ANTİMİKROBİYAL DİRENCİ BELİRLEMEDE FENOTİPİK YÖNTEMLER VEYA KLASİK YÖNTEMLER

(1)

ANTİMİKROBİYAL DİRENCİ BELİRLEMEDE FENOTİPİK YÖNTEMLER VEYA KLASİK YÖNTEMLER

Dolunay GÜLMEZ

Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, ANKARA dolunayglm@gmail.com

ÖZET

Antimikrobiyal duyarlılık testleri ile tedavi için seçilen ilacın etkisinin doğru değerlendirilebilmesi ve etkisiz tedavilerin azaltılması amaçlanmaktadır. Fenotipik yöntemler bunun için ilk aşama olmayı sürdürmektedirler. İstenen sonuçların elde edilebilmesi, her mikroorganizma ve antimikrobiyal ajan için standart yöntemlerin geliştirilmesine ve eşik değerlerin gelişti- rilmesine bağlıdır. Daha kısa sürede sonuç veren ve mikroorganizmanın üretilmesine ihtiyaç duymadan uygulanabilen testler için arayış sürmektedir.

Anahtar sözcükler: antimikrobiyal direnç testleri, CLSI, disk difüzyon yöntemi, EUCAST mikrodilüsyon yöntemi, mini- mum inhibitör konsantrasyon

SUMMARY

Phenotypic or Classical Methods for Detecting Antimicrobial Resistance

Antimicrobial susceptibility tests are used to assess the effects of the drug chosen for therapy properly and reduce inef- fective treatment. Phenotypic methods continue to be the first stage of resistance detection. To obtain desired results, standard methods for each microorganism-antimicrobial combination should be developed and breakpoints should be established. Search for methods that give results in a shorter time and that can be applied without the need to cultivate the microorganism is going on.

Keywords: antimicrobial resistance testing, CLSI, disk diffusion method, EUCAST microdilution method, minimum inhibi- tory concentration

ANKEM Derg 2014;28(Ek 2):221-228

Bulaşıcı hastalıkların kontrol altına alın- masında hastalık etkenlerinin ve bulaş yolları- nın tanımlanması, hijyen koşullarının iyileşmesi ve aşılama gibi koruyucu önlemlerin yaygınlaş- masının son derece önemli olduğu bilinmekte- dir. Yirminci yüzyılda antimikrobiyal ajanların kullanıma girmesi, infeksiyon hastalıklarında tedaviyi de mümkün kılmıştır. Ancak bu ilaçla- rın kullanıma girmesinden sonra gözlenen tedavi başarısızlıkları, ilaçların tüm mikroorganiz- malara karşı etkili olmadıklarını ve ilaca duyarlı mikroorganizmalarda zaman içinde direnç geli- şebildiğini ortaya koymuştur.

Antimikrobiyal duyarlılık testleri ile tedavi için seçilen ilacın etkisinin doğru değerlendi- rilebilmesi ve etkisiz tedavilerin azaltılması amaçlanmaktadır. Fenotipik testlerde, mikroorganizma ile ilaç standart koşullarda bir araya

getirilerek etkileşim ölçülmektedir. Bu sayede bir minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri veya inhibisyon zon çapı elde edilmektedir. Elde edilen sonuç, bir eşik değer ile karşılaş- tırılmakta ve tedavi başarısı tahmin edilmeye çalışılmaktadır.

Antimikrobiyal duyarlılık testleri ile elde edilen değerlerin tedavi başarısını belirlemede yardımcı olabilmesi için test sonuçları tekrarlanabilir olmalıdır. Bunu sağlamak için testteki tek değişkenin mikroorganizmanın kendisi olması ve diğer değişkenlerin standardize edilmesi gereklidir. Bu amaçla antimikrobiyal duyarlılık testlerinde kullanması önerilen besiyeri, inkü- basyon koşulları, antimikrobiyal miktarı ve mikroorganizma miktarı önceden belirlenmiş- tir(9,10,13,14,25). Ayrıca, sonuçların güvenilirliğinin sağlanması için rutin kalite kontrol önerileri de

(2)

bulunmaktadır^(12,26). Bu sayede elde edilen MİK değerleri veya inhibisyon zon çapları, mikroorganizma ve antimikrobiyal kombinasyonları için tek tek belirlenen klinik eşik değerler ile ka rşılaştırılabilmektedir^(12,24). Klinik eşik değerler;

mikroorganizma-ilaç kombinasyonu için bulu- nan in vitro MİK/zon çapı dağılımları, hayvan deneyleri ile elde edilen ilaç ile ilgili farmakoki- netik ve farmakodinamik veriler ve klinik çalış- malardaki tedavi başarısı ile MİK/zon çapı değerleri arasındaki korelasyonun değerlendi- rilmesi ile belirlenmektedir(27,28,39,44).

