Pseudomonas’ın Virülens Faktörleri

Pek çok P. aeruginosa suşu bakteriyal kolonilere mavi-yeşil renk veren piyosiyanin (N-metil-1-hidroksifenazin) pigmentini üretirler (Denning vd., 1998). P. aeruginosa tarafından üretilen düşük molekül ağırlığına sahip olan piyosiyanin molekülü, önemli patojenite faktörlerinden birisidir ve üretimi çevreyi algılama sisteminin kontrolü altındadır (Fuqua vd., 2001). Bu molekül birçok bakteri türüne karşı antibiyotik özelliği göstererek, P. aeruginosa’nın bulunduğu ortamda rekabet şansını arttırır (Hassett vd., 1992).

a b

Şekil 2.3. P. aeruginosa’ nın ürettiği piyosiyanin molekülü a) nötr veya bazik pH’ta zwitteriyon olarak davranır ve mavi renklidir b) asidik ortamda ise kırmızı renklidir.

Yapılan in vitro çalışmalar, piyosiyaninin kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinde oldukça fazla hücresel hasara neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca bu molekül insan hücrelerinde hücresel solunumun, epidermal hücre büyümesinin engellenmesi gibi fonksiyonlara sahiptir (Denning vd., 1998). Bu molekülün konak hücreye sitotoksititesi genellikle redoks döngüsünün potansiyeliyle güçlü bir şekilde ilgilidir (Şekil 2.3). Elektronları doğrudan NADH veya NADPH moleküllerinden alır ve aerobik koşullarda bu elektronları, reaktif oksijen türevleri (ROS) superoksit (O2–

·) ve hidrojen peroksit (H₂O₂) oluşumuna yol açan O₂ molekülüne aktarır (Griffith, 1999). Yine piyosiyanin epitel hücrelerinde katalaz aktivitesini inhibe ederek akciğerde oksidatif hasara neden olur.

Pek çok memeli hücresi radikal oksijen türevlerinin oluşmasını sınırlayacak bir kaç tipte mekanizmaya sahiptir. Bu moleküllerin oluşumunu engellemek için kullanılan hücresel moleküllerden birisi glutatiyondur. Ancak piyosiyanin glutatyonun aktivitesini inhibe eder.

Elastaz, elastin ve kollajen gibi ökaryotik proteinleri parçalayan ve insan immunoglobulin G hücrelerini inaktive eden bir metalloproteazdır (Hamood vd., 1996). Elaztaz lasB geni tarafından kodlanır. lasB geni, LasR-LasI çevreyi algılama sisteminin kontrolündeki LasR regülatörü tarafından kontrol edilir (Passador vd, 1993). Elastazın P. aeruginosa’nın patojenitesine önemli katkısı olduğu, hayvan deneyleriyle ortaya konmuştur. LasB elastaz gerek tek başına gerekse Pseudomonas tarafından üretilen diğer proteazlar ile birlikte işlev göstererek biyolojik olarak önemli birçok substratı parçalar veya inaktive eder (Nicas ve Iglewski, 1985).

Pseudomonas tarafından sentezlenen LasA proteaz, lasA tarafından kodlanan 41 kDa’luk prekürsör olarak sentezlenir ve 22 kDa’luk aktif proteini oluşturmak için kesilir. Pseudomonas tarafından üretilen ve LasA’ya benzer özellikler gösteren diğer bir proteaz lasD geni tarafından kodlanan LasD’dir. LasD yalnız yüksek pH değerlerinde aktifken, LasA geniş bir pH aralığında aktivite gösterir. Bu proteinler aynı zamanda önemli virülens faktörleri olarak kabul edilmektedirler.

P. aeruginosa belirli çevresel koşullar altında ramnolipid olarak adlandırılan, hidrofilik kısmı bir veya iki ramnoz molekülü içeren ve hidrofobik kısmı yağ asidi yapısında olan biyosurfaktan üretir. Bunlar ramnolipid I, Ramnosil-L-ramnosil-B-hidroksi-dekanoil-β-hidroksi-dekanoat (mono ramnolipid) ve Ramnolipid II ise ramnosil-ramnosil-β-hidroksidekanoil-β-hidroksi-dekanoat (diramnolipid) şeklindedir (Şekil 2.4). Ramnolipidler yüzey gerilimini azaltıcı özelliklerinden dolayı, endüstriyel ve çevreyle ilgili pek çok alanda kullanılmaktadır. Bunlar arasında hidrokarbonlar gibi düşük çözünürlüğe sahip kirleticilerin uzuklaştırılması yada biyodegredasyonunun arttırılması sayılabilir (Maier ve Chavez, 2000).

a b

Şekil 2.4. P. aeruginosa’ nın ürettiği ramnolipid molekülleri a) mono b) di ramnolipid (m,n 4-8).

