NKUBAP.00.20.AR.14.13 nolu proje
SIÇANLARDA KADMİYUMUN SEBEP OLDUĞU TESTİS TOKSİSİTESİNDE KAFEİK ASİT FENETİL ESTER’İN KORUYUCU ETKİSİNİN İNCELENMESİ
YÜRÜTÜCÜ:
Yrd. Doç. Dr. Mustafa ERBOĞA Araştırmacılar:
Prof. Dr. Mehmet KANTER Arş. Gör. Emel AKTAŞ
2015
TÜRKİYE CUMHURİYETİ NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ BİRİMİ
SIÇANLARDA KADMİYUMUN SEBEP OLDUĞU TESTİS TOKSİSİTESİNDE KAFEİK ASİT FENETİL ESTER’İN KORUYUCU ETKİSİNİN İNCELENMESİ
ARAŞTIRMA PROJESİ
YÜRÜTÜCÜ:
Yrd. Doç. Dr. Mustafa ERBOĞA Araştırmacılar:
Prof. Dr. Mehmet KANTER Arş. Gör. Emel AKTAŞ
Proje No: NKUBAP.00.20.AR.14.13
2015 – TEKİRDAĞ
ÖNSÖZ
Çalışmamız, sıçanlarda kadmiyum maruziyeti ile oluşturulan testis hasarına karşı kafeik asit fenetil ester (CAPE)'in koruyucu etkisinin histolojik, apoptotik ve biyokimyasal olarak araştırılması amacıyla yapıldı. Çalışmamız Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklendi (Proje No:
NKUBAP.00.20.AR.14.13). Projemizin amacı doğrultusunda gerekli malzemeler proje bütçesinden alınarak çalışmamız tamamlandı.
Çalışmamızda 40 adet erkek rat 4 gruba ayrıldı: Kontrol grubu, sadece CAPE verilen grup, kadmiyum grubu ve kadmiyum+CAPE (10 μmol/kg) grubu. 30 günlük kadmiyum (1 mg/kg) uygulaması sonunda sıçanlar ketamin-xylazin anestezisi altında sakrifiye edildi ve testis dokusu çıkartılarak ağırlığı ölçüldükten sonra histopatolojik ve biyokimyasal incelemelerde kullanıldı. Ayrıca serum testosteron düzeyinin belirlenmesi için kan örnekleri de alındı. Işık mikroskobik incelemeler için alınan testis dokusunun Bouin solüsyonu içinde fikse edilmesi, parafin inklüzyonu yapıldıktan sonra, parafin blokların elde edilmesi ve parafin bloklardan elde edilen 5 μm kalınlığındaki testis kesitleri histolojik yapı değişikliklerinin incelenmesi için hematoksilen eozin ile boyandı. Ayrıca yine parafin bloklardan elde edilen 5 μm kalınlığındaki kesitlere apoptozisin belirlenmesi için TUNEL yöntemi uygulandı.
Biyokimyasal olarak antioksidan enzimlerden süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktiviteleri ile lipid peroksidasyonunun son ürünü olan malondialdehit (MDA) düzeyleri spektrofotometrik olarak belirlendi.
Çalışmamızda kadmiyum grubunda vücut ve testis ağırlıklarının düştüğü gözlenirken CAPE tedavisinin de düşen ağırlıkları tekrar kontrol seviyesine yükselttiği tespit edildi. Ayrıca kadmiyum uygulaması sonucunda, seminifer tübül çapı ve Johnsen skorunun da düştüğü görüldü. CAPE tedavisinin ise kadmiyum sonrası düşen seminifer tübül çapı ve Johnsen skorunu yükselttiği görüldü. Kadmiyum sonrasında testislerin interstisyel yapısında bozulma, seminifer tübül yapılarında düzensizlik, germ hücre dökülmesi, nekrotik değişiklikler ve vakuolar dejenerasyon gözlendi. Testisteki bu yapısal bozulmaların CAPE tedavisi sonrasında hafiflediği görüldü. Ayrıca kadmiyum uygulaması sonucunda seminifer tübüllerin duvarında ve interstisyel alanda çok sayıda TUNEL pozitif apoptotik hücre izlendi. CAPE tedavisinin ise TUNEL pozitif apoptotik hücre sayısını azalttığı görüldü. Biyokimyasal olarak kadmiyum uygulamasının testis dokusunda SOD, CAT ve GSH-Px aktivitelerinde azalmaya, MDA düzeyinde ise artmaya neden olduğu saptandı.
Kadmiyum+CAPE grubu, kadmiyum grubuyla karşılaştırıldığında SOD, CAT ve GSH- Px aktivitelerinde artış, MDA düzeyinde ise azalma tespit edildi. Aynı zamanda CAPE'nin, kadmiyuma bağlı düşen testosteron hormon düzeyini yükselttiği görüldü.
Sonuç olarak, CAPE'nin antiapoptotik ve antioksidan etkileri ile kadmiyumun sıçan testislerinde neden olduğu olumsuz değişiklikleri önlediği görüldü.
Projemiz ile yapmış olduğumuz çalışmanın verileri SCI kapsamındaki Amerika Birleşik Devletleri merkezli "Biological Trace Element Research" isimli uluslararası hakemli dergide 2015 Eylül ayında yayınlanmıştır. Ayrıca çalışmamızın verileri 2-6 Eylül 2015 tarihinde İstanbul'da yapılmış olan "XXIV International Symposium on Morphological Sciences" Kongresi’nde poster olarak sunulmuştur.
Çalışmamızın gerçekleştirilmesinde her türlü maddi olanağı sağlayan Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi'ne desteklerinden ötürü bir kez daha teşekkür ederiz.
İÇİNDEKİLER
Sayfa
Özet……...……….………. 1
Abstract………...
1.Giriş………..………...
2 3 2.Materyal Metod………...………...
3.Bulgular………...
3 8
4.Tartışma.……….… 14
5.Kaynaklar…………..………..… 16
RESİMLER
Sayfa
Resim 3.1. Vücut ve testis ağırlıkları ...……… 8
Resim 3.2. Semnifer tübül çapı ve Johnsen tübüler biyopsi skoru...……… 9
Resim 3.3. Hematoksilen Eozin boyamaları... 10
Resim 3.4. TUNEL boyamaları...……….…11
Resim 3.5. Apoptotik indeksler..…...………...12
Resim 3.6. MDA, SOD, CAT ve GSH-Px düzeyleri...………...13
Resim 3.7. Testosteron düzeyleri...…………....13
TABLOLAR
Sayfa
Tablo 2.1. Histolojik takip basamakları………... 4
Tablo 2.2. Hematoksilen Eozin boyama protokolü………...…………... 5 Tablo 2.3. Johnsen testiküler biyopsi skoru (JTBS).……….… 5
1 ÖZET
Amaç: Önemli endüstriyel ve çevresel kirleticilerden biri olan kadmiyum, canlılar üzerinde oldukça toksik etki gösteren esansiyel olmayan ağır metallerden biridir.