Antimikrobiyal duyarlılık testleri için standartların belirlenmesi ve elde edilen sonuç- lara göre tedavi başarısının tahmin edilebilmesi için farklı kurumlar uzun süredir çalışmaktadır.

İlk olarak 1972’de Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) National Committee for Clinical and Laboratory Standards (NCCLS, sonra Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) tara- fından standardizasyon önerileri yayınlan- mıştır⁽³⁾. Bu girişimi farklı ülkelere ait kurumlar takip etmiştir. Günümüzde Avustralya, Birleşik Krallık, Almanya, Danimarka, Hollanda, Fransa, İspanya, İsveç, İsviçre ve ABD’de ulusal standartlar ve bunların kliniğe yansıması üzerinde çalışan kurumlar ve/veya çalışma grupları bulunmaktadır⁽²⁹⁾. Ülkemizde de Türk Mikrobi- yoloji Cemiyeti bünyesinde 1994’te kurulan Antibiyotik Duyarlılık Testlerinin Standardi- zasyonu (ADTS) çalışma grubu bu işlevi üstlen- miştir. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ise European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) ve the European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) hima- yesinde, bu iki kurumun maddi desteğiyle 1997’de kurulmuş olup European Medicines Agency (EMA) ve ECDC için Avrupa çapında testlerin standardizasyonunu ve klinik klinik eşik değerlerinin belirlenmesini üstlenmiştir⁽²⁹⁾. Günümüzde CLSI ve EUCAST antimikrobiyal duyarlılık testleri üzerinde çalışan iki önde gelen ekibi barındırmakta ve karşılıklı etkileşim içinde çalışmalarına devam etmektedirler.

Antimikrobiyal ajan ile mikroorganizma- nın standart koşullarda bir araya getirilerek etkileşimin ölçülmesi, halen ilacın mikroorganizma üzerindeki etkisinin belirlenebilmesi için

ilk adımdır. Bir antimikrobiyal maddenin mik- roorganizmanın üremesini inhibe edebilen kon- santrasyonunun düşük olması, ilacın in vivo etkinliğine yönelik ilk kanıttır. Aynı şekilde bir mikroorganizma için MİK değerlerinde yüksel- me/inhibisyon zon çapında azalma gözlenmesi direnç gelişimine işaret etmektedir. Değişim klinik eşik değeri geçtiğinde mikroorganizma dirençli olarak tanımlanmaktadır. Değişimin ölçülebilmesi için çoğu mikroorganizma/antimikrobiyal için tanımlanmış standart testler bulunmaktadır. Agarda veya sıvı besiyerinde (tüpte veya mikroplakta) uygulanabilen dilüs- yon yöntemleri ile tekrarlanabilir MİK değerleri elde edilebilmektedir(7,9,15,16). Dilüsyon yöntemle- rinde belirli miktarda mikroorganizma, farklı dilüsyonlarda antimikrobiyal içeren agar veya sıvı besiyerine eklenmekte ve inkübasyon son- rasında üremeyi inhibe eden en düşük antimikrobiyal konsantrasyonu MİK olarak belirlenmektedir. Benzer şekilde, daha kolay uygulana- bilir bir yöntem olan disk difüzyon yöntemi ile de inhibisyon zon çapları elde edilebilmektedir^(5-

7,10,38). Bu yöntemde, belirli miktarda mikroorga-

nizma standart bir besiyeri yüzeyine yayılmakta ve belirli miktarda antimikrobiyal içeren bir disk besiyeri yüzeyine yerleştirilmekte ve inkü- be edilmektedir. Diskten uzaklaştıkça, besiyerine yayılan antimikrobiyal miktarı azalmaktadır.

Bu nedenle mikroorganizmanın inhibe olması için ne kadar az miktarda ilaç gerekli ise, inkü- basyon sonrasında oluşan inhibisyon zonu o kadar geniş olmaktadır. İnhibisyon zon çapları belirlenen eşik değerler ile karşılaştırılarak duyarlılık üzerine yorum yapılabilmekte ve gerekirse elde edilen inhibisyon zon çapı ile MİK arasındaki ilişki hesaplanabilmektedir.