Yine Pseudomonasların ürettiği bu molekül, diğer birçok bakteri için antibakteriyel özellik göstererek bulundukları ortamda bu bakterilere avantaj sağlar. Ramnolipidler, konakta, akciğer yüzeyindeki fosfolipidleri çözerek P. aeruginosa tarafından üretilen fosfolipaz C molekülünün etki etmesini kolaylaştırırlar. Ayrıca bu bakterilerin kayma hareketinin (Kohler vd., 2000; Deziel vd., 2003) ve biyofilm oluşturmalarının da (Deziel vd., 2003) ramnolipid üretimiyle yakından ilişkili olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur.

Pseudomonas tarafından üretilen ve toxA geninin kodladığı ekzotoksin A, toksik bir proteindir (Callahan, 1976). Bu protein, konak hücre protein sentezinin inhibisyonuyla sonuçlanan ökaryotik translasyon faktöründen (EF-2), ADP-ribosil EF-2’yi oluşturmak üzere ADP-ribozilasyonunu katalize eder (Leppla, 1976). Hücre zehirlenmesindeki bu mekanizma difteri toksinininkiyle aynıdır. toxA geni ortamda düşük demir konsantrasyonu mevcudiyetinde yüksek seviyelerde ekspresse edilir. Bu durum Fur olarak adlandırılan ve aynı zamanda siderofor üretimini kontrol eden(ferric uptake regulator)sistem tarafından kontrol edilir.

Ekzoenzim S, exoS geni tarafından kodlanan 43 kDa büyüklüğünde bir proteindir. Bu enzim, vimentin gibi ökaryotik proteinlerde ADP fosforilasyon aktivitesine sahiptir.

ADP’nin ribozillenmesi için FAS (factor for activating exoenzyme S) isimli ökaryotik protein gereklidir (Coburn vd., 1991). Yine ExoS enzimiyle benzer molekül ağırlığına sahip, exoT geni tarafından kodlanan ve ExoT olarak adlandırılan diğer bir protein, FAS’a bağlı ADP’yi ribozilleme özelliğine sahiptir. Bu enzimlerin

her ikisi de sitotoksik etki gösteririler ve tip III salgılama sistemi tarafından salgılanırlar (Iglewski vd., 1978). Hem exoS hem de exoT genleri, ExsA olarak adlandırılan ve exsA geni tarafından kodlanan transkripsiyonel aktivatör tarafından kontrol edilir (Hovey ve Frank, 1995). P. aeruginosa’nın patojenitesinde ADP-Ribozillenmesinin rolü tam olarak bilinmemesine rağmen, ExoS üretiminin epitel hücre hasarı ve P. aeruginosa’nın enfekte ettiği konakta yayılabilmesi için gerekli olduğu bilinmektedir (Nicas vd., 1985; Apadoca vd.,1995; Kang vd.,1997).

Alginat önemli bir virülens faktörüdür. Alginat aynı zamanda gıda, eczacılık ve kimya sektöründe de oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Đnsanlarda alginat üreten P. aeruginosa kistik fibrozisli hastaların pulmoner yollarında kolonize olurlar ve akciğer hava yollarını kapatarak hastaların ölümlerine sebep olurlar.

Pseudomonas algL geni tarafından kodlanan ve alginatı parçalayarak alginat polimerinin uzunluğunu kontrol eden alginat liyaz enzimi üretir. Alginat liyaz, bakterilerin hücre yüzeylerine tutunarak yeni yaşam alanlarına yerleşmelerinde ve yeni alginat zincirlerini oluştururken primer olarak kullanılan kısa oligosakkaritleri oluşturmada önemlidir. Osmolarite, azot yetersizliği, fosfat yetersizliği, susuzluk gibi stres durumları ve antibiyotikler gibi bir çok çevresel etmen alginat üretimini uyarır.

mucA ve mucB gibi regülatör genlerdeki mutasyonlar alginat sentezini etkiler.

Lipopolisakkarit (LPS), Pseudomonas tarafından üretilen diğer bir virülens faktörüdür. Lipopolisakkarit, hidrofobik lipid A merkez oligosakkarit ve O polisakkaritten oluşur. P. aeruginosa’nın ürettiği lipid A endotoksik iken O polisakkarit immünudominanttır. O antijeni lizojenik bir faj olan D3 tarafından kodlanır. Pseudomonas tarafından A ve B olmak üzere iki tip LPS üretilir.

Pseudomonas tarafından üretilen lipazlar lipolitik, hemolitik ve hemolitik olmayan fosfolipaz C olmak üzere üç gruba ayrılır.

a) Lipaz: P. aeruginosa tarafından salgılanan 26kDa’luk bu enzim oldukça geniş bir aralıktaki trigliseritlere etkilidir.

b) Fosfolipaz C: Pseudomonaslarda hemolitik ve hemolitik olmayan olmak üzere iki tip fosfolipaz C bulunur.

