lasI, rhlR and rhlI. Analysis of the sequences of the rhlR and rhlI genes of these four isolates showed that two of the four isolates had mutational defects in both rhlR and rhlI genes and other two were only mutated in the rhlI gene. These mutations were not reported previously. Mutations in these isolates could explain virulence factor negative phenotype, as well as their deficiency in BHL production.
Although these isolates have deficient QS systems, they are capable of causing infections.
Key words: P. aeruginosa, Quorum sensing, N-Acyl-Homoserine lactone.
2007, 100 pages
TEŞEKKÜR
Tez çalışmalarım boyunca, değerli tecrübe ve destekleriyle bana yol gösteren Danışman Hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Gülgün TINAZ’a saygı ve teşekkürlerimi borç bilirim.
Karşılıksız burs desteği (Yurt Đçi Doktora Burs Programı) ve hızlı destek programı ile (TBAG-HD/79 (105T296) tez çalışmamın tamamlanmasında büyük katkısı olan TÜBĐTAK Bilim Đnsanı Destekleme ve Daire Başkanlığı ile Temel Bilimler Araştırma Grubu Başkanlığı’na; ayrıca 1094-D-05 No’lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na teşekkür ederim.
Tez çalışmam sırasında kullanılan suşların tiplendirilmesini sağlayan Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’na, Laboratuvar çalışmalarım boyunca Deneysel ve Gözlemsel Öğrenci Araştırma ve Uygulama Merkezinin imkanlarını kullanmam konusunda desteklerini esirgemeyen sayın müdürümüz Prof. Dr. Nilgün GÖKTÜRK BAYDAR’a ve manevi desteklerini hiçbir zaman eksik etmeyen ve her zaman yanımda olan mesai arkadaşlarıma teşekkürü borç bilirim.
Çalışmalarım boyunca beni sürekli destekleyen ve fedakarlıklarını hiçbir zaman esirgemeyen sevgili aileme teşekkür ederim.
Seyhan ULUSOY ISPARTA, 2007
vi
ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ
Sayfa Şekil 2.1. P. aeruginosa bakterisinin görüntüsü………. 5 Şekil 2.2. P. aeruginosa a) şematik gösterim b) elektron mikrokop
görüntüsü, 1- Pilus, 2- Lipopolisakkarit, 3- Hücre içi, 4-
Flagella………... 7
Şekil 2.3. P. aeruginosa’ nın ürettiği piyosiyanin molekülü a) nötr veya bazik pH’ta zwitteriyon olarak davranır ve mavi renklidir b) asidik ortamda ise kırmızı renklidir……… 8 Şekil 2.4. P. aeruginosa’ nın ürettiği ramnolipid molekülleri a) mono b)
di ramnolipid (m,n 4-8)………... 10 Şekil 2.5. Biyofilm oluşumunun basamakları 1) tutunma, 2)
mikrokolonilerin oluşması, 3) Hücre dışı polisakkarit bileşenlerin üretilmesi, 4) olgunlaşma, 5) diğer bölgelere yayılma……… 15 Şekil 2.6. a)Euprymna scolopes, b) Işık organı………... 22 Şekil 2.7. Homoserin lakton molekülleri a)N-(3-okzohekzanoyil)-L-
homoserin lakton (OHHL), b)N-bütanoyil-L-homoserin lakton (BHL), c)N-(3-hidroksi butanoyil)-L-homoserin lakton (HBHL), d)N-hekzanoyil-L-homoserin lakton (HHL), e)N-(3- okzooktanoyil) -L-homoserin lakton (OOHL), f) N-(3- okzodekanoyil) -L-homoserin lakton (ODHL), g) N-(3- okzododekanoyil) -L-homoserin lakton (OdDHL)………. 23 Şekil 2.8. luxR-I tip çevreyi algılama sistemi ve ışık üretimi a) düşük
bakteri konsantrasyonu, b) yüksek bakteri konsantrasyonu…… 25 Şekil 2.9. P. aeruginosa’da lasR-I ve rhlR-I çevreyi algılama sistemleri... 30 Şekil 4.1. a. 1-2 BHL sinyal molekülünü üretemeyen suşlar, 3-PAO1
kontrol suşu b. OdDHL sinyal molekülünü üreten suşlar, 1, 2, 4, 5 klinik izolat, 3-PAO1 kontrol suşu…………... 56 Şekil 4.2. AHL moleküllerinin TLC görüntüsü. Örnekler ters faz C18 ince
tabaka plakalarına yüklenmiş ve metanol/su (60:40, vol/vol) mobil fazı kullanılarak ayrımları sağlanmıştır. Đndikatör suş
olarak C. violaceum 026 kullanılmıştır. 1) HHL ve BHL standartları, 2) 2, 3, 4, 5 Klinik izolatlar, 6) PAO1 kontrol
suşu………... 57
Şekil 4.3. BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda piyosiyanin üretimi………..… 59 Şekil 4.4. BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda
elastaz aktivitesi………..……… 60 Şekil 4.5 BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda
proteaz aktivitesi a) Grafik olarak, b) petride………... 61 Şekil 4.6. BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda
ramnolipid üretimi a) Grafik olarak, b) Petride………... 62 Şekil 4.7. BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda
lasA aktivitesi………...……... 63 Şekil 4.8. BHL üretiminde bozukluk olan bir izolatta ve PAO1 suşunda
twitch hareketi a) Grafik olarak, b) Petride………….………... 66 Şekil 4.9. BHL üretiminde bozukluk olan izolatlarda ve PAO1 suşunda
(ortada) yüzme hareketi a) Grafik olarak, b) Petride………….. 67 Şekil 4.10. BHL üretiminde bozukluk olan bir izolatta ve PAO1 suşunda
kayma hareketi a) grafik olarak, b1) PAO1, b2) klinik izolat petride……….. 68 Şekil 4.11. Đmipeneme hassas bir P. aeruginosa suşu………... 69 Şekil 4.12. Disk difüzyon testi uygulanan klinik izolatlar ve
antibiyotikler……….………….. 70 Şekil 4.13. 1; PAO1 rhlR (730bp), 2; PAO1 rhlI (625bp), 3; PAO1 lasR
(725bp), 4; PAO1 lasI (605bp), 5; I-440 rhlR (730bp), 6; I-440 lasI (605bp), Marker (1kb), 7; I-441 lasI (605bp), 8; I-441 lasR (725bp), 9; I-441 rhlR (730bp), 10; I-442 rhlR (730bp), 11; I-442 lasR (725bp), 12; I-443 lasR (725bp)……… 71
viii
ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ
Sayfa Çizelge 2.1. Bazı bakteriler ve onların çevreyi algılama sisteminde rol alan
homoserin lakton molekülleri……….. 28 Çizelge 2.2. P. aeruginosa’da çevreyi algılama sistemleri ve bunların
kodladığı özellikler……….. 32
Çizelge 3.1. Çalışma sırasında kullanılan suşlar 43
Çizelge 3.2. Deneysel çalışmalar sırasında kullanılan besiyeri ve çözeltiler……….. 45 Çizelge 3.3. rhlI, lasI, lasR ve rhlR gen bölgelerinin PCR analizi için
kullanılan primerler ve oluşacak ürün büyüklükleri…………... 50 Çizelge 4.1. Elastaz, proteaz, piyosiyanin, lasA ve Ramnolipid üretim
düzeyleri için bağıntı analizi r (korelasyon katsayısı) ve P (0.001 seviyesinde anlamlılık derecesi)……….. 64 Çizelge 4.2. Dizi analizi yapılan dört suş için RhII ve RhlR proteinlerinde,
nükleotit değişikliklerinin sebep olduğu amino asit değişiklikleri dizi analizi sonuçları a) I-457 için rhlR geni, b) I- 461için rhlR geni, c) I-457 için rhlI geni, d) I-458 için rhlI geni, e) I-459 için rhlI geni, f) I-461 için rhlI geni. Query:
örnek aminoasit dizisi, Sbjct: referans aminoasit dizisi……….. 73 Çizelge 4.3. Dizi analizi yapılan dört suş için RhII ve RhlR proteinlerinde,
nükleotit değişikliklerinin sebep olduğu amino asit değişiklikleri……… 75 Çizelge 4.4. Amino asitler için kullanılan uluslar arası kodlar………... 77
SĐMGELER VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ
µg mikrogram
3-oxo-C12-HSL N-(3-okzododekanoyil)-L-homoserin lakton
AHL Açil homoserin lakton
BHL N-bütanoyil-L-homoserin lakton
bç Baz çifti
C4-HSL N-bütanoyil-L-homoserin lakton
CFP Sefaperazon
CIP Siprofloksasin
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CN Gentamisin
CTAB Cetyltrimetylammonium bromide
ECR Elastin Kongo Red
EDTA Etilenoaminotetraasetik asit
GTX Gatifloksasin
HHL N-hekzanoyil-L-homoserin lakton
IPM Đmipenem
LA Luria agar
LB Luria-Broth
M Molar
mg Miligram
MHA Müller Hinton Agar
MHB Müller Hinton Broth
x
mM Milimolar
nm Nanometre
OD Optik dansite
OdDHL N-(3-okzododekanoyil)-L-homoserin lakton PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
QS Quorum Sensing
TLC Đnce tabaka kromatografisi tris Tris (hidroksimetil) amino metan
v/v Hacim/hacim
w/v Ağırlık/hacim
UV Ultra violet ışığı
X-gal 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid
1. GĐRĐŞ
Prokaryotik tek hücreli organizmalar birbirleriyle, sözcükler yerine kimyasal sinyal molekülleri kullanarak iletişim kurarlar. Bu moleküllerin kullanılmasıyla, mikroorganizmalar çeşitli fonksiyonlarını populasyon yoğunluklarına göre düzenleyebilirler. Çevreyi algılama (quorum-sensing) olarak adlandırılan bu olay, tek bir mikroorganizmanın ortama sinyal molekülünü bırakması ve bu molekülün diğer mikroorganizmalar tarafından algılanmasıyla gerçekleşir (Fuqua vd., 1994).