Gradiyent MİK yöntemleri ise difüzyon yönte- mi ile MİK değeri elde edilmesine dayanan yön- temlerdir. Belirli miktarda mikroorganizma standart bir besiyeri yüzeyine yayılmakta ve alt ucundan üst ucun doğru artan miktarda antimikrobiyal içeren bir şerit besiyeri yüzeyine yerleştirilmektedir. İnkübasyon sonrasında, daha fazla miktarda antimikrobiyal içeren üst tarafı daha geniş olan, armut şeklinde bir inhibisyon zonu oluşmaktadır. Mikroorganizmanın şeridin hemen yanında üreyebildiği noktadaki antimikrobiyal derişimi MİK değerini vermekte-

(3)

dir. Gradiyent MİK yöntemleri için üretici firma- ların önerileri kullanılmaktadır. EUCAST, makro gradiyent yöntemleri olarak tanımlanan yüksek inokulum miktarı (2 MacFarland) kullanılarak zengin besiyerinde uygulanan gradiyent yön- temleri ile direnç taraması yapılabileceğini belirtmiş ancak, elde edilen değerin MİK değeri olmadığının altını çizmiştir⁽²³⁾.

Her ne kadar MİK/zon çapı değerlerinin belirlenmesi antimikrobiyal ajanın mikroorga- nizmaya etkisinin belirlenmesine yönelik ilk aşama olsa da bazı durumlarda direncin ortaya çıkarılmasında yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle olası direnç mekanizmalarının saptanmasına yönelik bazı testler geliştirilmiştir ve belirli durumlarda MİK/zon çapı değeri ne olursa olsun, ilgili direnç mekanizmasının saptanması durumunda mikroorganizmanın dirençli olarak rapor edilmesi gerekmektedir.

Enterobacteriaceae’da genişlemiş spekt- rumlu beta-laktamaz (GSBL) saptanması: 2010 yılında hem CLSI hem de EUCAST sefalosporin direnç eşik değerlerinde yapılan değişiklikler öncesinde GSBL doğrulama testi pozitif çıkan izolatlarda MİK/zon çapı sonuçlarına göre duyarlı görünen suşların dirençli olarak rapor edilmesi gerekmekteydi. Günümüzde geçerli olan eşik değerleri ile bu gereksinim ortadan kalkmış olmakla birlikte, epidemiyolojik verile- rin toplanabilmesi için GSBL testlerin yapılmaya devam edilmesi istenmektedir(11, 12, 23). Bunun için tarama ve doğrulama testleri önerilmektedir.

CLSI Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca ve Proteus mirabilis için öneri- lerde bulunmaktadır⁽¹²⁾. Tarama testinde bazı beta-laktamların MİK değerlerinde yükseklik gözlenirse (P.mirabilis dışındakiler için seftazi- dim, aztreonam, sefotaksim ve seftriakson ≥1 µg/ml, sefpodoksim ≥4 µg/ml; P.mirabilis için seftazidim, sefotaksim ve sefpodoksim ≥1 µg/

ml) doğrulama testi önerilmektedir. Tarama disk difüzyon ile de yapılabilmekte, birden fazla ajan ile tarama yapıldığında duyarlılığın arttığı belir- tilmektedir. Doğrulama testlerinde sefotaksim VE seftazidim disk zon çapı değerleri, bu antibi- yotiklerin klavulanik asitle birlikte bulunduğu disk zon çapları ile karşılaştırılmakta ve ≥5 mm fark olması durumunda GSBL pozitif olarak değerlendirilmektedir. Aynı şekilde sefotaksim

VE seftazidim MİK değerleri ile klavulanik asitli formlarının MİK değerleri arasında ≥3 dilüs- yon fark olması da GSBL pozitifliğine işaret etmektedir^(12,23). EUCAST ise, tarama için sefotaksim veya seftriakson VE seftazidim veya tek başına sefpodoksim MİK/zon çapı değerlerinin kullanılmasını önermektedir⁽²³⁾. Ayrıca, CLSI’dan farklı olarak, doğrulama testlerinde Enterobac- teriaceae için iki grup belirlemiş, birinci grup (E.coli, Klebsiella spp., P.mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp.) için sefotaksim VE seftazidim ile klavulanik asitli formlarının test edilmesini;

birinci grupta sefoksitin MİK değeri >8mg/L ise veya doğrulama testi sonucu kesin değil ise ve indüklenebilir kromozomal AmpC içeren ikinci grup üyeleri için (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia stuartii, Serratia spp., Hafnia alvei) sefepim ve klavulanik asitli formunun değerlendirilmesini önermiş- tir⁽²³⁾. Test yöntemi olarak agar dilüsyon, mikro- dilüsyon, disk difüzyon, gradiyent MİK yön- temleri veya otomatize sistemler kullanılabil- mektedir. Doğrulama testi olarak kombinasyon disk testinin çift disk sinerji testine ve gradiyent MİK yöntemine göre daha başarılı olduğu belirtilmiştir⁽²³⁾.