1) Hemolitik Fosfolipaz C (PLC-H): 78 kDa büyüklüğünde ısıya dayanıklı bir protein olup, lipaz aktivitesini fosfotidil kolin ve sfingomiyelin üzerinde gösterir.

2) Nonhemolitik Fosfolipaz C (PLC-N): Bu, Pseudomonas tarafından üretilen ikinci fosfolipazdır. 73 kDa büyüklüğündedir ve PLC-N olarak bilinir. Fosfotidil kolin ve fosfotidil serine etkiliyken koyun eritrositlerine etkili değildir. Ortamda düşük fosfat varlığı ve aerobik şartlar PLC sentezini ve aktivitesini uyarırken yüksek NaCl mevcudiyeti PLC aktivitesini baskılar. Hem PLC-H hem de PLC-N fosfotidil kolini, diaçil gliserol ve koline parçalar. Bu olay akciğer surfaktanının parçalanarak akciğerin şişmesine ve doku hasarına yol açar. Ayrıca PLC-H aktivitesi akciğer dokusunda hemorajik nekroza neden olur.

Pseudomonaslar lökositler ve diğer ökaryotik hücrelere karşı da sitotoksin üretirler (Scharmann, 1976). ctx geni tarafından kodlanan pro-sitotoksin olgunlaşarak 18 kDa büyüklüğünde aktif toksine dönüşür. CTX toksini, konak hücresinin lipid tabakasında açıklık oluşumuna neden olur.

Pseudomonaslar, piyosin olarak adlandırılan ve diğer bakterileri öldüren bakteriyosinleri üretirler. Pseudomonaslarda R, F ve S tipi olmak üzere üç tip piyosin mevcuttur. R ve F tipi piyosinler bakteriyofajın kuyruk proteinlerine benzerler.

Bakteriyosinler genellikle plazmitler tarafından kodlanmasına rağmen piyosin genleri P. aeruginosa’da kromozom üzerinde bulunurlar. S tip piyosinler proteaza duyarlı kolisin benzeri basit proteinlerdir ve S1, S2, S3, AP41 olmak üzere dört alt grubu ayrılırlar (Sano vd., 1993; Sano ve Kageyama, 1993). R1, R2, R3, R4 ve R5 olmak üzere beş alt gruba ayrılan R-tip piyosinler kontraktil bakteriyofaj kuyruklarına benzerler. Bu alt gruptaki piyosinler serolojik ve yapısal özellikler açısından birbirlerine benzerken, reseptör özgüllüğü açısından birbirlerinden ayrılırlar. F-tip piyosinler, faj kuyruklarına benzemelerine rağmen esnektir, ancak konraktil değildir.

Piyosinler çevreye salgılanarak ortamdaki diğer bakterilerin öldürülmesiyle ekolojik baskınlığa sahip olmada önemli rol oynar. Lize edilen bakteriler parçalanarak besin olarak kullanılırlar.

P. aeruginosa diğer virülens faktörlerinin yanısıra belirli şekerlere bağlanan ve lektin olarak adlandırılan özel proteinler üretirler. PA-IL ve PA-IIL olmak üzere iki tip lektin karakterize edilmiştir. PA-IL, D-galaktoz ve onun türevlerine spesifik iken PA-IIL,L-fukoz ve D-mannoza spesifik bağlanır (Winzer vd., 2000). Lektinler bakterilerin hücrelere tutunup IL-1 ve IL-6 gibi konak sitokinlerini indükler.

P. aeruginosa siderofor olarak adlandırılan ve demirin eksik bulunduğu durumlarda demiri güçlü bir şekilde bağlayan kimyasal olarak birbirinden farklı, piyoverdin ve piyoselin olmak üzere iki temel bileşen üretir (Vasil ve Ocshner 1999; Takase vd., 2000). Sideroforlar demiri bağlarlar ve reseptöre dayalı mekanizmalarla bunları hücre içine alınırlar. Bu mekanizmayla, Pseudomonas demir için yarışarak ortamdaki diğer bakterilerin gelişmesini kısıtlar.

Piyoselin, fenolik siderofordur. Piyoselin demire bağlanır ve bu oloşan yapı 75DA’luk dış membran proteiniyle taşınır (Ankenbauer vd., 1988). Ayrıca piyoselin enfeksiyon sırasında bakteriyel büyümeyi uyarır. Piyoverdin Pseudomonasa sarı-yeşil renk veren, siderofora bağlanmaya yüksek ilgi gösteren, 2,3 diamino-6,7 dihidroksiquinolon yapısında ikinci sınıf fluoresan bileşendir.