Ortamdaki sinyal molekülü konsantrasyonu, mevcut bakteri miktarıyla orantılıdır. Bu nedenle sinyal moleküllerinin algılanması, bakterilerin birbirlerini algılamasını sağlar. Bu sayede sinyal molekülleri bakterilerin topluluk olarak yaşadıkları zaman, özel fonksiyonlarını gerçekleştirmelerini sağlayan genetik değişikliklerine imkan verir (Swift vd., 1994; Taga ve Bassler, 2003). Bakteride hücreler arası iletişim alanındaki son gelişmeler, çoğu bakteri gruplarının davranışlarını düzenlemek için ürettikleri kimyasal sinyal moleküllerini iletişimde kullandığını ortaya koymaktadır.
Bakterilerin iletişim için her bir türü birden fazla kimyasal sinyal molekülü kullanmaktadır. Bu sinyaller bakteriler için tür içinde ve türler arasında iletişimi sağlayarak yaşamı devam ettirmek ve doğal habitatlarıyla etkileşim açısından kritik önem taşımaktadır (Miller ve Bassler, 2001). Ayrıca çevreyi algılama sistemi bakterilerde, virülens faktörlerinin gen ekspresyonu, spor oluşumu, biyofilm oluşumu, kayma hareketi, yüzme hareketi, antibiyotik üretimi ve biyoışıma gibi birçok olayın gerçekleştirilmesini düzenler.
Çevreyi algılama sistemleri hakkında araştırma yapılan gram negatif bakterilerin büyük bir çoğunluğunda, sinyal molekülü olarak N-açil homoserin lakton molekülleri (AHL) iş görmektedir. Bu moleküller ilk olarak, ışık üretimini çevreyi algılama sistemi kullanarak düzenleyen deniz bakterisi olan Vibrio fischeri’de tanımlanmıştır (Nealson vd., 1970). Bu moleküller yoğunlukları sınır değere ulaştığı zaman, transkripsiyonel aktivatöre ya da R proteinine bağlanarak hedef genlerin ekspresyonunu uyarırlar. Bakteriler arasında, AHL sinyal moleküllerine dayanan bu sistemi kullandığı bilinen pek çok tür vardır. Bunlar arasında çevreyi algılama sistemi en çok çalışılmış olan; P. aeruginosa’da biyofilm üretimi ve virülens
faktörlerinin üretimini kontrol eden LasI/R ve RhlI/R sistemi, Agrobacterium tumefaciens’te Ti plazmitinin konjugasyonunu kontrol eden TraI/R sistemi, Erwinia carotovora’da antibiyotik üretimi ve ekzoenzim üretimini kontrol eden CarI/R sistemi (Fuqua vd., 2001; Whitehead vd., 2001; Smith vd., 2003; Lazdunski vd., 2004) sayılabilir.
Gram-negatif bakteriler arasında fırsatçı patojen olanların çoğu, yüksek yapılı organizmalarda kolonize olmaları sırasında, bu sinyal moleküllerini kullanarak populasyon davranışlarını düzenlerler (Hentzer vd., 2002). Dolayısıyla çevreyi algılama sistemi, bakterilere konak üzerinde kendi kritik populasyon yoğunluklarını algılayarak, gerekli virülens faktörlerini ve gen ürünlerinin ekspresyonunu aktive etmelerini sağlar (Parsek ve Greenberg, 2000; Pearson vd, 2000). Bu patojenlerden olan P. aeruginosa, toprakta ve sulu ortamlarda yaşayabilen gram-negatif, aerobik, hareketli bir bakteridir. Bu bakteri, fırsatçı bir insan patojeni olup insanlarda nazokomiyal enfeksiyonlara neden olması, güçlü adaptasyon yeteneklerinin olması gibi sebeplerden dolayı çalışma konusu olmuştur. Bu fırsatçı patojen, çeşitli ciddi enfeksiyonlar (yanık, AIDS, kanser) sonucu bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda veya kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinde enfeksiyonlara neden olmaktadır. P . aeruginosa enfeksiyonuna maruz kalmış kistik fibrozisli hastalarda, bu bakteri yüksek morbidite ve mortalitenin sebebi durumundadır (Lyczak vd., 2002). Ayrıca P.
aeruginosa; kataterler, kalp kapakları ve diş protezleri gibi vücut içi tıbbi cihazlarda da kolonize olmaktadır (de Kievit ve Iglewski, 2000; Dunn ve Wunderink, 1995). P.
aeruginosa, virülensinin ortaya çıkmasında rolü olan çok çeşitli hücre dışı ürün sentezler. Bu virülens faktörlerinin ekspresyonu, hücre yoğunluğuna bağlı olarak düzenlenir ve pek çoğunun ekspresyonu sürekli değildir. Diğer birçok gram negatif bakteri gibi P. aeruginosa da, difüze olabilen N-açil homoserin lakton sinyal moleküllerine dayanan, kendi populasyon yoğunluklarını algılamalarını sağlayan ve çevreyi algılama sistemi olarak adlandırılan mekanizmayı kullanırlar (Delden ve Iglewski, 1998; Williams vd., 2000). Bu iletişim sisteminin temeli iki protein molekülüne bağlıdır. Bunlardan birisi LuxI ailesine mensup AHL sentetaz ve diğeri de LuxR ailesine ait AHL reseptör proteinidir. Düşük hücre populasyonunda az miktarda AHL üretilir. Hücre sayısının artmasıyla AHL sinyal molekülleri büyüme
ortamında sayıca artar ve sınır değere ulaştığı zaman AHL LuxR-tip reseptör proteine bağlanarak hedef genlerin indüksiyonunu veya represyonunu sağlar. P.
aeruginosa’da LasI/R ve RhlI/R sistemi olmak üzere iki adet çevreyi algılama sistemi mevcuttur. Las sisteminin transkripsiyonal aktivatörü LasR ve N-(3- okzododekanoyl)-L-homoserin lakton (OdDHL) molekülünün sentezini kontrol eden AHL sentetaz olan LasI proteinlerinden oluşur. Yine RhlR ve RhlI sisteminde transkripsiyonel aktivatör olarak RhlR ve N-bütanoyl-L-homoserin lakton (BHL) molekülünün sentezini kontrol eden RhlI proteinleri mevcuttur. Đki sistem birbirinden bağımsız değildir ve las sistemi rhlR ve rhlI nin ekspresyonunu pozitif olarak düzenler. P. aeruginosa’da las sistemi, bu iki sinyal sisteminin en üzerinde yer alır ve iki döngü hiyerarşik bir şekilde işlemektedir. Bu karmaşık sistemde rol oynayan Vfr, GacA, RsaL ve RpoS gibi ilave regülatörler mevcuttur. las sistemi, elastaz A, elastaz B ve alkalin proteaz gibi virülens faktörlerinin ekspresyonunu kontrol eder (Gambello vd., 1993; Passador vd., 1993). rhl sistemi, ramnolipid ve piyosiyanin biyosentez enzimlerinin ekspresyonunu ayrıca hidrojen siyanid sentezini kontrol eder (Ochsner ve Reiser, 1995; Brint ve Ohman, 1995; Pessi ve Haas, 2000). las ve rhl sistemleri birlikte iki yüzden fazla genin ekspresyonunda etkilidirler ve biyofilm oluşumunu da kontrol ederler (Whiteley vd., 1999). Ayrıca çevreyi algılama sistemi, bu bakteriler için oldukça kompleks davranışsal bir süreç olan biyofilm oluşumunu etkiler (Davies vd., 1998; Huber vd., 2001). Biyofilm oluşumu bakteriyal patojenitede ve ısrarcı enfeksiyonlarda önemli rol oynar (Costerton vd., 1999; Hoiby vd., 2001; Middleton vd, 2002; Singh vd., 2002).