Ek olarak AmpC varlığında GSBL’nin gös- terilebilmesi için sefotaksim VE seftazidim ile bunların klavulanik asit ile birlikte bir AmpC inhibitörü olan kloksasilin içeren formları kullanılabilmektedir⁽²³⁾. EUCAST sefoksitin MİK değeri>8mg/L olan E.coli, K.pneumoniae, P.mira- bilis, Salmonella spp, Shigella spp.’de indüklene- bilir AmpC tipi beta-laktamaz varlığının araştı- rılması için kloksasilin sinerjisine bakılabileceği- ni de bildirmiştir⁽²³⁾. E.coli ve Shigella’da AmpC kromozomal veya plazmide bağlı olabilmektedir ve bu test ile ayrım yapılamamaktadır.

Boronik asit ile sinerji de AmpC tespiti için kul- lanılabilmekte ama, sınıf A karbapenemazlarla da pozitif sonuç gözlenebildiğinden her zaman AmpC varlığını göstermemektedir⁽²³⁾.

Enterobacteriaceae’da karbapenemaz saptanması: Direnç mekanizmasının tespitine yönelik olan bu testler, GSBL testlerine benzer şekilde 2010 yılında CLSI ve EUCAST’ın karbapenem duyarlılık eşik değerlerinde yaptıkları değişiklik sonrasında yalnızca epidemiyolojik amaçla uygulanmakta ve MİK/zon çapı sonuç-

(4)

larına göre elde edilen sonuçların raporlanması- na etkileri bulunmamaktadır^(11,12,23). CLSI, Enterobacteriaceae’da karbapenemaz doğrula- ma testi olarak ertapenem veya meropenem diskleri ile yapılan Modifiye Hodge Testi’ni (MHT) önermektedir⁽¹²⁾. MHT testinin duyarlılı- ğı daha çok KPC üreten Amerika suşlarında yüksek olup NDM gibi farklı karbapenemazlar- da düşüktür⁽¹²⁾. Özgüllüğü de istenen düzeye çıkamamaktadır^(23,37,45). Ayrıca MHT’nin Proteus, Prevotella ve Morganella gibi karbapenemaz dışında bir mekanizma ile karbapenem MİK değeri artabilen cinslerde yararı bilinmemekte, nonfermenterlerde karbapenemaz tespitindeki yeri ile ilgili yeterli veri bulunmamaktadır⁽¹²⁾. EUCAST, karbapenem epidemiyolojik sınır değerlerinden yararlanarak yapılan bir tarama önermektedir. Meropenem MİK değeri >0.12 mg/L veye zonçapı <25 mm olduğunda ve fark- lı beta-laktamaz inhibitörleri ile olası mekaniz- manın tahmin edilebileceğini belirtmektedir (Tablo)⁽²³⁾. Bu testler ile bir gecelik inkübasyon sonrasında sonuç alınabildiğinden daha hızlı testlere ihtiyaç duyulmaktadır. “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry” (MALDITOF-MS) ile karbapenem hidrolizinin incelenmesi daha hızlı sonuç verebilmektedir^(23,31,33). MALDITOF-MS ile Enterobacteriaceae’da diğer beta-laktamazların belirlenmesi ve Enterobacteriaceae dışındaki bak- terilerde, örneğin Bacteroides fragilis’te, karbape- nemaz tespiti de araştırılmaktadır^(32,33). Daha kısa sürede sonuç alınabilmesi amacıyla pozitif sinyal veren kan kültürü şişelerine de uygulan- mıştır⁽⁴⁾. Renk değişimi esasına dayalı olan Carba NP testi ile en fazla iki saatlik inkübasyon son-

rasında karbapenemazların saptanması müm- kün olmaktadır^(21,23,40). Carba NP testi Pseudomonas için de kullanılabilmektedir^(20,21).

Stafilokoklarda beta-laktamaz varlığının saptanması: Stafilokoklarda nitrosefin testinde sarıdan kımızı/pembeye renk değişikliği (negatif testin penisilin diski ile doğrulanması gerekmektedir) veya 10 U’lik penisilin diski ile keskin zon saptanması beta-laktamaz varlığını göster- mekte ve bu suşlar penisilin, aminopenisilin, karboksipenisilin ve ureidopenisilinlere dirençli olarak rapor edilmektedir^(12,36).

