TÜBERKÜLOZ TANISI VE MOLEKÜLER EP‹DEM‹YOLOJ‹K ÇALIﬁMALARDA ELDE ED‹LEN LABORATUVAR SONUÇLARINA YAKLAﬁIMIMIZ NASIL OLMALI ?

(1)

ÖZET

Son 10-20 y›l içinde moleküler epidemiyoloji konusunda yap›lan çal›flmalar, konvansiyonel epidemiyolojik yöntemler- le birlikte kullan›ld›¤›nda, tüberküloz bulafl dinamiklerinin daha iyi anlafl›lmas›n› sa¤lam›flt›r. Sürekli geliflen yöntemler, yerel ve global tüberküloz epidemiyolojisinin daha ayr›nt›l› ve kesin anlafl›lmas›n› olanakl› hale getirmiflti. Hangi yöntemleri ne zaman kullanaca¤›n› herbir merkezin ihtiyaçlar› ve amaçlar› bizzat belirleyecektir.

Anahtar sözcükler: DNA parmakizi, moleküler epidemiyoloji, tüberküloz SUMMARY

The Approach to the Results of Molecular Epidemiological Typing Studies in Tuberculosis

Molecular epidemiologic studies over the past one to two decades, when combined with conventional epidemiological tools have yielded a better understanding of tuberculosis transmission dynamics. The ever developing methods has achieved a greater resolution and accuracy in describing the local and global epidemiology of tuberculosis. The decision when and which method to use is totally dependent on each research centre’s own need and aims.

Keywords: DNA fingerprinting, molecular epidemiology, tuberculosis

TÜBERKÜLOZ TANISI VE MOLEKÜLER EP‹DEM‹YOLOJ‹K ÇALIﬁMALARDA ELDE ED‹LEN LABORATUVAR SONUÇLARINA YAKLAﬁIMIMIZ NASIL

OLMALI ?

Orhan Kaya KÖKSALAN

‹stanbul Üniversitesi Deneysel T›p Araﬂt›rma Enstitüsü, Tüberküloz Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvar›, Çapa, ‹STANBUL

okkoksalan@hotmail.com

23.ANKEM ANT‹B‹YOT‹K VE KEMOTERAP‹ KONGRES‹, ÇEﬁME-‹ZM‹R, 28 MAYIS – 01 HAZ‹RAN 2008

ANKEM Derg 2008;22(Ek 2):93-96

Son y›llarda gelifltirilen moleküler epide- miyolojik tiplendirme yöntemlerin konvansiyo- nel epidemiyolojik araçlarla birlikte kullan›m›, Mycobacterium tuberculosis sufllar›n›n daha kesin olarak birbirinden ay›rdlanmas›n› ve hastal›¤›n toplum içinde bulafl ve yay›lma dinamiklerinin daha iyi anlafl›lmas›n› sa¤lam›flt›r

⁽²⁶⁾

.

KL‹N‹K FAYDALAR

1. Moleküler epidemiyolojik tiplendirme yöntemleri ile elde edilen sonuçlar tüberküloz laboratuvarlar›ndaki kros-kontaminasyonlar›n varl›¤›ndan flüphelenilmesi, saptanmas› ve za- ten flüphelenilen hallerde onaylanmas›n› sa¤la- yabilmektedir. Klinik tüberküloz laboratuvarla- r›nda M.tuberculosis üretilen hastalar›n yaklafl›k olarak % 3’ünde

⁽³⁾

, ki bu oran baz› yay›nlarda

% 16’ya kadar ç›kmaktad›r

⁽⁷⁾

, tüberküloz hasta- l›¤› gerçekte bulunmamaktad›r. ARB yaymas›

negatif ve sadece tek kültürde pozitifli¤in sap-

tand›¤› olgularda kros-kontaminasyon olas›l›¤›

daha yüksektir. Klinik bulgular›n tüberkülozu düflündürmedi¤i, yayma negatif tek kültür po- zitif olgularda moleküler tiplendirme yöntemle- ri de kros-kontaminasyonu iflaret ediyorsa, anti- tüberküloz tedaviye bafllanmaz, e¤er baflland›y- sa tedavi kesilir.