Kadmiyum böbrek, akciğer, pankreas, kemik ve testis dokularında birikerek birçok hasara sebep olmaktadır. Bu çalışmada, testiküler dokuda kadmiyumun sebep olduğu yapısal değişiklikler ve bu değişiklikler üzerine koruyucu amaçla uygulanan kafeik asit fenetil ester (CAPE)'in antiapoptotik ve antioksidan etkilerinin belirlenmesi amaçlandı.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda 40 adet erkek rat 4 gruba ayrıldı: Kontrol grubu, sadece CAPE verilen grup, kadmiyum grubu (1 mg/kg) ve kadmiyum+CAPE (10 μmol/kg) grubu. 30 günlük kadmiyum uygulaması sonunda sıçanlar ketamin-xylazin anestezisi altında sakrifiye edildi ve testis dokusu çıkartılarak ağırlığı ölçüldükten sonra histopatolojik ve biyokimyasal incelemelerde kullanıldı. Ayrıca serum testosteron düzeyinin belirlenmesi için kan örnekleri de alındı. Işık mikroskobik incelemeler için alınan testis dokusunun Bouin solüsyonu içinde fikse edilmesi, parafin inklüzyonu yapıldıktan sonra, parafin blokların elde edilmesi ve parafin bloklardan elde edilen 5 μm kalınlığındaki testis kesitleri histolojik yapı değişikliklerinin incelenmesi için hematoksilen eozin ile boyandı. Ayrıca yine parafin bloklardan elde edilen 5 μm kalınlığındaki kesitlere apoptozisin belirlenmesi için TUNEL yöntemi uygulandı. Biyokimyasal olarak da, alınan dokularda malondialdehit (MDA), süperoksit dimutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH- Px) ve katalaz (CAT) düzeylerine bakıldı. Ayrıca tüm verilerin istatistiksel analizi ve gruplar arası karşılaştırmaları da yapıldı.
Bulgular: CAPE tedavisinin, kadmiyum sonucu düşen vücut ve testis ağırlıkları, seminifer tübül çapı ve Johnsen skorunu yükselttiği görüldü. Kadmiyum sonrasında testislerin interstisyel yapısında bozulma, seminifer tübül yapılarında düzensizlik, germ hücre dökülmesi, nekrotik değişiklikler ve vakuolar dejenerasyon gözlendi. Testisteki bu yapısal bozulmaların CAPE tedavisi sonrasında hafiflediği görüldü. Ayrıca kadmiyum uygulaması sonucunda seminifer tübüllerin duvarında ve interstisyel alanda çok sayıda TUNEL pozitif apoptotik hücre izlendi. CAPE tedavisinin ise TUNEL pozitif hücre sayısını önemli ölçüde azalttığı görüldü. Biyokimyasal olarak kadmiyum uygulamasının testis dokusunda SOD, CAT ve GSH-Px aktivitelerinde azalmaya, MDA düzeyinde ise artmaya neden olduğu saptandı. Kadmiyum+CAPE grubunda, sadece kadmiyum verilen grupla karşılaştırıldığında SOD, CAT ve GSH-Px aktivitelerinde artış, MDA düzeyinde ise azalma tespit edildi. Aynı zamanda CAPE'nin, kadmiyum uygulamasına bağlı düşen testosteron hormon düzeyini yükselttiği görüldü.
Sonuç: Antiapoptotik ve antioksidan etkileri olan CAPE'nin, kadmiyum sıçan testislerinde neden olduğu histopatolojik değişiklikleri, apoptozisi, oksidatif stres ve lipid peroksidasyonunu önlediği görüldü.
Anahtar Kelimeler: Kadmiyum, CAPE, testis, apoptozis, oksidatif stres.
2 ABSTRACT
Anti-Apoptotic and Anti-Oxidant Effects of Caffeic Acid Phenethyl Ester on Cadmium-Induced Testicular Toxicity in Rats
Objective: Cadmium is a serious environmental and occupational contaminant and may represent a serious health hazard to humans and other animals. Cadmium is reported to induce the generation of reactive oxygen species, and induces testicular damage in many species of animals. The goal of the our study was to examine the anti-apoptotic and anti-oxidant effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on cadmium-induced oxidative stress, apoptosis and testicular injury in rats.
Material and Method: A total of 40 male Wistar albino rats were divided into four groups:
control, CAPE alone, Cadmium-treated, and Cadmium-treated with CAPE; each group consisted of 10 animals. To induce toxicity, Cadmium (1 mg/kg body weight) was dissolved in normal saline and subcutaneously injected into rats for 30 days. The rats in CAPE treated group was given a daily dose of 10 μmol/kg body weight of CAPE by using intraperitoneal injection. This application was continued daily for a total of 30 days.
Results: CAPE-treated animals showed an improved histological appearance and serum testosterone levels in cadmium-treated group. Our data indicate a significant reduction in the number of apoptotic cells in testis tissues of the cadmium-treated group with CAPE treatment. Moreover, CAPE significantly suppressed lipid peroxidation, compensated deficits in the antioxidant defenses in testes tissue resulted from cadmium administration.
Conclusion: These findings suggest that the protective potential of CAPE in cadmium toxicity might be due to its antioxidant and antiapoptotic properties, which could be useful for achieving optimum effects in cadmium-induced testicular injury.
Keywords: Cadmium, CAPE, testis, apoptosis, oxidative stress.
3 1. GİRİŞ
Kadmiyum esansiyel olmayan, endüstriyel alanlarda, yiyeceklerde ve toprakta konsantrasyonu yüksek seviyelere ulaşan, besin zincirine de dahil olabilen ve kaygı uyandıran çevresel bir toksik metaldir (Gao ve ark., 2014; Waisberg ve ark., 2003).
İnsanda, kadmiyum toksisitesi çoğunlukla kontamine olmuş yiyeceklerden, içme suyundan ve her bir pakette yaklaşık olarak 16 μg kadar bulunduğu sigara kullanımından kaynaklanmaktadır (Kolluru et al. 2006).
