NUMUNE HAZIRLAMA- EKSTRAKSİYON YÖNTEMLERİ. Doç. Dr. Şebnem BUDAK

NUMUNE HAZIRLAMA-

EKSTRAKSİYON YÖNTEMLERİ

Doç. Dr. Şebnem BUDAK

Matriks Analit Referans Standart...

• Matriks : Numune Ortamı

• Analit : Bir numunenin tayin edilecek bileşeni

• Referans Standart : Yüksek saflıkta analitik

standart

Kimyasal analizi yapılacak numuneler genellikle aranan madde (analit) dışında birçok bileşenin yer aldığı karışık bir matriks içerirler.

Bu nedenle örnek hazırlama özellikle

• Yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC),

• Gaz kromatografi (GC)

• Gaz kromatografi-kütle spektrofotometresi (GC/MS)

• Kağıt Kromatografisi (TLC)

yapılan analizler öncesinde uygulanması gereken çok önemli bir basamaktır.

Matriks Analit Referans Standart...

Örnek hazırlama,

örneklerin istenmeyen bileşenlerden temizlenmesi ve konsantre edilmesi için yapılmaktadır.

Temizleme (CLEAN-UP) işlemi ile

• Matriksten analizin yanlış

sonuçlanmasına neden olabilecek,

• Aranan maddenin tespit edilmesini engelleyebilecek

AMAÇ = TEMİZLEME (CLEAN-UP)

Fizikokimyasal parametreler

Analit girişim yapan diğer türlerden nasıl uzaklaştırılır?

Polarite

• Sıvı sıvı ekstraksiyonu, Katı Faz Ekstraksiyonu Büyüklük

• Büyüklükçe ayırma kromatografisi (GPC) Uçuculuk

• Headspace, SPME

Ektraksiyon Yöntemleri

1) SIVI-SIVI EKSTRAKSİYONU (LLE)

2) KATI FAZ EKSTRAKSİYONU (SPE)

SIVI-SIVI EKSTRAKSİYONU

• Bu yöntem iki sıvının yoğunluk farkından yararlanılarak uygulanır

• Yeterli saflığa sahip olmayan ekstraktlar elde edilmesi

• Fazla miktarda çözücü harcanması

• Ekstraksiyon sırasında emülsiyon oluşması

• Çözücülerin yeterince uzaklaştırılamaması

• Duyarlı kantitatif sonuçlar elde edilememesi

Sıvı-Sıvı Ekstraksiyonu

Ayırma Hunisi

Organik çözücüde çözünenler Sulu fazda çözünenler

Sıvı-Sıvı Ekstraksiyonu

• Temizleme özelliğinin yanında ektraktı konsantre etmek için de kullanılabilir

• Hedef analit veya analitler sıvı ekstraksiyonla sulu fazdan organik faza geçer

• Polar maddeler sulu faz içinde kalır

Polar maddeler polar çözücülerde

Apolar maddeler apolar çözücülerde çözünür.

Sıvı Sıvı Ekstraksiyonunda Kullanılan Çözücüler

• Diklormetan

• Siklohekzan/Etilasetat

• Isooktan

• Hekzan

• Toluen

• SPE gıda ve farmasötik numunelerde en yaygın kullanılan numune hazırlama tekniğidir

 Kolay uygulanabilir ve ucuz bir metottur.

 Pratik ve ekonomik bir yöntemdir.

 Az miktarda numune ve çözücü harcanır. (5-10 mL hacimlik çözücü ekstraksiyonu sonrasında 5-10 mL’lik elüsyon)

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

İdeal bir Katı Faz Ekstraksiyon metodu;

 Asidik, bazik ve nötral maddeler için

yüksek geri kazanım oranlarına sahip olması,

 İlaç ve metabolitlerinin biyolojik sıvılarda pg/mL düzeyinde izole edilebilmesine olanak sağlaması,

 Büyük hacimli örnekler için kolay otomasyon sağlayabilmesi,

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Örnek haznesi

Adsorban yatağı

Diskler

KATI FAZ EKSTRAKSİYON (SPE) yönteminde , içerisine çeşitli tutucu maddelerin (adsorban) doldurulması ile elde edilen tek kullanımlık ekstraksiyon kolon veya diskleri kullanılır.

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Katı Faz Ekstraksiyon Kolonları

• Sıvı numune bu kolonlar içerisinden geçirilir.

• Sıvı örneğin kolondan geçirilmesi, yerçekimi vasıtasıyla (manual) gerçekleştirilebildiği gibi, zaman kaybının önüne geçmek amacıyla vakum manifoldları yardımıyla da yapılabilir.

• Son yıllarda aynı prensiple çok daha düşük miktarda örneğin uygulandığı çok sayıda kuyucuk (genelde 96 tane) içeren SPE plakaları da kullanılmaktadır .

Katı Faz Ekstraksiyonu

Vakum Manifold

SPE metodunda kolondan geçirilme sırasında örnek molekülleri ile adsorban arasında

kimyasal bir etkileşim meydana gelir.

