MATERNAL PLAZMADAN SERBEST FETAL DNA ANALİZLERİ İLE
ANÖPLOİDİLERİN PRENATAL TANISI
Prof. Dr. Seher Başaran
İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi,
Tıbbi Genetik ABD
Live born infants in relation to maternal age in
Switzerland
BEVNAT, BFS KH Nicolaides, NJ Sebire, RJM Snijders
Trizomi 21
Trizomi 18
Trizomi 13
Turner s
Triploidi s
Turner s Trizomi 18 Trizomi 13 Triploidi s Trizomi 21
Fetal kromozom anomalilerinin prenatal tanısı
TARAMA Testleri;
1. USG; NT ve
diğer markerler
2. MS-Tarama Testleri;
• Üçlü test, Dörtlü test
• 11-14 hafta testi
• Bunların kombinasyonları 3. MS- fetal DNA/RNA
analizleri ile anöploidi -Kantitatif yöntemler-
TANI Testleri;
1. İnvaziv Girişim (AS,CVS, KS) sonrası
• fetal kromozom analizi
• FISH/QF-PCR (anöploidi)
• mikroarray/a-CGH
(2. Non-invaziv Yöntem
MS- fetal DNA/RNA analizleri
ile fetal cinsiyet ve paternal
mutasyonun araştırılması
- Kalitatif yöntemler-)
1. TTT ile DS Yakalama Oranı
1. TTT
>1:300 82%
1. TTT
<1:300 18%
NT ile DS Yakalama Oranı
NT ↑ 75%
NT normal 25%
> 35 yaş 30%
< 35 yaş 70%
İAY ile DS Yakalama Oranı ÜT ile DS Yakalama Oranı
ÜT riski
<1:250
40% ÜT riski
>1:250 60%
Tarama testleri ve duyarlılıkları
Tri 21 prevalansı 1:700 100 Tri 21 doğumu için 70 000 gebelik
Anne yaşı (>35)% 10 7 000 AS 30x Tri 21 70 DS’lu doğacak Üçlü test % 5 3 500 AS 60x Tri 21 40 DS’lu doğacak NT % 5 3 500 AS 75x Tri 21 25 DS’lu doğacak 1.Tri tarama % 5 3 500 AS >90x Tri 21 <10 DS’lu doğacak + USG
…… diğer biokimyasal ve ultrasonografik (burun kökü hipoplazisi, vd) parametrelerin kullanımı ile duyarlılık artmakta……
Amaç,
daha az girişim yaparak daha geniş bir populasyona
ulaşmak ve daha fazla anomali yakalamak.
Anne kan dolaşımında fetal hücreler (T21) 1:1 000 000
Anne beyninde fetal erkek hücreler
80’ler ve 90’lar anne dolaşımından
fetal hücre avı ile geçti….
Anne karaciğerinde fetal erkek hücreler
yıl 2012 ve
PLAZMADA EKSTRASELLÜLER DNA
- 1940 larda insanda plazmada ekstraselluler DNA bildirildi,
-1990 larda kanser hastalarının plazmalarından elde edilen serbest DNA da tümör kökenli genetik markerler saptandı,
-1997 de erkek çocuğa gebe olan kadınların plazmalarında fetusun Y
kromozomuna ait markerler gösterildi (Lo et al., 1997).
Maternal Plazmada Dolaşan Fetal DNA’nın Biyolojik Özellikleri
-Serbest dolaşımdaki fDNA’nın % 80’i <200 bp küçük parçalar halinde bulunur ve plazmadaki tüm DNA’nın % 3-10 unu oluşturur,
-Implantasyonu takip eden 18 inci günden itibaren maternal serumda saptanmaya başlanır ve
gebelik ilerledikçe miktarı artar,
-Gebelik bittikten sonra, yarı ömrü 16 dakikadır,
-Genel görüş, fDNA nın maternal plazmada kalıcı olmadığıdır; ancak bir yayın fetal DNA nın uzun süre (27 yıl) maternal kanda saptanabildiğini öngörmekte ve bu
durum bazı fetal hücrelerin maternal yapıda uzun yaşadığı ve plazma ayrıştırması esnasında tüm nükleuslu hücrelerin iyi uzaklaştırılamaması ile açıklanmaktadır,
-fDNA, ağırlıklı olarak plasenta kaynaklı olduğundan, plasentaya ait özellikleri (plasenta ile sınırlı mozaisizm, plasental epigenetik özellikler, vs) de
yansıtacaktır.
