Seher Başaran
İ.Ü., İstanbul Tıp Fak., Tıbbi Genetik AD
GEN
transkripsiyon 1941-1990
transkripsiyon-translasyon
DNA RNA PROTEİN
Promoter
Kırpılma Translasyon
Protein Primer
transkript (RNA)
Wellcome Trust
Olgun mRNA Ekzon1-İntron1- E2- İ2- E3- İ3- E4
nukleus sitoplazma 90 000-100 000 gen
olduğu düşünülüyordu.
Genom Projesi ile
20,000 fonksiyonel (protein kodlayan) gen olduğu bulundu.
Tüm genomun
İnsan genlerinin transkripsiyonel karmaşası
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
kısa RNA
snoRNA ncRNA miRNA
kısa RNA
3’ 5’
kısa RNA Antisens ncRNA
Antisens ncRNA
kısa RNA
p telomer q telomer
Transkripsiyonal çeşitlilik
A1 A2 B3 B4
Translasyonda yeni bir protein
A proteini Ekzonlar
A geni B geni
A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 B proteini
Translasyonal çeşitlilik
İki insanın genomu %99.9 birbirine benzer
GRCh37; Genome Reference Consortium human genome (build 37) 13 isimsiz gönüllü, kan grubu “O” olan bireyler
Yani farklarımız sadece %0.1
İnsan Genetik Varyasyonları
• Genomda 300 bp de bir nükleotid polimorfiktir.
• Genelde iki formda olur (A ya da G; C yada T gibi).
1) Single nucleotide polimorfizm (SNPs) (tüm varyasyonların %90 ı);
2) Kopya sayısı varyantları (CNVs);
Referans genomla kıyaslandığında, farklı sayıda bulunan, boyutu 1 Kb veya daha fazla olan DNA segmentlerine Kopya Sayısı Varyasyonu (CNV) denir.
Varyasyonlar;
1) Patojenik (Mutasyon)
2) Zararsız (benign) (toplumda >%1); a. Sık veya b. Ender görülen 3) Klinik anlamı kesin olarak bilinmeyen (Variants of uncertain
significance –VUS veya VOUS) değişimler olabilir!!!
GENOMUMUZ VARYASYONLARLA DOLU
Her bireyin genomunda 300 patolojik varyasyon olabilir, eğer o birey sağlıklı ise bu durumunu genomundaki diğer milyonlarca varyasyona borçludur.
Craig Venter
2007 de genom dizisini yayınladı.
1.2 milyon SNP
317 geninde patolojik varyasyon.
Zellweger hastalığına neden olan mutasyonu taşıyor.
GSTM1 geninde mutasyon
taşıyor (çevre toksinlerine karşı düşük direnç; ailesinde cilt
kanseri yaygın).
James D. Watson
2008 de genom dizisini yayınladı.
3.3 milyon SNP
23 CNV (26 kb-1.6 Mb)
32 hastalık ilişkili mutasyon (retinitis pigmentosa, konj. nefrotik sendrom, vs).
Güney Afrikalı Başpiskopos Desmond Tutu 2010 yılında genom dizisi yayınlandı.
SLC24A5 genindeki varyantı fazla melanin salgılıyor.
VDR genindeki homozigot varyantı kemik mineral yoğunluğunu arttırıyor.
ACTN3 homozigot varyantı, kas gücünü arttırıyor.
PTC varyantı tat duyusunda toksik madde ayırımı yapabiliyor.
OMIM 22 Kasım 2017
~10.000 tek gen hastalığı
Moleküler temeli belli 6.115 fenotip
İlişkili mutasyon-fenotipi belli gen 3.846 1 Fenotip ile ilişkili gen 2.632
2 Fenotip ile ilişkili gen 722 3 Fenotip ile ilişkili gen 259
>4 Fenotip ile ilişkili gen 233
TEK GEN Hastalıkları
OMIM 15 Mayıs 2018
~10.000 tek gen hastalığı 6.201 fenotip
3.907
2.677
732 265
233
OMIM İstatistik Gen/Fenotip
OMIM’de tanımlı gen sayısı 15 858 11 965 genin fenotipe% 75
yansıması bilinmiyor 3 893 gen defektinin% 25
klinik ilişkisi biliniyor
10.Nisan.2018
1. «SANGER Dizileme»
DNA’nın Nukleotid (bazlar A, G, T ve C) Dizisinin Belirlenmesi
• Halӑ «gold standart» test
• Tek tek, ekzon ekzon dizileme gerekiyor, her dizilemede ~600 baz okunur
• Zaman alıcı
• Büyük genler (örn. Distrofin geni 79 ekzon) için tanı amaçlı imkansız
• İnsan gücü ve maliyet artar
• Mozaikleri (<%30), büyük del/dup, inv, ins gösteremez
Bazı sık görülen «Tek gen» hastalıkları ve sıklıkları
Hastalık İnsidans Taşıyıcı sık.