Gen işleyişlerinin çevreyi algılama sistemini kullanılarak engellenmesiyle, P.
aeruginosa enfeksiyonlarının kontrol edilmesi yeni stratejiler arasındadır (Kline vd., 1999). Bu karmaşık düzenleyici sistemde bir çok potansiyel hedef bölgenin varlığı mevcuttur. P. aeruginosa’da in vivo olarak gerçekleştirilen kromozomal lasI ve rhlI genlerindeki mutasyonların, otoindükleyici sentezini ve virülens genlerinin ekspresyonunu güçlü bir şekilde azalttığı bilinmektedir (Ochsner ve Reiser, 1995;
Brint ve Ohman, 1995; Pearson vd., 1997; Pessi ve Haas, 2000). Ayrıca P.
aeruginosa’nın patojenitesinde çevreyi algılama sisteminin önemi, çeşitli hayvan deneyleriyle ortaya konmuştur. Bunlar arasında Caenorhabditis elegans nematot
modeli (Tan vd., 1999), neonatal pnömonili faremodeli (Tang vd., 1996) ve yanık fare modeli (Rumbaugh vd., 1999) sayılabilir. Bu hayvan deneylerinin tümünde, çevreyi algılama sisteminde mutasyon olan suşların orijinallerine göre daha az virülent olduğu ortaya konmuştur.
Çevreyi algılama sistemi pek çok farklı virülens faktörünün üretimini kontrol ettiği için bu sistemlerden birisinde veya her ikisinde birden bulunabilecek herhangi bir bozukluk, P. aeruginosa’ nın insanlarda enfeksiyona sebep olmasını ciddi bir şekilde etkiler. Yapılan kaynak araştırmasında, çevreyi algılama sisteminin çeşitli basamaklarında sorun olduğu düşünülen P. aeruginosa suşları için uygulanan değişik moleküler ve fenotipik testler uygulandığı tespit edilmiştir. Bu tip suşların, bu özellikler açısından incelenmesi önem taşımaktadır.
Bu çalışma kapsamında, çevreyi algılama sistemlerinde fonksiyonel eksikliğe rağmen klinik enfeksiyonlara neden olan P. aeruginosa suşlarında üretimi çevreyi algılama sisteminin kontrolü altında olan N-açil homoserin lakton ve diğer bazı virülens faktörlerinin üretimi, çeşitli moleküler ve fenotipik testler kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla yüz adet klinik P. aeruginosa izolatı içerisinden çevreyi algılama sistemlerinde fonksiyonel bozukluk bulunan yirmi suş karakterize edilmiştir.
2. KAYNAK ÖZETLERĐ
Gram-negatif ve zorunlu aerop olan Pseudomonaslar ilk kez Gessard tarafından 1882’de tanımlanmıştır. Pseudomonaslar gram negatif ve tek flagellalı mikroorganizmalardır. Zorunlu aerop olmalarına rağmen ortamda arjinin varlığında anaerobik olarak da yaşamlarını devam ettirebilirler. Bu mikroorganizmalar yaklaşık 1-5µm uzunluğa ve 0.1-5µm genişliğe sahiptirler (Şekil 2.1). P. aeruginosa’nın genom büyüklüğü, bileşimi %65 G+C olmak üzere 5.9Mb’dır .
Şekil 2.1. P. aeruginosa bakterisinin genel görüntüsü (Wikipedia, Đnternet sitesi) rRNA/DNA oranına ve karakteristik testlere gore Pseudomonadaceae familyası birbiriyle ilişkili 5 grupta sınıflandırılır. Gruplar arasındaki farklılıklar 7 tip teste dayanır. Bu testler:
a) Koloni Yapısı, b) Koku,
c) Fenazin Pigmentlerinin Üretimi, d) 42 ºC’de Üreyebilme Yeteneği, e) Jelatini Sıvılaştırma
f) Denitrifikasyon,
g) Özel Karbon bileşiklerini kullanarak farklılaşmış büyüme örnekleri gösterme olarak sayılır.
Pseudomonas cinsi Palleroni’nin I. rRNA grubuna dahildir. Bu grupta üç adet fenotipik alt grup mevcuttur (Kapatral vd., 2000).
2.1. Pseudomonasların Genel Özellikleri
P. aeruginosa suşlarının hareketli olmaları, besin ortamlarına yerleşmelerine yardımcı olur (Drake ve Montie, 1988). P. aeruginosa suşlarının hareketleri yüzme, titreme ve kayma olmak üzere üç çeşittir (Kohler vd., 2000). Sıvı besin ortamlarındaki hareketleri olan yüzme hareketini flagella ile gerçekleştirirler. Ayrıca Pseudomonas şeker gibi ilgi duyduğu moleküllere kemotaksisini flagellası aracılığıyla sağlar. Đnsanlarda hastalıklara neden olan Pseudomonaslar, enfeksiyonun erken safhalarında konak canlıya tutunma ve dokuda yayılmak için flagellalarını kullanırlar. P. aeruginosa suşları flagellanın hem a hem de b tipini eksprese ederler.
Bu tip sınıflandırma, filC tarafından kodlanan flagellin alt ünitesinin görünen kısmının büyüklüğüne ve antijenitesine bağlıdır. A-tip flagellinler heterojendir ve çeşitli alt gruplara ayrılırlar. B-tip flagellinler ise homojendir.
Pseudomonas pilisi tip IV veya N-metil-fenil-alanin (NMeFe) olarak adlandırılan sınıfa aittir. Ayrıca epitel hücrelere ve mukozal yüzeylere tutunmasında önemli role sahiptir. Pilinin ucu konak hücre yüzeyine tutunmadan sorumludur. Pili aynı zamanda bakteriyofajlar için reseptör görevi görür (Bradley ve Pitt, 1974). Pili, pilA geni tarafından kodlanan ve pilin olarak adlandırılan 15-18 kDa’luk homopolimerlerden oluşan uzun polar flamentlerdir. PilA öncelikle prepilin olarak sentezlenir ve taşınması sırasında pilin alt ünitesini oluşturmak üzere işlenir.
Kesildikten sonra yeni oluşan N-ucundaki ilk peptit metillenir.
Şekil 2.2. P. aeruginosa a)Şematik gösterim b) Elektron mikroskop görüntüsü (Roche, Đnternet sitesi). 1- pilus, 2- Lipopolisakkarit, 3- Hücre içi, 4- Flagella
Pilinin biyogenezisinde rol oynayan, pilBCD tarafından kodlanan üç adet aksesuar gen mevcuttur. Bu genler pilinin yapısal genlerinin bitişiğinde yer alırlar. pilD geni prepilin proteininin işlenmesinde rol oynayan prepilin peptidazı kodlar. Pilin proteini, tam pilusa dönüşmeden önce hücrenin dış membranında alıkonulur. Pilin flamentleri yaklaşık 5.2nm çapında ve ortalama uzunluğu 2.5mm ayrıca alt üniteleri içi boş silindirik yapı oluşturacak şekilde sarmal bir biçimde yerleşmişlerdir. Pili, titreme olarak da adlandırılan katı besin ortamlarında hareket imkanı sağlayan bir yapıya sahiptir (Bradley, 1980). Pili, PilR/PilS’den oluşan iki bileşenli sistem tarafından düzenlenir. Bu sisteme ilave olarak, sigma faktörü RpoN de pilinin gen ekspresyonunu kontrol eder.
Flagellin ve pili, yapısına, fonksiyonuna ve genetik organizasyonuna göre değişik analojiler gösterirler (Şekil 2.2). Pseudomonas, RpoN’i özellikle besin miktarının az olduğu durumlarda ve insan konağa yerleşmenin başlangıcında hem flagellin hem de pili hareketini kontrol etmek için kullanır.
2.2. Pseudomonas’ın Virülens Faktörleri
Pek çok P. aeruginosa suşu bakteriyal kolonilere mavi-yeşil renk veren piyosiyanin (N-metil-1-hidroksifenazin) pigmentini üretirler (Denning vd., 1998). P. aeruginosa tarafından üretilen düşük molekül ağırlığına sahip olan piyosiyanin molekülü, önemli patojenite faktörlerinden birisidir ve üretimi çevreyi algılama sisteminin kontrolü altındadır (Fuqua vd., 2001). Bu molekül birçok bakteri türüne karşı antibiyotik özelliği göstererek, P. aeruginosa’nın bulunduğu ortamda rekabet şansını arttırır (Hassett vd., 1992).
a b
Şekil 2.3. P. aeruginosa’ nın ürettiği piyosiyanin molekülü a) nötr veya bazik pH’ta zwitteriyon olarak davranır ve mavi renklidir b) asidik ortamda ise kırmızı renklidir.
