T. C.
ÖMER HALĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
TARIMSAL GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
YÜKSEK LĠSANS TEZĠ T.DĠNÇ, 2016LĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
cry1Ac VE cry2A GENLERĠNE SAHĠP BÖCEĞE DAYANIKLI TÜTÜN HATLARININ GELĠġTĠRĠLMESĠ
TOLGA DĠNÇ
Eylül 2016
DanıĢman
Yrd. Doç. Dr. Allah BAKHSH T. C.
ÖMER HALĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
TARIMSAL GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
cry1Ac VE cry2A GENLERĠNE SAHĠP BÖCEĞE DAYANIKLI TÜTÜN HATLARININ GELĠġTĠRĠLMESĠ
TOLGA DĠNÇ
Yüksek Lisans Tezi
Eylül 2016
Tolga Dinç tarafından Yrd. Doç. Dr. Allah Bakhsh danışmanlığında lıa/.ırldnan
"crylAc ve cry2A Genlerine Sahip Böceğe Dayamklı Tütün Hatlarının Geliştirilmesi" adlı bu çalışma jürimiz tarafından Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarımsal Genetik Mühendisliği Ana Bilim Dalı'nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan
Üye
Üye
ONAY:
� �
..
: Prof. Dr. Klıalid Mahmood KHA WAR, Ankara Universitesi
: Yrd. Doç. Dr. Allah BAKHSH, Ömer Halisdemir Üniversitesi
Bu tez, Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulunca belirlenmiş olan yukarıdaki jüri üyeleri tarafından ... ./ ... ./20.... tarihinde uygun görülmüş ve L:nstitL.i \' i\ı-:tiııı Kumlu'nun .... / ... ./20 .... tarih ve ... sayılı kararıyla kabul celi imiştir.
... / .... ./20 ...
Doç. Dr. Murat BARUT MÜDÜI{ V.
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin bilimsel ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalıĢmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Tolga DĠNÇ
ÖZET
cry1Ac VE cry2A GENLERĠNE SAHĠP BÖCEĞE DAYANIKLI TÜTÜN HATLARININ GELĠġTĠRĠLMESĠ
DĠNÇ, Tolga
Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Tarımsal Genetik Mühendisliği Anabilim Dalı
DanıĢman : Yrd. Doç. Dr. Allah BAKHSH
Eylül 2016, 57 sayfa
Türkiye, Ģark tütünü piyasasında dünyada önemli bir yere sahiptir. Tütün üretimini sınırlandıran en büyük sebeplerden biri de zararlı böceklerdir. Bu tez çalıĢmasında, gen piramit stratejesi kullanarak cry1Ac ve cry2A isimli iki adat böcek dirençlilik sağlayan genlerin Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla, Basma ve Nail Türk tütün hatlarına aktarılarak böceklere karĢı dayanıklı tütün hatları geliĢtirilmiĢtir. ÇalıĢmada, gen aktarım amacıyla kullanılan pK2AC plazmidi, 35S promotoru, T-DNA bölgesinde ayrıca npt-II ve GUS-INT genlerinide içermektedir. Elde edilen analizler sonucunda, Basma hattına ait 22 adet ve Nail hattına ait ise 3 adet bitkisinde hem GUS pozitif ekspresiyonu hemde genomik PCR ile cry1Ac, cry2A ve npt-II genlerinin bitki genomlarında entegrasyonu teyit edilmiĢtir.
ELISA testi de transgenik bitkilerin cry1Ac proteinini 0,017-0,607 µg/g konsantrasyonları arasında sentezlediğini göstermiĢtir. Transgenik hatlarında, yapılan biyoanaliz testleri sonucunda elde edilen transgenik hatların patates güvesi (Phthorimea operculella) karĢı dirençli olduğu görülmüĢtür. Hatların her ikisine ait bitkilerde T1 nesilde de kanamisin içeren MS ortamında antibiyotiğe karĢı direnç göstererek yabancı genin baĢarıyla bir sonraki nesle aktarılabildiğini göstermiĢtir. Transgenin varlığını sürderen transgenik tütün hatları bir tütün ıslahı programı için mükemmel gen kaynakları olabilirler.
Anahtar kelimeler: Böceklere karĢı dirençlilik, Ģark tütünü, genetik transformasyon, transgenik hatlar, bitki ıslah programları
SUMMARY
DEVELOPMENT OF ĠNSECT RESĠSTANT TOBACCO LĠNES EXPRESSĠNG cry1Ac AND cry2A GENES
DĠNÇ, Tolga
Ömer Halisdemir University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Agricultural Genetic Engineering
Supervisor : Assistant Prof. Dr. Allah BAKHSH
September 2016, 57 pages
Turkey, has an important place in the world trade of oriental tobacco. One of the main constraints in agricultural production of tobacco is huge damages incurred by insects. The study aimed to transform two tobacco lines Basma and Nail to encode insect resistance using pyramid gene transfer strategy. The plasmid pK2AC contained both genes under control of 35S promoter; that also harbored GUS-INT with in T-DNA region for earlier screening of putative transformants. Consequently, the genomic PCR results confirmed integration of cry1Ac, cry2A and nptII genes in 22 plants from line Basma and 3 plants from Nail. ELISA results showed variation in expression of cry1Ac protein among transgenic plants varying from 0,017 µg/g of fresh tissue weight to 0,607. Bioassay results with potato tuber moth (Phthorimea operculella) showed significant mortality of targeted pest on primary transformants. Furthermore, T1 transgenic progeny also confirmed resistance on MS selection medium containing kanamycin. These transgenic lines can serve as an excellent source of germplasm for an efficient tobacco breeding programme.
Keywords: Ġnsect resistance, Oriental tobacco, genetic transformation, transgenic lines, plant breeding programmes
ÖN SÖZ
Yüksek lisans tez çalıĢmam boyunca, benden desteğini esirgemeyen, laboratuvarında bana çalıĢma imkanı sağlayan, PZR çalıĢmaları, istatistik analizlerinde, her türlü ekipman desteğinde ve her daim yanımda olan danıĢman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Allah BAKHSH‟a sonsuz teĢekkür ederim.
Özellikle laboratuvarda doku kültürü ve sera çalıĢmalarında yardımcı olan, değerli arkadaĢım Emin ġahin‟e, teĢekkür ederim. Ayrıca, laboratuvarda her türlü isteğimi yapan sevgili Nur EfĢan Çırık‟a tez arkadaĢım Safa Sümer‟e, değerli arkadaĢım Yasin Ġnce ve laboratuvar arkadaĢlarım Nur Sena Çolak‟a, Esra Duru ve Tahira Hussain‟e teĢekkür ederim.
DNA izolasyonu ve PZR optimizasyonu sırasında bana yardımcı olan arkadaĢım Abu Bakar Zia ve tezimi yazarken yardımlarını esirgemeyen ArĢ. Gör. Ayten Kübra Türkmen‟e teĢekkür ederim.
Her zaman olduğu gibi bugüne gelmemde de büyük payları olan, yaptığım her Ģeyin koĢulsuz arkasında olan ve bana inanan babam Mustafa Dinç‟e ve annem Ġjlal Dinç‟e, kardeĢlerim Ġbrahim Dinç‟e, Kerem Dinç‟e ve Didem Dinç‟e sonsuz teĢekkür ederim.
Bu tez çalıĢması Ömer Halisdemir Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri (BAP) birimine ait FEB314/10-BAEP6 numaralı proje ile finansal destek sağlanmıĢtır.