Akondroplazi 1/10.000
NF 1 1/3.500
Marfan sendromu 1/5.000
Beta Talasemi (Türkiye) 1/2.500 1/23 Kistik Fibroz 1/2.000 1/22 Fenilketonuri (Türkiye) 1/4.500
KAH 1/10.000
SMA 1/10.000
DMD (E) 1/3.000
Frajil X Sendromu 1/4.000 1/6.000
Hemofili 1/4.000
(A1/8.000, B1/20.000)
TEK GEN Hastalıkları
Doğumdaki prevalans ~1:100
2. «Yeni Nesil (Next Generation) Sekanslama»
Whole Genome Sequencing (WGS)
Tüm Genom Sekanslama, 6 milyar bazın dizilenmesi
Whole Exome Sequencing (WES) %1,5 Genomdaki ~20.000 genin sadece ekzon ve UTR bölgelerinin dizilenmesi (Mendel kalıtımı gösteren tek gen hastalıklarındaki
mutasyonların %85’i ekzonlarda bulunmaktadır).
Targeted Gene Panel (TGP)
Belli bir fenotip ile ilişkili bilinen genlerin ekzon ve UTR’lerinin dizilenmesi
Tüm genomun
Whole Genome Seq (WGS)
Whole Exome Seq (WES)
Targeted Seq (NGS-Panel)
Hedefin büyüklüğü (bp) 3x109 5x107 500 000
Her çalışmadaki örnek sayısı 6-15 120 Gen sayısı/
büyüklüğü belirler
Kapsama derinliği x30 x100 > 500
Bioinformatik analiz/örnek >48 hr 4 hr 1 hr
www.centogene.com 18
Likelihood of detecting a mutation: The scores depicted combine how good the target is covered and the sensitivity of the method in detecting any point mutation with the region that is targeted.
Information content: amount of information captured by a given technique. It scales linearly with the size of the region that is being probed for the respective test.
Centogene Product Genes Depth Coverage
Information content
Likelihood of detecting a specific mutation
Whole Genome Sequencing
(CentoGenome®) ~20.000 ~30x ~99% >10x ~3.2GB ~97.6%
Whole Exome Sequencing
(CentoXome®) ~20.000 ~100x ~97% >10x ~60MB ~93.2%
Clinical Exome Sequencing
(CentoDx Plus™) ~6.700 ~150x ~95% >20x ~15MB ~94.1%
NGS Panel Genomic ~10-1000 ~30x ~99% >10x 200-500MB ~99.1%
NGS Panel Plus 10-200 ~200x 100% 20-400KB ~99.1%
NGS Panel 10-1000 ~200x ~98% >20x 20-400KB ~96.1%
Single Gene Sequencing (Sanger) 1 NA NA 0.2-5KB ~99.9%
Hot Spot Testing 1- few NA NA Single base
pair ~99.9%
NEW NEW
Which test to choose?
VUS=Variant of Uncertain (unknown) Significance
Klinik bulgu ve kalıtım modeline göre
TIBBİ GENETİKÇİ
OLGU;
• 30 y [G2 A1] G1. 2017 yılında anembriyonik gebelik 27(-) hafta gebelik
• USG bulguları:
– Kalpte ARSA ve perimembranöz outlet VSD – Timus hipoplazisi
– Solda dudak yarığı, primer sert damak intakt
• VSD, ARSA, timus hipoplazisi, sol dudak yarığı nedeniyle
– 22q11.2 mikrodelesyon sendromu – diğer mikrodel-dup sendromları – CHARGE sendromu
• Kromozom+ DGS-FISH+mikroarray; Normal
• ÖNERİ: Prenatal WES-Klinik ekzom (Centogene)
• 32 (+) haftalık gebelik
• USG bulguları:
– Kalpte ARSA ve perimembranöz outlet VSD – Timus hipoplazik
– Solda dudak yarığı, primer sert damak intakt görünümde
– Sağ pelviektazi [AP çapı 9.4 mm] ölçüldü. Sağ böbrek korteksinde minimal en büyüğü 3.4 mm ölçülerinde kistik lezyonlar saptandı.
1. OD CHARGE sendromu ilişkili CHD7 geninde heterozigot c.6070C>T [p.Arg2024*]
2. OD BOR sendromu ilişkili EYA1 geninde heterozigot c.229C>T[p.Arg77*]
Bu mutasyonların ikisi de nonsense değişiklikleri olduğundan ve HGMDE2017.3 versiyonunda sırasıyla Class I ve Class II olarak sınıflandırıldığından, patojenik özellikte oldukları söylenebilir.