2. Moleküler epidemiyolojik tiplendirme yöntemlerinin bir di¤er klinik faydas› ayn› has- tadan izole edilen suﬂun de¤iﬂik direnç patern- leri göstermesi halinde ortaya ç›kar;

a. Önceleri duyarl› olan bir suﬂ zaman için-

de “dirençli” sonuç veriyorsa, ﬂu olas›l›klar ak-

la gelmelidir; ya hastal›¤›n baﬂ›ndan beri mev-

cut olan suﬂ tedavi esnas›nda dirençli hale gel-

miﬂ veya hasta dirençli farkl› bir suﬂla reinfekte

olmuﬂ veya hastan›n kültürü laboratuvardaki

ekim prosedürü esnas›nda dirençli bir di¤er

suﬂla kros-kontamine olmuﬂtur. Hastadan izole

edilen suﬂlarla, hastan›n materyalinin iﬂlendi¤i

(2)

gün laboratuvarda üreyen di¤er sufllar›n mole- küler epidemiyolojik tiplendirmesi (genotiplen- dirmesi) bu olas›l›klar›n hangisinin söz konusu oldu¤unu ortaya ç›kar›r. Birinci olas›l›k söz ko- nusu ise, yani duyarl› orijinal sufl tedavi uyum- suzlu¤u, malabsorbsiyon veya ilaç etkileflmesi sonucu dirençli hale geldi ve ilk ve sonras›nda- ki kültürlerde üretilen sufllar›n parmakizleri ay- n› (özdefl) ise, tedavi flemas›nda de¤ifliklik ya- p›lmal›d›r. ‹kinci olas›l›k yani reinfeksiyon söz konusu ise yani ilk ve sonras›ndaki kültürlerde üretilen sufllar›n parmakizleri farkl› ise tedavi flemas›nda yine de¤ifliklik yap›lmal›, bunun ya- n›s›ra kaynak olgunun belirlenmesine çal›fl›lma- l›d›r. Üçüncü olas›l›k, kros kontaminasyon söz konusu ise, tedavi flemas›nda bir de¤ifliklik ya- p›lmamal›, kültür tekrar edilmelidir.

b. Daha nadiren dirençli bir suﬂ, reinfeksi- yon veya laboratuvar kros-kontaminasyonuna ba¤l› olarak sonradan duyarl› sonuç verebilir.

Hangi olas›l›¤›n incelenen özel durumda söz konusu oldu¤u yine genotiplendirme ile sapta- n›r.

Rekürran tüberküloz olgular›nda, e¤er her iki episoda neden olan suflun da genotiplendir- mesi yap›ld›ysa, ikinci episodun relaps m› yok- sa yeni bir suflla reinfeksiyona m› ba¤l› olarak geliflti¤i saptanabilir. Relaps söz konusu ise te- davi baflar›s›zl›¤›na hükmedilir.

EP‹DEM‹YOLOJ‹K FAYDALAR Moleküler epidemiyolojik yöntemler, kü- çük ölçekte de¤erlendirildi¤inde bulafllar› sap- tayarak epidemiyolojik veri oluflturman›n yan›- s›ra, global düzeyde tüberküloz hastal›¤›n›n dünyan›n de¤iflik bölgelerinde da¤›lma dina- miklerinin saptanmas›na yard›mc› olur. Ancak bu iki farkl› amaç için kullan›lan yöntemler de farkl›d›r. Yerel epidemiyolojik çal›flmalar için tekrarlay›c› DNA elemanlar›n› temel alan spoli- gotyping, MIRU-VNTR, IS6110-RFLP gibi yön- temler kullan›l›rken

(14,15,17,18,22-25,30)

, dünya ba- z›nda tüberküloz hastal›¤›n›n yay›l›m›, filoge- netik ve filoco¤rafik çal›ﬂmalar söz konusu ol- du¤unda, tüm genom düzeyinde genetik var- yasyonlar›n saptanmas›n› temel alan, “Large Se- quence Polymorphisms (LSPs)” ve “Single Nuc- leotide Polymorphism (SNP)”lerden faydalan›l-

maktad›r. Mikobakterilerdeki büyük dizi poli- morfizmleri (LSPs), tüm genom karﬂ›laﬂt›rmal›

hibridizasyonu temelli DNA microarray tekno- lojisi kullan›larak saptan›r

(4,16,19-21,28,29)

. SNP’ler ise tüm genomu deflifre edilmifl M.tuberculosis sufllar›n›n dizilerinin bilgisayar ortam›nda “in- silico” karfl›laflt›r›lmas› ile saptan›r

(1,5,6,8,11-13)

.

