Yrd. Doç. Dr. Bengi ÇINAR KUL
Polimorfizm/Mutasyon Polimorfizm/Mutasyon
tarama teknikleri
tarama teknikleri
Not:
Polimorfizm bireyin
herhangi bir gen açısından en az 2 alleli olması
durumudur (A yada a gibi)
Bir popülasyonda aynı gen için çok farklı
alleller olabilir
(multipleallelizm)
Polimorfizmin yararları
• Pedigrinin saptanması,soy testi, babalığın belirlenmesi
• Polimorfik genlerden verim ve hastalıklara
dayanıklık ile ilgili işaret gen olarak yararlanılması.
• Tek yumurta ikizliğinin belirlenmesi (özellikle sığırlarda önemli)
• Irkların kökenlerinin belirlenmesi, popülasyon genetiği ve hayvan ıslahı çalışmaları.
• Polimorfizmin temelinde ne vardır?
• Nasıl bir mutasyon olmalıdır?
- Sessiz - Nötral
- Missense
- Fonksiyon kaybı veya artışı
Bazı Mutasyon Tarama Teknikleri Bazı Mutasyon Tarama Teknikleri
1. Direkt Mutasyon Tarama Yöntemleri 1. Direkt Mutasyon Tarama Yöntemleri
•RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Kesim parçası uzunluk polimorfizmi
•ASA (Allele Specific Amplification)
•DNA Dizi Analizi
•SNP mikroarray
2. İndirekt Mutasyon Tarama Yöntemleri 2. İndirekt Mutasyon Tarama Yöntemleri
•SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
•DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)
•Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (High Resolution Melting – HRM)
PCR PCR
Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction
Polimeraz Zincir Reaksiyonu: DNA’nın belirli bir bölgesinin tüp içinde çoğaltılması işlemi…
Bu teknik ile DNA molekülünde istenilen bir parçanın milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını yapmak
mümkündür. Mutasyon tarama tekniklerinin birçoğu PCR temellidir.
Replikasyonun laboratuar Replikasyonun laboratuar ortamında taklit edilmesidir ortamında taklit edilmesidir.
• Çift sarmal DNA açılır
• DNA polimeraz enzimi yeni ve komplementer iplikçiği üretir.
PCR’ın aşamaları
1- DENATÜRASYON 1- DENATÜRASYON
2- PRİMER BAĞLANMASI DÖNGÜ 2- PRİMER BAĞLANMASI DÖNGÜ
3- UZAMA 3- UZAMA
Sıcaklık ve zaman yönünden 3 farklı aşamanın arka arkaya tekrarlanmasına dayanmaktadır.
1- DENATÜRASYON 1- DENATÜRASYON
Çift sarmal DNA’nın yüksek sıcaklık altında (93-96 C) ⁰ çözülerek tek zincir hale geçmesidir. Hidrojen bağlarının kırılmasıyla olmaktadır.
2- PRİMER BAĞLANMASI 2- PRİMER BAĞLANMASI
Hedef bölgeye komplementer primerin tek iplik DNA’da ilgili bölgeye bağlanmasıdır (54-64 C).⁰
3- UZAMA 3- UZAMA
• DNA polimeraz enzimi, primerlerin ucuna kalıp DNA’ya
eşlenik bazlar (dNTP) ekleyerek yeni DNA iplikçiğini uzatır.
(70-72 C)⁰
PCR Rea
PCR Rea ksiyonu için gerekenler: ksiyonu için gerekenler:
• Kalıp DNA
• Primerler
• Sıcaklığa dirençli polymerase
– DNA Polymerase
• dNTP
– (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• Tampon çözelti + Mg++
• Thermocyler (ısı döngü cihazı)
Thermus aquaticus
• Animasyon
(http://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E)
Agaroz Jel elektroforez PCR ürünlerinin görüntülenmesi
PCR ürünlerinin görüntülenmesi
Agaroz jel elektroforezi görüntülenmesi genellikle Etidyum bromide ile yapılır. EB, DNA ile kompleks bir bağ kurarak UV ışık altında parıldamasını sağlar.