Uzun süre kadmiyuma maruz kalınması sonucu özellikle erkek üreme sisteminde, yapısal ve fonksiyonel bozukluklar meydana gelmektedir (Sönmez ve ark., 2015; Arafa ve ark., 2014). Memeli testisleri kadmiyuma oldukça duyarlıdır. Kadmiyum, spermlerin motilitesinde ve spermatogenez indeksinde azalmaya neden olmaktadır (Adaramoye and Akanni 2015). Kadmiyumun sebep olduğu testiküler nekroz, kalıcı infertiliteye neden olabilmektedir. Kadmiyumun erkek infertilitesindeki moleküler etkileri tartışmalı olmakla birlikte, kronik kadmiyum uygulamasında, kadmiyumun sperm kromatinine katılarak fertilitede azalmaya neden olduğu ileri sürülmüştür (Gunnarsson ve ark., 2004).
Kafeik asit fenetil ester (CAPE), propolis maddesinin aktif bir bileşeni olup antioksidan, antimikrobik, immunomodülatör, antifibrotik ve antienflamatuar özellikleri olduğu gösterilmiştir (Li ve ark., 2015; Kerman ve ark., 2012; Tomur ve ark., 2011).
Yapıca flavanoidlere benzer ve iki halkasal yapı içerir. Bu halkasal yapılardan bir tanesinde iki adet hidroksil grubu taşımaktadır. Bu hidroksil grubu sayesinde redoks reaksiyonlarında aktif rol oynayarak E vitamini ve C vitamininde olduğu gibi antioksidan özellik göstermektedir (Koltuksuz ve ark., 2000).
CAPE'nin antioksidan ve antiapoptotik özelliği birçok çalışmada gösterilmesine rağmen literatürde kadmiyum uygulamasına bağlı olarak testis dokusunda oluşabilecek hasarlar üzerinde CAPE'nin nasıl bir etki gösterdiğine dair bir araştırmaya rastlanmamıştır. Bu amaçla çalışmamızda sıçanlarda testiküler toksisite üzerine güçlü bir antioksidan olan CAPE'nin antiapoptotik ve antioksidan etkilerinin araştırılması planlandı.
2. MATERYAL METOD
Araştırmamız Namık Kemal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Başkanlığı tarafından onaylanmıştır ve çalışma süresince etik kurallara uygun olarak çalışılmıştır (Sayı ve tarih: 2014/05-02, 01.09.2014).
2.1. Deney Hayvanlarının Bakımı
Çalışmamızda özel Kobay Deney Hayvanları Laboratuvarında üretilmiş ve standart laboratuvar koşullarında (22±1 0C, 12 saat aydınlık/karanlık siklusunda) tutulan 40 adet erkek sıçanın ağırlıkları birbirine yakın olanları aynı grupta olacak şekilde dört grup oluşturuldu. Deneklerin gruplandırılması aşağıdaki şekilde yapıldı;
Grup 1 (Kontrol, n=10): Bu gruptaki sıçanlara kadmiyum grubuna verilen miktar kadar serum fizyolojik verilmiştir.
Grup 2 (CAPE, n=10): Bu gruptaki sıçanlara 30 gün süreyle 10 μmol/kg CAPE intraperitoneal yoldan verilmiştir.
Grup 2 (Kadmiyum, n=10): Bu gruptaki sıçanlara 30 gün süreyle 1 mg/kg kadmiyum serum fizyolojik içerisinde çözünerek derialtı yoldan verilmiştir.
Grup 4 (Kadmiyum+CAPE, n=10): Bu gruptaki sıçanlara 30 gün süre ile kadmiyum (1 mg/kg) uygulamasıyla beraber CAPE (10 μmol/kg) de verilmiştir.
4
Deney süresi sonunda sıçanlar anestezisi altında sakrifiye edildiler ve testis dokuları ve kan örnekleri alınarak histopatolojik ve biyokimyasal değerlendirmeler yapıldı.
Hayvanlar sakrifiye edilmeden önce vücut ağırlıkları, testis dokuları alındıktan sonra da testis ağırlıkları ölçülmüştür. Histopatolojik olarak seminifer tübül çap (STÇ) ölçümü, Johnsen testiküler biyopsi skorlaması (JTBS), Hematoksilen-Eozin (H&E) boyaması ve bir apoptozis belirteçi olan TUNEL boyaması yapıldı. Biyokimyasal olarak da, alınan dokularda malondialdehit (MDA), süperoksit dimutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH- Px) ve katalaz (KAT) düzeylerine, alınan kan örneklerinde de testosteron hormon düzeylerine bakıldı. Ayrıca tüm verilerin istatistiksel analizi ve gruplar arası karşılaştırmaları da yapıldı.
2.2. Histolojik Uygulamalar
Işık mikroskobik incelemeler için alınan testis dokusu örnekleri Bouin fiksatifinde tespit edilerek trimleme işlemi yapıldı. Elde edilen doku trimleri 2 gün % 70’lik alkolde yıkandıktan sonra rutin histolojik takip serilerinden geçirilerek parafine gömüldü (Tablo 2.1).
Tablo 2.1. Histolojik takip basamakları Sıra No Kullanılan Madde Süre
1 % 70 Alkol 1 saat
2 % 90 Alkol I 1 saat
3 % 90 Alkol II 1 saat
4 % 96 Alkol I 1 saat
5 % 96 Alkol II 1 saat
6 % 100 Alkol I 45 dk
7 % 100 Alkol II 45 dk
8 % 100 Alkol III 45 dk
9 Ksilol I 1 saat
10 Ksilol II 1 saat
11 Ksilol III 1 saat
12 Yumuşak Parafin 1 saat
13 Y. Parafin + Sert Parafin 1 saat
14 Sert Parafin 3 saat
Histopatolojik inceleme için mikrotomda 5µm kalınlığında kesitler alınarak, H&E ile boyandı (Tablo 2.2). Hazırlanan preparatlar araştırma mikroskobunda (Nikon Eclipse E200, Tokyo, Japan) incelenerek 40X büyütmede fotoğrafları çekildi. Testisteki histolojik yapı değişiklikleri incelendi.
5
Tablo 2.2. Hematoksilen - Eozin boyama protokolü
Kullanılan Madde Süre
Ksilen (I) 10 dk
Ksilen (II) 10 dk
Ksilen (III) 10 dk
% 100 (Absolü) Alkol 2 dk
% 96 Alkol 2 dk
% 80 Alkol 2 dk
% 70 Alkol 2 dk
Çeşme Suyu 2 dk
Hematoksilen 5 dk
Çeşme Suyu 4 dk
Eozin 30 s
% 80 Alkol 2 kez daldır çıkar
% 96 Alkol 2 kez daldır çıkar
% 100 (Absolü) Alkol 5 dk
Ksilen (I) 10 dk
Ksilen (II) 10 dk
Ksilen (III) 10 dk
Entellan ile kapat 2.3. Seminifer Tübül Çapları
Seminifer tübüllerdeki etkilenmeyi saptamak için araştırma mikroskobunda ve mikroskoba uyarlanan oküler mikrometre yardımıyla bütün gruplara ait 100’er seminifer tübülün çapları ölçüldü. Her tübülün çapı dörder defa ölçülüp, ortalaması alındı.