Küçük ölçekte, baflka bir deyiflle yerel epi- demiyolojik çal›flmalar›n bir parças› olarak mo- leküler yöntemler kullan›ld›¤›nda, ki bunlar yu- kar›da da bahsedildi¤i gibi, tekrarlay›c› DNA elemanlar›n› temel alan spoligotyping, MIRU- VNTR, IS6110-RFLP gibi yöntemlerdir,

a. Bulafl zinciri içinde yer alan hastalar, bu zincirin kaynak ve endeks olgular› sapta- nabilir. Bulafl›n karakteristi¤i tespit edi- lip, bulaflt›r›c› hastalar tedavi edildi¤in- den bulafl durdurulabilir.

b. Bölgesel önemi olan tüberküloz genotip- leri belirlenebilir. Bunlar›n hastal›k for- malar›, antitüberküloz ilaçlarla iliﬂkileri saptanabilir. Bir co¤rafi bölgeye spesifik olup ayn› zamanda yayg›n olarak bulu- nabilen genoaileleri saptanabilir. Bir tü- berküloz klonunun devam› olan bir po- pulasyonun bölgeye özgün yap›sal özel- likler kazanmas›, fenotipik ve genotipik yeni ve farkl› M.tuberculosis populasyon- lar›n›n ortaya ç›kmas›na neden olabilir ki, belki de Mycobacterium bovis BCG aﬂ›la- malar›na yan›t›n bölgesel farkl›l›klar gös- termesi, dünyan›n baz› bölgelerinde eks- trapulmoner tüberküloza yatk›nl›¤›n faz- la olmas›, en az›ndan k›smi olarak, farkl›

bölgelerdeki farkl›laﬂm›ﬂ M.tuberculosis populasyonlar›n›n varl›¤›na ba¤l›d›r

⁽²⁾

.

Tüberküloz suﬂlar›n›n global da¤›l›m›, de-

¤iflik bölgelerdeki tüberküloz sufllar›n›n birbir- leriyle iliflkisi, kökenlerinin araflt›r›lmas› da mo- leküler epidemiyolojik yöntemlerle mümkün olmufltur. Ancak tekrarlay›c› DNA elemanlar›- na dayanan standard moleküler epidemiyolojik yöntemler, görece h›zl› de¤iflime u¤ray›p, ya- k›nsak (konverjan) mikroevolusyonlar geçirdi-

¤inden, çok farkl› kökenlerden gelen suﬂlar ayn›

parmakizi paternleri (homoplazi) gösterir ve geçmiﬂe yönelik derin filogenetik izler saptana-

94

(3)

maz. Bu amaçla yukar›da bahsedilen LSP ve SNP analizleri çok daha iyi yol göstericidir. Bu sayede de¤iflik araflt›rmac›lar tüberküloz suflla- r›n›n 4-6 ana kökenden yay›ld›¤›n› saptam›fllar- d›r

(2,5,9,12,27)

. Farkl›laﬂm›ﬂ, genetik varyasyonlar gösteren M.tuberculosis populasyonlar›n›n varl›-

¤› baz› tan› testlerinin baz› tüberküloz suﬂlar›n- da negatif sonuç vermesine yol açabilir. Gene- tik varyasyonlar sonucunda, baz› co¤rafyalarda daha s›k bulunan tüberküloz soylar›n›n antitü- berküloz ilaçlara karﬂ› do¤al direnç sa¤layan polimorfizmlere sahip olma olas›l›¤› mevcut- tur

⁽¹⁰⁾

.

Moleküler yöntemlerin tüberküloz alan›na girmesi tüberkülozun yerel ve yayg›n epidemi- yolojisine önemli katk›da bulunmufltur. Yukar›- da say›lan de¤iflik faydalar›n hepsi moleküler epidemiyolojik tüberküloz yöntemleri uygula- narak sa¤lanabilir. Bu testlerin uygulanmas›na ve sonuçlar›na yaklafl›m›m›z› herbir araflt›rma merkezinin kendi amaçlar› belirleyecektir.

KAYNAKLAR

1. Alland D, Whittam TS, Murray MB et al: Mode- ling bacterial evolution with comparative-genome-based marker systems: application to Myco- bacterium tuberculosis evolution and pathogenesis, J Bacteriol 2003;185(11):3392-9.

2. Baker L, Brown T, Maiden MC, Drobniewski F: Si- lent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis, Emerg Infect Dis 2004;10(9):1568-77.

3. Barnes PF, Cave MD: Molecular epidemiology of tuberculosis, N Engl J Med 2003;349(12):1149-56.

4. Behr MA, Wilson MA, Gill WP et al: Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray, Science 1999;284(5419):1520-3.

5. Cole ST, Brosch R, Parkhill J et al: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, Nature 1998;393 (6685):537-44.

6. Filliol I, Motiwala AS, Cavatore M et al: Global phylogeny of Mycobacterium tuberculosis based on single nucleotide polymorphism (SNP) analysis: Insights into tuberculosis evolution, phyloge- netic accuracy of other DNA fingerprinting systems, and recommendations for a minimal standard SNP Set, J Bacteriol 2006;188(2):759-72.

7. Fischl MA, Uttamchandani RB, Daikos GL: An outbreak of tuberculosis caused by multi-drug re- sistant tubercle bacilli among patients with HIV infection, Ann Intern Med 1992;117(3):177-83.