Stafilokoklarda metisilin direncinin sap- tanması: Stafilokoklarda metisilin direnci, tüm beta-laktam ajanlara (seftarolin gibi MRSA’ya etkin sefalosporinler hariç) direncin göstergesi olarak kullanılmaktadır^(12,36). Ancak, fenotipik testlerde metisilin ve sonrasında onun yerine kullanılan oksasilinin yerini sefoksitin almaya başlamıştır. CLSI önerileri, Staphylococcus aureus ve Staphylococcus lugdunensis’te tarama için %4 NaCl ve 6µg/mL oksasilin içeren Mueller Hinton agar (MHA) kullanılabileceğini, mikrodilüsyon ile sefoksitin veya oksasilinin test edilebileceği- ni, disk difüzyon testinde ise yalnızca sefoksitin sonuçlarının güvenilir olduğunu belirtmektedir⁽¹²⁾. EUCAST’ın S.aureus için önerileri de benzerdir⁽²³⁾. Ayrıca oksasilin ve sefoksitinin birlikte test edildiği durumlarda, içlerinden birinin dirençli olarak yorumlanması durumunda sonu- cun metisilin dirençli olarak bildirilmesi gerekmektedir^(12,23). S.lugdunensis dışındaki koa- gülaz negatif stafilokoklar (KNS) için CLSI sefoksitin disk difüzyon veya oksasilin mikrodi- lüsyon testlerinden birini önermektedir⁽¹²⁾.

Yakın zamanda stafilokoklarda mecA geni

Tablo. Enterobacteriaceae’da fenotipik testler ile olası direnç mekanizmalarının tespiti⁽²³⁾.

Beta-laktamaz MBLKPC MBL+KPC² OXA-48 benzeri AmpC+porin kaybı ESBL+porin kaybı

DPA/EDTA +- Değişken

-- -

APBA/PBA +- Değişken

+- -

DPA+APBA -- +- --

CLX -- -- +-

Temosilin MİK>32 mg/L veya zon çapı <11 mm Değişken¹

Değişken¹ Değişken¹ DeğişkenEvet ¹ Hayır

Kısaltmalar: MBL: metallo-beta-laktamaz, KPC: Klebsiella pneumoniae karbapenemaz, DPA: dipikolinik asit, EDTA: etilendiamintetraasetik asit, APBA: aminofenil boronik asit, PBA: Fenil boronik asit, CLX: kloksasilin

1Temosilin duyarlılık testi yalnızca sinerji saptanmayan izolatlar için önerilmektedir.

2Birden fazla inhibitör içeren (DPA veya EDTA + APBA veya PBA) disk/tabletlerin kullanımı ile ilgili çalışmalar sınırlıdır. Bu kombinasyon karbapenemlere yüksek-düzey dirence neden olmaktadır ve Yunanistan dışında nadirdir.

10 µg meropenem diski ile zon çapında artış şeklinde sinerji gözlenen madde

(5)

ile % 70 benzerlik gösteren ve PBP2a benzeri bir penisilin bağlayan protein kodlayan mecC geni bulunmuş ve metisilin direncine neden olduğu gösterilmiştir^(2,23). Metisilin direncinin fenotipik olarak saptanmasında, hem mecA hem de mecC taşıyan suşlarda sefoksitinin oksasilinden daha güvenilir olduğu bildirilmiştir^(23,43).

S.aureus’ta glikopeptit direncinin saptan- ması: Stafilokoklarda vankomisin duyarlılık durumunun belirlenmesi için bir dilüsyon yön- temi kullanılması gerekmektedir⁽¹²⁾. Disk difüz- yon yöntemi S.aureus için duyarlı ve orta duyar- lı suşları, KNS için ise duyarlı, orta duyarlı ve dirençli suşları ayıramamaktadır. EUCAST, gli- kopeptit dirençli S.aureus (GRSA) tespitinde disk difüzyon testinin kullanılabileceğini ancak duyarlı ve orta duyarlı suşlar için mikrodilüs- yon, gradiyent MİK yöntemleri veya otomatize sistemler ile MİK belirlenmesi gerektiğini belirtmiştir⁽²³⁾. Ancak, gradiyent MİK yöntemleri ile belirlenen değer, standart mikrodilüsyon ile elde edilen değere göre 0.5-1 dilüsyon yüksek olabilmektedir^(23,41,42). CLSI, S.aureus’ta glikopep- tit direnci taraması için 6µg/mL vankomisin içeren beyin kalp infüzyon agar (BHIA) kullanı- labileceğini ve direncin doğrulanması için yine standart mikrodilüsyon yöntemlerine gerek ola- cağına işaret etmiştir⁽¹²⁾. Tarama için 5 mg/L teikoplanin içeren MHA öneren EUCAST, gradiyent testlerin de direnç saptamada yeri olduğu- nu belirtmiştir. EUCAST, GRSA ve glikopeptit orta duyarlı S.aureus (GISA) dışında heterojen glikopeptit orta duyarlı suşlar (hGISA) da bulunduğunu belirtmiş ve tedavi başarısızlığı şüphesinde hGISA aranmasını önermiştir⁽²³⁾. hGISA’nın doğrulanması için populasyon anali- zi profili-eğri altındaki alan (population analysis profile-area under curve, PAP-AUC) gerekmektedir.