İÇİNDEKİLER
ÖZET ... iv
SUMMARY ... v
ÖN SÖZ ... vi
ĠÇĠNDEKĠLER DĠZĠNĠ ... vii
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... ix
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... x
SĠMGE VE KISALTMALAR ... xiiii
BÖLÜM I GĠRĠġ ... 1
BÖLÜM II GENEL BĠLGĠLER ... 6
2.1 Agrobacterium Tumefaciens ile Bitkilere Gen Aktarım ... 6
2.2 Böceklere Dayanıklı Transgenik Bitkilerin GeliĢtirilmesi ... 11
2.2.1Bacillus thuringiensis δ-endotoksin genleri ... 11
BÖLÜM III MATERYAL VE METOT ... 19
3.1 Materyal ... 19
3.1.1Bitki materyali ... 19
3.1.2 Bakteri materyali ... 19
3.2 Metot……….. ... 20
3.2.1Besin ortamı ve doku kültürü koĢulları ... 20
3.2.2 Tohum yüzey sterilizasyonu ... 21
3.2.3 Agrobacterium kültürlerinin büyütülmesi ... 21
3.2.4 Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla tütüne gen aktarımı... 23
3.2.5Histokimyasal GUS analizi ... 25
3.2.6Polimeraz zincir reaksiyonu ... 25
3.2.7ELĠSA testi ile cry1Ac genin ekspresyon analizi ... 27
3.2.8 Yaprak biyoanalizi ... 27
3.2.9 T1 bitkilerinde tohumların çimlendirilmesi ... 27
3.2.10 Verilerin istatistiksel degerlendirilmesi ... 28
BÖLÜM IV BULGULAR VE TARTIġMA ... 29
4.1 Tütün Hatlarının Tohum Yüzey Sterilizasyonları ... 29
4.2 Tütün Hatlarının Agrobacterium Aracılığıyla Genetik Transformasyonu ... 29
4.3 Aday Transgeniklerin Moleküler Analizleri ... 34
4.3.1Gen aktarımın doğrulanması ... 34
4.3.2Histokimyasal GUS analiz ... 36
4.3.3ELISA testi ile cry1Ac genin ekspresyon analizi ... 38
4.4Yaprak Biyoanalizi ... 40
4.5 T1 Transgenik Tütün Bitkilerinin Tohum Analizi ... 41
BÖLÜM V SONUÇ ... 44
KAYNAKLAR ... 46
EKLER ... 55
ÖZ GEÇMĠġ ... 56
TEZ ÇALIġMASINDAN ÜRETĠLEN ESERLER ... 57
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Kristalize (Cry) toksin genleri ve etkilediği böcek türleri (Bakhsh vd., 2015)...13 Çizelge 3.1. MS ortamında bulunan besin maddeleri ve miktarları (Murashige ve Skoog
1962)...20 Çizelge 3.2. X-Gluc solüsyonu hazırlamak için kullanılan kimyasal ve miktarları...25 Çizelge 3.3. Tütünün basma ve nail hatlarına ait aday transgenik bitkilerin teyit edilmesinde kullanılan gen bölge, kullanılan primer baz dizileri, gen bölge uzunlukları ile primerlerin bağlanma sıcaklıkları...26 Çizelge 4.1. Basma ve nail tütün hatlarının transformasyon parametreleri verileri...30 Çizelge 4.2. cry1Ac ve cry2A genlerinin aktarıldığı basma(B) ve nail(N) aday transgenik
bitkilerine ait T1 transgenlerindeki nptII geni uyumluluğunu değerlendirmek için ki-kare testi...42
ŞEKİLLER DİZİNİ
ġekil 1.1. Ömer Halisdemir Üniversitesi, Tarım Bilimleri ve Teknolojileri Fakültesi, Tarımsal Genetik Mühendisliği bölümün seralarında yetiĢtirilen (a) nail ve (b) basma tütün hatlarına ait bitkilerinin görünümü...2 ġekil 2.1. Farklı bitki türlerinde agrobacterium tumefaciens tarafından oluĢturulan tümörler (Özcan vd., 2004 ve www.amerinursery.com/plants/plant-galls-myths misconceptions web sayfasından alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016)...6 ġekil 2.2. Agrobacterium hücresinde bulunan Ti plazmidi ve bitki hücrelerine T-DNA
aktarımı (Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016)...7 ġekil 2.3. Agrobacterium‟dan bitki hücrelerine T-DNA aktarımında gerekli olan bölgeler
(Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016)...8 ġekil 2.4. YaralanmıĢ bitki hücreleri tarafından salgılanan fenolik bileĢiklerin vir genlerini uyarması ve bitki kromozomuna T-DNA‟nın aktarımı (Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016)...10 ġekil 2.5. Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilerde böceklere dayanıklılığı
sağlayan cry genlerinin bacillus thrungiensis bakterisinden bitki hücresine aktarılması (Özcan 2009, eriĢim 23.09.2016)...12 ġekil 2.6. (Bt) Bacillus thuringiensis δ-endotoksin (cry) genlerinin üç boyutlu yapısı (De
Maagd vd., 1999)...14 ġekil 2.7. Cry proteinlerinin etki mekanizması. (a) Cry proteinleri böcek tarafından
alınarak bağırsak sıvısında çözünür, (b) mor ile gösterilen C-terminal ve sarı ile gösterilen N-terminal bölgenin bir kısmı bağırsak proteazları tarafından kesilir, (c) aktif toksin epitel hücreleri üzerinde bulunan reseptörlere bağlanır, (d) 1.
bölgenin yapısında bulunan 2 heliks saç tokası epitel hücrelerine yerleĢir, (e) toksin hücre zarında delikler olusturur ancak delik oluĢumunun mekanizması tam olarak açıklanamamıĢtır (De Maagd vd., 2001)...15 ġekil 3.1. pK2AC plazmidinin T-DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A gösteren bölgelerin Ģematik görüntüleri. Ayrıca bitki seçmek için kanamisin geni olan nptII kullanılmıĢtır...19 ġekil 3.2. Agrobacterium tumefaciens ‟in LBA4404, pK2AC plazmidinin T-DNA
bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A genleri içeren bakterilerin LB ortamında çoğaltılması, (a) LB besin ortamında çizilmiĢ bakterilerden steril
pipet ucuyla tek koloni alınması ve rifampisin ve kanamisin antibiyotiklerinin ilave edilmesi. (b) bir gece inkübatörde çoğaltılmaya hazır bakteri. (c) bir gece sonra çoğaltılmıĢ bakteri...22 ġekil 3.3. Tütün bitkisine agrobacterium tumefacien‟in LBA4404 pK2AC plazmidinin T- DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A genleri içeren hattıyla gen aktarım çalıĢmaların aĢama aĢama görünümü (a, b) steril ortamda yapsak disk eksplantların elde edimesi ve (c, d) LB ortamnda agro inokülasyonu (e, f) 30 dk sonra 3 günlük ko-kültüvasyon ortamına alınması (g, h) fazla geliĢmiĢ bakterilerin steril su ve antibiyotikle yıkanması ve ardından kurutulması...24 ġekil 4.1. Basma (a) ve nail (b) tütün hatlarının tohumlarının MS besin ortamında
çimlendirilmesi...29 ġekil 4.2. Basma ve nail tütün hatlarının genetik transformasyon aĢamaları. (a) basma tütün hatına ait 10 adet eksplantın seleksiyon ortanında alınması, (b) 3 haftalık basma (c) nail hatlarına ait eksplantları üzerinde kallus oluĢması, (d) 5-6 haftalık basma ve (e) nail hatlarına ait yaprak diski eksplantlarında kallus oluĢturmadan direk sürgün oluĢumu...32 ġekil 4.3. Basma ve nail tütün hatlarının genetik transformasyon aĢamalarının devamı (a) sürgün oluĢturan eksplantların 100 mg/l kanamisin bulunduran seleksiyon ortamına aktarılması, (b) sürgünlerin büyümesi, (c) tekrar yeni seleksiyon ortamında alt kültürü ve (d) bitkilerin büyümesi...33 ġekil 4.4. Basma ve nail tütün hatlarının genetik transformasyona uğramıĢ (a, b) kök ve
sürgün oluĢturmuĢ bitkilerin dıĢ ortama aktarılmaya hazır aday bitkiler...33 ġekil 4.5. Basma ve nail tütün hatlarına ait genetik transformasyona uğramıĢ bitkilerin
(a) sera ortamında alıĢtırılması, (b, c) büyümesi ve (d) çiçeklenmesi...34 ġekil 4.6. Basma ve nail aday transgeniklerde nptII geninin çoğaltımı. (M):1 kb DNA marker, (B): Basma hattının aday transgenik bitkileri, (N): Nail hattının aday transgenik bitkileri, (PK): Pozitif kontrol (Plazmid DNA), (NK): Negatif kontrol...35 ġekil 4.7. Basma ve nail aday transgeniklerde cry1Ac geninin çoğaltımı. (M): 1 kb DNA Marker, (B): Basma hattının aday transgenik bitkileri, (N): Nail hattının aday transgenik bitkileri (NK): Negatif kontrol, (PK): Pozitif kontrol (Plazmid DNA)...35 ġekil 4.8. Basma ve nail aday transgeniklerde cry2A geninin çoğaltımı. (M): 1 kb DNA
marker, (B): Basma hattının aday transgenik bitkileri, (N) Nail hattının aday transgenik bitkileri, (PK): Pozitif kontrol (Plazmid DNA), (NK): Negatif kontrol...36 ġekil 4.9. Yaprak, sürgün ve kesilmiĢ eksplantların histokimyasal GUS analizi. Mavi
renkli olan bitki kesitleri aday transgenik bitkiyi gösterirken mavi renkli olmayanlar transgenik adayı değildir...37 ġekil 4.10. Aday transgenik bitkilerdeki cry1Ac protein konsantrasyonunu belirlemek için
yapılan ELISA testinin yapım görünümü...38 ġekil 4.11. Basma ve nail transgenik hatlarının ELĠSA testi ile cry1Ac ekspresyonu. N:
Nail transgenik bitkiler, B: Basma transgenik bitkiler, NC: Negatif kontrol...39 ġekil 4.12. cry1Ac ve cry2A genlerinin aktarıldığı basma(B) ve nail(N) aday transgenik
bitkilerine ait yapraklarda biyoanaliz test çalıĢmaları sonucunda zehirlenerek ölmüĢ olan Phthorimaea operculella larvaları...40 ġekil 4.13. cry1Ac ve cry2A genlerinin aktarıldığı basma(B) ve nail(N) hatlarına ait aday transgenik tütün bitkisinden oluĢan tohumlarından geliĢen bitkilerde (a, b) kanamisinli ortamda seleksiyon ve (c, d) GUS histokimyasal analizi ekspresiyonu...43
SİMGE VE KISALTMALAR
Simgeler Açıklama
kg Kilogram
mm Milimetre
g Gram mL Mililitre
Min/dk Dakika m Metre
oC Santigrat derece mg Miligram
g (rpm) Yerçekimi (Dakika baĢına dönüĢ sayısı) µl Mikrolitre
ng Nanogram
V Voltaj
Kısaltmalar Açıklama
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
LB Left Border (sol sınır)
RB Right Border (sağ sınır)
DNA Deoksiribonükleikasit
Vir Virülens
Ti Tumour-inducing (tümör oluĢturan) Cry Kristalize
Bt Bacillus Thuringiensis GUS β-glukuronidaz
MS Murashige ve Skoog
NptII Neomysinfosfotransferaz Geni
BÖLÜM I
GİRİŞ
Bitkiler, insanlar tarafından çok uzun zamandan beri besin olarak kullanılıyor olması tarımsal ürünlerin önemini her geçen gün artırmaktadır. Bu bağlamda tarımı yapılan bitkilerin verimini her zaman artırılması hedeflenmiĢtir. Bu güne kadar, hedeflenen gayeye ulaĢmak için, çevreye zararlı olan böcek ilaçları, sentetik gübre ve yabancı ot ilaçları kullanılmıĢtır (Andrews vd., 1987). GeliĢmiĢ tarım yöntemleri son 50 yılda ve modern teknolojiler ile birlikte son derece geliĢmiĢ ıslah süreçleri, tarımı yapılan bitkilerin verim ve kalitesinde büyük bir artıĢa neden olmuĢtur (Özcan vd.,1993).