8. Fleischmann RD, Alland D, Eisen JA et al: Whole- genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains, J Bacteriol 2002;184(19):5479-90.

9. Gagneux S, DeRiemer K, Van T et al: Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis, Proc Natl Acad Sci USA 2006;103(8):2869-73.

10. Gagneux S, Small PM: Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development, Lancet Infect Dis 2007;7(5):328-37.

11. Garnier T, Eiglmeier K, Camus JC et al: The complete genome sequence of Mycobacterium bovis, Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(13):7877-82.

12. Gutacker MM, Mathema B, Soini H et al: Single- nucleotide polymorphism-based population genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains from 4 geographic sites, J Infect Dis 2006;193(1):121-8.

13. Gutacker MM, Smoot JC, Migliaccio CA et al: Ge- nome-wide analysis of synonymous single nucleotide polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex organisms: resolution of genetic re- lationships among closely related microbial strains, Genetics 2002;162(4):1533-43.

14. Kam KM, Yip CW, Tse LW et al: Optimization of variable number tandem repeat typing set for dif- ferentiating Mycobacterium tuberculosis strains in the Beijing family, FEMS Microbiol Lett 2006;256(2):258-65.

15. Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A et al: Simultaneo- us detection and strain differentiation of Myco- bacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology, J Clin Microbiol 1997;35(4):907-14.

16. Kato-Maeda M, Rhee JT, Gingeras TR et al: Com- paring genomes within the species Mycobacteri- um tuberculosis, Genome Res 2001;11(4):547-54.

17. Kremer K, Au BK, Yip PC et al: Use of variable- number tandem-repeat typing to differentiate Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from Hong Kong and comparison with IS6110 restriction fragment length polymorphism typing and spoligotyping, J Clin Microbiol 2005;43(1):

314-20.

18. Mazars E, Lesjean S, Banuls AL et al: High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology, Proc Natl 95

(4)

Acad Sci USA 2001;98(4):1901-6.

19. Mostowy S, Cousins D, Behr MA: Genomic inter- rogation of the dassie bacillus reveals it as a uni- que RD1 mutant within the Mycobacterium tuberculosis complex, J Bacteriol 2004;186(1):104-9.

20. Mostowy S, Cousins D, Brinkman J, Aranaz A, Behr MA: Genomic deletions suggest a phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis complex, J Infect Dis 2002;186(1):74-80.

21. Mostowy S, Onipede A, Gagneux S et al:Genomic analysis distinguishes Mycobacterium africanum, J Clin Microbiol 2004;42(8):3594-9.

22. Oelemann MC, Diel R, Vatin V et al: Assessment of an optimized Mycobacterial interpersed repeti- tive unit-variable number of tandem repeat typing system combined with spoligotyping for population-based molecular epidemiology studies of tuberculosis, J Clin Microbiol 2006;45(3):691-7.

23. Roring S, Scott A, Brittain D et al: Development of variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium bovis: comparison of results with those obtained by using existing exact tandem repeats and spoligotyping, J Clin Microbiol 2002;40(6):2126-33.

24. Roring S, Scott AN, Hewinson RG, Neill SD, Sku- ce RA: Evaluation of variable number tandem repeat (VNTR) loci in molecular typing of Mycobac- terium bovis isolates from Ireland, Vet Microbiol 2004;101(1):65-73.

25. Skuce RA, McCorry TP, McCarroll JF et al: Dis- crimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets, Microbiology 2002;148(Pt 2):519-28.

26. Small PM, van Embden JDA: Molecular epidemiology of tuberculosis, “Bloom BR (ed): Tuber- culosis Pathogenesis, Protection, and Control” ki- tab›nda s.569-82, ASM Press, Washington, DC (1994).

27. Sreevatsan S, Pan X, Stockbauer KE et al: Restric- ted structural gene polymorphism in the Myco- bacterium tuberculosis complex indicates evoluti- onarily recent global dissemination, Proc Natl Acad Sci USA 1997;94(18):9869-74.

28. Tsolaki AG, Gagneux S, Pym AS et al: Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a dis- tinct genetic lineage of Mycobacterium tuberculosis, J Clin Microbiol 2005;43(7):3185-91.

29. Tsolaki AG, Hirsh AE, DeRiemer K et al: Functio- nal and evolutionary genomics of Mycobacterium tuberculosis: insights from genomic deletions in 100 strains, Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(14):4865-70.

30. Zhang L, Chen J, Shen X et al: Highly polymorp- hic variable-number tandem repeats loci for diffe- rentiating Beijing genotype strains of Mycobacte- rium tuberculosis in Shanghai, China, FEMS Mic- robiol Lett 2008;282(1):22-31.

96