Enterokoklarda glikopeptit direncinin saptanması: CLSI, enterokoklarda vankomisin direncinin saptanması için 30 µg vankomisin içeren disk kullanılabileceğini ancak, orta duyar- lı suşların bir dilüsyon yöntemi ile ayrıca test edilmesini önermektedir⁽¹²⁾. EUCAST ise 5 µg disk veya dilüsyon yöntemlerini önermektedir⁽²³⁾. Her iki kurum da inkübasyonun 24 saate tamam- lanmasının ve ince üremelerin gözden kaçırıl- mamasının önemine dikkati çekmiş, gerektiğin-

de tarama için 6 mg/L vankomisin içeren besiyeri (CLSI MHA, EUCAST ise BHIA) kullanıl- masını önermişlerdir^(12,23). EUCAST, buna ek olarak zon sınırlarının bulanık olduğu durumlarda da zon çapına bakılmaksızın suşun direnç- li rapor edilmesi gerektiğini belirtmiştir⁽²³⁾. Ayrıca, enterokoklarda, kromozomal direnç taşı- yan iki tür olan Enterococcus gallinarum ve Enterococcus casseliflavus için infeksiyon kontrol önlemleri gerekli olmadığından bu iki türün ayrımının yapılması da gerekmektedir^(12,23).

Streptococcus pneumoniae’da penisilin direncinin saptanması: Pnömokoklarda 1 µg oksasilin diski ile tarama yapıldığında penisilin duyarlılığı belirlenebilmekte ancak, zon çapı ≤19 mm ise MİK belirlenerek ayrım yapılması gerekmektedir^(12,23,36).

İndüklenebilir klindamisin direncinin saptanabilmesi için stafilokoklar, pnömokoklar ve beta-hemolitik streptokoklarda eritromisin diski ile klindamisin diski belirli bir uzaklıkta yerleştirilmekte ve klindamisin zonunda düz- leşme veya bulanıklık varlığında klindamisin dirençli olarak rapor edilmektedir^(12,36). Bu direnç, mikrodilüsyonda aynı kuyucuğa eritromisin ve klindamisin eklenerek de test edilebilmektedir⁽¹²⁾.

CLSI, ayrıca stafilokoklarda mupirosin direncinin ve enterokoklarda yüksek düzey gen- tamisin ve streptomisin direncinin belirlenebilmesi için de mikrodilüsyon ve disk difüzyon yöntemi önerilerinde bulunmaktadır⁽¹²⁾.

Fenotipik antimikrobiyal duyarlılık testlerinde standart olarak önerilen yöntemlerin çok zaman almaları nedeniyle daha kısa sürede sonuç verebilen yöntem arayışları sürmektedir.

Bakteri üremesi ile renk değiştiren ve disk difüz- yon ve gradiyent MİK yöntemleri ile oluşan zonların 4-6 saatte okunmasına olanak veren Quicolor besiyeri bunlardan biridir^(19,22,34).

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında daha az sıklıkta karşılaştığımız bakteriler ve diğer mikroorganizmalar için de duyarlılık testleri standardize edilmeye çalışılmaktadır. CLSI, nadir izole edilen veya zor üreyen bakteriler, anaerop bakteriler, mikobakteri, Nocardia ve Actinomycetes, maya ve küfler için standartlar yayınlamıştır(5-8,15-17,29). Standartlara ek olarak daha hızlı sonuç veren ve maliyeti daha düşük yöntem arayışları devam etmektedir. Bunlara

(6)

örnek olarak mikobakterilerde kültür ve antimikrobiyal duyarlılık için kullanılabilen TK besiyeri ve mayalarda antifungal duyarlılık için geliştirilen Fungitest ve Sensititre YeastOne buna örnek verilebilir^(1,18,35). Bu yöntemler, üreme ile renk değişimi ilkesine göre geliştirilmişlerdir.

Fenotipik antimikrobiyal duyarlılık testlerinin standardizasyonunda oldukça yol alınmış olmasına karşın istenen sonuca her zaman kolay ulaşılamamaktadır. Örneğin katyonik bir antibiyotik olan kolistinin disk difüzyon yöntemi ile test edilmesinde sorunlar yaşanmış ve dilüsyon yöntemleri ile de sorunlar tam olarak çözüm- lenememiştir⁽³⁰⁾. Bu konuda çalışmalar devam etmektedir.

