DNA Mikroarrayler:
SNP analizleri
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
DNA Mikrodizin
Genomik Dizi
5´ 3´
Allel ‘A’
SNP T / G
SNP
prob = 25 baz
Perfect Match Mismatch Perfect Match
Mismatch Allel ‘B’
DNA Mikrodizin
TAGCCATCGGTA N SNP C / A
GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G
ATCGGTAGCCAT T ATCGGTAGCCAT A
ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA
PM Allel MM Allel PM Allel MM Allel
A A B B
DNA Mikrodizin
• 7 Prob Çift Seti (Kuartet)
• SNP başına 56 olasılık
• Oryantasyon başına 28
• Dağıtılmış yerleşim
Düz zincir
Ters zincir Düz zincir
Ters zincir
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
-4 4
B
MM PM MM PMA
A B
MM
B
PM MM PMA
A B
-1
-2 0 1 3
DNA Mikrodizin
1 2 3 4 5 6 7
PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA
MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA
PMB PMB PMB PMB PMB PMB PMB
MMB MMB MMB MMB MMB MMB MMB
• 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP’yi temsil etmek üzere seçilir.
• Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP’nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler.
• Tek bir TNP’yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır.
Tek Primer Amplifikasyonu ile
Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması
DNA Mikrodizin
250 ng Genomik DNA
RE muamelesi
Xba Xba Xba
Adaptörün bağlanması Tek primer ile
amplifikasyon 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon
ve işaretleme
Hibridizasyon Ve Tarama
DNA Mikrodizin
Mikrosatellit 10K
# Marker 400 10,000
Çözünürlülük 10 cM (10 MB) 1 cM (1 MB) *
# PCR Reak/örnek
# PCR Primer/örnek
200 (2x multipleks) 800
4 1 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta Belirteç başına DNA
Deney başına DNA
40 ng
16,000 ng
.025 ng 250 ng
DNA Mikrodizin
Farklılıklar 100k 10K
Dizin sayısı 2 1
Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba
Başlangıç DNA miktarı 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng
PCR Amplifikasyon Boyutu 250-2000bp 250-1000bp
Fragmente edilecek miktar 40ug 20ug
Tarama
Yüksek çözünülürlüklü
tarama Rutin tarama
Fragmentasyon reaktifinin
konsantrasyonu 0.06U/uL 0.048U/uL
Algoritma ve yazılım DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0 Ana uygulama alanı Asosiyasyon çalışmaları Bağlantı
TNP’ler Perlegen ve Kamu
Kamu
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
<>
<>
Resequencing Tiling
Strategy
A C G T
T C G C A
Düz zincir
Düz zincir
A C G T
AGCGT
ACCGT
CustomSeq™ Resequencing Dizinleri
• Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb.
A C G T
CustomSeq™ Deney Protokolü
Miktar tayini-Örneklerin Karıştırılması
Fragment İşaret
Hibridizasyon
Veri analizi
Genomik DNA
Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR
Kontrol
Kalıp/Primerler
Fragmentasyon reaktifi
Hibridizasyon için oligo kontrolleri
Deney Akışı
Yıkama İstasyonu Yıkama İstasyonu:: Yıkama/Boyama Yıkama/Boyama Tarama
Tarama Sondan işaretli fragmentlerSondan işaretli fragmentler İlgilenilen
İlgilenilen genlerin genlerin belirlenmesi belirlenmesi
İşaretleme İşaretleme Genomi
Genomikk DNADNA
Karıştırma ve Karıştırma ve Fragment
Fragmentasyonasyon
PCR ÜrünleriPCR Ürünleri
DNA fragment DNA fragmentlerileri
BB
BB BB
BB BB BB
BB
Geceboyu hibridizasyon
Wash Scan &
Stain
Probe Probe Array Array Probe Probe Array Array
>chr21:29595444-29636248
gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaa ttttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggt ctcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgct gggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaa aaggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgg gtcaataccagaattgggtgggggtcttcagctcacccctaaactcat cattgataagcagaatgaatgaccatggctggtttagaca……….
Affymetrix CustomSeq™ Arrays
~30 Kb Biological
Sample
2.5 Days
2.5 Days
DNA Analiz Yazılımı
Cihaz Kontrolü
.DAT dosyasının oluşturulması .CEL dosyasının oluşturulması .CHP dosyasının oluşturulması .CHP veri karşılaştırılması
GCOS
GeneChip DNA
Analysis Software 2.0 (GDAS)