2.4. Johnsen Testiküler Biyopsi Skoru
Johnsen testiküler biyopsi skoru Tablo 2.3’teki ölçütlere göre derecelendirildi (Johnsen 1970). Her grup için ayrı ayrı 100 adet seminifer tübül değerlendirilerek ortalama JTBS hesaplandı.
Tablo 2.3. Johnsen testiküler biyopsi skoru.
Skor Histolojik Bulgular
1 Tübüllerde hiçbir hücre yoktur 2 Sadece Sertoli hücreleri vardır 3 Sadece spermatogonyumlar vardır 4 Az sayıda (5/ tübül) spermatosit vardır 5 Fazla sayıda spermatosit mevcuttur 6 Az sayıda (5/ tübül) spermatid mevcuttur
7 Farklanma işareti olmaksızın fazla sayıda spermatid vardır 8 Olgun spermatozoa olmaksızın geç spermatidler mevcuttur 9 Az sayıda (5/ tübül) spermatozoa vardır
10 Fazla sayıda spermatozoanın görüldüğü tam spermatogenez mevcuttur
6
2.5. TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick End Labeling) Yöntemi
Apoptozisin belirlenmesi amacı ile TUNEL tekniğinden yararlanıldı. Apoptotik germ hücrelerinin belirlenmesi için apoptozis kiti (TUNEL Universal Apoptosis Detection Kit- Biotin-labeled POD, Cat. No. L00290, GenScript USA Inc., Piscataway, USA) kullanıldı.
TUNEL tekniğinde apoptotik hücreler şu şekilde belirlenir; apoptotik sinyaller DNA üzerinde kırıklar oluşturmaktadır. Açığa çıkan DNA parçacıklarının serbest 3'-OH uçlarına terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) aracılığı ile biotin ile işaretlenmiş ve işaretlenmemiş deoksinükleotidler eklenir. Daha sonra biotin ile işaretlenmiş nükleotidler, streptavidin-horseradish peroksidaz konjugatı ile tespit edilir. Diaminobenzidine, işaretlenmiş örnek ile tepkimeye girerek DNA kırığı bölgesinde çözünemeyen bir substrat oluşturur. Metil yeşili ile ters boyama yapılarak işlem sonlandırılır. Böylelikle dokulardaki apoptotik hücreler mikroskopik olarak görüntülenebilir.
Bu işlemlerden geçirilerek boyanan testis dokusu kesitleri araştırma mikroskobu (Nikon Eclipse E200, Tokyo, Japan) ile değerlendirildi. Germ hücrelerinin sayısal analizi Hu ve ark. tarafından geliştirilen metoda göre yapıldı (2003). Apoptozise uğrayan Leydig hücrelerinin sayımı ise Aktas ve Kanter'e göre yapıldı (2009). Tüm sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi.
2.6. Biyokimyasal Ölçümler 2.7.1. Dokuların Saklanması
Biyokimyasal analizler için alınan testis dokusu örnekleri öncelikle soğuk (+4 ºC) PBS (phosphate buffered saline) ile yıkandı ve kurutma kağıdı ile kurutuldu. Daha sonra alüminyum folyo içerisine sarılarak numaralandırıldı ve -25 °C’de muhafaza edildi.
Alınan kan örnekleri santrifürüj edildikten sonra radioimmunoassay tekniği ile testoteron hormon düzeyleri ölçüldü.
2.7.2. Dokularda Biyokimyasal Analizler
Biyokimyasal analizlerden enzim aktiviteleri ve MDA düzeyleri spektrofotometre (Shimadzu UV-1601; Shimadzu, Kyoto, Japan) ile ölçülerek belirlendi.
2.7.2.1. Homojenizasyon ve Numunelerin Hazırlanması
Derin dondurucudan çıkarılan testis dokularının buzu çözüldükten sonra soğuk distile su ile yıkandı. Bu işlem dokuların üzerine yapışmış eritrositlerin uzaklaştırılmasını sağlamak için üç defa tekrarlandı. Testis dokularının yaş ağırlıkları tartıldıktan sonra soğukluğu muhafaza edilerek cam tüplere aktarıldı. Doku üzerine 2 ml Tris-HCl tamponu eklendi. Bir buz kabının içerisine yerleştirilen cam tüpteki doku homojenizatör ile (Ultra Turrax Type T25-Basic, IKA, Staufen, Germany) 13 500 devir/dk hızda homojenize edildi. Son hacim, testis dokusunun ağırlığının 5 katı olacak şekilde tampon ilave edildi. Tekrar homojenize edilerek süre 3 dk’ya tamamlandı. Her bir numune için yaş doku ağırlığı ve ilave edilen tampon miktarları kaydedildi. Hazırlanan her bir homojenattan 1 ml’lik iki numune üzeri numaralandırılmış ependorf tüplere alınarak analiz zamanına kadar -40 °C’de saklandı.
Elde edilen homojenatlardan MDA düzeyi ve Lowry metodu ile homojenat protein tayini yapıldı (Lowry ve ark., 1951).
Homojenatlardan 1,5 ml’lik 2 örnek daha ependorf tüplere alınarak, 3200 devir/dk hızında 30 dk süreyle +4 °C soğutmalı santrifüjde (Nüve NF 800R, Obelis SA, Brusseis, Belgium) santrifüj edilerek süpernatan elde edildi ve analiz zamanına kadar (1 hafta) –40 ºC’de bekletildi. Ayrılan süpernatanlardan CAT, GSH-Px aktivite ve protein
7
konsantrasyon tayinleri yapıldı. Süpernatan 1/1 (v/v) oranında kloroform/etanol (3/5, v/v) ile vortexlenip cam tüpte 3200 devir/dk hızında 40 dk süreyle +4 °C ’de santrifüj edildi.
Üstte oluşan etanol fazından protein ve SOD enzim aktivite tayini yapıldı.