Yapılan in vitro çalışmalar, piyosiyaninin kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinde oldukça fazla hücresel hasara neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca bu molekül insan hücrelerinde hücresel solunumun, epidermal hücre büyümesinin engellenmesi gibi fonksiyonlara sahiptir (Denning vd., 1998). Bu molekülün konak hücreye sitotoksititesi genellikle redoks döngüsünün potansiyeliyle güçlü bir şekilde ilgilidir (Şekil 2.3). Elektronları doğrudan NADH veya NADPH moleküllerinden alır ve aerobik koşullarda bu elektronları, reaktif oksijen türevleri (ROS) superoksit (O2–
·) ve hidrojen peroksit (H2O2) oluşumuna yol açan O2 molekülüne aktarır (Griffith, 1999). Yine piyosiyanin epitel hücrelerinde katalaz aktivitesini inhibe ederek akciğerde oksidatif hasara neden olur.
Pek çok memeli hücresi radikal oksijen türevlerinin oluşmasını sınırlayacak bir kaç tipte mekanizmaya sahiptir. Bu moleküllerin oluşumunu engellemek için kullanılan hücresel moleküllerden birisi glutatiyondur. Ancak piyosiyanin glutatyonun aktivitesini inhibe eder.
Elastaz, elastin ve kollajen gibi ökaryotik proteinleri parçalayan ve insan immunoglobulin G hücrelerini inaktive eden bir metalloproteazdır (Hamood vd., 1996). Elaztaz lasB geni tarafından kodlanır. lasB geni, LasR-LasI çevreyi algılama sisteminin kontrolündeki LasR regülatörü tarafından kontrol edilir (Passador vd, 1993). Elastazın P. aeruginosa’nın patojenitesine önemli katkısı olduğu, hayvan deneyleriyle ortaya konmuştur. LasB elastaz gerek tek başına gerekse Pseudomonas tarafından üretilen diğer proteazlar ile birlikte işlev göstererek biyolojik olarak önemli birçok substratı parçalar veya inaktive eder (Nicas ve Iglewski, 1985).
Pseudomonas tarafından sentezlenen LasA proteaz, lasA tarafından kodlanan 41 kDa’luk prekürsör olarak sentezlenir ve 22 kDa’luk aktif proteini oluşturmak için kesilir. Pseudomonas tarafından üretilen ve LasA’ya benzer özellikler gösteren diğer bir proteaz lasD geni tarafından kodlanan LasD’dir. LasD yalnız yüksek pH değerlerinde aktifken, LasA geniş bir pH aralığında aktivite gösterir. Bu proteinler aynı zamanda önemli virülens faktörleri olarak kabul edilmektedirler.
P. aeruginosa belirli çevresel koşullar altında ramnolipid olarak adlandırılan, hidrofilik kısmı bir veya iki ramnoz molekülü içeren ve hidrofobik kısmı yağ asidi yapısında olan biyosurfaktan üretir. Bunlar ramnolipid I, Ramnosil-L-ramnosil-B- hidroksi-dekanoil-β-hidroksi-dekanoat (mono ramnolipid) ve Ramnolipid II ise ramnosil-ramnosil-β-hidroksidekanoil-β-hidroksi-dekanoat (diramnolipid) şeklindedir (Şekil 2.4). Ramnolipidler yüzey gerilimini azaltıcı özelliklerinden dolayı, endüstriyel ve çevreyle ilgili pek çok alanda kullanılmaktadır. Bunlar arasında hidrokarbonlar gibi düşük çözünürlüğe sahip kirleticilerin uzuklaştırılması yada biyodegredasyonunun arttırılması sayılabilir (Maier ve Chavez, 2000).
a b
Şekil 2.4. P. aeruginosa’ nın ürettiği ramnolipid molekülleri a) mono b) di ramnolipid (m,n 4-8).
Yine Pseudomonasların ürettiği bu molekül, diğer birçok bakteri için antibakteriyel özellik göstererek bulundukları ortamda bu bakterilere avantaj sağlar. Ramnolipidler, konakta, akciğer yüzeyindeki fosfolipidleri çözerek P. aeruginosa tarafından üretilen fosfolipaz C molekülünün etki etmesini kolaylaştırırlar. Ayrıca bu bakterilerin kayma hareketinin (Kohler vd., 2000; Deziel vd., 2003) ve biyofilm oluşturmalarının da (Deziel vd., 2003) ramnolipid üretimiyle yakından ilişkili olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur.
Pseudomonas tarafından üretilen ve toxA geninin kodladığı ekzotoksin A, toksik bir proteindir (Callahan, 1976). Bu protein, konak hücre protein sentezinin inhibisyonuyla sonuçlanan ökaryotik translasyon faktöründen (EF-2), ADP-ribosil EF-2’yi oluşturmak üzere ADP-ribozilasyonunu katalize eder (Leppla, 1976). Hücre zehirlenmesindeki bu mekanizma difteri toksinininkiyle aynıdır. toxA geni ortamda düşük demir konsantrasyonu mevcudiyetinde yüksek seviyelerde ekspresse edilir. Bu durum Fur olarak adlandırılan ve aynı zamanda siderofor üretimini kontrol eden(ferric uptake regulator)sistem tarafından kontrol edilir.
Ekzoenzim S, exoS geni tarafından kodlanan 43 kDa büyüklüğünde bir proteindir. Bu enzim, vimentin gibi ökaryotik proteinlerde ADP fosforilasyon aktivitesine sahiptir.
ADP’nin ribozillenmesi için FAS (factor for activating exoenzyme S) isimli ökaryotik protein gereklidir (Coburn vd., 1991). Yine ExoS enzimiyle benzer molekül ağırlığına sahip, exoT geni tarafından kodlanan ve ExoT olarak adlandırılan diğer bir protein, FAS’a bağlı ADP’yi ribozilleme özelliğine sahiptir. Bu enzimlerin
her ikisi de sitotoksik etki gösteririler ve tip III salgılama sistemi tarafından salgılanırlar (Iglewski vd., 1978). Hem exoS hem de exoT genleri, ExsA olarak adlandırılan ve exsA geni tarafından kodlanan transkripsiyonel aktivatör tarafından kontrol edilir (Hovey ve Frank, 1995). P. aeruginosa’nın patojenitesinde ADP- Ribozillenmesinin rolü tam olarak bilinmemesine rağmen, ExoS üretiminin epitel hücre hasarı ve P. aeruginosa’nın enfekte ettiği konakta yayılabilmesi için gerekli olduğu bilinmektedir (Nicas vd., 1985; Apadoca vd.,1995; Kang vd.,1997).
Alginat önemli bir virülens faktörüdür. Alginat aynı zamanda gıda, eczacılık ve kimya sektöründe de oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Đnsanlarda alginat üreten P. aeruginosa kistik fibrozisli hastaların pulmoner yollarında kolonize olurlar ve akciğer hava yollarını kapatarak hastaların ölümlerine sebep olurlar.
Pseudomonas algL geni tarafından kodlanan ve alginatı parçalayarak alginat polimerinin uzunluğunu kontrol eden alginat liyaz enzimi üretir. Alginat liyaz, bakterilerin hücre yüzeylerine tutunarak yeni yaşam alanlarına yerleşmelerinde ve yeni alginat zincirlerini oluştururken primer olarak kullanılan kısa oligosakkaritleri oluşturmada önemlidir. Osmolarite, azot yetersizliği, fosfat yetersizliği, susuzluk gibi stres durumları ve antibiyotikler gibi bir çok çevresel etmen alginat üretimini uyarır.
mucA ve mucB gibi regülatör genlerdeki mutasyonlar alginat sentezini etkiler.
Lipopolisakkarit (LPS), Pseudomonas tarafından üretilen diğer bir virülens faktörüdür. Lipopolisakkarit, hidrofobik lipid A merkez oligosakkarit ve O polisakkaritten oluşur. P. aeruginosa’nın ürettiği lipid A endotoksik iken O polisakkarit immünudominanttır. O antijeni lizojenik bir faj olan D3 tarafından kodlanır. Pseudomonas tarafından A ve B olmak üzere iki tip LPS üretilir.
Pseudomonas tarafından üretilen lipazlar lipolitik, hemolitik ve hemolitik olmayan fosfolipaz C olmak üzere üç gruba ayrılır.
a) Lipaz: P. aeruginosa tarafından salgılanan 26kDa’luk bu enzim oldukça geniş bir aralıktaki trigliseritlere etkilidir.
b) Fosfolipaz C: Pseudomonaslarda hemolitik ve hemolitik olmayan olmak üzere iki tip fosfolipaz C bulunur.