Tütün (Nicotiana tabacum L.), keyif verici bitkiler sınıfında olan patlıcangiller (Solanaceae) familyasından tek yıllık bir bitkidir (ġekil 1.1). Tütün bitkisi, yapraklarının iĢlenmesi sonucunda oluĢan tarımsal ürün, en yaygın olarak sigara yapımında kullanılmaktadır. Bahsi geçen bu ürün hem aromatik bitki hemde endüstriyel bitkiler sınıfında da yer almaktadır.
Adaptasyon kabiliyeti yüksek olan ve çeĢitli coğrafyalara uyum sağlayabilen tütün bitkisi, kısa sürede yetiĢmesi itibariyle en iyi tarımsal bitkilerden birisidir. Sigara olarak tüketilmesinin yanında tütün, pestisit yapımında ve tıpta kullanılmaktadır.Amerika BirleĢik Devletleri, Çin, Küba, Hindistan, Türkiye ve diğer ülkede önemli bir endüstri bitkisidir (Villegier vd., 2003).
Anavatanı Orta Amerika olan tütün,Osmanlı Ġmparatorluğuna Ġngiliz ve Ġtalyan denizciler tarafından 1700‟lü yılların baĢında getirilmiĢtir. Tütün, imparatorluğun sınırları içinde ilk olarak 1687 yılında, Makedonya‟da yetiĢtirilmiĢtir. Daha sonra özenli ekim, doğru tarım yöntemleri ve uygun ekolojik koĢulları sayesinde üretim yaygın hale gelmiĢtir. Türk tütünü yüksek kalitesi ile dünya pazarlarında iyi bir nam kazanmıĢtır. Dünya çapında 2014 yılı itibariyle 120‟den fazla ülke 4.2 milyon hektarlık geniĢ bir alanda tütün üretimi yapılmakta ve Dünya‟daki tütün üretiminin %80‟ninden fazlası Çin, Brezilya, Hindistan, Amerika BirleĢik Devletleri, Türkiye, Zimbabve ve Malavi‟de gerçekleĢmektedir (FAO, 2016).
Türkiye 2014 yılında dünyadaki 7 milyon ton tütün üretiminin 153 bin tonluk kısmını üreterek dünya ülkeleri arasında 11. sırada yer almaktadır (FAO, 2016). Dünya üzerinde 60‟ın üzerinde tütün türleri vardır ve Nicotiana tabacum L. bunların içerisinde en fazla yetiĢtirilenidir. Ülkemizde de yetiĢtirilen tütünler arasında en fazla paya (%95) sahiptir.
Bahsi geçen bu türün yanında yetiĢtiriciliği yapılan bir baĢka tür Nicotiana rustica L.
(Hasankeyf tütünü) olup, bu tür ülkemizde genellikle Doğu Anadolu ve Güneydoğu
Anadolu Bölgelerinde yetiĢtirilmektedir. Dünya piyasalarında Nicotiana tabacum L. Türk tütünü veya ġark (doğu) tipi tütün olarak da bilinmekte olup genellikle sigara üretiminde kullanılan tütün türüdür. Nicotiana rustica çoğunlukla nargile, pipo, enfiye, çiğnemelik ve zehirli dart yapmak için kullanılan, nikotin oranı yüksek tütün türleri arasındadır. Bu tür düĢük kaliteli Türk tütünü olarakta geçmektedir.
a b
Şekil 1.1. Ömer Halisdemir Üniversitesi, Tarım Bilimleri ve Teknolojileri Fakültesi, Tarımsal Genetik Mühendisliği bölümün seralarında yetiĢtirilen (a) nail ve (b) basma tütün
hatlarına ait bitkilerinin görünümü
Türk (ġark/Oriental) tütünü Nicotiana tabacum L. türünden olup içeriğindeki etken madde ve kalite yönünden göstergesi olan nikotin miktarı %1‟e yakın olmakla birlikte ülkemizdeki tüm tütünler göz önüne alındığında bu oran %1-2 arasında değiĢmektedir. Sigara üretiminde içim yönünden en hafif ve nikotin oranı yüksek olan tütünler ile harmanlamada istenilen bir özellik taĢımaktadır. Genel çerçevede ġark tipi tütünler; protein yönünden ve azot içeriği açısından az, nikotin oranı düĢük, tadı ve kokusu yoğun olmayan 2 metreye kadar boylanabilen, ülkemiz koĢullarına adaptasyonu çok iyi olan bir bitkidir. Ayrıca bunların tohumlarında %34-45 arasında nitelikli yağ içeren, yaprak ayası küçük ve kurumuĢ yaprakların rengi sarı olmaktadır (Er vd., 2011).
Türk ya da Ģark tütünü diğer tarımsal bitkilerin yetiĢtiriciliği için uygun olmayan fakir
topraklara uyum sağlamaktadır. Türkiye çoğunlukla küçük yapraklı Ģark tütün tiplerinin yetiĢtirilmesine uygun toprağa, iklim koĢullarına ve geleneğe sahip olup, büyük yapraklı tütün tipleri çok az miktarda yetiĢtirilmektedir. Hasat edilen yapraklar çoğunlukla güneĢ ıĢığında kurutulur ve kendine özgü altın sarı rengi kalite özellikleri açısından dünya çapında çok ünlüdür. ġark tütünü yüksek aroması, küçük yaprakları, düĢük Ģeker ve nikotin içeriği ile tanınmaktadır. Dünyanın en büyük sigara üreticilerin çoğu ürettikleri sigaraların aromasını ve kalitesini zenginleĢtirmek için Türk tütünü kullanmaktadırlar.
Türkiyede yetiĢtirilen tütünler arasında kalitesi en üstün ve dünya çapında üne sahip tütünlerimizden Basma, Evkaf, Samsun Canik ve Samsun Maden adlarıyla bilinen tütünlerimiz Samsun bölgesinde üretilip yetiĢtirilmektedir. Ege Bölgesine göre kıyaslandığında çeĢitlerin homojen dağılmayıp aksine farklı bölge yerlerinde yetiĢtiriciliği yapılmaktadır. Bu bağlamda bölgede yetiĢtirilen tütünlerin renk, koku, tat, boyut, Ģekil, dıĢ görünüĢü, içim özellikleri bakımından farklılık gösterebilmektedir.
Türkiye tütünlerinin özellikleri bakımından Karadeniz Bölgesi tütünleri konumuz gereği seçilen çeĢitlerin bu bölgede yetiĢtirilmektedir. Karadeniz Bölgesi tütünleri olan ve dünyaca tanınmıĢ Samsun, Bafra tütünleri bu bölgede yetiĢtirilmektedir. GümüĢhacıköy basması hariç diğerlerinin hepsi zenepli ve hafif yaĢmaklı tütünlerdir. Bu bölgedeki tütünler 5 grup altında toplanmıĢ olup, Samsun tütünleri bu grup içinde en önemlisidir. Samsun tütünleri, küçük yapraklı, tatları hoĢ ve hafiftir. Hiçbir harmana lüzum kalmadan yalnız baĢına içilen yegane tütünlerimizdendir. Sigara randımanı yüksek, nikotin oranı çok düĢüktür (%0.32- 1.60). Harmanlarda ıslah gayesiyle kullanılmaktadır. Dünya literatürlerine Samsun tütünü olarak geçmiĢtir. Dünyanın nikotini en az tütünüdür. Tokça, tatlı, hafif kokulu ve yanması iyidir. Samsun tütününün oymakları arasına giren Samsun (Canik Oymağı) küçük yapraklı, ince dokulu, zenepli omuzsuzdur. Harmanlara koku vermek maksadıyla katılır ve Nail çeĢiti bu oymak içinde yer almaktadır. Diğer oymak ise GümüĢhacıköy Basmasıdır ve araĢtırmamızda kullanılan diğer çeĢitimiz olan Basma bu oymakta bulunur. Zenepsiz yaĢmaklı, kalın dokulu, küçük yapraklı tütünlerdir. Karadeniz tütünleri arasında yegane yaĢmaklı tütündür. Karamelemsi kokusu vardır. Harmanlara yavaĢlılık verir. Sigara randımanı orta, nikotin oranı %1.00 - %1.40 arasındadır (Geçit vd., 2009).
Böcek zararlıları, tüm bitkisel üretimde olduğu gibi tütün üretiminde de dünya çapında büyük bir tehdit ve üretkenliği sınırlayan önemli faktörlerden biri olarak kabul edilmektedir (Bakhsh vd., 2009a; Sohail vd., 2012). YaklaĢık olarak 67.000 zararlı canlı türleri bitkilere zarar vermektedir. Bunların içinde <9000 böcekler ve akarlar bulunmaktadır (Ross ve
Lembi 1985). Bu zararlı böcekler bitkilerin meyve, kök, gövde ve yapraklarındaki hücre öz suyunu emerek veya bitkileri keserek ölmelerine sebep olmaktadırlar. GeçmiĢte yapılan çalıĢmlarına göre böcekler ve hastalıkların bitkilere verdiği zarar üretimde %37‟dir ve bu zararlarda böceklerin payı %13 olarak bildirilmiĢtir (Gatehouse vd., 1992) ve yeni çalıĢmalara göre %35-100 oranında zarar verebildiği belirtilmiĢtir (Gatehouse vd., 2011).
Bu oran iklim koĢullarına ve böcek türlerine göre değiĢiklik gösterebilmektedir (Bakhsh vd., 2015a).
Bol yapraklı ve etli yapıya sahip tütün bitkileri zararlı böceklerin beslenmesi, yaĢaması ve üremesi için uygun koĢullara sahiptir. Tütün bitkisine zarar veren yaygın böcek zararlıları çeĢitli kurtlar, yaprak biti, yaprak çekirgeleri ve toprak nematodları olup, bunların içerisinde kurtlar en yaygın olanlarıdır. En yaygın kurt zararlısı tütün ya da domates boynuzlu kurdu (Manduca sexta)'dur. Tütündeki diğer yaygın kurtlar çizgili yaprak kurdu, bozkurt ve bazen gamma kelebeğidir. Kurt zararı doğrudan mahsulün verimini azaltır, dolaysıyla onları kontrol amacıyla güçlü önlemler alınmaktadır.