2.7.2.2. Ekstraksiyonlu ve Ekstraksiyonsuz Numunelerde Protein Tayini
Tüm testis dokularındaki protein ölçümleri Lowry ve ark. (1951)’nın belirlemiş olduğu yöntemle gerçekleştirildi. Alkali çözeltide bakır-protein kompleksi oluşarak fosfomolibdat- fosfotungstat reaktifini (Folin-Ciocalteu-Phenol reaktifi) redükler ve koyu mavi bir renk oluşur. Oluşan rengin koyuluğu ortamdaki protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
700 nm’de numunenin ve standardın absorbansı köre karşı okundu.
2.7.2.3. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesinin Belirlenmesi
GSH-Px aktivitesi Paglia ve Valentina (1967)’nın metodu ile ölçüldü. GSH-Px enzimi, H2O2 varlığında redükte glutatyonun (GSH) okside glutatyon (GSSG)’a yükseltgenmesini katalizler. H2O2’nin bulunduğu ortamda GSH-Px’in oluşturduğu GSSG, glutatyon redüktaz ve NADPH yardımı ile GSH’a indirgenir. GSH-Px aktivitesi, NADPH’ın NADP+’ya yükseltgenmesi sırasındaki absorbans azalmasının 340 nm’de okunmasıyla hesaplandı.
Sonuçlar U/mg protein şeklinde belirtildi.
2.7.2.4. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Belirlenmesi
SOD aktivitesi Sun ve ark. (1988)’nın metoduna ve Durak ve ark. (1993)’nın tarif ettiği modifikasyona göre belirlendi. Bu metodun prensibi nitroblue tetrazolium’un (NBT) süperoksit üreticisi olan ksantin-ksantin oksidaz sistemi tarafından indirgenmesi esasına dayanmaktadır. Ortamda oluşan süperoksit radikalleri NBT’yi indirgeyerek renkli bileşik oluşturur. Bu renkli kompleks 560 nm’de maksimum absorbans verir. Bir SOD ünitesi;
NBT redüksiyonunu % 50 oranında inhibe eden enzim aktivitesidir. Sonuçlar U/mg protein olarak ifade edildi.
2.7.2.5. Katalaz (CAT) Aktivitesinin Belirlenmesi
CAT aktivitesi Aebi (1974) tarafından tanımlanan metoda göre belirlendi. H2O2 240 nm’de maksimum absorbans verir. Deney ortamına ilave edilen H2O2 CAT tarafından su ve oksijene parçalanmakta, bu ise kendini ultraviyole spektrumda absorbans azalması şeklinde göstermektedir. Enzim aktivitesi ile ortamda azalan H2O2 düzeyleri spektrofotometrik olarak 240 nm’de belirlendi. Bu dalga boyunda numune ilavesi ile absorbans azalması her 15 s’de bir defa olmak üzere 5 dk süre ile kaydedildi. Lineer absorbans azalmasının değerleri alınarak hesaplama yapıldı. Aktivite düzeyleri U/mg protein olarak ifade edildi. Absorbanstaki bu azalma CAT enziminin aktivitesi ile doğru orantılıdır.
2.7.2.6. Malondialdehit (MDA) Düzeylerinin Belirlenmesi
Testis MDA düzeyleri Draper ve Hadley (1990)’in metoduna göre belirlendi. Bu metodda lipid peroksidasyon ürünü olan MDA, +90 °C’de tiyobarbitürik asit (TBA) ile reaksiyona girerek 532 nm’de maksimum absorbans veren pembe renkli kompleks oluşur.
Spektrofotometrede ölçüm yapıldıktan sonra MDA-TBA kompleksi absorbans katsayısı (1,56 x 105 cm-1 M-1) kullanılarak MDA konsantrasyonu hesaplandı. Sonuçlar nmol/mg protein olarak ifade edildi.
2.8. İstatistiksel Analiz
Verilerin istatiksel olarak değerlendirilmesinde “PASW® Statistics 18 for Windows”
(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) istatistik paket programı kullanıldı. Grupların dağılımı
8
Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Veriler normal dağılım gösterdiği için parametrik olarak kabul edildi. Gruplar arası ikili karşılaştırmalar independent sample t testi ile yapıldı. Elde edilen “p” değerinin <0,05 olması istatistiksel olarak anlamlılık ifadesi olarak kabul edildi. Elde edilen sayısal değerler ortalama ± standart deviasyon (SD) olarak tabloya geçirildi.
3. BULGULAR 3.1. Vücut ve Testis Ağırlıkları
Bu araştırmada uyguladığımız süre ve dozdaki kadmiyumun, deney hayvanlarında canlı ağırlık kaybı ve testis ağırlık kaybına sebebiyet verdiği görüldü. Kadmiyum ile birlikte sıçanlara CAPE verilmesi sonucunda ise canlı ağırlık kaybı ve testis ağırlık kaybının önlendiği saptanmıştır (Resim 3.1).
Resim 3.1. Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait vücut ve testis ağırlıkları. aP<0.01 kontrol ve CAPE grupları ile karşılaştırıldığında; bP<0.05 kadmiyum grubu ile karşılaştırıldığında.
3.2. Seminifer Tübül Çapları ve Johnsen Testiküler Biyopsi Skoru
Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait deneklerin seminifer tübül çapları (STÇ) ve JTBS ile istatistiksel karşılaştırmaları Resim 3.2’de gösterilmiştir.
Kadmiyum grubu seminifer tübül çapları ve Johnsen testiküler biyopsi skorlarının kontrol grubu ve sadece CAPE grubu değerleri ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı bulundu (p<0,01) (Resim 3.2). Kadmiyum+CAPE grubu STÇ ve JTBS kadmiyum grubunun değerlerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde fazla olduğu tespit edildi (p<0,05) (Resim 3.2).
9
Resim 3.2. Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait STÇ ve JTBS değeleri. aP<0.01 kontrol ve CAPE grupları ile karşılaştırıldığında; bP<0.05 kadmiyum grubu ile karşılaştırıldığında.
3.3. Işık Mikroskopik Bulgular
Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarının testislerindeki histopatolojik değişiklikler Resim 3.3’de gösterilmiştir. Kontrol ve CAPE gruplarının testis yapısının normal görünüm sergilediği görüldü (3.3a,b). Buna karşın kadmiyum maruziyeti sonrasında ise seminifer tübüller ve interstisyel alanda şiddetli hasar izlendi. Seminifer tübül yapılarında düzensizlik, spermatogenik seriye ait hücre sayısında azalma, tübüllerde nekrotik değişiklikler ve bazı tübüllerde vakuolar dejenerasyon görüldü (3.3c,e). Testisteki bu yapısal bozulmaların ise CAPE tedavisi sonrasında hafiflediği gözlendi (3.3d,f).
10
Resim 3.3. Kontrol (a), CAPE (b), kadmiyum (c,e) ve kadmiyum+CAPE (d,f) gruplarına ait H&E boyaması. (Yıldız: nekrotik alanlar, Ok: vakuolar dejenerasyon), (H&E, X400).