KLİNİK UYGULAMALAR
Maternal kandan alınan plazma örneğinde tüm hücre yapılarının uzaklaştırılması
DNA nın ekstraksiyonu
(Minör oranda fetal DNA+Major oranda maternal DNA)
Kalitatif Yöntemler;
Maternal ve fetal DNA polimorfizm/değişimlerini tanır
TANI
Kantitatif Yöntemler;
Normal ile karşılaştırma esasına göre tanır
TARAMA
www.nature.com/reviews/genetics
Kalitatif yöntemle PATERNAL mutasyonun fetusta TANISI;
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon
İncelenen tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Anne ye ait DNA fragmanları
Fetusa ait DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; ÖPLOİD FETUSTA BULGULAR
Kromozom
18 13 21 Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1
Başlangıçtaki DNA Havuzu
Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon
21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış Fetusa ait
DNA fragmanları Anne ye ait DNA fragmanları
Kantitatif Yöntem; ANÖPLOİD FETUSTA BULGULAR
Kromozom 18 13 21
Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu
Kromozom
18 13 21
1 : 1 : 1,1
Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States
Ashwin Agarwal, Lauren C. Sayres, Mildred K. Cho, Robert Cook-Deegan, and Subhashini Chandrasekharan
Prenatal Diagnosis 2013, 33, 521–531
Noninvasive prenatal testing for aneuploidy–ready for prime time?
Lyn S. Chitty, Melissa Hill, Helen White, David Wright, Stephen Morris, American Journal of Obstetrics & Gynecology, APRIL 2012
Firma Son yayın
Sequenom Palomaki, 2011 ve 2012
Verinata Bianchi, 2012
Ariosa
Norton, 2012 Nicolaides, 2012
Natera
Zimmermann, 2012 Nicolaides, 2013
BGI
Jiang, 2012 Test adı Materni21
Materni21plus
Verifi Harmony Panorama NIFTY
Teknik MP shotgun S MPSS DANSR- targeted
NGS -SNP based- targeted
MPSS
Hedef Anomaliler
21, 18, 13, X, Y Plus +DGS,5p-, 1p36 -, PW/AS
21, 18, 13, X, Y 21, 18, 13 X,Y
21, 18, 13, X, Y, triploidi
21, 18, 13, X, Y
Olgu sayısı 1971 532 3080 185 903
Duyarlılığı T21 %99,1 T18 >%99,9 T13 %91,7 X/Y %96,2
T21 %100
T18 %97,2 T13 %78,6 X, Y %93,8-100 T21 %100
T18 %97,4 T13 %80
T21 >%99 T18 >%99 T13 >%99 45,X %91,7 T21 %100
T18 %100
T13 %100
45,X %75
Yanlış negatif T21 3/212 T13 1/12 X/Y 25/26 T18 1/36 T13 3/14 XX 232/233 T21 0/81 T18 1/38 T13 2/10 45,X 1/12 45,X 1/4 Özgüllüğü T21 %99,9 T18 >%99,6 T13 %99,7 X/Y %99,7 T21 %100
T18 %100
T13 %100
X ,Y %99,6-100 T21 %99,97 T18 %99,93 T13 >%99 Tümü %100
T21 %100
T18 %99,7 T13 %100
Yanlış pozitif
T21, T18, T13 24/1688 ( %1,4)
T21, T18, T13
%0
T21 1/2888 T18 2/2888 T13 1/1939
0 T18 1/891
Cell Free Fetal DNA Uygulama Endikasyonları;
• İleri anne yaşı (>35)