OLGU;
Fetus 1 (2015) 25. GH USG bulguları; lizensefali+mikrosefali+interhemisferik kist
• Öneri; Karyotip+aCGH - Normal,
• SIX3 geni (2 ekzon) Sanger dizi- Normal
Fetus 2 (2017) 27. GH USG bulguları; lizensefali+mikrosefali+interhemisferik kist+ sloping alın
• Post mortem bulgular; geniş burun kökü+hipertelorizm+malar hipoplazi+ bil. 5. parmak klinodaktili+geniş haluks
• TANI: MKA/MR
• Kromozom+a-CGH; Normal
• Öneri: WES (CentoXome GOLD) SONUÇ;
RTTN geninde ekzon 28’de het. c.3705C>A (p.Tyr1235*) ve intron 35’de het. c.4748-19T>A CLP1 geninde ekzon 3’de het. c.419G>A (p.Arg140His)
Anne het. RTTN geni c.4748-19T>A ve het. CLP1 geni c.419G>A Baba het. RTTN geni c.3705C>A (p.Tyr1235*)
YORUM;
RTTN geni c.4748-19T>A varyantı daha önce tanımlanmamış, Alamut v.2.7.1. program analizine göre transkripte kırpılma hatasına yol açıyor. c.3705C>A gen transkriptinde «dur» kodonu oluşturuyor.
Mikrosefali, kısa boy, polimikrogri ve epilepsi ile karakterize bir hastalıkla ile ilişkili (MIM#614833).
Fetusta, OR bileşik heterozigot formda RTTN geni fenotip ilişkili gen olarak değerlendirildi.
CLP1 geni OR pontoserebellar hipoplazi tip 10 ilişkili ve c.419G>A tanımlanmış bir mutasyon. Ancak fetus ve anne heterozigot, ancak WES tüm delesyon mutasyonlarını gösteremediğinden fetusta diğer allelin incelenmesi önerilir.
Prenatal olgularda Prenatal WES-Klinik Exom Sonuçlarımız
USG katarakt -terminasyon-WES- CRYBB1 geni - İzole katarakt
USG multiple kontraktürler-terminasyon- WES- ASCC1 geni- konj. Fraktürlü SMA
USG mikroretrognati- WES- TCOF geni- Treacher Colins send.- doğdu ve ex
USG izole postaksiyel polidaktili – WES- BBS10 geni – Bardet Biedel send.-terminasyon
USG VSD+NT+plevral eff.+hepatosistemik şant- WES- RIT1 geni-Noonan send.-IUMF
USG hiperekojenik böbrek-WES- OD-PKD1 geni – doğdu
USG VSD+IUGG+hipopadias- WES- Normal- doğdu gelişimi normal
USG-izole unilateral CL-WES-Normal- doğdu gelişimi iyi
4xHidrops –WES- normal
Prenatal WES (Klinik Exom) Algoritması?
• Ağır USG Malformasyon (terminasyon endikasyonu olanlar)
– 1. Genetik danışma
– 2. Hızlı anöploidi testi –Normal ise – 3. Karyotip + Mikroarray
– 4. Aday genler Sanger dizileme (örn. Akondro/Hipokondroplazi) – 5. Genetik danışma
– 6. Klinik Exom
• Gebelik sonlandırıldıktan sonra mı?
• Gebelik sürerken mi?
• Pozitif USG Bulguları (genetik tanıya göre terminasyon endikasyonu olanlar)
– 1. Genetik danışma
– 2. Hızlı anöploidi testi –Normal ise – 3. Karyotip + Mikroarray
– 4. Aday genler Sanger dizileme (örn. Noonan için) – 5. Genetik danışma
– 6. Klinik Exom
– 7. Genetik danışma – terminasyon kararı
ve tüm organizasyon ekibine ve tüm dinleyenlere
teşekkür ederim.
OLGU;
• 3 aylık erkek olgu hipertrofik kardiomiyopati ve bil. katarakt bulguları ile izleniyor
• Anne baba 4. derece kuzen evliliği, ilk doğan erkek hipertrofik kardiomiyopati ile 4,5 aylıkken kaybedilmiş.
• Doğumdan 2 gün önce anne ilk çocuğundan söz etmiş ve detaylı USG de hipertrofik kardiomiyopati, ventrikülomegali, vermis hipoplazisi, pelviektazi, polihidramnios saptanmış.
• Doğum sonrası sepsis
• Dismorfik bulgular; skafosefali, bitemporal basıklık, sarı ince telli saçlar, bil. epikantus, kısa burun, kalkık üst dudak, dar damak, retrognati, gingiva hipertrofisi, bükülebilir heliks üst krus silinmiş kulak
• Hipoton
• KLİNİK TANI; MKA/MR, A/T Sengers, I-Cell….
• Karyotip ve mikroarray sonuçları NORMAL
• Öneri; WES-Klinik exom (Centogene)