3.4. TUNEL Bulguları
Çalışmamızda kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarının testis dokularında apoptozisi belirlemek için TUNEL metodu kullanıldı (Resim 3.4.). Kadmiyum uygulaması sonucunda seminifer tübüllerin duvarında ve interstiyel alanda çok sayıda TUNEL pozitif apoptotik hücre izlendi. CAPE tedavisinin ise apoptotik hücre sayısını düşürdüğü görüldü.
Ayrıca TUNEL pozitif hücrelerin sayımı sonucunda ortaya çıkan verilere göre kadmiyum grubunda kontrol ve CAPE grubu ile karşılaştırıldığında apoptotik hücre
11
sayılarının arttığı, kadmiyum+CAPE grubunda ise apoptotik hücre sayılarının kadmiyum grubu değerlerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı saptandı (Resim 3.5.).
Resim 3.4. Kontrol (a), CAPE (b), kadmiyum (c,e) ve kadmiyum+CAPE (d,f) gruplarına ait TUNEL boyama görüntüsü. (İnce ok: TUNEL pozitif germ hücreler, Kalın ok: TUNEL pozitif interstisyel (Leydig) hücreler), (TUNEL, X400).
12
Resim 3.5. Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait apoptotik hücre sayıları. aP<0.001 kontrol ve CAPE grupları ile karşılaştırıldığında; bP<0.01 kadmiyum grubu ile karşılaştırıldığında.
3.5. Biyokimyasal Bulgular
Sıçanlar üzerinde gerçekleştirmiş olduğumuz bu çalışmada, antioksidan savunma sisteminin enzimlerinden olan SOD, CAT ve GSH-Px aktiviteleri spektrofotometrik olarak belirlendi. Bunun yanı sıra, lipid peroksidasyonu sonucu oluşan ve oksidatif hasarın ortaya konulmasında önemli bir parametre olarak kullanılan MDA düzeyleri de yine aynı yöntemle ölçüldü. Ayrıca serum testosteron düzeyleri çalışıldı.
CAPE tedavisinin, kadmiyum sonucunda artan MDA düzeyini azalttığı, azalan SOD, GSH-Px, ve CAT seviyelerini ise arttırdığı tespit edildi (3.6.).
Ayrıca testosteron hormon düzeyinin kadmiyum sonucunda azaldığı, CAPE uygulamasının ise azalan testosteron düzeyini arttırdığı görüldü (3.7.).
13
Resim 3.6. Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait MDA, SOD, GSH-Px ve CAT düzeyleri. aP<0.01 kontrol ve CAPE grupları ile karşılaştırıldığında;
bP<0.05 kadmiyum grubu ile karşılaştırıldığında.
Resim 3.7. Kontrol, CAPE, kadmiyum ve kadmiyum+CAPE gruplarına ait serum testosteron düzeyleri. aP<0.01 kontrol ve CAPE grupları ile karşılaştırıldığında; bP<0.05 kadmiyum grubu ile karşılaştırıldığında.
14
4. TARTIŞMA
Endüstriyel ve çevresel kirletici olan Cd çok sayıda doku için toksiktir. Akut kadmiyum zehirlenmesinde pulmoner ödem, hemoraji, fulminant hepatitis ve testiküler hasar gözlenirken, uzun süreli kadmiyum maruziyetinde nefrotoksisite, osteotoksisite ve immünotoksisiteden bahsedilmektedir (Klaassen et al. 2009).
Testisler kadmiyumun önemli hedef organlarındandır ve kadmiyuma karşı oldukça duyarlıdır. Kadmiyum spermatogenezis olayında etkili olan Sertoli hücreleri arasındaki baglantı kompleksini bozarak kan-testis bariyerinin de hasarına baglı olarak spermatogenik seriye ait hücrelerde dejenerasyona neden olmaktadır (Siu et al. 2009).
Ayrıca, kadmiyuma maruz kalan erkek sıçanlarda testiste nekrozis, prostat kanseri, sertoli hücrelerinde hasar, sperm kalitesinde ve serum testesteron seviyelerinde azalma gibi birçok olumsuz etki ortaya konmuştur (Satoh et al. 2002; Satarug and Moore 2004).
Bu araştırmada uyguladığımız süre ve dozdaki kadmiyumun, deney hayvanlarında canlı ağırlık kaybına ve testis ağırlığının azalmasına neden olduğu görüldü. Daha önce yapılan araştırmalarda da buna benzer sonuçlar elde edilmiştir (Adaramoye and Akanni 2015; Arafa et al. 2014). Testis hasarına karşı koruyucu olarak kullanılan bazı antioksidan maddelerin kadmiyumun neden olduğu canlı ağırlık kayıplarını engellediği daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir (Wang et al. 2012; Kumar et al. 2013). Bizim çalışmamızda da kadmiyum ile birlikte sıçanlara CAPE verilmesi sonucunda canlı ağırlık kaybı ve testis ağırlık kaybının önlendiği saptanmıştır.
Aktas ve ark. (2012) sıçanlarda kadmiyum uygulaması sonrası testis dokusunda mikroskopik olarak çeşitli değişiklikler tespit etmişlerdir. Kadmiyumun STÇ and JTBS değerlerini düşürdüğünü, seminifer tübüller ve interstisyel alanda ağır hasara sebebiyet verdiğini göstermişlerdir. Sonmez ve Tascioglu (2015), kadmiyumun seminifer tübüllerde nekroza sebebiyet verdiğini, seminifer tübül epitel hücrelerinin lümene döküldüğünü, ve tübül epitelinin dejenere olduğunu bildirmektedirler. Daha önce çeşitli yollarla testis hasarı oluşturulmuş çalışmalarda, CAPE'nin testisi oluşan hasarlardan koruduğu gösterilmiştir (Abdallah et al. 2012; Atik et al. 2006).
