DNA Mikroarrayler:
İfade profillemesi, SNP analizleri
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Mammals
Homo sapiens [NCBI 35]
browse | what's new | Vega
Pan troglodytes [CHIMP1]
browse | what's new
Macaca mulatta [Mmul 0.1]
browse pre! site
Mus musculus [NCBI m34]
browse | what's new | Vega
Rattus norvegicus [RGSC 3.4]
browse | what's new
Canis familiaris [CanFam1.0]
browse | what's new | Vega
Bos taurus [Btau 1.0]
browse | what's new | pre! [Btau 2.0]
Other chordates
Gallus gallus [WASHUC1]
browse | what's new
Xenopus tropicalis [JGI 3]
browse | what's new
Danio rerio [WTSI Zv5]
browse | what's new | Vega
Takifugu rubripes [Fugu 2.0]
browse | what's new
Tetraodon nigroviridis [TETRAODON 7]
browse | what's new
Other eukaryotes
Drosophila melanogaster [BGDP 4]
browse | what's new
Anopheles gambiae [MOZ 2]
browse | what's new
Apis mellifera [Amel 2.0]
browse | what's new
Caenorhabditis elegans [WS140]
browse | what's new
Saccharomyces cerevisiae [SGcurrent browse | what's new
Ciona intestinalis [JGI 1.95]
browse | what's new
Monodelphis domestica [MonDom2]
browse pre! site
Ensembl
Data Resources
Cancer Gene Census: Mutated genes causally implicated in human cancer.
COSMIC: Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer
Protein Kinases: Somatic mutations in protein kinase ge nes.
NCI-60:
Mutations in cancer genes in the NCI-60 cell lines.
Cancer Cell Line Project:
Mutations of cancer cell lines.
Copy Number Analysis:
An analysis of copy number in cancer cell lines and tumours.
Overview
The Foundation’s Microbial Genome Sequencing Project was launched in April, 2004 after the American Society for Limnology and Oceanography meeting in Honolulu, Hawaii.
The Foundation was encouraged by scientists to increase the number of genome sequences of ecologically-relevant microorganisms.
Over 200 microorganisms were nominated for sequencing—86 candidates were selected by a committee of preeminent marine microbiologists based on five selection criteria.
Phase one of the project was initiated in the Fall, 2004 with a grant to the Institute of Biological Energy Alternatives (now the J. Craig Venter Institute).
Auto-annotated genome sequences will be deposited in GenBank.
This website serves as a portal; consult GenBank and the PI website for further information.
HIGH-THROUGHPUT
YÜKSEK İŞLEM HACMİ
D N A’nın sabit ortama aktarımı Southern Blot
(Edward M. Southern, 1975)
mRNA Analiz Yöntemleri
• Northern Blot (Tek gen analizi)
• RT-PCR (Tek gen analizi)
• Mikroarray (Genom boyunca analiz)
•mRNA’lar boylarına göre jelde yürürler.
•mRNA’lar naylon membrana transfer edilir ve
radyoaktif işaretli DNA probları ile hibridize edilir.
•İşlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir.
NORTHERN BLOT
•Total veya polyA RNA üzerinden “reverse transcriptase” enzimi ile cDNA sentezlenir.
•Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır.
•Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir.
•İşlem hacmi northern blot’tan yüksek mikroarraylerden düşüktür.
RT-PCR
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
• cDNA array: 500-5000 bç uzunluğunda probların cam yüzeylere basılması ile üretilir.
• Oligo array: 20-80 bç uzunluğundaki
oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip
yüzeyine immobilize edilmesi veya doğrudan
çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile
üretilir.
DNA Mikroarray
DNA Mikrodizin
DNA Mikroarray
DNA Mikrodizin
Affymetrix
24µm24µm
Özgül oligonükleotit probun Özgül oligonükleotit probun milyonlarca kopyası
milyonlarca kopyası
Hibridize olmuş oligo array’in görüntüsüHibridize olmuş oligo array’in görüntüsü
>200,000
>200,000 farklı eşlenik probfarklı eşlenik prob Tek zincirli
Tek zincirli,,
işaretlenmiş RNA hedef işaretlenmiş RNA hedef
molekülü molekülü Oligon
Oligonükükleotileotitt prob prob
* * *
*
*
1.28cm 1.28cm GeneChip
GeneChip OligoOligo Array Array Hibridize olmuş prob hücresiHibridize olmuş prob hücresi
RNA
Nitelik ve Nicelik Tayini
18S 28S
Fluorescence
Time (seconds) 0
100 200 300 400 500 600 700 800
19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69
Affymetrix platformunda ifade analizi
biobio cDNAcDNA
Fragment Fragment
(Isı(Isı, Mg, Mg2+2+))
biobio biobio biobio
Yıkama Yıkama
&
& BoyamaBoyama Tarama
Tarama HibridizeHibridize
İşaretli
İşaretli cRNA cRNA trans
transkriptlerikriptleri Total RNA
Total RNA veyaveya Poly (A)
Poly (A)+ + mRNAmRNA
IVTIVT
(bio-NTP) (bio-NTP) AAAAAAAA
İşaretli İşaretli
fragmentler fragmentler biobio biobio
biobio
biobio RTRT
Hedef örneğin hazırlanışı
Hibridizasyon Hibridizasyon
kontrolleri kontrolleri polyA
polyA kontrolleri kontrolleri
Affymetrix
Affymetrix
• About 100 pixels per probe cell
• These intensities are combined to form one number representing
expression for the probe cell oligo
• What about genes?