Kimyasal böcek öldürücüleri, günümüzde kullanılan en etkili ve en yaygın zararlı kontrol stratejisi olarak bilinmektedir. Ancak, insektisitlerin yaygın ve sınırsız kullanımı sonucunda böceklerde bu ilaçlara karĢı direnç geliĢtirilmiĢ olup, üstelik hedef olmayan yararlı böceklere ve doğal çevreye de zararlı etkiler yapmaktadırlar. Bu nedenle, sentetik ilaçlara karĢı alternatif olarak böceklere dirençli transgenik bitkiler geliĢtirilmektedir (Bakhsh vd., 2009b; Sohail vd., 2012).
Bitki biyoteknolojisinde en önemli ilerlemelerden birisi, böcek zararlılarına karĢı dirençli bitkilerin geliĢtirilmesidir (Dhaliwal vd., 1998). Moleküler genetik yöntemlerin kullanılması ile böceklere dayanıklı transgenik bitkiler elde edilmiĢ ve uygulama yönünden birçok farklı yöntemler geliĢtirilmiĢtir. Günümüzde kullanılan yöntemlerin en bilineni B. thuringiensis bakterisinin böcekler için ölümle sonuçlanmasına neden olan geninin bitkilere aktarılması ile olmaktadır. Bunu bir baĢka bakteri olan ve bitkilerin doğal genetik mühendisi olarak tanımlanan Agrobacterium tumefaciens bakterisi aracılığıyla gerçekleĢtirmesidir (Özcan, 2009; Ġnce vd., 2013). Bu bakımdan böcek zararlılarına karĢı mücadele edebilecek, böcek dirençli tütün çeĢidi geliĢtirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır.
Daha önceki çalıĢmalarda bitkilere böceklere dayanıklı bir gen aktarılmıĢtır. Ancak böcekler aktarılan gene karĢı dirençlilik kazandıkları için transformasyon çalıĢmaları uzun süreli dayanıklılık sağlamamıĢtır. Bu tez konusunun amacı da öncelikle gen piramitleme
teknolojisi kullanarak cry1Ac ve cry2a genlerini taĢıyan geniĢ spektrumlu böceklere dayanıklı genleri taĢıyan transgenik tütün bitkisi elde edilmesidir. ÇalıĢmada birden fazla gen kullanılarak böceklerin direnç kazanmasını engelleyerek tütün bitkisinin böceklere karĢı dayanıklı hale getirilmesi hedeflenmiĢtir.
BÖLÜM II
GENEL BİLGİLER
2.1 Agrobacterium Tumefaciens ile Bitkilere Gen Aktarımı
Günümüzde, bitkilere gen transferinde en yaygın olarak kullanılan araç Agrobacterium tumefaciens bakterisidir. Agrobacterium tumefaciens baklagillerde azot fiksasyonu yapan Rhizobiaceae familyasına ait bir Alpha proebacterium'dur. Toprakta doğal olarak yaĢayan çubuk Ģeklinde, spor oluĢturmayan gram-negatif bir bakteridir. A. tumefaciens özellikle iki çenekli bitkilerin kök boğazında oluĢan yaralardan enfekte ederek taç uru hastalığına (tümör) neden olan bir bakteri türüdür (ġekil 2.1.). Yapılan çalıĢmalarda bu tümörlü hücrelerin, yüksek oranlarda oksin ve sitokininleri ürettiği, bundan dolayı da hormon dengesi bozulan hücrelerin tümöre dönüĢtüğü belirlenmiĢtir. Bu tümörlerin normal bitki hücrelerinden farklı, amino asit ve opin‟ler olarak bilinen Ģeker türevlerini sentezleyerek bakterinin bu ürünleri karbon ve nitrojen kaynağı olarak kullandığı tespit edilmiĢtir (Hooykaas ve Schilperoort 1992; Özcan ve Özgen 1996; Özcan vd., 2004).
a b
Şekil 2.1. Farklı bitki türlerinde (a, b) agrobacterium tumefaciens tarafından oluĢturulan tümörler (Özcan vd., 2004 ve www.amerinursery.com/plants/plant-galls-myths
misconceptions web sayfasından alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016).
Tümör oluĢumuna yapılan çalıĢmaların neticesinde, Agrobacterium‟dan bitki hücrelerine geçen ve bitki DNA‟sıyla birleĢen bazı genlerin neden olduğu tespit edilmiĢtir. A.
tumefaciens’in kromozomal DNA‟sı yanında Ti (tumour-inducing) plazmidi olarak adlandırılan küçük bir plazmid DNA‟yı da içermektedir. Bu plazmid bakterinin bitkiyi
enfekte ettiği sırada T-DNA (transfer-DNA) bölgesi olarak adlandırılan bir DNA parçasının bakteriden bitki hücresine geçtiği (ġekil 2.2.) ve bitki kromozomlarıyla birleĢtiğini belirlemiĢlerdir (Watson vd., 1975; Chilton vd., 1977 Chilton vd., 1980). Bitki hücresini enfekte ettikten sonra T-DNA bölgesinde bulunan oksin ve stokinin genleri ile opin genlerinin (ġekil 2.3.) harekete geçmesiyle hücrede aĢırı bir hormon üretimi yapılarak bitki hücresi hızlı ve kontrolsüz bölünmeyle tümör oluĢmaktadır. Tümörlü hücrelerin enerji kaynağı için ise opin genleri aktif hale geçerek Ģeker üretimi yapmaktadır (Nester vd., 1984;
Özcan vd., 2004).
Şekil 2.2. Agrobacterium hücresinde bulunan Ti plazmidi ve bitki hücrelerine T-DNA aktarımı (Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016)
Agrobacterium tumefaciens bakterisinin bitki hücrelerine gen aktarımı yapabilmesi için üç temel bölge gereklidir (ġekil 2.3). Bunlar, T-DNA bölgesi, virülens (vir) bölgede ve kromozomda bulunan genlerdir. Bakterinin Ti plazmidi üzerinde bulunan T-DNA bölgesi sağ (RB/right border) ve soldan (LB/left border) 24 baz çifti (bç) uzunluğunda belirli baz dizinleri ile sınırlandırılmıĢtır (Yadav vd., 1982; Özcan vd., 2004). Ti plazmid den bitki kromozomuna aktarılan DNA bölgesi bu sınırlar içerisinde kalan kısım olup, aktarım için sağ sınır mutlak gereklidir. T-DNA bölgesinde 2 adet oksin ve 1 adet sitokinin sentezini sağlayan genler ile opin sentezine kodlayan genler bulunmaktadır (ġekil 2.3). Bu DNA parçaları bakteri hücresinde aktif değilken, bitki kromozomlarına aktarıldığı zaman aktif hale geçmesinin nedeni, bu genlerin promotör (baĢlama noktası) bölgelerinin bitki genlerinin promotör bölgeleriyle benzerlik göstermesidir.
Şekil 2.3. Agrobacterium‟dan bitki hücrelerine T-DNA aktarımında gerekli olan bölgeler (Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır, eriĢim 23.09.2016).
T-DNA transferinde gerekli olan ikinci bölge ise virülens genlerin olduğu bölgedir. Bu bölgede 8 adet gen bölgesi (VirA, B, C, D, E, G, F, H) bulunmaktadır (ġekil 2.3). Bu genler yaralanan bitki hücrelerinden gelen fenolik bileĢikleri algılayıp üretmiĢ oldukları enzim sayesinde T-DNA bölgesini sınırlardan keserek, bitki hücresine hareketini ve bitki kromozomal genleriyle birleĢtirilmesinde etkili olmaktadırlar. Bitki hücresine T-DNA bölgesi birden fazlada aktarılabilmektedir (Tora vd., 1989; Zambryski, 1992; Özcan vd., 2004).
Üçüncü bölge ise Agrobacterium bakterisinin kromozomunda bulunan 4 adet gen bölgesidir (chvA, chvB, pscA ve attR) (ġekil 2.3). Bitki kromozomu üzerinde bulunan bu genler bakterinin bitki hücrelerine tutunması, yaralanmıĢ bitki dokularında bakterinin çoğalmasını ve Ti plazmidi üzerinde bulunan vir genlerinin düzenlenmesinde rol oynamaktadır (Douglas vd., 1985; Kado, 1991).
T-DNA transferinin aktivasyonunda etkili olan ilk protein olan VirA, bakteri hücresinde daima aktiftir. YaralanmıĢ bitki hücrelerinden salgılanan asetosringon (AS) gibi fenolik bileĢiklerin bakteri hücresine girmesiyle VirA proteini uyarılır bu sırada VirG proteini de uyarılarak bütün vir proteinlerinin aktif hale getirilmesi sağlanmaktadır. Aktif hale gelen vir genlerinin üretmiĢ olduğu enzimler de T-DNA kesilerek tek iplik DNA olarak bitki hücresine aktarılır ve bitki kromozomuyla birleĢmektedir (ġekil 2.4) (Stachel ve Zambryski, 1986; Gelvin, 2000; Özcan vd., 2004).
Modern teknolojinin geliĢmesiyle birlikte Agrobacterium hatlarında bulunan Ti plazmidin üzerindeki T-DNA bölgesinin tümör oluĢumuna neden olan sağ ve sol sınır bölgeleri arasındaki genler kesici enzimler yardımıyla çıkartılarak yerlerine herhangi bir canlıdan (bitki, hayvan, mikroorganizma gibi) alınıp izole edilmiĢtir. Ġzole edilen tarımsal açıdan önemli genler aktarıldığında in vitro Ģartlarda geliĢen hücre ve dokular bu A. tumefaciens bakterisiyle enfekte edilmektedir. Böylece istenilen özelliklere sahip bir veya birden fazla genler bitki hücrelerine aktarılarak in vitro doku kültürü yöntemleriyle bazı özellikler kazandırılmıĢ transgenik bitkiler elde edilmiĢtir (Özcan vd., 2004).