Apoptozis, birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda meydana gelen programlanmış hücre ölümüdür. Apoptotik sürecin başlamasında hücre içi ve hücre dışı kökenli ölüm sinyalleri etkili olur. Bu uyarılara maruz kalan hücrede, ilgili genetik mekanizma harekete geçer ve apoptozis başlar. Metabolizma ve siklus bozuklukları, hiperkalsemi, pH değişiklikleri gibi etkiler hücre içinden kaynaklanan sinyallerdir. Hücre dışından gelen sinyaller ise ultraviyole ışınları, hipoksi, ısı değişiklikleri, antikanser ilaçlar ve toksik maddelerdir (Kuş ve ark., 2008). Serbest oksijen radikalleri de hücre metabolizmasındaki birçok reaksiyonu etkileyerek DNA hasarına, lipid peroksidasyonuna, sitokinlerin ekspresyonuna, histolojik inflamasyona ve neticede fibrogeneze ve apoptozis veya nekrozla hücre ölümüne yol açmaktadırlar (Lavine, 2000; Chatterjee ve ark., 2002). Daha önce yapılan çalışmalarda kadmiyum maruziyetinin testiste apoptozise sebebiyet verdiği gösterilmiştir (Niknafs ve ark., 2015; Ji ve ark., 2013; Aktoz ve ark., 2012; Sonmez ve Tascioglu, 2015). Ayrıca, bu çalışmalarda sadece germ hücrelerinin değil Leydig hücrelernin de apoptozise uğradığı tespit edilmiştir. Bizim çalışmamızda kadmiyum testislerde hem germ hücrelerinde hem de Leydig hücrelerinde apoptotik hücrelerin sayısını ve apoptotik indeksi arttırmıştır. Sonuçlarımız daha önceki çalışmalarla uyumludur. CAPE uygulaması ise hem apopitotik hücrelerin sayısını hem de apoptotik indeksi azaltmıştır.
Kadmiyumun sadece spermatogenezisi değil, aynı zamanda testosteron üretimini de inhibe ettiği, kadmiyum uygulaması sonucu Leydig hücrelerinin sayısında azalma ve paralel olarak serum testosteron düzeylerinde düşmenin gözlendiği bildirilmiştir (El-
15
Demerdash ve ark 2004; Adaramoye and Akanni 2015; Wang et al. 2012). Aynı zamanda düşen testosteron seviyelerini kadmiyum ile birlikte verilen antioksidan maddelerin tekrar yükselttiği ve testosteron düzeyinin kontrole yakın seviyelere döndüğü yapılan çalışmalarda gösterilmiştir (Arafa et al. 2014; Fouad et al. 2013; Aktas et al. 2012). Bizim çalışmamızda da literatür ile uyumlu olarak kadmiyum toksikasyonu sonrası serum testosteron seviyesi düşmüştür. Kadmiyumla birlikte CAPE uyguladığımız grupta ise testosteron seviyesi eski düzeyine yaklaşmıştır.
Serbest radikal üretimi, patofizyolojinin bir parçasıdır ve pek çok zenobiyotigin toksisitesi, serbest radikal üretimi ile ilgilidir. Kadmiyum bir fenton metali olmamasına rağmen, proteinlerdeki fenton metallerinin (bakır, demir) yerini alarak bu metallerin bağlı olmayan formlarının miktarını artırır; kalmodulindeki Ca+2’la yer değiştirip, kalmoduline bağlı fonksiyonları değiştirir; proteinler, enzimler gibi tiyol (-SH) grubu içeren biyolojik yapılara olan güçlü afinitesinden dolayı, bu yapılara bağlanır ve aktivitelerini baskılar;
CAT, SOD ve GSH-Px gibi antioksidan enzimleri inhibe eder. Bu nedenle süperoksit ve nitrik oksidinde içinde olduğu birçok serbest radikalin üretimine dolaylı yoldan neden olduğu ve böylece hücre membranındaki yapıların peroksidasyonuna, DNA hasarına ve protein oksidasyonuna yol açtığı düşünülmektedir (Brzóska ve Moniuszko-Jakoniuk, 2001; Lermioglu ve Bernard, 1998). Akut maruziyetle kadmiyumun böbrek, karaciğer, beyin, kalp, akciğer, plasenta, uterus ve testiste serbest radikallerin üretimini artırarak, lipit peroksidasyona neden olduğu, nekrozu indükledigi ve hücresel hasar olusturduğu;
kronik olarak maruz kalınması ile ise özellikle akciğer, böbrek, karaciğer ve kemikte ciddi hasarlara yol açtığı bilinmektedir (Coyle ve ark., 2000; Choi ve ark., 2007; Koyuturk ve ark., 2006 ).
Son dönemlerde, antioksidan özelliğe sahip doğal maddelerin ve besinlerin serbest radikallerin neden olduğu hücresel hasar üzerine olan olası faydaları birçok araştırıcı tarafından çalışılmaktadır. Bu doğal bileşiklerden biri de CAPE'dir. Bizim çalışmamızda da daha önce yapılan çalışmaları destekler şekilde kadmiyumun biyokimyasal olarak, teatiste MDA seviyesini, kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttırırken, SOD, CAT ve GSH-Px seviyelerini ise azalttığı görüldü. Kullandığımız antioksidan madde olan CAPE ise kadmiyuma bağlı artan MDA seviyesini azaltırken, SOD, CAT ve GSH-Px antioksidan seviyelerini ise arttırdı.
Sonuç olarak; kadmiyumun, histopatolojik değişiklikler, oksidatif hasar, lipid peroksidasyonu ve apoptozisle karakterize testiküler toksisiteye neden olduğu, CAPE'nin ise antioksidan ve antiapoptotik etkileri ile testiküler toksisiteyi önemli ölçüde azaltıldığı bulundu. Bu durum CAPE'nin antioksidan ve antiapoptotik özellikleri ile kadmiyum uygulamasına bağlı testiküler toksisiteyi önleyici bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
16 KAYNAKLAR
Abdallah FB, Fetoui H, Zribi N et al (2012) Protective role of caffeic acid on lambda cyhalothrin-induced changes in sperm characteristics and testicular oxidative damage in rats. Toxicol Ind Health 28(7):639-647
Adaramoye OA, Akanni OO (2015) Protective effects of Artocarpus altilis (Moraceae) on cadmium-induced changes in sperm characteristics and testicular oxidative damage in rats. Andrologia DOI: 10.1111/and.12426
Aebi H (1974) Catalase. In: Bergmeyer HU (ed) Methods of enzymatic analysis, Academic Press, New York, pp 673-677.
Aktas C, Kanter M (2009) A morphological study on Leydig cells of scrotal hyperthermia applied rats in short-term. J Mol Hist 40:31–39
Aktas C, Kanter M, Erboga M, Ozturk S (2012) Anti-apoptotic effects of curcumin on cadmium-induced apoptosis in rat testes. Toxicol Ind Health 28(2):122-130
Arafa MH, Mohammad NS, Atteia HH (2014) Fenugreek seed powder mitigates cadmium-induced testicular damage and hepatotoxicity in male rats. Exp Toxicol Pathol 66(7):293-300
Atik E, Görür S, Kiper AN (2006) The effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on histopathological changes in testicular ischemia-reperfusion injury. Pharmacol Res 54(4):293-297
Brzóska MM, Moniuszko-Jakoniuk J (2001) Interactions between cadmium and zinc in the organism. Food Chem Toxicology 39(10):967-980
Chatterjee PK, Patel NS, Kvale EO, Cuzzocrea S, Brown PA, Stewart KN, Mota- Filipe H, Thiemermann C (2002). Inhibition of inducible nitric oxide synthase reduces renal ischemia/reperfusion injury. Kidney Int 61:862-871.
