ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ENDOTOKSEMİ OLUŞTURULMUŞ SIÇANLARDA PROPOLİSİN KARACİĞER KORUYUCU ETKİNLİĞİNİN
ARAŞTIRILMASI
Hazırlayan
Züleyha DOĞANYİĞİT
Danışman
Prof.Dr.Birkan YAKAN
Doktora Tezi
Şubat 2012
KAYSERİ
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ENDOTOKSEMİ OLUŞTURULMUŞ SIÇANLARDA PROPOLİSİN KARACİĞER KORUYUCU ETKİNLİĞİNİN
ARAŞTIRILMASI
Hazırlayan
Züleyha DOĞANYİĞİT
Danışman
Prof.Dr.Birkan YAKAN
Bu çalışma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TSD- 10- 2976 nolu proje ile desteklenmiştir.
Şubat 2012
KAYSERİ
TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim süresince yardım ve desteğini esirgemeyen, bilgi ve tecrübesiyle daima yol gösterici olan danışman hocam Prof. Dr. Birkan Yakan’a, çalışmamda bilgi ve önerilerini esirgemeyen bölüm hocalarımız Prof. Dr. Saim Özdamar’a ve Doç. Dr.
M. Fatih Sönmez’e ve tez çalışmam süresince özveriyle yardımcı olan dostluğunu ve desteğini esirgemeyen Ziraat Fakültesi öğretim üyesi Doç. Dr. Sibel Silici’ye,
Eğitimim boyunca birlikte çalışmaktan mutlu olduğum, desteklerini hiç bir zaman esirgemeyen bölüm arkadaşlarıma özellikle öğretim görevlisi Arzu Yay başta olmak üzere, Derya Akkuş, Esra Balcıoğlu, Ayça Kara ve diğer yüksek lisans ve doktora öğrencisi arkadaşlarıma,
Çalışmamda yardımlarını esirgemeyen Patoloji Anabilim dalı öğretim üyesi Doç. Dr.
Kemal Deniz’e, tezimin biyokimyasal çalışmaları sırasında özveriyle yardımcı olan Biyokimya Anabilim dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Figen Narin’e, moleküler biyolojik analizlerde yardımcı olan aynı zamanda dostluğunu ve desteğini her zaman yanımda hissettiğim can dostum Yrd. Doç. Dr. Serpil Taheri’ye ve Yrd. Doç. Dr. Fatma Öztürk Küp’e,
Hayatımın her aşamasında manevi olarak yanımda olan aileme, desteği, güveni ve sabrıyla hep yanımda olan canım eşim’e ve hayatımı güzelleştiren sonsuz sevgiyle bağlı olduğum canım kızım Nihan’ıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
ENDOTOKSEMİ OLUŞTURULMUŞ SIÇANLARDA PROPOLİSİN KARACİĞER KORUYUCU ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Züleyha DOĞANYİĞİT
Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Doktora Tezi, Şubat 2012 Danışman: Prof. Dr. Birkan YAKAN
KISA ÖZET
Endotoksik şok hipotansiyon, zayıf doku perfüzyonu ve çoklu organ yetmezliği ile karakterize edilen ve yatan hastalarda ölüme neden olan etkenlerin başında gelen ciddi bir komplikasyondur. Başta lipopolisakkarit (LPS) olmak üzere endotoksinler tarafından oluşturulan endotokseminin patofizyolojik mekanizmalarının anlaşılmasında ve tedavisinde pek çok strateji geliştirilmesine rağmen, hala yoğun bakım ünitelerinin büyük bir problemidir. Bu araştırma da son yıllarda antibakteriyel, antioksidan, antiinflamatuvar ve antitümoral etkinliklerine dair çok sayıda araştırmaya konu olan propolisin sıçanlarda oluşturulacak deneysel endotoksemideki karaciğeri koruyucu etkinliğini belirlemek amaçlanmıştır.
Çalışmada, Sprague dawley türü (200-300gr ağırlığında) dişi sıçanlar kullanılmıştır. Her birinde on tane olmak üzere sıçanlar yedi gruba ayrılmıştır. Kontrol grubunun dışındaki gruplar da LPS’nin dozuna ve propolisin önce ve sonra verilmesine göre düzenlenmiştir.