Şekil 2.4. YaralanmıĢ bitki hücreleri tarafından salgılanan fenolik bileĢiklerin vir genlerini uyarması ve bitki kromozomuna T-DNA‟nın aktarımı (Özcan vd., 2004‟den alınmıĢtır
eriĢim 23.09.2016).
2.2 Böceklere Dayanıklı Transgenik Bitkilerin Geliştirilmesi
Moleküler biyoloji önemli çalıĢma alanlarından biri de, zararlılarla mücadeledir. Yöntemin baĢlıca prensibi, böcekler için toksik etkisi bulunan proteinlerin üretilmesinden sorumlu genlerin bitki hücresine aktarılarak genetiği değiĢtirilmiĢ bitkilerin geliĢtirilmesi esasına dayanmaktadır. Bu amaçla doğadan veya yapay yolla üretilen genlerin en çok ve en yaygın Bacillus thuringiensis (Bt) δ-endotoksin proteinlerinin sentezinden sorumlu olan kristalize (cry) genleri olmasıdır (Öktem 2004).
2.2.1 Bacillus thuringiensis δ-endotoksin genleri
Bacillus thuringiensis (Bt) spor oluĢturan, aerobik, gram pozitif ve 20 türden fazla bakteri türü içeren genel biyolojik özellikleri birbirine benzer Bacillus cinsidir (Lal ve Lal, 1993).
Ġlk olarak 1901 yılında baygınlık hastalığının rastlandığı ipekböceği (Bombyx mori) larvalarında, Japonya‟da keĢfedilerek Bacillus sotto olarak isimlendirilmiĢtir (Ishiwata 1901). Sonrasında 1911 yılında bir un güvesi (Ephetia kuhniella) popülasyonu içerisinde, Almanya‟nın Thuringia kentinde yeniden keĢfedilerek ismini oraya izafen almıĢ olup insektisit etkiside bu yılda belirlenmiĢtir (Berliner, 1911). Bu bakteriler sporülasyon esnasında insektisidal etki gösteren sınırlı konukçu profiline sahip, delta-endotoksin, Cry toksin veya insektisidal Cry proteinleri (ICP) olarak adlandırılan bazı kristalize yapılar oluĢturmaktadır. Ġlk defa Fransa‟da 1938 yılında geniĢ miktarlarda üretilen Bt‟nin, O.
nubilalis (mısır kurdu) hasarını önlemek amacıyla mısır tarlalarında spreyi kullanılmıĢtır (Aronson vd., 1986).
Cry proteini üretebilen ilk Bt geni, 1981 yılında klonlandıktan sonra Agrobacterium tumafaciens bakterisinin gen aktarım için özelleĢmiĢ T-DNA‟sı aracılığıyla (ġekil 2.5) bakteriye aktarılmıĢtır. Sonrasında Bt genini taĢıyan ilk transgenik bitkiler 1987 yılında Belçika‟daki bir biyoteknoloji Ģirketi tarafından, tütün ve domatese aktarılmasıyla elde edilmiĢtir (Schnepf ve Whiteley 1981; Ecevit ve Tuncer, 1991; Lal ve Lal, 1993). Ġlk Bt geni taĢıyan transgenik ürünler 1995 yılında piyasaya çıkarılmıĢtır.
Bacillus thuringiensis (Bt), böcek direnç genlerinin belki de en önemli kaynağıdır. B.
thuringiensis‟den elde edilen genler lepidopteralar (Hofte ve Whitely 1989; Cohen vd., 2000), koleopteralar ve dipteralar gibi farklı böceklerin larvaları için zehirli olan kristal proteinleri kodlamaktadırlar (Krieg, vd., 1983; Herrnstadt vd., 1986).
Şekil 2.5. Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilerde böceklere dayanıklılığı sağlayan cry genlerinin bacillus thrungiensis bakterisinden bitki hücresine aktarılması
(Özcan, 2009 eriĢim 23.09.2016) .
B. thuringiensis 'in değiĢik özelliklere sahip olan 200‟den fazla Cry proteini bulunmaktadır.
Bunlar böceklerde etkili olma durumlarına göre dört gruba ayrılmıĢtır. Bunlardan Cyr-I toksinleri Lepidoptera larvalarına özgü olanlara etki gösterirken, Cry-II toksini hem Lepidoptera hem de Diptera larvaları, Cry-III toksini Coleoptera larvalarına özgü olanlara ve Cry-IV toksinide Diptera larvalarına karĢı etki göstermektedirler (Öktem, 2004; Bravo vd., 2007). Bu genlerin diğer gruplandırılmıĢ olanları Çizelge 2.1‟de verilmiĢtir.
Çizelge 2.1. Kristalize (Cry) toksin genleri ve etkilediği böcek türleri (Bakhsh vd., 2015)
Cry geni Hedef böcek türleri Böcek sınıfı
cryIA(a) cryIA(b) cryIA(c) cryIA(e) cryIB cryIC cryIC(b) cryID cryIE cryIF cryIG cryIIA cryIIB cryIIC cryIIIA cryIIIA(a) cryIIIB cryIIIC cryIVA cryIVB cryIVC cryIVD cryV
Ġpek böceği, tütün boynuzlu kurdu, Avrupa mısır kurdu Tütün boynuzlu kurdu, pamuk kurdu, lahana solucanı, sivrisinek Tütün tomurcuk kurdu, lahana piresi, pamuk kurdu
Tütün tomurcuk kurdu lahana solucanı
Pamuk yaprak kurdu, sivrisinek Pancar ordu solucanı
Pancar ordu solucanı, Tütün boynuzlu kurdu Pamuk yaprak kurdu
Avrupa mısır kurdu, pancar ordu solucanı Büyük mum kurdu
Çingene güvesi, sivrisinek, pamuk kurdu
Çingene güvesi, lahana piresi, tütün boynuzlu kurdu Tütün boynuzlu kurdu, çingene güvesi
Patates böceği Patates böceği Patates böceği Benekli salatalık böceği Sivrisinek (Aedes ve Culex) Sivrisinek (Aedes)
Sivrisinek (Culex)
Sivrisinek (Aedes ve Culex)
Avrupa mısır kurdu, benekli salatalık böceği
Lepidoptera
Lepidoptera ve Diptera Lepidoptera
Lepidoptera Lepidoptera
Lepidoptera ve Diptera Lepidoptera
Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Lepidoptera Coleoptera Coleoptera Coleoptera Coleoptera Diptera Diptera Diptera Diptera
Lepidoptera ve Coleoptera
B. thuringiensis δ-endotoksin genlerinin etki Ģekli 3 farklı bölgeden meydana gelmektedir (ġekil 2.6). I. bölge, böcekğin bağırsağına yapıĢma ve hücreleri parçalamaya neden olmaktadır. II. ve III. bölgeler ise böceğin bağırsağındaki epitel hücrelerinin reseptörlerini tanıması ve bağlanma özelliği taĢımasıdır (De Maagd vd., 1999). Bu, Bt Cry proteinlerinin etki mekanizması, böceğin orta bağırsağındaki kristalin çözülmesine neden olması Ģeklindedir. Bu proteinler larva tarafından yenildiğinde, zehirli proteinler orta bağırsak bölgesinde spesifik reseptörlere bağlanmakta ve duyarlı böceklerin orta bağırsak epitel dokusunu parçalamaktadır. Böylece genel zehirlenme etkisine neden olur ve sonunda larvalar ölmektedir (Kranthi vd., 2005).Bu zehirlenmenin aktif kısmı, böceğin orta bağırsak florası ve Cry proteinlerinin istenilen uygun reseptörü barındıran zara bağlanması ile oluĢmaktadır (ġekil 2.7). Günümüzde, sırasıyla cryIAb, cryIAc ve cryIIIA genlerini barındıran pamuk, mısır ve patates bitkileri geliĢtirilmiĢ. Günümüzde ticari olarak cryIAb,
cryIAc, cryIFa, cryIIIBb, cry34Ab, cry35Ab genlerini bulunduran mısır, cryIAc ve cryIIAb genlerini bulunduran pamuk ile cryIIIAa genlerine sahip patates ticari çeĢitleri piyasada bulunmaktadır.
Şekil 2.6. (Bt) Bacillus thuringiensis δ-endotoksin (cry) genlerinin üç boyutlu yapısı (De Maagd vd., 1999)
III. BÖLGE I. BÖLGE
II. BÖLGE
Şekil 2.7. Cry proteinlerinin etki mekanizması. (a) Cry proteinleri böcek tarafından alınarak bağırsak sıvısında çözünür, (b) mor ile gösterilen C-terminal ve sarı ile gösterilen N- terminal bölgenin bir kısmı bağırsak proteazları tarafından kesilir, (c) aktif toksin epitel hücreleri üzerinde bulunan reseptörlere bağlanır, (d) 1. bölgenin yapısında bulunan 2 heliks
saç tokası epitel hücrelerine yerleĢir, (e) toksin hücre zarında delikler olusturur ancak delik oluĢumunun mekanizması tam olarak açıklanamamıĢtır (De Maagd vd., 2001)
Günümüzde ve geçmiĢte birçok bitkiye ve tütünde Bt geni aktarılarak böceklerle mücadele konusunda çalıĢmalar yapılmıĢtır. Bunlardan bir kısmı aĢağıda kaynak özetlerinde verilmiĢtir.
Barton vd. (1987), B. thuringiensis bakterisinden izole edilen δ endotoksin genini tütün bitkisine aktarmıĢlardır. 100‟den fazla transformat bitki denemesinden yaklaĢık olarak % 25‟inde transformasyon görülmüĢ ve bununla beslenen M. sexta larvalarının tamamının 4 gün içinde öldüğü gözlenmiĢtir. Daha dayanıklı bitkilerde denemenin ilk birkaç saatinde larva beslenmesinin çok az olduğu gösterilmiĢtir.