Choi AO, Cho SJ, Desbarats J, Lovric J, Maysinger D (2007) Quantum dot-induced cell death involves Fas upregulation and lipid peroxidation in human neuroblastoma cells.
J Nanobiotechnology 5(1)
Coyle P, Niezing G, Shelton TL, Philcox JC, Rofe AM (2000) Tolerance to cadmium hepatotoxicity by metallothionein and zinc: in vivo and in vitro studies with MT-null mice.
Toxicology 150(1-3):53-67
Draper HH, Hadley M (1990) Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation. Methods Enzymol 186:421-431.
Durak I, Yurtarslanl Z, Canbolat O, Akyol O (1993) A methodological approach to superoxide dismutase (SOD) activity assay based on inhibition of nitroblue tetrazolium (NBT) reduction. Clin Chim Acta 214:103-104.
El-Demerdash FM, Yousef MI, Kedwany FS, Bahadadi HH (2004) Cadmium induced changes in lipid peroxidation, blood hematology, biochemical parameters and semen quality of male rats: protective role of vitamin E and b-carotene. Food Chem Toxicol 42:1563–1571
Fouad AA, Albuali WH, Jresat I (2013) Simvastatin treatment ameliorates injury of rat testes induced by cadmium toxicity. Biol Trace Elem Res 153(1-3):269-278
Gao P, Liu S, Ye W et al (2014) Assessment on the occupational exposure of urban public bus drivers to bioaccessible trace metals through resuspended fraction of settled bus dust. Sci Total Environ 508:37–45
Gunnarsson D, Svensson M, Selstam G, Nordberg G (2004) Pronounced Induction of Testicular PGF(2 Alpha) and Suppression of Testosterone by Cadmium-Prevention by Zinc. Toxicology 200:49–58
17
Hu JH, Jiang J, Ma YH (2003) Enhancement of germ cell apoptosis induced by ethanol in transgenic mice overexpressing Fas Ligand Cell Res 13:361-367
Ji YL, Wang H, Zhang C et al (2013) N-acetylcysteine protects against cadmium- induced germ cell apoptosis by inhibiting endoplasmic reticulum stress in testes. Asian J Androl 15(2):290-296
Johnsen SG (1970) Testicular biopsy score count a method for registration of spermatogenesis in human testes. Normal values and results of 335 hypogonadal males.
Hormones 1:2–25
Kerman M, Kanter M, Coskun KK et al (2012) Neuroprotective effects of caffeic acid phenethyl ester on experimental traumatic brain injury in rats. J Mol Histol 43(1):49-57
Klaassen CD, Liu J, Diwan BA (2009) Metallothionein protection of cadmium toxicity.
Toxicol Appl Pharmacol 238(3):215-220
Kolluru GK, Tamilarasan KP, Priya SG et al (2006). Cadmium induced endothelial dysfunction: Consequence of defective migratory pattern of endothelial cells in association with poor nitric oxide availability under cadmium challenge. Cell Biol Int 30(5):427-438
Koltuksuz U, Irmak MK, Karaman A et al (2000) Testicular nitric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsion in rats pretreated with caffeic acid phenethyl ester.
Urol Res 28(6):360-363
Koyuturk M, Yanardag R, Bolkent S, Tunali S (2006) Influence of combined antioxidants against cadmium induced testicular damage. Environ Tox Pharm 21(3): 235- 240
Kumar BA, Reddy AG, Kumar PR et al (2013) Protective role of N-Acetyl L-Cysteine against reproductive toxicity due to interaction of lead and cadmium in male Wistar rats. J Nat Sci Biol Med 4(2):414-419
Kuş İ, Zararsız İ, Akpolat N, Ögetürk M, Kuş MA, Özen OA, Sarsılmaz M (2008) Deneysel formaldehit zehirlenmesinde omega-3 yağ asitlerinin testislerdeki antiapopitotik etkileri: immunohistokimyasal bir çalışma. Fırat Tıp Dergisi 13:162-166.
Lavine JE (2000) Vitamine E treatment of nonalcoholic steatohepatitis in childiren: a pilot study: J Pediatr 136:734–738.
Lermioglu F, Bernard A (1998) Effect of calmodulin-inhibitors and verapamil on the nephrotoxicity of cadmium in rat. Toxicol Lett 95(1):9-13
Li M, Wang XF, Shi JJ et al (2015) Caffeic acid phenethyl ester inhibits liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol 21(13):3893-3903
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193:265-275
Niknafs B, Salehnia M, Kamkar M (2015) Induction and determination of apoptotic and necrotic cell death by cadmium chloride in testistissue of mouse. J Reprod Infertil 16(1):24-29
Paglia DE, Valentine WN (1967) Studies on the quantitative and qualitative characterisation of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70:158-169.
Satarug S, Moore MR (2004) Adverse health effects of chronic exposure to low level cadmium in foodstuffs and cigarette smoke. Environ Health Perspect 112:1099-1103
Satoh M, Koyama H, Kaji T et al (2002) Perspectives on cadmium toxicity research.
Tohoku J Exp Med 196:23-32
Siu ER, Mruk DD, Porto CS, Cheng CY (2009) Cadmium-induced testicular injury.
Toxicol Appl Pharmacol 238(3):240-249
18
Sonmez MF, Tascioglu S (2015) Protective effects of grape seed extract on cadmium-induced testicular damage, apoptosis, and endothelial nitric oxide synthases expression in rats. Toxicol Ind Health DOI: 10.1177/0748233714566874
Sun Y, Oberley LW, Li Y (1988) A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem 34:497-500.
Tomur A, Kanter M, Gurel A, Erboga M (2011) The efficiency of CAPE on retardation of hepatic fibrosis in biliary obstructed rats. J Mol Histol 42(5):451-458
Waisberg M, Joseph P, Hale B, Beyersmann D (2003) Molecular and cellular mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology 192:95–117
Wang W, Sun Y, Liu J, Wang J, Li Y, Li H, Zhang W, Liao H (2012) Protective effect of theaflavins on cadmium-induced testicular toxicity in male rats. Food Chem Toxicol 50(9):3243-3250