P. putida ve P. syringae gibi bazı suşlar, farklı aminoasit dizilimine sahip piyoverdine benzer sideroforlar üretirler. Sideroforlar için reseptörler, farklı türlerde çeşitlilik gösterirler (Ankenbauer vd., 1988).

P. aeruginosa çevreyi algılama sisteminin kontrolü altında, sıvı ve katı yüzeylerde biyofilm adı verilen bir yapı oluşturur. Bakterilerin bu yapıyı oluşturması, bakteriyal antibiyotik direncini arttırması ve biyofilm üzerindeki bakterilerin konağın immün cevabından daha az etkilenmesi nedeniyle tıbbi açıdan önem taşımaktadır (Costerton vd., 1999). Aerobik ortamlarda biyofilm oluşumunda las sistemi merkezi rol oynar (De Kievit vd., 2001). Yine bir biyosurfaktan olan ramnolipid üretimi de biyofilm oluşturulmasında önem taşımaktadır (Yoon vd., 2002).

Pseudomonasta aprA geninin kodladığı alkalin proteaz korneayı enfekte eder. AprA proteininin üretilmesi için, AprD, AprE ve AprF olmak üzere üç çeşit protein gereklidir. Pseudomonas aynı zamanda aprI geninin kodladığı ve AprI olarak adlandırılan alkalin proteaz inhibitörü üretir.

P. aeruginosa çoğu doğal yaşam alanında katı ve sıvı yüzeylerde biyofilm adı verilen yapılar içerisinde canlılıklarını sürdürürler. Bakteriyel biyofilmler doğal olarak çoğu ıslak yüzeyde yaygındır ve bunlar çevresel sorunlara yol açabilir. P. aeruginosa sadece doğal yaşam alanlarında değil, kronik olarak bu bakteri ile infekte olmuş kistik fibrozis hastalarının akciğerlerinde de biyofilm oluşturarak canlılıklarını devam ettirirler (Costerton vd.,1999).

Biyofilmler, bakterilerin uygun olmayan şartlarda büyümelerini ve hayatta kalmalarını sağlar. Biyofilm öncelikle iç yüzeylerde veya ölü dokularda, yaygın olarak tıbbi aletlerin üzerinde ve ölü doku fragmentlerinde gelişir ve bunların yanı sıra canlı dokuların üzerinde de oluşurlar. Biyofilmler bir veya daha fazla bölgede yavaş bir şekilde gelişirler. Sesil bakteri hücreleri antijenleri nedeniyle antikor yapımını uyarırlar. Ancak antikorlar biyofilm içerisindeki bakterileri öldüremez. Her bir birey oldukça mükemmel hücresel ve hümoral bağışıklık sistemine sahip olmasına rağmen, konağın savunma sistemi tarafından biyofilm enfeksiyonlarının üstesinden gelinmesi oldukça nadir meydana gelir (Costerton vd., 1999).

Biyofilm oluşumu, sinyallerle düzenlenen yüzeye tutunma, mikrokoloni oluşması, hücre dışı polisakkarit bileşenlerin üretilmesi, olgunlaşma ve diğer bölgelere yayılma şeklinde 4 ana süreçten oluşur (Şekil 2.5.). Biyofilm oluşumunun başlangıç basamağında P. aeruginosa yüzeye tutunmak için ve yayılmış ilk tabakayı oluşturmak için flagellasını kullanır (Costerton vd.,1999).

Şekil 2.5. Biyofilm oluşumunun basamakları 1) tutunma, 2) mikrokolonilerin oluşması, 3) Hücre dışı polisakkarit bileşenlerin üretilmesi, 4) olgunlaşma, 5) diğer bölgelere yayılma (Biofilms, Đnternet sitesi).

Biyofilmin derinliği ve biyofilm oluşumunun tüm aşamaları oldukça iyi korunmuş sinyallerle kontrol edilir. Bu düzenleyici sinyaller, biyofilm içerisindeki bakteri hücrelerinin besin gereksinimlerini optimize ederler (Stanley ve Lazazzerra, 2004).

Bu yapılar hücre dışı polimer matriksle sarılıdır. Biyofilmler homojen mat hücrelerden oluşmuş kalın bir yapıya sahip olabilirken, besin alınımı ve atık atılımına hizmet eden su kanallarından oluşmuş karmaşık bir yapıya sahip olabilir.

Biyofilm oluşumu, tıbbi alanlarda ve ekonomik olarak ciddi sorunlara sebep olduğu için ilgi gösterilen çalışma konularından birisi olmuştur. Biyofilm oluşumunun incelenmesi için P. aeruginosa model organizma olarak kullanılmaktadır.