Fenotipik yöntemler antimikrobiyal duyar- lılığın belirlenmesinde ilk aşama olmayı sürdür- mektedirler. Testlerin değerlendirmesinin doğru yapılabilmesi her mikroorganizma ve antimikrobiyal ajan için standart yöntemlerin geliştiril- mesine, sonuçların yorumlanması için ise eşik değerlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu unutulmamalıdır. Daha kısa sürede sonuç veren ve mikroorganizmanın üretilmesine ihtiyaç duymadan uygulanabilen testler için arayış sürmek- tedir.

KAYNAKLAR

1. Altındiş M, Çetinkaya Z, Kalaycı R, Çiftçi İH, Arslan A, Aktepe OC. Detection of Mycobacterium isolates with different methods and their resistan- ce ratios against anti-tuberculosis drugs, J Microb Infect Dis 2011;1(1):5-9.

http://dx.doi.org/10.5799/ahinjs.02.2011.01.0002 2. Ballhausen B, Kriegeskorte A, Schleimer N, Peters

G, Becker K. The mecA homolog mecC confers resistance against beta-lactams in Staphylococcus aureus irrespective of the genetic strain backgro- und, Antimicrob Agents Chemother 2014.

http://dx.doi.org/10.1128/AAC.02731-13 3. Bartlett RC, Mazens-Sullivan M, Tetreault JZ,

Lobel S, Nivard J. Evolving approaches to mana- gement of quality in clinical microbiology, Clin Microbiol Rev 1994;7(1):55-88.

4. Carvalhaes CG, Cayo R, Visconde MF et al.

Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision, J Antimicrob Chemother 2014.

http://dx.doi.org/10.1093/jac/dku094

5. CLSI. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of nondermatophyte filamentous fungi; approved guideline. M51-A, baskı.

Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2010).

6. CLSI. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline- second edition. M44-A2, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2009).

7. CLSI. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline-second edition. M45-A2, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2010).

8. CLSI. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria; approved standard- eighth edition. M11-A8, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2012).

9. CLSI. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved atandard-ninth edition. M07-A9, baskı.

10. CLSI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard-eleventh edition. M02-A11, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2012).

11. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twentieth informational supplement. CLSI Document M100-S20., baskı.

12. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fourth informational supplement. CLSI Document M100-S24, baskı.

13. CLSI. Protocols for evaluating dehydrated Mueller-Hinton Agar; approved standard - second edition. M06-A2, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2006).

14. CLSI. Quality control for commercially prepared microbiological culture media; approved standard- third edition. M22-A3, baskı. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA (2004).

15. CLSI. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi;

approved standard-second edition. M38-A2, baskı.

(7)

16. CLSI. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standard-third edition, M27-A3, baskı. Clinical and LAboratory Standards Institute, Wayne, PA (2008).

17. CLSI. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and other aerobic Actinomycetes; approved standard-second edition. M24-A2, baskı.

18. Cuenca-Estrella M, Gomez-Lopez A, Mellado E, Rodriguez-Tudela JL. Correlation between the procedure for antifungal susceptibility testing for Candida spp. of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST) and four commercial techniques, Clin Microbiol Infect 2005;11(6):486-92.

http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-0691.2005.01166.x 19. Çiftçi IH, Aşık G, Er H, Karakeçe E. Rapid detecti-

on of resistance in Staphylococcus aureus by using Quicolor ES, World J Microbiol Biotechnol 2014;30(2):715-8.

http://dx.doi.org/10.1007/s11274-013-1474-2 20. Dortet L, Poirel L, Nordmann P. Rapid detection

of carbapenemase-producing Pseudomonas spp, J Clin Microbiol 2012;50(11):3773-6.

http://dx.doi.org/10.1128/JCM.01597-12

21. Dortet L, Poirel L, Nordmann P. Rapid identifica- tion of carbapenemase types in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. by using a biochemical test, Antimicrob Agents Chemother 2012;56(12):6437- 40.

http://dx.doi.org/10.1128/AAC.01395-12 22. Ercis S, Sancak B, Kocagoz T, Kocagoz S, Hascelik

G, Bolmstrom A. Rapid 4 to 6 hour detection of extended-spectrum beta-lactamases in a routine laboratory, Scand J Infect Dis 2007;39(9):781-5.

http://dx.doi.org/10.1080/00365540701367751 23. EUCAST. EUCAST guidelines for detection of resis-

tance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, www.eucast.org.Version 1.0 (2013).