1) Hemolitik Fosfolipaz C (PLC-H): 78 kDa büyüklüğünde ısıya dayanıklı bir protein olup, lipaz aktivitesini fosfotidil kolin ve sfingomiyelin üzerinde gösterir.
2) Nonhemolitik Fosfolipaz C (PLC-N): Bu, Pseudomonas tarafından üretilen ikinci fosfolipazdır. 73 kDa büyüklüğündedir ve PLC-N olarak bilinir. Fosfotidil kolin ve fosfotidil serine etkiliyken koyun eritrositlerine etkili değildir. Ortamda düşük fosfat varlığı ve aerobik şartlar PLC sentezini ve aktivitesini uyarırken yüksek NaCl mevcudiyeti PLC aktivitesini baskılar. Hem PLC-H hem de PLC-N fosfotidil kolini, diaçil gliserol ve koline parçalar. Bu olay akciğer surfaktanının parçalanarak akciğerin şişmesine ve doku hasarına yol açar. Ayrıca PLC-H aktivitesi akciğer dokusunda hemorajik nekroza neden olur.
Pseudomonaslar lökositler ve diğer ökaryotik hücrelere karşı da sitotoksin üretirler (Scharmann, 1976). ctx geni tarafından kodlanan pro-sitotoksin olgunlaşarak 18 kDa büyüklüğünde aktif toksine dönüşür. CTX toksini, konak hücresinin lipid tabakasında açıklık oluşumuna neden olur.
Pseudomonaslar, piyosin olarak adlandırılan ve diğer bakterileri öldüren bakteriyosinleri üretirler. Pseudomonaslarda R, F ve S tipi olmak üzere üç tip piyosin mevcuttur. R ve F tipi piyosinler bakteriyofajın kuyruk proteinlerine benzerler.
Bakteriyosinler genellikle plazmitler tarafından kodlanmasına rağmen piyosin genleri P. aeruginosa’da kromozom üzerinde bulunurlar. S tip piyosinler proteaza duyarlı kolisin benzeri basit proteinlerdir ve S1, S2, S3, AP41 olmak üzere dört alt grubu ayrılırlar (Sano vd., 1993; Sano ve Kageyama, 1993). R1, R2, R3, R4 ve R5 olmak üzere beş alt gruba ayrılan R-tip piyosinler kontraktil bakteriyofaj kuyruklarına benzerler. Bu alt gruptaki piyosinler serolojik ve yapısal özellikler açısından birbirlerine benzerken, reseptör özgüllüğü açısından birbirlerinden ayrılırlar. F-tip piyosinler, faj kuyruklarına benzemelerine rağmen esnektir, ancak konraktil değildir.
Piyosinler çevreye salgılanarak ortamdaki diğer bakterilerin öldürülmesiyle ekolojik baskınlığa sahip olmada önemli rol oynar. Lize edilen bakteriler parçalanarak besin olarak kullanılırlar.
P. aeruginosa diğer virülens faktörlerinin yanısıra belirli şekerlere bağlanan ve lektin olarak adlandırılan özel proteinler üretirler. PA-IL ve PA-IIL olmak üzere iki tip lektin karakterize edilmiştir. PA-IL, D-galaktoz ve onun türevlerine spesifik iken PA-IIL,L-fukoz ve D-mannoza spesifik bağlanır (Winzer vd., 2000). Lektinler bakterilerin hücrelere tutunup IL-1 ve IL-6 gibi konak sitokinlerini indükler.
P. aeruginosa siderofor olarak adlandırılan ve demirin eksik bulunduğu durumlarda demiri güçlü bir şekilde bağlayan kimyasal olarak birbirinden farklı, piyoverdin ve piyoselin olmak üzere iki temel bileşen üretir (Vasil ve Ocshner 1999; Takase vd., 2000). Sideroforlar demiri bağlarlar ve reseptöre dayalı mekanizmalarla bunları hücre içine alınırlar. Bu mekanizmayla, Pseudomonas demir için yarışarak ortamdaki diğer bakterilerin gelişmesini kısıtlar.
Piyoselin, fenolik siderofordur. Piyoselin demire bağlanır ve bu oloşan yapı 75DA’luk dış membran proteiniyle taşınır (Ankenbauer vd., 1988). Ayrıca piyoselin enfeksiyon sırasında bakteriyel büyümeyi uyarır. Piyoverdin Pseudomonasa sarı- yeşil renk veren, siderofora bağlanmaya yüksek ilgi gösteren, 2,3 diamino-6,7 dihidroksiquinolon yapısında ikinci sınıf fluoresan bileşendir.
P. putida ve P. syringae gibi bazı suşlar, farklı aminoasit dizilimine sahip piyoverdine benzer sideroforlar üretirler. Sideroforlar için reseptörler, farklı türlerde çeşitlilik gösterirler (Ankenbauer vd., 1988).
P. aeruginosa çevreyi algılama sisteminin kontrolü altında, sıvı ve katı yüzeylerde biyofilm adı verilen bir yapı oluşturur. Bakterilerin bu yapıyı oluşturması, bakteriyal antibiyotik direncini arttırması ve biyofilm üzerindeki bakterilerin konağın immün cevabından daha az etkilenmesi nedeniyle tıbbi açıdan önem taşımaktadır (Costerton vd., 1999). Aerobik ortamlarda biyofilm oluşumunda las sistemi merkezi rol oynar (De Kievit vd., 2001). Yine bir biyosurfaktan olan ramnolipid üretimi de biyofilm oluşturulmasında önem taşımaktadır (Yoon vd., 2002).
Pseudomonasta aprA geninin kodladığı alkalin proteaz korneayı enfekte eder. AprA proteininin üretilmesi için, AprD, AprE ve AprF olmak üzere üç çeşit protein gereklidir. Pseudomonas aynı zamanda aprI geninin kodladığı ve AprI olarak adlandırılan alkalin proteaz inhibitörü üretir.
P. aeruginosa çoğu doğal yaşam alanında katı ve sıvı yüzeylerde biyofilm adı verilen yapılar içerisinde canlılıklarını sürdürürler. Bakteriyel biyofilmler doğal olarak çoğu ıslak yüzeyde yaygındır ve bunlar çevresel sorunlara yol açabilir. P. aeruginosa sadece doğal yaşam alanlarında değil, kronik olarak bu bakteri ile infekte olmuş kistik fibrozis hastalarının akciğerlerinde de biyofilm oluşturarak canlılıklarını devam ettirirler (Costerton vd.,1999).
Biyofilmler, bakterilerin uygun olmayan şartlarda büyümelerini ve hayatta kalmalarını sağlar. Biyofilm öncelikle iç yüzeylerde veya ölü dokularda, yaygın olarak tıbbi aletlerin üzerinde ve ölü doku fragmentlerinde gelişir ve bunların yanı sıra canlı dokuların üzerinde de oluşurlar. Biyofilmler bir veya daha fazla bölgede yavaş bir şekilde gelişirler. Sesil bakteri hücreleri antijenleri nedeniyle antikor yapımını uyarırlar. Ancak antikorlar biyofilm içerisindeki bakterileri öldüremez. Her bir birey oldukça mükemmel hücresel ve hümoral bağışıklık sistemine sahip olmasına rağmen, konağın savunma sistemi tarafından biyofilm enfeksiyonlarının üstesinden gelinmesi oldukça nadir meydana gelir (Costerton vd., 1999).
Biyofilm oluşumu, sinyallerle düzenlenen yüzeye tutunma, mikrokoloni oluşması, hücre dışı polisakkarit bileşenlerin üretilmesi, olgunlaşma ve diğer bölgelere yayılma şeklinde 4 ana süreçten oluşur (Şekil 2.5.). Biyofilm oluşumunun başlangıç basamağında P. aeruginosa yüzeye tutunmak için ve yayılmış ilk tabakayı oluşturmak için flagellasını kullanır (Costerton vd.,1999).
Şekil 2.5. Biyofilm oluşumunun basamakları 1) tutunma, 2) mikrokolonilerin oluşması, 3) Hücre dışı polisakkarit bileşenlerin üretilmesi, 4) olgunlaşma, 5) diğer bölgelere yayılma (Biofilms, Đnternet sitesi).
Biyofilmin derinliği ve biyofilm oluşumunun tüm aşamaları oldukça iyi korunmuş sinyallerle kontrol edilir. Bu düzenleyici sinyaller, biyofilm içerisindeki bakteri hücrelerinin besin gereksinimlerini optimize ederler (Stanley ve Lazazzerra, 2004).