• DNA ya da PCR ürünü agaroz jeldeki kuyucuklara yüklenir.
• DNA (–) yüklüdür ve (+) yüklü elektroda doğru hareket eder.
• DNA’nın büyüklüğünü ölçmek için DNA ladder (size marker) kullanılır.
PCR- RFLP PCR- RFLP
PCR’ın ardından restriksiyon enzimlerinin kullanılmasıyla mutasyon taranmasıdır.
Restriksiyon enzimleri, DNA’da özgün dizileri tanır ve o noktadaki fosfodiester bağını keserler.
Örneğin EcoRI enzimi GAATTC dizisini tanır ve G ile A bazları arasından fosfodiester bağlarını kırar.
Restriksiyon enzimleri bakterilerin kendilerini koruma silahlarıdır.
PCR işlemi ardından EcoRI enzimi ile kesildiğinde;
daha küçük iki band oluşuyorsa homozigot normal, PCR ürünü kesilmeden kalıyorsa homozigot mutant,
3 band görülüyorsa (normal ve mutanttan kaynaklanan) heterozigot bir bireydir denilebilir.
DNA dizi analizi DNA dizi analizi
DNA’nın nukleotid dizisinin saptanmasıdır.
Eski olmakla beraber en sık kullanılan yöntem SangerSanger sekanslamadır.
Bu teknik, normal dNTP´lerin (3 '-hidroksilli (OH-) yanı sıra 3'-hidroksil (OH-) grubu olmayan
dideoksiribonükleozit trifosfatların (ddNTP) ve DNA Polimeraz enziminin yardımıyla DNA moleküllerinin 5’3’ yönünde uzatılmasına dayanır.
• DNA’nın yapısı…
Bir nükleotidin 5' ucunda bulunan fosfat grubuna başka bir nükleotidin 3' hidroksil grubu bağlanırsa fosfodiester bağı oluşur. DNA’nın sentez yönü bu yüzden 5’ 3'
Reaksiyon sırasında DNA polimeraz tarafından
sentezlenen PCR ürününe herhangi bir ddNTP´nin katılması ile 3´ pozisyonunda serbest hidroksil grubu 3´ pozisyonunda serbest hidroksil grubu
olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam
etmez.
etmez.
Bunun sonucu olarak da serbest Hidroksil grubu olmayan A,G,T ve C bazlarına bağlı olarak değişen boylarda PCR ürünleri oluşmaktadır
• Kalıtsal hastalıkların genlerinin araştırılması, populasyondaki bireylerin taranmasıKalıtsal hastalıkların genlerinin araştırılması, populasyondaki bireylerin taranması
• Verimle ilgili genlerin populasyonda taranmasıVerimle ilgili genlerin populasyonda taranması
• Moleküler ıslahMoleküler ıslah
• Prenatal tanı Prenatal tanı
• Irkların ve türlerin tarihsel gelişiminin aydınlatılmasıIrkların ve türlerin tarihsel gelişiminin aydınlatılması
• Evrim çalışmaları ve antik DNA çalışmalarıEvrim çalışmaları ve antik DNA çalışmaları
• Adli çalışmalar (tür belirleme, ebeveyn belirleme)Adli çalışmalar (tür belirleme, ebeveyn belirleme)
• Hastalık etkenlerinin (viral, bakteriyal vs.) tür tayiniHastalık etkenlerinin (viral, bakteriyal vs.) tür tayini
• Aşı üretimiAşı üretimi
• Gıda katkılarının belirlenmesiGıda katkılarının belirlenmesi
• GDO üretimi ve gıdalarda GDO varlığının belirlenmesi………..GDO üretimi ve gıdalarda GDO varlığının belirlenmesi………..
Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca
kullanım alanları kullanım alanları
Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca Veteriner hekimlikte PCR’ın başlıca
kullanım alanları kullanım alanları