Bu etkileşimden faydalanılarak maddelerin ayrılma işlemi başlıca 2 yolla gerçekleştirilir.

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Birinci yöntemde, analiz edilecek bileşik tutucu maddeye bağlanarak kolon içinde tutulur.

Çözelti ve istenmeyen

bileşenler bu madde ile herhangi bir etkileşime girmezler.

Daha sonra istenmeyen

bileşenler uygun yıkama çözeltisi ile uzaklaştırılır ve analiz edilecek bileşen tutucu maddeden uygun

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Örneğin kolondan geçirilmesi Şartlandırma

Örnek

• Immunoaffinite Kolonlar Spesifik Antikor

İkinci yöntemde ise, istenmeyen bileşenlerin tutucu madde ile etkileşimi sözkonusudur.

Özellikle atık yağlar gibi matriksden ayrılması zor olan

maddelerin analizinde kullanılan bu yöntemde, matriksteki istenmeyen bileşenler adsorban tarafından sıkı şekilde tutulurlar.

Asıl aranan madde ise tutucu madde ile etkileşime girmez ve uygun çözelti yardımıyla çözdürülerek toplanır.

Bu yöntemde, kolon içerisindeki tutucu maddenin oluşturduğu katı faz

Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)

Örneğin kolondan geçirilmesi Şartlandırma

Katı faz ekstraksiyon yönteminde ayrılma adsorban, çözücü ve analizi yapılacak madde bileşenleri arasındaki etkileşime bağlıdır.

Bu nedenle katı faz ekstraksiyonunda adsorban ve çözücü cinsi önemli derecede rol oynamaktadır.

Katı Faz Ekstraksiyonunda Kullanılan Adsorbanlar

ADSORBAN KİMYASAL FORMÜLÜ

SİLİKAJEL ALUMİNA FLORİSİL

OKTADESİL(C18) OKTİL(C8)

SiOH Al₂O₃ MgSiO₃ (CH₂)₁₇CH₃

(CH₂)₇CH₃

SPE Kolonlarının Kullanıma Hazırlanması

Katı faz ekstraksiyonunda kolon kullanılmadan önce adsorbanın şartlandırılması gerekmektedir.

Şartlandırma işlemi neden yapılmalıdır?

Kolondan uygun çözelti geçirilerek tutucu maddenin aktif hale getirilmesi ve

Matriksteki maddeler ile tekrarlanabilir etkileşim için gerekli ortamın sağlanabilmesi amacıyla yapılmaktadır.

Nasıl gerçekleştirilir?

 Polar olmayan tutucu maddeler, kolon hacminin 2-3 katı

miktarda suyla karışabilen metanol, tetrahidrofuran, isopropanol gibi polar çözücüler ile; polar tutucu maddeler ise polar olmayan

SPE Metodunda Maddelerin Ayrılma Prensipleri

SPE metodunda maddelerin birbirinden ayrılması, analizi yapılacak maddenin molekülleri ile adsorban yapısındaki

fonksiyonel gruplar arasındaki moleküller arası etkileşimler sayesinde açıklanır.

Analizi yapılacak madde

molekülleri adsorbandaki etkin gruplara iyonik, hidrojen, dipol-dipol, dipol

indüklenmiş dipol ve indüklenmiş dipol-indüklenmiş dipol (van der

Waals) bağları ile bağlanır. Bu şekilde

Katı Faz Ekstraksiyonunda Kullanılan Çözücüler

Polarite Çözücü Suyla Karışabilme

Nonpolar ^Hekzan_İzooktan

Petrol eteri Sikloheksan

Karbontetraklorür Kloroform

Metilen klorür Tetrafuran Dietileter Etil asetat Aseton Asetonitril Isopropanol Metanol

Hayır Hayır Hayır Hayır Hayır Hayır Hayır Evet Hayır Zayıf Evet Evet Evet Evet

SPE Metodunun Başlıca Kullanım Alanları

Gıdalarda Başlıca Aflatoksin ve Mikotoksinlerin Analizinde,

Bitkisel ve Bal, Süt, Peynir Gibi Hayvansal Gıdalarda Pestisitlerin Analizinde

Et ve Et Ürünlerinde Özellikle Steroid Hormonların Analizinde,

 Sudaki Organik Kirliliklerin

(Organik Klorlu ve Organik Posforlu Pestisitler,

Anilinler, Organik Azot Ve Nitro-Aromatikler) Analizinde,

İdrar, Kan, Serum, Safra, Mide İçeriği, Karaciğer, Beyin Gibi Biyolojik Örneklerde İlaç Düzeylerinin Tespitinde,

Katı Faz Ekstraksiyonu- Sıvı sıvı Ekstraksiyon

 Interferans yapan maddelerin ayrımı daha kolaydır

 SPE ile seçicilik artar LOD ve LOQ düşer

 Geri kazanım daha yüksektir

 Çözücülerin birbiri içinde karışmaması gerekmez

 Daha kolay, hızlı ve güvenilirdir

TEŞEKKÜRLER…