• Fetal USG de anöploidi riskini arttıran bulgu varsa
• Trizomili gebelik öyküsü
• MS- tarama testlerinde trizomi için artmış risk
• 21 ve 13. kromozomlarının katıldığı Robertson tipi
translokasyon için taşıyıcı ebeveynlerin gebelikleri
1. Artmış anöploidi (21, 18, 13 için) riski taşıyan gebeliklerde cff-DNA test önerilebilir.
Bu teknolojinin <0,5% yanlış pozitiflik ile Down sendromlu fetusların ~ %98 ini yakalaması beklenmektedir.
2. cff-DNA testi rutin prenatal laboratuvar uygulamalarının bir parçası olmamalıdır, ancak test hasta seçimine bırakılmalıdır.
3. cff-DNA testi yeterli deneyim olmadığından düşük risk grubuna veya çoğul gebeliklere önerilmemelidir.
4. Ön danışmada, cff-DNA testinin tanı testi olmamasına rağmen yüksek
duyarlılıkta olduğu, sadece sık görülen 5 kromozom anöploidisine yönelik uygulandığı ve diğer genetik hastalıklar için bilgi vermeyeceği belirtilmelidir.
5. Test öncesi aile öyküsü alınmalı ve gebelikte prenatal tanısı mümkün diğer genetik hastalıklar için risk olup olmadığı belirlenmelidir.
6. Eğer fetal USG de anomali saptanırsa invaziv prenatal tanı önerilmelidir.
7. Negativ cff-DNA testi sağlıklı fetusun garantisi değildir.
8. Pozitiv cff-DNA test sonucu alındığında genetik danışmaya yönlendirilmeli ve konfirmasyon amacı ile invaziv prenatal tanı önerilmelidir.
9. cff-DNA testi, CVS veya amniosentezin tanısının güvenilirliğini ve doğruluğunu karşılayamaz .
İnvaziv yöntemlere göre endikasyon grublarında saptanan kromozom anomalileri ve % leri
cff-DNA testi ile yakalanabilir
anomaliler
n %
cff-DNA testi ile yakalanamayan anomaliler n %
Endikasyon grublarındaki rezidual risk
% CVS-ileri anne yaşı
335’de 15 anomali %4,5 12 66,8 3 33,2 %0,9 1:111
CVS- Tarama testi +
282’de 53 anomali %18,8 39 73,6 14 26,4 %5 1:20
CVS- Patolojik USG
824’de 244 anomali %29,6 199 81,6 45 18,4 %5,5 1:18
AS- ileri anne yaşı
10 430’da 233 anomali %2,2 135 57,9 98 42,1 %0,9 1:111
AS- Tarama testi +
6749’da 185 anomali %2,7 120 64,9 65 35,1 %1 1:100
AS- Patolojik USG
4442’de 378 anomali %8,5 298 78,8 80 21,2 %1,8 1:56
PRETAM+PREMED serilerinde ( 2 453 CVS ve 23 338 Amniosentez)
saptanan anomaliler içinde sık görülen 5 anöploidinin oranı ve cff-DNA testinin hassasiyeti %100 kabul edildiğinde hipotetik yakalama/yakalayama oranı
cff-DNA Testi Öncesi Genetik Danışma
Tarama testleri, “hedefe yönelik” testlerdir
cff-DNA testlerinin PPV ve NPV değeri?
Prenatal tanı = Down s. tanısı değildir
Testin (–) olmasının bir garanti olmadığı,
FN ve FP olasılıkları
testin saptayamadığı anomali olasılıkları (rezidual risk) anlatılmalı
Gebeye NIPD ve IPD farkları anlatılmalı
Ayrıca Türkiye özelinde;
Bugüne kadarki uygulamalar nasıl yürütüldü?
Genetik “danışma” veriliyor mu?
Sonuçlar nasıl ve bunlar kayıt altında mı?
cff-DNA testinin izlemde yeri nerededir?