De Maagd vd. (1996), cry1Ab, cry1C genlerinin hibrit ve hibrit olmayan arasındaki etkiyi yönünden araĢtırma yapmıĢlardır. Bu bağlamda Spodoptera exiqua (pancar kurdu) zararlısına karĢı etkisi belirlenmiĢ. Yapılan çalıĢma sonuçlarına göre yapay genlerin etkisi doğal genlere (cry1Ab ve cry1C) oranla yüksek ve ölüm oranı istenilen düzeyin üstünde çıkmıĢtır.
Stewart vd. (1996), kanolada yaptıkları çalıĢmalarında, cry1Ac genine dayanıklı çeĢitler elde etmiĢler. Gen aktarım yöntemi olarak A. tumefaciens aracılığıyla yapılımıĢ. Plutella xylostella ve Trichoplusiani zararlılarına karĢı yapılan çalıĢmada, toplamda 57 adet bitki
materyali kullanılıp 23 adet trasgenik adayı bitkide Southern analizi sonucunda belirlenmiĢtir. Protein konsantirasyonu seviyesini % 0-0.4 arasında olduğunu belirlemiĢlerdir.
Christov vd. (1999), tütünde yaptıkları çalıĢmalarında, yabani tip genler ve sentetik genlerden oluĢan cry1C (Agrobakterium tumefaciens LBA4404 bakterisi hattı kullanılmıĢ) genleri ile rbcS promotörü kullanılarak genetiği değiĢtirilmiĢ bitkiler elde edilmiĢtir.
Yapılan çalıĢma sonucunda Spodoptera litura‟ya dirençli bitkiler belirlemiĢlerdir. Yabani tip gene göre sentetik genlerin (cry1C) etkili daha çok olduğu belirlenmiĢtir. Daha sonrasında bitkilerden 23 tanesinde 3 gün sonrasında % 80-100 arasında zehirlenme belirtisi gösterip ölüm meydana gelmiĢtir. Protein konsantrasyonu en yüksek RSC23 bitkisinde % 0.01 olarak bulunmuĢtur.
Wang ve Guo‟e (1999) göre cryIA (b&c) ve GNA genlerini taĢıyan pGW4BAI vektörü barındıran Agrobakterium tumefaciens (LBA4404) hattı ile yapmıĢ olduğu çalıĢmasında, tütün bitkisine gen aktarımı yapılarak transgenik tütün bitkisi elde edilmiĢtir. ÇalıĢmada kanamisine dirençli 28 bitki belirlenmiĢ ve PCR, Southern blot analiz yöntemleriyle kesinleĢtirmiĢ olup cotton bollworm (Pamuk kılıfı kurdu) (H. armigera) karĢı yaprak diski analizlerinde tütün bitkilerinin, çok iyi aktiviteye sahip olduğunu göstermiĢlerdir.
Cao vd. (2005), lahana (Brassica oleracea)‟da Plutella xylostella‟ya karĢı cry1Ac (npt- II ile birlikte) ve cry1C genlerini kullanarak hedef böceğe dayanıklı bitkiler elde etmeye çalıĢmıĢlardır. 30 adet kanamisin antibiyotiğine dayanıklı, 28 adette higromisin antibiyotigine dayanıklı bitki elde etmiĢlerdir. Bu bitkilerin bir kısmı yüksek (%0.1‟in üzerinde) düzeyde toksin üretmistir ve P. xylostella‟ya karsı yüksek oranda dayanıklılık sağlanmıĢtır. Elde edilen bütün bitkilerde duyarlı larvalara karsı %100 dayanıklılık elde etmiĢlerdir.
Chen vd. (2005), cry2A genini çeltiğe Agrobacterium aracılığıyla aktarmıĢlardır. Yapılan PCR analizinde 102 adet tek bitkiden 71 tanesinin cry2A genini içerdiğini belirlemiĢler.
Transgenik bitkilerde cry2A protein miktarı 9.65 – 12.11 μg/g arasında değiĢim göstermiĢtir.
Transgenik bitkilerin Lepidoptera takımına ait çeltik zararlılarına karĢı önemli ölçüde koruma sağladığını gözlemiĢlerdir.
Sanyal vd. (2005), nohutta yaptıkları çalıĢmasında Cry1Ac geninin kullanarak A.
tumefaciens ile böceklere dayanıklı transgenik bitkiler elde etmeye çalıĢmıĢlardır.
Transformasyon frekansını %1.12 olarak belirlemiĢler. T0 ve T1 bitkilerinde cry1Ac protein miktarı 14.5-23.5 27 ng/mg olarak belirlemiĢler. 10 ng/mg‟dan daha yüksek ekspresyon seviyelerinde Helicoverpa armigera‟ya karsı yüksek oranlarda koruma sağlamıĢlardır.
Zaidi vd. (2005), yaptıkları çalıĢmalarında Tütünde ST-LS1 (sap ve yaprak spesifik) promotorunun cry2Aa2 geninin değiĢik dokulardaki ekspresyon seviyesi ile Heliothis virescens larvalarına karsı etkisini araĢtırmıĢlardır. Toplamda 30 adet kanamisine dayanıklı bitki elde etmiĢler bunun 27 tanesinin PCR sonuçları pozitif bulunmuĢtur. Bioassay sonuçlarında ise yaprakla beslenen larvalarda ölüm oranı % 100, sapla beslenenlerde sırasıyla %41, 44, 35 ve 22, kökte ise %1-5 ölmüĢtür. YeĢil dokularda belirlenen bu değiĢik protein oranlarının bitkiye zarar veren böceklerin devamlı toksine mahzur kalma durumunda kazanacakları dayanıklılığa karĢı engel oluĢturabileceğini bildirmiĢlerdir.
Bakhsh‟a (2010) göre A. tumefaciens aracılığıyla NIAB-846 çeĢidinin olgun embriyolarının sürgün ucu meristemlerine cry1Ac genini aktarmıĢtır. Transformasyon için Rbcs promotör ve cry1Ac genini içeren pRb-Ac ve 35S promotör ve cry1Ac genini içeren pk2Ac plazmidlerini taĢıyan LBA4404 bakteri hattı kullanılmıĢ. Sürgün ucu meristemleri ko- kültivasyon ortamına alındıktan sonra sürgün oluĢturma ve köklendirme ortamlarına alınmıĢtır. Daha sonra toprağa alınan aday transgenik bitkiler GUS, PCR, ELĠSA ve Southern Blot analizleri ile transgenik bitkiler doğrulanmıĢtır. Sonuçlar cry1Ac geninin bitkilerin genomuna entegre olduğunu göstermiĢtir.
Chuan vd. (2012), Agrotis ypsilon böceğine karĢı tütün bitkisinin genetik transformasyon yöntemiyle dirençli hale getirilmesi çalıĢması yapılmıĢ. Önce cry2Ab4 geni ve Vip3Aa11 geninin, Bacillus thuringiensis'den klonlanmıĢtır. Sonrasında iki bitki ifade vektörleri pCS2Ab ve pCSvip3A içerisine cry2Ab4 ve Vip3Aa11 genlerini aktarımı yapılarak Agrobakterium tumefaciens aracılığıyla tütün (Nicotiana tabacum L.) içine transfer edilmiĢtir. OluĢturulan transgenik bitkiler 32 ile 35 arasında pozitif aktivite gösterdiği belirlenmiĢ ve sonuçlar PCR, RT-PCR ve Western blot analiz yöntemleriyle doğrulamıĢlar.
ÇalıĢma sonucunda Agrotis ypsilon larvalarına karĢı dirençlilik %82 oranında öldürücü etki yaptığı tarla ve yaprak analizlerinde gözlemlemiĢlerdir. Ayrıca Vip3Aa11 geninin cry2Ab4 genine göre daha etkin olduğunu belirlemiĢlerdir.
Sohail vd. (2012), böceklere dayanıklı tütün bitkisi elde etmek için yapılan çalıĢmada, cry1Ac ve cry2Ab iki tanesinin aynı zamanda aktarılması yapılmak için tütün bitkisinde denemeler yapılmıĢ olup bitki ekspiresyon vektörü kullanılarak tütün bitkisine aktarılmıĢtır.
Bu bitkilerden 58 tanesinde gen aktarımında baĢarı sağlanmıĢ olup PCR yöntemiyle de genlerin aktarımı doğrulanmıĢ. Toplam RNA izole edilip çoğaltılmıĢtır. Daha sonrasında yapraklar üzerine Helicoverpa armigera ve Spodoptera exigua larvaları konularak 24 saat sonra S. exigua larvasında %12 H. armigera larvasında ise %62 oranın dirençlilik göstermiĢlerdir.
Yüceer‟e (2012) göre cry1Ac genin taĢıyan EHA101 Pcambıa 1301 A. tumefaciens hattı ile yapmıĢ olduğu çalıĢmasında, Marfona ve Granola patates çeĢitlerinin yaprak ve boğum arası eksplantlarını kullanarak transgenik patates bitkileri elde etmiĢtir. Transgenik bitkiler PCR ile doğrulanmıĢ olup, yapılan böcek biyotestlerinde transgenik bitkiler üzerinde beslenen patates böceği larvalarında % 80-85 oranında ölüm oluĢturduğunu belirtmiĢtir.
Negawo vd. (2013), B. thuringiensis ‘ den izole edilen cry1Ac geni bezelyeye gen aktarım çalıĢması yapılmıĢ olup bitkinin bir sonraki jenerasyonunda (T1) analiz edilmiĢ ve PCR, Southern blot, RT-PCR ve protein analiziyle tespit edilmiĢtir. tobacco budworm tütün kurduna karĢı yapılan yaprak denemelerinde %85 oranında transgenik bezelye bitkisinin direnç gösterdiği belirlenmiĢtir.