Bu yapılar hücre dışı polimer matriksle sarılıdır. Biyofilmler homojen mat hücrelerden oluşmuş kalın bir yapıya sahip olabilirken, besin alınımı ve atık atılımına hizmet eden su kanallarından oluşmuş karmaşık bir yapıya sahip olabilir.
Biyofilm oluşumu, tıbbi alanlarda ve ekonomik olarak ciddi sorunlara sebep olduğu için ilgi gösterilen çalışma konularından birisi olmuştur. Biyofilm oluşumunun incelenmesi için P. aeruginosa model organizma olarak kullanılmaktadır.
2.3. P. aeruginosa’nın Etkeni Olduğu Hastalıklar
P. aeruginosa insanda yaygın olarak bulunan saprofit bir bakteri olmasına rağmen sağlıklı insanlarda nadiren enfeksiyonlara neden olurlar. Bu mikroroganizmanın sebep olduğu hastalıklar çeşitli sebeplerle (yanık hastaları, vücudunun çeşitli bölgelerinde kateter bulunduran hastalar, yeni doğanlar, AIDS hastaları, kistik fibrozis hastaları, nötropeni hastaları ve vücut bütünlüğü bozulmuş hastalarda görülür. Pseudomonal enfeksiyonlar üç aşamada ortaya çıkarlar. Bu aşamalar;
a) Bakterilerin konağa tutunması ve kolonize olması,
b) Bölgesel invazyon,
c) Yayılma ve sistemik hastalığın ortaya çıkışı şeklindedir (Pollack, 1984).
Pseudomonal enfeksiyonlar;
a) AIDS-ile ilgili hastalıklar,
b) Bakteremi ve sepsis
Bu tip hastalıkta ilk görülen belirti genellikle ateştir. Bu tip bakteremi, uzun süre hasadetde yatmış ve uzun süre antibiyotik tedavisi uygulanmış veya vücudunun herhangi bir bölgesinde kateter bulunan bağışıklık sistemi baskılanmış (yeni doğanlar dahil) bireylerde görülür.
c) Febril nötropeni
d) Kemik ve eklem enfeksiyonları (osteomiyelit,osteokondirit,piyartrozis)
Bu tip kemik ve eklem hastalıkları, damar içi ilaç kullananlarda, ameliyat sonrası dönemde yumuşak doku enfeksiyonlarını takiben ayrıca şeker ve romatoid artrit hastalarında görülür.
e) Koagülaz negatif enfeksiyonlar (beyin apsesisi, menenjit)
Bu tip Pseudomonas enfeksiyonları bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda görülür. Ayrıca menenjitli yaşlı hastalardan bu bakteri sıklıkla izole ediliken, Pseudomonas enfeksiyonu nadiren yenidoğanlarda menejitinin sebebi durumundadır.
f) Kulak enfeksiyonları (orta kulak iltihabı, dış kulak iltihabı ve kötü huylu dış kulak iltihabı). P aeruginosa kötü huylu dış kulak iltihabı vakalarının %95’inden fazlasının etkeni durumundadır.
g) Göz enfeksiyonları
P. aeruginosa’nın etkeni olduğu göz enfeksiyonları arasında endooftalmitis, keratitis sayılabilir. Pseudomonasların etkeni olduğu göz enfeksiyonları daha çok kontakt lens kullanımıyla ilgili olmasına rağmen lens kullanmayan bireylerde de bu enfeksiyonunu görüldüğü bildirilmiştir.
h) Gastro-Đntestinal sistem enfeksiyonları
Bunlar arasında epidemik diyare, enterokolit ve rektal apseler sayılabilir.
ı) Kalp-Damar Sistem enfeksiyonları
Endokardit, perikardit Pseudomonasın sebep olduğu enfeksiyonlar arasındadır.
Pseudomonal enfeksiyonunu sebep olduğu endokardit kalbin her iki tarafındaki normal olan ve normal olmayan kapakçıkları etkileyerek, kapakçık hasarına ve kalp rahatsızlığına sebep olur.
i) Solunum sistemi enfeksiyonları
Bu enfeksiyonlar arasında pnömoni ve alt solunum yolu enfeksiyonları sayılabilir.
j) Cilt ve yumşak doku enfeksiyonları: Dermatit, yanık enfeksiyonları, piyoderma, cerrahi enfeksiyonlar örnek olarak sayılabilir.
k) Üriner sistem enfeksiyonları: Bunlar arasında epididimit, prostatit ve üretrit sayılabilir.
2.3.1.Kistik Fibrozisli Hastalarda Pseudomonas
Kistik fibrozis Kafkas toplumunda yaygın olarak bulunan bir hastalıktır. Bu hastalıktan muzdarip olan hastalarda, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) olarak adlandırılan gende mutasyon mevcuttur. Bu hastaların yaklaşık % 80-90’ı pulmoner fonksiyon bozukluğu ve dolayısıyla erken ölüme sebep olan P. aeruginosa ile enfekte olmaktadır. Sağlıklı insan akciğerinde NaCl konsantrasyonu 85 mM civarındadır ve defesinler bakterileri öldürmek üzere aktiftirler. Buna karşın kitik fibrozisli hastaların akciğerlerinde defesinler inaktiftirler ve bakteriler çok fazla mukus üreterek hayatlarını devam ettirirler. Bu durum bu hastalarda solunum yollarını tıkayarak ölüme sebep olur. Ayrıca kistik fibrozisli hastaların akciğerleri, Pseudomonasların alginat üretip biyofilm oluşturarak, bakterilerin antibiyotiklerden ve ilaçlardan korunması için iyi bir ortam sağlar.
Biyofilm aynı zamanda bakterilerin fagositler tarafından yenmesini engeller. Bu nedenle kistik fibrozisli hastalarda Pseudomonas enfeksiyonlarını tedavi etmek oldukça zordur.
2.3.2. Pseudomonas Enfeksiyonlarının Kontrolü
Sefotaksim, benzil penisilin, imipenem, gentamisin, tobramisin veya gentamisin- karbenisilin kombinasyonu gibi bir çok kemoterapötik etken Pseudomonas enfeksiyonlarının tedavisinde seçenek olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçlar bakteride yeni hücre duvarının sentezini engelleyerek bakterilerin çoğalmasını engellerler.
Ciddi Pseudomonas enfeksiyonlarında norfloksasin, gentamisin ve siprofloksasin gibi florlanmış kinolonlar tercih edilmektedir. Siprofloksasin Pseudomonaslara karşı oldukça etkili olduğundan özellikle yanık vakalarında tercih edilmektedir. Bazı vakalarda Pseudomonas enfeksiyonlarını engellemek için lipid analogları kullanılmaktadır. P. pseudomallei’nin etkeni olduğu melediosis hastalığında trimetoprim veya sulfometakzol kullanılır.
2.4. P. aeruginosa’da Antibiyotik Direnci
2.4.1. Biyofilm Oluşumundan Dolayı Direnç
Biyofilm içerisinde büyüyen bakteriler, planktonik olarak büyüyenlere göre antibiyotiklere çok daha fazla dirençlidir. Eski biyofilm içerisindeki bakterilerin MĐK ve minimal bakterisidal konsantrasyon (MBK) düzeyleri yeni oluşmuş biyofilm içerisindeki bakterilere göre 100-1000 daha fazladır (Hoiby, 2002). Biyofilm içerisindeki bakterilerin antibiyotiklere karşı direncini sağlayan faktörler çeşitlidir.
Bunlar arasında yavaş büyüme, biyofilmin tabanında azalan oksijen miktarı, pozitif yüklü aminoglikozitlerin negatif yüklü alginat polimerlerine bağlanmasıyla oluşan penetrasyon bariyeri, bakteride beta laktamazların varlığı sayılabilir (Nichols vd., 1988; Anwar vd., 1992; Stewart ve Costerton, 2001).
Kullanılan standart hassasiyet testleri kullanılan antibiyotiklere karşı duyarlı olduğunu göstermesine rağmen biyofilm içerisindeki bakterilerde artan direnç bunların ortadan kaldırılmasını genellikle başarısızlığa uğratmaktadır. P. aeruginosa biyofilmlerinde büyük bir oksijen gradienti mevcuttur. Aynı şekilde pH ve besin gradienti de mevcuttur (Parsek ve Greenberg, 2000).