Ekstra bir ücret ile yapılan bu testte
sorumluluk kimde?
Cinsiyet tanısının kötüye kullanımı nasıl
kontrol edilecek?
Genetik materyalin topluca yurtdışına
gönderilmesi için Sağlık Bakanlığının izni gerek
bu konuların tartışılması gerekmiyor mu?
Sorular;
1. Down sendromu için “tanı” mı yoksa tarama mı?
2. Tarama testi + ise, NIPD invaziv prenatal tanının yerini alabilir mi?
3. Fetal kromozom analizinde (CVS ve AS) saptanan diğer anöploidileri saptayabilir mi?
4. FISH veya mikroarray teknikleri ile saptanan mikrodelesyon/duplikasyon sendromları?
5. Klasik tarama testlerinin yerini alır mı? Evet ise biokimyasal ve USG nin konjenital malformasyonların erken gebeliklerdeki potansiyel faydalarını kaybeder miyiz?
Cevaplar;
1. Tanı testi , %100 duyarlılığı ve özgüllüğü olmalı, NIPD çok yüksek duyarlığı olan tarama testidir, tanı testi değildir,
2. Eğer tarama testi + ise ve NIPD + ise Down sendromu riski 290 kez artmıştır,
NIPD – ise risk 110 kez azalmıştır ancak çok az da olsa rezidual risk önemli ve ciddidir, 3. T21 anomalilerin yarısını oluşturur, tarama testleri ile diğer anöploidi ve triploidi için risk hesaplanabilir, ancak NIPD çalışmalarında klinik süreç tamamlanmadı,
4. NIPD ile mikrodelesyon/duplikasyon tanısının yakın gelecekte gerçekleşmesi beklenmiyor, 5. USG’nin yerini alamaz.
cff-DNA özellikle non-viable trofoblast kökenli olduğundan “CPM” riskini taşır.
NIPD testleri yüksek riskli gruplarda yapılmış ve yapılmaktadır. NIPD’nin düşük ve orta risk grubunda performansı daha düşüktür, buna karşın maliyeti artıracaktır.
Tarama testi > 1:150 ise ->NIPD + ise ->CVS
1:380 Down s. Prevalansı
500 000 gebelikte 1 389 Down s.
Taramada >1:150 ise
13 646 NIPD %99 DR ve %1 FPR 1 305 CVS
13 düşük ve 1 169 Down s. NIPD 200 £ ise tarama+tanı 29,7 milyon £
Duyarlılık %100
Özgüllük %99 ( 100’ de 1 yanlış pozitif) Prevelans Down sendromu %10 ise 1000 olguda;
Pozitif prediktif değer %91
Prevelans Down sendromu %0,1 ise 1000 olguda;
Pozitif prediktif değer %9
……coming soon …….
Bugün 10 Kasım
ATAMIZI sevgi ve saygıyla anıyoruz
Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama Fetal DNA da genetik
hastalığın dışlanması Y kromozom arama RHD
Paternale özgün hastalıkla ilişkili allel tarama (real time, fluorescence, konvansiyonel PCR, kütle spektrofotometresi/tek alleli çoğaltma)
Fetal cinsiyet (%100 güvenilir) Fetal RHD (rhesus blood group D-antigen) (%100 güvenilir)
Fetal HLA (human lökosit antijenleri) haplotiplemesi
Paternal mutasyonlar
X-e bağlı hastalıklar
Rh- kadınlarda, RHD immunoglobin uygulama kararı için (kafkas ırkında Rh- anne oranı % 15)
Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi HLA ya bağlı hastalıklar (erkek fetuslar için)
B-talasemi, hemoglobin E-hastalığı, kistik fibroz, konjenital adrenal hiperplazi, myotonik distrofi, Huntington hastalığı (fetal DNA yı maternal DNA dan ayırmak için allel spesifik PCR yapmak gerekiyor)
KALİTATİF YÖNTEM
Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama
Gebelikle ilişkili hastalıkların takibi için fetal DNA analizi
Plasental RNA analizi
Epigenetik analizler
Real-time PCR ve benzeri kantifikasyon yöntemleri ile aynı gebelik yaşındaki normaller ile karşılaştırma yapmak
Real-time RT- PCR ile plasentaya ait transkriptlerin
kuantifikasyonu
Transkriptlerin quantifikasyonu;
RNA-SNP allelik oranların saptanması
Real-time metilasyon spesifik PCR; epigenetik allelik oranlar
Fetal durum,
Diğer gebelik komplikasyonları CGB (chorionic gonadotropin, beta polipeptidi)
CRH (Corticotropin releasing hormone)
21. kromzomun kodladığı transkripitler
Hipometile SERPINB5
Fetal aneuploidiler, intrauterin büyüme geriliği, fetomaternal kanamalar
Pre-eklamsi, pre-term labour, ektopik gebelik, invazif plasentasyon, hiperemesis gravidatum, polihidramnios Gestasyonal trofoblastik hastalıklar
Pre-eklampsi Fetal trisomi 21
Pre-eklampsi, fetal trisomi 18
KANTİTATİF YÖNTEM
Sequenom – LifeCodexx – Materni21 plus
Trizomiler; 21, 18, 13, X and Y ve 16 ve 22 Mikrodeletions;
del 22q11.2 (DiGeorge s.), 5p- (Cri-du-chat s.), del 15q11.2 (Prader- Willi/Angelman s., del 1p36
Verinata - Verifi
ARIOSA – Harmony test
HARMONY 400 kan örneği 300 öploid 3 örnekte risk skoru belirlenememiş.
297 örnekte risk değeri < 0,01% specificity %100 50 T21 50/50 risk değeri > 99% sensitivity %100 50 T18 47/50 risk değeri > 99%
1/50 risk değeri > 98,8%
1/50 risk değeri > 88,5%
1/50 risk değeri 0,11%
Toplam 49/50 sensitivity %98 FNR %2
2002 örnekten 53 ünde sonuç alınamamış, 1949 örnekte risk skoru alınmış.
10 T13 risk skoru > 99% 8/10 sensitivity 80.0%
FNR 20%
1939 öploid risk skoru < 0.01% 1937/1939 specificity 99.9%
0.79% 1/1939
> 99% 1/1939 FPR 0.05% (95% CI,0.0–0.3%)
From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and challenges Diana W Bianchi, Nature Medicine, 2012
Chromosome anomalies
(including mosaics) CVS n CBCR NIR LR AMA ST P-USG 45,X and variants 42 0 1 0 1 4 36 Polysomy X/Y 6 0 2 0 2 0 2 Tri somy 21 125 1a 0 2 7 29 86 Trisomy 18 61 1a 0 0 1 4 55 Trisomy 13 23 0 0 0 1 2 20
Uncommon trisomies 20 0 2 1 1 8 8
Poliploidies 20 1 0 0 0 2 17 Balanced structural 51 35 5 1 2 1 7
Unbalanced structural 37 21 0 0 0 3 13
Total 385 59 10 4 15 53 244 Table 4a: The number of chromosome anomalies detected in different indication groups of CVS series (385 anomalies detected in 2 453 CVS)
Table 4b: The number of chromosome abnormalities detected in different indication groups of AC series (890 anomalies detected in 23 338 AC)
Chromosome anomalies (including
mosaics) AC
n CBCR NIR LR AMA ST P-USG
45,X and variants 58 0 1 0 6b 18bbb 33 Polysomy X/Y 68 0 0 0 32 18 18 Trisomy 21 324 0 1 1 80 75 167 aa Trisomy 18 87 1a 0 0 13 a 7 66 Trisomy 13 21 0 0 1 4 2 14 Uncommon trisomies 20 0 0 0 5 4 11 Polyploidies 17 0 0 0 1 1 15 Balanced structural 218 64 5 6 74 47 22 Unbalanced
structural 77 11 0 3 18 13 32
Total 890 76 7 11 233 185 378