BÖLÜM III
MATERYAL VE METOT
3.1 Materyal
3.1.1 Bitki materyali
ÇalıĢmada Basma ve Nail tütün hatları bitki materyali olarak kullanılmıĢtır. Deneme materyali olarak kullanılan hatlar Samsun il tarım müdürlüğünden temin edilmiĢtir. Basma ve Nail hatları yüksek verime sahiptirler ve tütün üretim bölgelerinde ticari olarak yetiĢtirilmektedirler; ancak her ikisi böcek saldırılarına karĢı hassastırlardır.
3.1.2 Bakteri materyali
Bakteri materyali olarak pK2AC plazmidini taĢıyan Agrobacterium tumefaciens‟in LBA4404 hattı kullanılmıĢtır. pK2AC plazmidi, iki böcek öldürücü gen cry1Ac ve cry2a ile GUS-INT genini içermektedir. Böcek öldürücü genlerin ikisi de iki kat artırılmıĢ 35S promotör ve nos terminatör tarafından yönetilmektedir (Bakhsh vd. 2009b; ġekil 3.1).
Ayrıca plazmid de bitki besin ortamında seçilmesi amacıyla kanamisine dayanıklılığı sağlayan neomisin fosfotransferaz II (npt-II) ) geni ve bitkide solüsyon yardımıyla mavi renk oluĢturan GUS (β-glukuronidaz) genide bulunmaktadır. Agrobacterium‟da ifadesini engellemek için GUS geninin kodlama bölgesine bitkisel bir intron yerleĢtirilmiĢtir.
Şekil 3.1. pK2AC plazmidinin T-DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A gösteren bölgelerin Ģematik görüntüleri. Ayrıca bitki seçmek için kanamisin geni olan nptII
kullanılmıĢtır
3.2 Metot
3.2.1 Besin ortamı ve doku kültürü koşulları
ÇalıĢmalarda %3 sakkaroz içeren ve %0,7‟lik agar ile katılaĢtırılan MS mineral tuz ve vitaminleri (Murashige ve Skoog 1962; Çizelge 3,1) temel besin ortamı olarak kullanılmıĢtır. Ortamların hazırlığında distile su kullanılmıĢ, duruma göre besin ortamlarına farklı konsantrasyonlar da bitki büyüme düzenleyicileri (BAP, NAA) ilave edilmiĢtir. Besin ortamlarının pH‟sı 1 N NaOH ya da 1 N HCl kullanılarak 5.6-5.8‟e ayarlandıktan sonra, 1.2 atmosfer basınç altında ve 121 °C‟de 20 dk otoklavda tutularak steril edilmiĢtir. Tüm kültürler beyaz floresan ıĢık altında 16 saat ıĢık ve 8 saat karanlık olacak Ģekilde fotoperiyot uygulanıp 24 ± 2 °C‟de tutulmuĢtur. Yüzey sterilizasyonu ve tüm doku kültürü iĢlemleri steril kabin içinde yürütülmüĢtür. Kapların, metal ekipman (bistüri, pens ve makas), cam petri, saf su ve ortamın sterilizasyonunda 1.2 atmosfer, 121°C ve 20 dakikaya ayarlı otoklav kullanılmıĢtır.
Çizelge 3.1. MS ortamında bulunan besin maddeleri ve miktarları (Murashige ve Skoog 1962)
Besin Maddeleri Miktarı (mg/l)
Makro besin elementleri NH4NO3 1650,00
KNO3 1900,00
CaCl2.2H2O 440,00
MgSO4.7H2O 370,00
KH2PO4 170,00
Mikro besin elementleri KI 0,83
H3BO3 6,20
MnSO4.4H2O 22,30
ZnSO4.7 H2O 8,60
Na2MoO4.2 H2O 0,25
CuSO4.5 H2O 0,025
CoCl2.6 H2O 0,025
FeSO4.7 H2O 27,80
Na2EDTA.2 H2O 37,30
Vitaminler Inositol 100,00
Nicotinik Asit 0,50
Pyridoksin-HCl 0,50
Thiamin-HCl 0,10
Glisin 2,00
3.2.2 Tohum yüzey sterilizasyonu
Her iki tütün hattına ait tohumlar % 2 Tween 20 içeren % 30 çamaĢır suyu (%5 sodyum hipoklorit içeren çözeltisi) ile 10-15 dk çalkalanarak yüzey sterilizasyonları yapılmıĢtır.
Sterilize edilmiĢ tohumlar, steril saf su ile 5-7 defa durulanmıĢtır. Tohumlar kurutulmuĢ, ardından katılaĢtırılmıĢ ½ MS ortamında kültüre alınmıĢtır. Bu tohumların çimlenmesi sonucu oluĢan bitkilerin yaprakları gen transferinde eksplant olarak kullanılmıĢtır.
3.2.3 Agrobacterium kültürlerinin büyütülmesi
ÇalıĢmada kullanılan A. tumefaciens LBA4404 hatları -80°C‟de muhafaza edilen gliserol stoklardan alınarak 10 ml‟lik steril tüplerde, sıvı LB (Lysogeny broth) besin ortamında, 28°C‟de, çalkalamalı inkübatörde 200 rpm‟de bir gece boyunca büyütülmüĢtür. Büyüyen bakteri kültürleri örnekler alınarak petri kapları içerisinde seçici antibiyotikleri içeren katı LB besin ortamına yayılarak, petri kapları ters çevrilmek suretiyle 2 gün süreyle 28°C‟de geliĢmeye bırakılmıĢtır. Katı besin ortamlarında geliĢen bakteri kültürleri 2 ay boyunca +4°C‟de muhafaza altına alınarak, ihtiyaç durumunda kullanılmıĢtır. Tütüne gen aktarımında kullanılmak üzere katı besin ortamında geliĢen bakteriler, içerisinde seçici antibiyotik olarak 20 µl rifampisin ve 10 µl kanamisin içeren 10 ml‟lik sıvı LB besin ortamında, 50 ml‟lik steril tüplerde, 28 °C‟de ve 200 rpm devirde çalkalamalı inkübatörde bir gece boyunca tekrar büyütülerek, gen aktarımında kullanılmıĢtır (ġekil 3.2). Seçici antibiyotikler steril stok solüsyonlardan alınıp kullanıldıktan sonra -20°C‟de muhafaza edilmiĢtir.
Şekil 3.2. Agrobacterium tumefaciens ‟in LBA4404, pK2AC plazmidinin T-DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A genleri içeren bakterilerin LB ortamında çoğaltılması, (a) LB besin ortamında çizilmiĢ bakterilerden steril pipet ucuyla tek koloni
alınması ve rifampisin ve kanamisin antibiyotiklerinin ilave edilmesi. (b) bir gece inkübatörde çoğaltılmaya hazır bakteri. (c) bir gece sonra çoğaltılmıĢ bakteri
e
d
a b
c
f
3.2.4 Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla tütüne gen aktarımı
Gen aktarımında, in vitro kültürde 4-6 hafta büyütülen steril Basma ve Nail tütün çeĢitlerine ait fidelerinden alınan yaprak eksplantları kullanılmıĢtır. Tütüne gen aktarımı aĢağıdaki gibi yapılmıĢtır (ġekil 3.3).
1. pK2AC vektörlerini içeren A. tumefaciens LBA4404 hattı, 50 mg/l rifampisin ve 50 mg/l kanamisin ihtiva eden 10 ml LB sıvı besin ortamı içerisinde bir gece boyunca büyütülmüĢtür.
2. Ġnokülasyon için sıvı LB besin ortamı, ko-kültivasyon için katı MS bitki besin ortamı ve tütün seleksiyon için MSD4X2 ortamı (1 mg/l BAP, 0.1 mg/l NAA) + 30 g/l sakkaroz + geniĢ spektrumlu Duocid (Pfizer Ġstanbul - A. tumefaciens‟in geliĢimini engellemek amacıyla) + kanamisin (gen aktarımı yapılan bitki seleksiyon için) kullanılmıĢtır.
3. Steril ortamda geliĢen Basma ve Nail tütün çeĢitlerinin uygun büyüklükteki yaprakları steril kabin içerisinde ortalama; 0.5 cm çapında kesilerek her 35 adet yaprak eksplantlar üzerine 2 ml cry1Ac ve cry2A genleri içeren A. tumefaciens LBA4404 hattına ait sıvı bakteri süspansiyon eklenerek 30 dk süreyle ara ara hafif çalkalanarak inokülasyon yapılmıĢtır.
4. Ġnoküle edilen eksplantlar daha sonra katı ko-kültivasyon ortamına aktarılarak 3 gün boyunca büyütme kabininde ko-kültivasyona tabi tutulmuĢtur.
5. Üç gün sonra eksplantların steril kabin içerisinde steril saf su ve 500 mg/l duocid kullanılarak 10 dk yıkama iĢlemi yapılarak steril kağıt üzerinde kuruması sağlanmıĢtır. Yıkama iĢlemi eksplantların kenarındaki bütün bakterileri ortamdan uzaklaĢtırmak için yapılmıĢtır
6. Daha sonra eksplantları seleksiyon ortamına her bir petri kabında 10 adet eksplant olacak Ģekilde 3 tekerürlü olarak yapılarak büyütme kabininde tutulmuĢtur.
7. YaklaĢık 6 hafta sonra yaprak eksplantları üzerinde hem kanamisine dayanıklı kallus sayımı hemde kanamisine dayanıklı sürgün sayımı yapılmıĢtır.
8. GeliĢen transgenik aday sürgünleri daha sonra 100 mg/l kanamisin ve 500 mg/l duocid içeren MS besin ortamında köklendirilmiĢtir.
9. KöklendirilmiĢ sürgünler (10-15cm) dıĢ ortama alıĢtırmak amacıyla 3:1 oranında torf ve perlit içeren saksılara ĢaĢırtılarak sera ortama aktarılmıĢtır.