2.4.2. Beta Laktamaz Enzimlerinin Sağladığı Direnç
P. aeruginosa’da antimikrobiyal tedavi sırasında belirli genlerdeki mutasyonlar tarafından yönlendirilen direnç gelişimi, özellikle kronik olarak bu mikroorganizmalarla kolonize olan hastalarda yüksek oranda mutasyon bulunan suşların yaygın olarak bulunması gibi önemli klinik sonuçları nedeniyle sık karşılaşılan bir problemdir (Oliver vd., 2000). Tikarsilin veya piperasilin gibi anti pseudomonal antibiyotiklere ve sefalosporinlere (seftazidim veya sefepim) direnç gelişmesinin en sık karşılaşılan sebebi, kromozomal sefalosporinaz AmpC’nin oluşan mutasyonlar ile aşırı üretilmesidir (Livermore, 1987; Giwercman vd., 1990). AmpC Enterobacteriaceae familyasında ve P. aeruginosa’da ve diğer nonfermentatif gram
negatif basillerde en çok bulunan beta laktamazdır (Livermore, 1995). Beta laktamaz, Escherichia coli ve Shigellae haricinde düşük bazal seviyede üretilir ancak ekspresyonu sefoksitin ve imipenem gibi belirli beta laktamlarla uyarılabilir (Livermore, 1995). Beta-laktam kullanılarak uygulanan tedavi sırasında, dirençli suşların yüksek seviyelerde AmpC üretmesi nedeniyle tedavi başarısız olur (Giwercman vd., 1990).
2.4.3. Đlaç Pompalarının Sağladığı Direnç
P. aeruginosa pek çok antibiyotiğe kalıtsal olarak dirençli olduğu için eradikasyonu oldukça zordur. Öncelikle bu iç direncin düşük dış membran (OM) geçirgenliği ile ilgili olduğuna inanılmaktaydı. (Nikaido, 1989). P. aeruginosa’da, bulunan dört çeşit efflux pompası MexABOprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, and MexXY (Poole, vd., 1993, Li, vd., 1995; Poole, vd., 1996 Kohler, vd., 1997) tanımlanmıştır. Bu dört pompa arasında orijinal tip P. aeruginosa suşunda sadece MexAB-OprM pompasının sürekli olarak eksprese edildiği bilinmektedir. P. aeruginosa’da, MexAB-OprM pompası tetrasiklin, kloromfenikol, kinolonlar, novobiyosin, makrolitler, trimetoprim, beta-laktamlar ve beta-laktamaz inhibitörleri (Poole, vd., 1993; Li, vd., 1995; Gotoh, vd., 1995,Kohler, vd., 1996; Li, vd., 1998) gibi pek çok antimikrobiyal etkene karşı iç direncin oluşturulmasında rol oynar. P. aeruginosa’da son zamanlarda tanımlanmış olan MexXY efflux pompasının aminoglikozitler, eritromisin, ve fluorokinolonlara (Westbrock-Wadman, vd., 1999; Aires, vd., 1999; Mine, vd., 1999) karşı direnç oluşturulmasında önemli rolü olduğu bulunmuştur.
2.5. Pseudomonaslarda Salgılama Sistemi
Pseudomonaslarda proteinlerin dış membrana doğru salgılanmaları için, genel salgılama sistemi (GSS) dahil üç salgılama sistemi mevcuttur. Bu sistemler Tip I, II, III olmak üzere sınıflandırılmıştır.
Tip1: Alkalin proteaz tip I sistemince salgılanması kontrol edilir.
Tip II: Bu salgılama sistemi 11 gen ürününü de kodlayan hücre dışı protein salgılama (xcp)gen bölgesinden oluşur. Salgılanan bu heterojen proteinler arasında elastaz, alkalin proteaz ve fosfolipaz mevcuttur. Bu proteinler, bunların periplazmaya yönlendirilip Xcp sistemi tarafından hemen tanınarak dış ortama taşınması için sinyal peptit görevi görürler. Tip IV pilinin biyosentezi ve salgılanması da Tip II salgılama sistemine benzer bir mekanizmayla gerçekleştirilmektedir.
Tip III: Pseudomonasta bulunan bu salgılama sistemi Yersinia’da bulunan YopE (Yersinia outer proteins) salgılama sistemiyle benzerdir. Bu sistem Pseudomonas’ın önemli virülens özelliklerinden birisidir ve bakterinin toksinlerini konak hücreye aktarmasını sağlar. Bu sistem salgılama birimi, salgılanan toksinler ve kendi salgılanmalarına imkan sağlayan bağımsız bölgeler (chaperone) olmak üzere üç parçadan oluşur (Gauthier vd.,2003). P. aeruginosa tip III salgılama sistemiyle ExoS, ExoT, ExoU ve ExoY.olmak üzere dört tip toksin salgılandığı bilinmektedir. P.
aeruginosa enfeksiyonlarında bu salgılama sisteminin önemi çeşitli hayvan deneyleriyle oytaya konmuştur. Tip III salgılama sisteminin proteinlerinin nötralize edilmesiyle septik şokun engellendiği ve hayatta kalma süresinin uzadığı bildirilmiştir (Shime vd., 2001).
2.6. Gram-Negatif Bakterilerde Çevreyi Algılama
Bakterilerin her bir türü birbirleriyle iletişim kurmak için birden fazla sayıda veya birden fazla çeşitte sinyal molekülü kullanırlar. Bu sinyal molekülleri, bakteriyel populasyonlara kendi hücre yoğunluklarını algılama imkanı sağlar. Bakterilerin bu şekilde kendi populasyon yoğunluklarını algılayabilme yeteneklerine “Çevreyi Algılama” denir (Fuqua vd., 1994). Bu sinyal molekülleri, tür içinde ve türler arasında iletişimi sağlayarak bakterilerin yaşamlarını devam ettirmeleri ve doğal habitatlarıyla etkileşimleri açısından kritik önem taşır (Miller ve Bassler, 2001).
Çevreyi algılama sistemleri çalışılan gram negatif bakterilerin büyük bir çoğunluğunda sinyal molekülü olarak N-açil homoserin lakton molekülleri kullanılmaktadır (Şekil 2.7). Bu moleküller yoğunlukları eşik seviyeye ulaştığı zaman, transkripsiyonel aktivatöre ya da R proteinine bağlanarak hedef genlerin
ekspresyonunu uyarırlar. Bakteride hücreden hücreye iletişim alanındaki artan çalışmalar, çoğu bakteri gruplarının davranışlarını düzenlemek için salgıladıkları kimyasal molekülleri iletişimde kullandığı ortaya konmaktadır. Ayrıca kimyasal sinyal moleküllerinin farklı sınıflarının pek çok çeşidinin kullandığı bilinmektedir.
Çevreyi algılama sistemi ilk defa, 25 yıl önce iki lüminesens deniz bakterisi türü olan Vibrio fisheri ve Vibrio harveyi’de ortaya konmuş ve tanımlanmıştır. Her iki türde de ışık üretiminden sorumlu enzimler lusiferaz yapısal operonu olan lucCDABE tarafından kodlanır ve ışığın üretilmesi sadece yüksek hücre yoğunluğunda üretilmiş sinyal moleküllerinin kümeleşmesiyle çevreyi algılama sisteminin kontrolü ile olur.
a b
Şekil 2.6. a)Euprymna scolopes, b) Işık organı. (National Science Foundation, Đnternet sitesi).
Aeromonas hydrophila ve Aeromonas salmonicida gibi bazı Gram-negatif türler de açil homoserin lakton molekülleri üretirler veya LuxRI’ın homologlarını içerirler. Bu yaygın balık patojenleri LuxRI’ın homologları olan AhyRI ve AsaRI’ı exprese ederek, BHL ve HHL sinyal moleküllerinin sentezini düzenlerler. Yine bir başka balık patojeni olan Vibris anguillarum’da LuxRI homoloğu olan VanI N-(3-oxo- Dekanoyl)-L-HSL (ODHL) molekülünün sentezini katalizler. Serbest yaşayan bir mikroorganizma olan C. violaceum’da HHL, kısmi olarak antibiyotik üretimini, virülens faktörlerini, kitinolitik aktiviteyi ve mor pigment üretimini bu sinyal moleküllerine dayanan çevreyi algılama mekanizmasını kullanarak düzenler. Yine bu bakterinin sinyal molekülü üretemeyen mutantı, diğer bakterilerin açil homoserin lakton molekülü üretimlerini test için kullanılmaktadır (Sharma vd., 2003).
Şekil 2.7. Homoserin lakton molekülleri
a)N-(3-okzohekzanoyil)-L-homoserin lakton (OHHL), b) N-bütanoyil-L-homoserin lakton (BHL), c)N-(3-hidroksi bütanoyil)-L-homoserin lakton (HBHL), d)N- hekzanoyil-L-homoserin lakton (HHL), e)N-(3-okzooktanoyil) -L-homoserin lakton (OOHL), f) N-(3-okzodekanoyil)-L-homoserin lakton (ODHL), g) N-(3- okzododekanoyil)-L-homoserin lakton (OdDHL).