24. EUCAST. http://www.eucast.org/clinical- breakpoints/. Erişim tarihi: 14.07.2013. (2013).

25. EUCAST. Media preparation for EUCAST disk diffusion testing and for determination of MIC values by the broth microdilution method, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, www.eucast.org.Version 3.0 (2013).

26. EUCAST. Routine internal quality control as recommended by EUCAST, European Committee

on Antimicrobial Susceptibility Testing, www.

eucast.org.Version 3.1 (2013).

27. EUCAST. Standard operating procedure:

Harmonization of breakpoints for existing antimicrobial agents, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Version 2.1 (2013).

28. EUCAST. Standard Operating Procedure: Setting breakpoints for new agents, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Version 1.1 (2013).

29. EUCAST. www.eucast.org. Erişim tarihi:

30.04.2014

30. Hindler JA, Humphries RM. Colistin MIC variabi- lity by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant Gram-negative bacilli, J Clin Microbiol 2013;51(6):1678-84.

31. Hrabak J, Studentova V, Walkova R et al. Detection of NDM-1, VIM-1, KPC, OXA-48, and OXA-162 carbapenemases by matrix-assisted laser desorpti- on ionization-time of flight mass spectrometry, J Clin Microbiol 2012;50(7):2441-3.

http://dx.doi.org/10.1128/JCM.01002-12 32. Johansson A, Nagy E, Soki J. Detection of carbape-

nemase activities of Bacteroides fragilis strains with matrix-assisted laser desorption ionization-- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), Anaerobe 2014;2649-52.

http://dx.doi.org/10.1016/j.anaerobe.2014.01.006 33. Jung JS, Popp C, Sparbier K, Lange C, Kostrzewa M, Schubert S. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid detection of beta-lactam resistance in Enterobacteriaceae derived from blood cultu- res, J Clin Microbiol 2014;52(3):924-30.

http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02691-13 34. Kocagoz S, Budak F, Gur D. Evaluation of a chro-

mogenic medium for rapid detection of extended spectrum beta-lactamase producing Salmonella spp., Indian J Med Res 2006;124(4):443-6.

35. Kocagoz T, Altin S, Turkyilmaz O et al. Efficiency of the TK Culture System in the diagnosis of tuber- culosis, Diagn Microbiol Infect Dis 2012;72(4):350-7.

http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2011.12.004 36. Leclercq R, Canton R, Brown DF et al. EUCAST

expert rules in antimicrobial susceptibility testing, Clin Microbiol Infect 2013;19(2):141-60.

http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-0691.2011.03703.x 37. Mathers AJ, Carroll J, Sifri CD, Hazen KC.

Modified Hodge test versus indirect carbapenemase test: prospective evaluation of a phenotypic assay for detection of Klebsiella pneumoniae car-

(8)

bapenemase (KPC) in Enterobacteriaceae, J Clin Microbiol 2013;51(4):1291-3.

38. Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G.

Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laborato- ries, Clin Microbiol Infect 2014;20(4):O255-66.

http://dx.doi.org/10.1111/1469-0691.12373 39. Mouton JW, Brown DF, Apfalter P et al. The role of

pharmacokinetics/pharmacodynamics in setting clinical MIC breakpoints: the EUCAST approach, Clin Microbiol Infect 2012;18(3):E37-45.

http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-0691.2011.03752.x 40. Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection

of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, Emerg Infect Dis 2012;18(9):1503-7.

http://dx.doi.org/10.3201/eid1809.120355 41. Rybak MJ, Vidaillac C, Sader HS et al. Evaluation

of vancomycin susceptibility testing for methicillin- resistant Staphylococcus aureus: comparison of Etest and three automated testing methods, J Clin Microbiol 2013;51(7):2077-81.

42. Sader HS, Jones RN, Rossi KL, Rybak MJ.

Occurrence of vancomycin-tolerant and heteroge- neous vancomycin-intermediate strains (hVISA) among Staphylococcus aureus causing bloodstre- am infections in nine USA hospitals, J Antimicrob Chemother 2009;64(5):1024-8.

http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkp319

43. Skov R, Larsen AR, Kearns A et al. Phenotypic detection of mecC-MRSA: cefoxitin is more reliab- le than oxacillin, J Antimicrob Chemother 2014;69(1):

133-5

http://dx.doi.org/10.1093/jac/dkt341

44. Turnidge J, Paterson DL. Setting and revising anti- bacterial susceptibility breakpoints, Clin Microbiol Rev 2007;20(3):391-408, table of contents.

http://dx.doi.org/10.1128/CMR.00047-06.

45. Wang P, Chen S, Guo Y et al. Occurrence of false positive results for the detection of carbapenemases in carbapenemase-negative Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates, PLoS One 2011;6(10):e26356.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0026356