10. Sera ortamda geliĢtirilmiĢ bitkilerden yaprak örnekleri alınarak histokimyasal GUS analizi, PCR analizi, ELĠSA testi ve yaprak biyoanalizi ile teyit edilmiĢtir
Şekil 3.3. Tütün bitkisine Agrobacterium tumefacien‟in LBA4404 pK2AC plazmidinin T- DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A genleri içeren hattıyla gen aktarım çalıĢmaların aĢama aĢama görünümü (a, b) steril ortamda yapsak disk eksplantların
elde edimesi ve (c, d) LB ortamnda agro inokülasyonu (e, f) 30 dk sonra 3 günlük ko- kültüvasyon ortamına alınması (g, h) fazla geliĢmiĢ bakterilerin steril su ve antibiyotikle
yıkanması ve ardından kurutulması g h
e f
c d
a b
3.2.5 Histokimyasal GUS analizi
pK2AC plazmidinin T-DNA bölgesi GUS genini içeriyor olması nedeniyle, transgenlerin erken dönemde taranması nispeten kolay olmaktadır. Gen aktarım çalıĢmalarında sonra, yaprak disklerinde histokimyasal GUS analiz yapılmıĢtır.
Etki mekanizması, X-gluc (5-Brom-4-klor-3-indolyl glucoronide)‟ın β-glukoronidaz enzimi tarafından hidrolizi sonucu renksiz indoksil türevinin oksidatif dimerizasyonu vasıtasıyla güçlü çivit (indigo, mavi) rengi oluĢturmasıdır. Histokimyasal gen analizi Jefferson (1987)‟ın tarif ettikleri Ģekilde yapılmıĢtır. X-Gluc solüsyonu için Çizelge 3.2‟de gerekli kimyasallar verilmiĢtir.
Çizelge 3.2. X-Gluc solüsyonu hazırlamak için kullanılan kimyasal ve miktarları
Kimyasallar Miktar
X-Gluc
(5-Brom-4-klor-3-indolyl glucoronide) 1 mM
NaHPO4 (pH 7.0) 100 mM
Triton X-100 % 0.1
EDTA 10 mM
Methanol % 50
Kloramfenikol 100 g/ml
X-Gluc solüsyonu hazırlandıktan sonra yaprak disk eksplantları solüsyon içerisine daldırılarak 38 °C‟de 1-12 saat inkübe edilmiĢ meydana gelen mavi renk değiĢimi gözlenmiĢtir. Sonrasında muamele edilmiĢ yaprakları çözelti ortamından uzaklaĢtırılıp
%95‟lik etanol içerisinde 24 saat bekletildikten sonra GUS gen ekspresyonu belirlenmiĢtir.
3.2.6 Polimeraz zincir reaksiyonu
DNA izolasyonu
Transgenik aday bitkilerdengenç yaprak örnekleri alınmıĢ olup, -80°C‟de muhafaza edilmiĢtir. Bu yaprak dokularından DNA izolasyonu, NucleoSpin Plant II ticari kiti yardımıyla sağlayıcı firmanın kiti ile protokolü doğrultusunda yapılmıĢtır.
Primer dizileri
Transgenik tütün bitkilerini belirlemek amacıyla npt-II, cry1Ac ve cry2A gen dizileri PCR ile çoğaltılmıĢtır. Çizelge 3.3.‟te transgenik tütün bitkileri belirlemek amacıyla npt-II, cry1Ac ve cry2a genlerinin çoğaltımında kullanılan primer dizileri görülmektedir.
Çizelge 3.3. Tütünün Basma ve Nail hatlarına ait aday transgenik bitkilerin teyit edilmesinde kullanılan gen bölge, kullanılan primer baz dizileri, gen bölge uzunlukları ile
primerlerin bağlanma sıcaklıkları
Gen
bölgesi Primer baz dizini
Çoğaltılan gen bölgesi uzunluğu
(bç)
Primerlerin bağlanma
sıcaklığı npt-II
5‟-TTG CTC CTG CCG AGA AAG-3‟
5‟-GAA GGC GAT AGA AGG CGA-3‟ 780 58
cry1Ac
5‟-ATGGACAACCCAAACATC-3‟
5‟-TCATGTCGTTGAATTGAATACG-3‟ 690 58
cry2A
5‟-AGATTACCCCAGTTCCAGAT-3‟
5‟-GTTCCCGAAGGACTTTCTAT-3‟ 600 58
PCR reaksiyon koĢulları ve analizi
Tütün bitkisinden izole edilen DNA örnekleri npt-II, cry1Ac ve cry2a genlerinin varlığı açısından PCR analizleri ile test edilmiĢtir. Amplifikasyon reaksiyonu için gen spesifik primerler kullanılmıĢtır. Reaksiyon karıĢımı, 2 μl 1X PCR tamponu (50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2 ve 10 mM Tris-HCI ), 0.2 μl dNTP (200 µM), 1 μl ileri primer (50 pmol/ul), 1 μl geri primer (50 pmol/ul), 0.1 μl Taq DNA Polimeraz (10 µM), 1 μl genomik DNA (50 ng/ul) ve 14.7 μl ddH2O kullanılarak 20 μl toplam hacimde olacak Ģekilde 0.2 ml‟lik santrifüj tüplerinde hazırlanmıĢtır.
Örneklerin agaroz jel elekroforezi
PCR sonuçları, %1 agaroz jel ve 0.5X TBE (Tris- borat EDTA) tamponu kullanarak jel elektroforez yöntemiyle analiz edilmiĢtir. Buna göre %1‟lik agaroz 0.5X TBE çözeltisi içerisinde mikrodalga fırında eritilmiĢ ve 50-60°C ye kadar soğutulduktan sonra DNA‟nın UV‟de görüntülenebilmesi için 4 μl etüdyum bromit eklenmiĢtir. Sonrasında iki tarafı bant ile kapatılmıĢ, taraklı jel kalıbına dökülmüĢtür. Agaroz katılaĢtıktan sonra bantlar ve tarak çıkartılmıĢ, jel kabı 0.5X TBE tamponu içeren elektroforez tankına yerleĢtirilmiĢtir. PCR sonucu elde edilen örnekler üzerine 2 μl yükleme tamponu eklenmiĢ ve karıĢım kuyulara
yüklenerek 6,7V/cm gerilimde, 45 dk koĢturulmuĢtur. Elektroforez iĢlemi sonlandırıldıktan sonra jel UV lambası üzerinde kontrol edilerek fotoğraflanmıĢtır.
3.2.7 ELİSA testi ile cry1Ac genin ekspresyon analizi
Aday transgenik tütün bitkilerinde cry1Ac geninin ifadesini yaprak örneklerinde belirlenmesi için Envirologix (Cat # AP051) kiti kullanılarak ELĠSA testi yapılmıĢtır.
ELĠSA testi için 20 mg taze yaprak örneğine 200 µl ekstraksiyon tamponu ilave edilerek ELĠSA kitinde tarif edildiği Ģekilde ölçümler yapılmıĢtır. OD450 değeri ayarlandıktan sonra ELĠSA okuyucusu ile cry1A’nin protein miktarı hesaplanmıĢtır.
3.2.8 Yaprak biyoanalizi
Transgenik tütün bitkilerdeki böcek öldürücü genlerin toksit potansiyelini belirlemek için laboratuvarda böcek biyoanalizi yapılmıĢtır. Hedef böceklere karĢı dayanıklılık sergileyen aday bitkileri belirlemek için önceden aç olan 2. instar safhasındaki patates güvesi (Phthorimaea operculella) larvaları aday transgenik tütün bitkilerinin yaprakları ile beslenmiĢtir. Kontrol amacıyla transgenik olmayan tütün yapraklarınada kullanılmıĢtır.
Larva sayısı az olduğu için bir kez yapılımıĢtır ve bir yaprak için bir larva kullanılmıĢtır.
Larvaların ölüm oranları 48 saat sonra kaydedilmiĢtir.
3.2.9 T1 bitkilerinde tohumların çimlendirilmesi
Aday transgenik tütün bitkilerin sera ortamında büyütülerek oluĢturduğu çiçeklerin kendi polen ve yumurtasıyla döllenmesi (kendilenmesi) sonucu tohum oluĢturmuĢtur. KendilenmiĢ transgenik bitkilerin tohumları, %2 Tween 20 den %30 çamaĢır suyu (%5 sodyum hipoklorit içeren çözeltisi) ile 10-15 dk yüzey sterilizasyonuna tabi tutulmuĢtur. Sonrasında tohumlar steril saf su ile 5-7 defa durulanmıĢtır.
Bu çalıĢmada kullanılan LBA4404 pK2AC plazmidinin T-DNA bölgesi içindeki 35ScaMV altında cry1Ac ve cry2A genleri ve nptII geni bulunmaktadır. Bitki besin ortamında seçilimi mümkün olduğu için (nptII) kanamisin dirençlilik geninin olup olmadığı test edilmiĢtir.
Toplam 20 adet Nail ve Basma aday transgenik hatlar kullanılarak 100 mg/l kanamisin içeren MS besi ortamı hazırlanmıĢ ve her hattan 50‟Ģer adet steril tohum kanamisin içeren seçici ortama 3 tekrarlı olarak ekilmiĢtir. Petri kapları iklim odasında/ kabininde 24 °C altında büyümeye bırakılmıĢtır. 2 hafta sonra ekilen tohumlar çıkıĢ yapıp yapmadığına
bakılarak sonuçlar ki-kare testi ile değerlendirilmiĢtir. Ayrıca çıkıĢ yapan tohumlardan rastgele bir tohum seçilerek histokimyasal GUS analizi yapılmıĢtır.
3.2.10 Verilerin istatistiksel değerlendirilmesi
Rejenerasyon denemeleri 3 tekerrürlü olarak yapılmıĢ olup, her bir tekerrürde 10 eksplantın kültüre alındığı 100×10 mm‟lik petri kutuları kullanılmıĢtır. ÇalıĢmadan elde edilen veriler bilgisayarda “SPSS for Windows” ki kare programı ile analiz edilmiĢtir.