N O O
H O OH
H
H
C
N O O
H O H
D
N O O
H O O
H
G
N O O
H O H
B
N O
O O
H O H
A
H N O O
H O
E O
N O O
H O O
H
F
2.6.1. LuxI-LuxR Tip Çevreyi Algılama Sistemi
Gram-negatif bakteriler arasında en iyi çalışılmış çevreyi algılama sistemi LuxR- LuxI homolog sistemidir (Şekil 2.8) ve temel sinyal molekülü açil homoserin laktonlardır. Bu çevreyi algılama sistemi, gram-negatif bakteriler arasında yaygındır ve konakla ilgili virülens faktörlerinin ve sekonder metabolitlerin üretiminin kontrol edilmesinde rol oynar (Hentzer ve Giskov, 2002).
Pek çok bakteride Açil-HSL moleküllerinin varlığı tespit edilmiştir. Genellikle bu sinyal molekülüleri yağ açil zincirine amid bağıyla bağlanmış homoserin lakton molekülünden oluşur. Farklı bakteriler arasında Açil-HSL molekülleri açısından çeşitlilikler mevcut iken aynı bakteri türünce sentezlenen farklı Açil-HSL molekülleri de mevcuttur. Açil zincirinin uzunluğu 4-16 C arasında değişebilir. C-16 HSL molekülü Rhodobacter capsulatus tarafından üretilir. Açil zincirinin 3.C’u tamamiyle okside olabileceği gibi, taşıdığı hidroksil grubuyla tamamen redükte bir durumda da bulunabilir (Fuqua ve Greenberg, 2002) .
Geçen 10 yıl içerisinde 25’den fazla gram-negatif bakteri türünde çevreyi algılama döngüsünün olduğu tespit edilmiştir. V. harveyi ve M. xanthus’un çevreyi algılama sistemleri hariç gram negatif bakterilerdeki tüm çevreyi algılama sistemi, simbiyotik bakteri olan V. fischeri’deki döngüye benzer. Bu bakteriyel çevreyi algılama döngüleri en azından V. fischeri’nin regülatör proteini olarak bilinen LuxI ve LuxR proteinlerinin homologlarını içerirler.
LuxI benzeri proteinler, sinyal molekülü olarak bilinen homoserin lakton sinyal moleküllerinin biyosentezinden sorumludur. Ortamdaki sinyal molekülü konsantrasyonu, çoğalan hücre populasyon yoğunluğuyla artar.
LuxR benzeri proteinler aynı kökenli homoserin lakton sinyal moleküllerine, bu moleküllerin yoğunlukları kritik sınır değerine ulaştığında bağlanır ve bu molekül kompleksi hedef genin transkripsiyonunu da aktive ederek, genler tarafından kodlanan özelliklerin gerçekleştirilmesini sağlar (Miller ve Bassler, 2001).
a)
b)
Şekil 2.8. Vibrio fischeri’ de luxR-I tip çevreyi algılama sistemi ve ışık üretimi a) düşük bakteri konsantrasyonunda luxR-I düşük seviyede ekspresse edilir ve ortamdaki OHHL miktarı genlerin ekspresyonu için yetersizdir, b) yüksek bakteri konsantrasyonunda OHHL miktarı eşik değere ulaşır ve OHHL-LuxR kompleksi biyoışımanın gerçekleştirilmesini sağlar
LuxI LuxR
luxR luxI luxC luxD luxA luxB luxE
OHHL
LuxI LuxR
luxR luxI luxC luxD luxA luxB luxE
OHHL
+
AHL moleküllerinin spesifik reseptörleri, transkripsiyonel regülatörlerin LuxR ailesinin üyelerindendir. LuxR ailesinin üyeleri DNA’ya bağlanan C-terminal ve AHL’lara bağlanan N-terminal domainleri olmak üzere 2 domainden oluşur.
Genellikle R ve I genleri birbirleriyle bağlantılı olarak işlev gösterirler (Parsek ve Greenberg, 2000).
Gram-negatif bakteriler, çevreyi algılama mekanizmasını kullanarak, hücre populasyon yoğunluğundaki değişikliklerle, gen expresyonunu iyi şekilde düzenlerler (Çizelge 2.1). 25 tür bakteri arasında çevreyi algılama sistemi LuxI/LuxR tip döngüye dayalı olanlardan V. fischeri, P. aeruginosa, A. tumefaciens ve E.
carotovora en iyi çalışılmış sistemlerdir (Miller ve Bassler, 2001).
V. fischeri, pek çok ökaryotik konakla simbiyotik ilişki içinde yaşar. Bu örneklerde konak canlı, özelleşmiş bir ışık organına sahiptir. Ayrıca bu simbiyotik yaşamda ökaryotik konak V. fischeri’ye yaşaması için besince zengin bir ortam sağlar. Ve her ökaryotik konak bakterinin sağladığı ışığı özel amaçlar için kullanırlar. Örneğin, mürekkep balığı Euprymna scolopes–V. fischeri birlikteliğinde mürekkep balığı bu olayı savunma aracı olarak kullanır (Şekil 2.6). Yine bir balık olan Monocentris japonicus, V. fischeri’nin ürettiği ışığı karşı cinsi cezbetmek için kullanır. Bu durum da bu balığın üzerinde karşı cinsi cezbetmek için ışık saçan iki bölge bulunmaktadır.
V. fischeri’nin ürettiği ışık, avcılardan kaçmak ve yemini kendine doğru çekmek için de kullanılmaktadır. Işık emisyonu, ışık organındaki bakteri kültürünün hücre yoğunluğuyla sıkı şekilde ilişkilidir ve bu olay çevreyi algılama sistemi ile kontrol edilir. Işık organında V. fischeri’nin yoğunluğu ml’de 1011 hücre gibi oldukça yüksek değerlere ulaşır. V. fischeri kültürünün yoğunluğu arttıkça ürettiği sinyal molekülü hormonu hücre dışına salar. Bu hormon bakterinin ışık organının içinde tutulur.
Uygun pozisyonundaki ışık organında kümeleşen her önemli yoğunlukta, sinyal olarak görev görür. Otoindukleyicinin kümeleşmesi, konağın içindeki bakterileri dışarıdaki deniz suyundaki bakterilerle iletişim kurarak uygunsuzluğu gösterirler. V.
fischeri’nin çevreyi algılama sistemi, bu bakterinin ışık üretiminin sadece ışık için olumlu durumlar olduğunda üretilmesini sağlar. V. fischeri’nin hücre sayısı arttıkça, sinyal molekülü kümeleşerek yeterli sınır değere ulaşır. (~ 1-10 µg/ml) LuxR, LuxI
CDABE promotoruna bağlanır ve onun transkripsiyonunu aktive eder. Bu olay hem sinyal molekülü üretiminde hem de ışık emisyonunda hızlı artışa neden olur. LuxR- homoserin lakton komplexi aynı zamanda LuxR’ın expresyonunda negatif düzenleyici olarak da rol oynar (Miller ve Bassler, 2001).
A. tumefaciens, hassas konaklarda taç tümörlerini uyaran bitki patojenidir. A.
tumefaciens’te çevreyi algılama sistemi bakteriler arasında Ti plazmitinin konjugal transferini kontrol eder. Tümör oluşum süreci için, onkogenik Ti pilazmitinin bakteriden konağa transferi gereklidir. Ti plazmit genleri bitkide opinelerin biyosentezini ve salgılanmasını yönetir. Ti plazmiti aynı zamanda tümörlerle sonuçlanan konak hücresinin çoğalmasını uyaran bitki hormonlarının üretimini sağlayan genleri kodlar (Fuqua ve Winans, 1996).
Erwinia türleri hasat öncesi ve sonrası dönemlerde çeşitli bitki türlerinde hastalıklara neden olan fırsatçı bir fitopatojendir. Bitkiler üzerinde saprofit olarak yaşarlar.
Bitkilerde sulu çürüğe neden olurlar ve özellikle patates ve havuçlarda ürün kaybına yol açarlar. Bu sulu çürüğe konağın hücre duvarını parçalayan enzimler neden olur.
Bu enzimler arasında pektatliyaz (pel), poligalaktoüronaz (peh), selülaz (cel), proteaz (prt) sayılabilir. Bu enzimler iki farklı mekanizmasıyla salgılanırlar. E.
carotovora’nın bazı türleri bir beta laktam antibiyotik olan 1-carbapen-2-em-3- karboksilik asit üretirler. Bu antibiyotik üretimi, bakterinin rizosferde, antibiyotiğe hassas diğer yarışçı bakterilerin sayısını azaltarak, Erwinia’nın hayatını devam ettirmesini sağlar. Bu bakteride de tüm bu ekzoenzimlerin (Jones vd., 1993) ve antibiyotiğin üretimi (Bainton vd., 1992) çevreyi algılama sistemi tarafından kontrol edilir.