Affymetrix platformunda hibridizasyon, boyama ve yıkama
B B
GeneChip Biotin
İşaretli cRNA
+
B B
B
B
B
B
B
B
B
B +
SAPE Streptavidin-
fikoeritrin
Hibridize Array
Mikroarray kullanım amaçları
• Hücre metabolizmasına global bakış
– Mikroarrayler vasıtasıyla bir hücreye yapılan bir uygulamanın hücreyi nasıl etkilediği hangi metabolik yolakların uyarıldığı hangilerinin sustuğu uygulama öncesine göre kıyasla ortaya konabilir.
– Benzer yaklaşımla hastalıkların metabolizme üzerine etkilerinin belirlenmesi ve tedavi için hedef moleküllerin saptanması amacı ile hasta ve kontrol gruplarında mikroarrayler ile global ifade analizleri yapılabilmektedir.
• Tıbbi teşhis
– SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanmaktadır.
– 1999–6800 insan geni içeren bir mikroarray ile myeloid lösemi ile limfoblastik lösemi 50 adet ifade farklılığı gösteren gen yardımı ile birbirinden ayrıldı.
– 2003- Meme kanseri altgruplarını saptayabilen 70 adet gen saptandı yapılan global transkriptom analizi ile.
Fonksiyonel Analiz
Genlerin Nakavt Edilmesi/Gene Knockout
Fonksiyonel Analiz
siRNA
Affymetrix platformunda tarama
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
Genomik Dizi
5´ 3´
Allel ‘A’
SNP T / G
SNP
prob = 25 baz
Perfect Match Mismatch Perfect Match
Mismatch Allel ‘B’
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
TAGCCATCGGTA N SNP C / A
GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G
ATCGGTAGCCAT T ATCGGTAGCCAT A
ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA
PM Allel MM Allel PM Allel MM Allel
A A B B
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
• 7 Prob Çift Seti (Kuartet)
• SNP başına 56 olasılık
• Oryantasyon başına 28
• Dağıtılmış yerleşim
Düz zincir
Ters zincir Düz zincir
Ters zincir
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
-4 4
B
MM PM MM PMA
A B
MM
B
PM MM PMA
A B
-1
-2 0 1 3
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
1 2 3 4 5 6 7
PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA
MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA
PMB PMB PMB PMB PMB PMB PMB
MMB MMB MMB MMB MMB MMB MMB
• 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP’yi temsil etmek üzere seçilir.
• Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP’nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler.
• Tek bir TNP’yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır.
Tek Primer Amplifikasyonu ile
Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
250 ng Genomik DNA
RE muamelesi
Xba Xba Xba
Adaptörün bağlanması Tek primer ile
amplifikasyon 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon
ve işaretleme
Hibridizasyon Ve Tarama
DNA Mikroarray DNA Mikrodizin
Mikrosatellit 10K
# Marker 400 10,000
Çözünürlülük 10 cM (10 MB) 1 cM (1 MB) *
# PCR Reak/örnek
# PCR Primer/örnek
200 (2x multipleks) 800
4 1 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta Belirteç başına DNA
Deney başına DNA
40 ng
16,000 ng
.025 ng 250 ng
DNA Mikrodizin
Farklılıklar 100k 10K
Dizin sayısı 2 1
Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba
Başlangıç DNA miktarı 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng
PCR Amplifikasyon Boyutu 250-2000bp 250-1000bp
Fragmente edilecek miktar 40ug 20ug
Tarama
Yüksek çözünülürlüklü
tarama Rutin tarama
Fragmentasyon reaktifinin
konsantrasyonu 0.06U/uL 0.048U/uL
Algoritma ve yazılım DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0 Ana uygulama alanı Asosiyasyon çalışmaları Bağlantı
TNP’ler Perlegen ve Kamu
Kamu
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
<>
<>
Resequencing Tiling
Strategy
A C G T
T C G C A
Düz zincir
Düz zincir
A C G T
AGCGT
ACCGT
CustomSeq™ Resequencing Dizinleri
• Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb.
A C G T
CustomSeq™ Deney Protokolü
Miktar tayini-Örneklerin Karıştırılması
Fragment İşaret
Hibridizasyon
Veri analizi
Genomik DNA
Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR
Kontrol
Kalıp/Primerler
Fragmentasyon reaktifi
Hibridizasyon için oligo kontrolleri
Deney Akışı
Yıkama İstasyonu Yıkama İstasyonu:: Yıkama/Boyama Yıkama/Boyama Tarama
Tarama Sondan işaretli fragmentlerSondan işaretli fragmentler İlgilenilen
İlgilenilen genlerin genlerin belirlenmesi belirlenmesi
İşaretleme İşaretleme Genomi
Genomikk DNADNA
Karıştırma ve Karıştırma ve Fragment
Fragmentasyonasyon
PCR ÜrünleriPCR Ürünleri
DNA fragment DNA fragmentlerileri
BB
BB BB
BB BB BB
BB
Geceboyu hibridizasyon
Wash Scan &
Stain
Probe Probe Array Array Probe Probe Array Array
>chr21:29595444-29636248
gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaa ttttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggt ctcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgct gggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaa aaggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgg gtcaataccagaattgggtgggggtcttcagctcacccctaaactcat cattgataagcagaatgaatgaccatggctggtttagaca……….
Affymetrix CustomSeq™ Arrays
~30 Kb Biological
Sample
2.5 Days
2.5 Days
DNA Analiz Yazılımı
Cihaz Kontrolü
.DAT dosyasının oluşturulması .CEL dosyasının oluşturulması .CHP dosyasının oluşturulması .CHP veri karşılaştırılması
GCOS
GeneChip DNA
Analysis Software 2.0 (GDAS)