Alınan dokularda yapılan histolojik değerlendirmeler sonucunda LPS uygulanan gruplarda kontrol grubuna göre vasküler konjesyon, nötrofil infiltrasyonu, Kuppfer hücre aktivasyonu ve nekroz olmak üzere ciddi doku hasarı izlenmiş, propolisin önce verildiği gruplarda bu hasarın azaldığı görülmüştür. Ayrıca LPS uygulaması, mast hücre sayısını da kontrol grubuna göre anlamlı bir şekilde artırmıştır. LPS uygulaması, Malondialdehit (MDA) düzeylerini kontrole göre anlamlı bir şekilde yükseltmiş propolis verilmesi ise bu artışı hafifletmiştir. Doku örneklerinden elde edilen DNA’lar da Global DNA metilasyon düzeyi de LPS uygulaması ile azalırken propolis verilen gruplarda kontrole yakın bulunmuştur. Kan örneklerinde RAPD profilleri aracılığı ile genomik stabilite değerleri (GTS) incelenmiş ve LPS’nin genomik stabiliteyi azalttığı, tek başına propolis verilen grupta genomik stabilite değerinin kontrolle aynı olduğu ve LPS uygulamasından önce propolis verilen gruplarda genomik stabilite değerlerinin tekrar arttığı görülmüştür.
Bu çalışmanın sonuçları LPS ile oluşturulan endotoksemi sonucunda karaciğer de oluşan hasara karşı propolisin koruyucu rolünün olduğunu göstermiştir.
Anahtar Kelimeler: Endotoksemi, LPS, Karaciğer, Propolis, MDA, GTS
HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF PROPOLIS ON ENDOTOXEMIA INDUCED BY LPS IN RATS
Züleyha DOĞANYİĞİT
Erciyes University, Faculty of Medicine Department of Histology and Embryology
M.Sc. Thesis, Feb 2012
Supervisor: Prof.Dr. Birkan YAKAN ABSTRACT
Endotoxemic shock, characterized by hypotension, poor tissue perfusion and multi-organ dysfunction is a serious complication and one of the leading causes of death in hospitalized patients. It is induced by endotoxins, particularly lipopolysaccharide (LPS). The incidence of septic shock still remains high, despite of antibiotic therapy and intensive care management. We aimed in this study that hepatoprotective effect of Propolis on endotoxemia in rats. In recent years, propolis which are antibacterial, antioxidant, antiinflammatory and antitumoral effects has subjected many biological researchs.
Seventy female Sprague dawley rats (200–300 g) were randomly divided into seven equal groups. There are ten rats in each group. In groups exculute of control groups LPS dose and propolis are have been regulated according to before or after their treatments
Livers from control animals showed no morphological abnormalities. However, in rats that received LPS, vascular congestion and necrosis, as well as neutrophil infiltration, Kuppfer cell activation were observed in liver tissues. Propolis treatment significantly attenuated liver damage in LPS-induced endotoxemic rats. Application of LPS has significantly increased the number of mast cell compared with control group. The levels of MDA was increased in liver of rats treated with LPS. Propolis has been significantly reduced this increase. LPS treatment group the genome methylation level was less than the control group. Compared with the control group, there was no significant difference to the genome methylation levels in propolis treatment group. DNA qualitative analysis indicated an decrease in the stability of the DNA purified from the LPS exposed blood cells. Results indicate that changes in RAPD profiles after LPS treatment include modifications in bands by comparison with control and propolis group.
Genomic template stability (GTS) was increased in group applied prior of propolis. In conclusion, the present study showed that LPS induced damage in the blood and tissue DNA, and alterations of lipid peroxidation in liver of rats. Propolis treatment protected against the toxic effects induced by LPS
Key Words: Endotoxemia, LPS, Liver, Propolis, MDA, GTS
İÇİNDEKİLER
Sayfa no
İÇ KAPAK ...i
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI ...ii
YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ...iii
KABUL VE ONAY SAYFASI ...iv
TEŞEKKÜR ...v
KISA ÖZET ...vi
ABSTRACT ...vii
İÇİNDEKİLER ...viii
KISALTMALAR VE SİMGELER LİSTESİ ...ix
TABLO, GRAFİK VE ŞEKİLLER LİSTESİ ...xi
1.GİRİŞ VE AMAÇ...1
2.GENEL BİLGİLER ...4
2.1. KARACİĞER ...4
2.1.1.Karaciğerin Embriyolojisi ………..4
2.1.2. Karaciğerin Anatomisi………...6
2.1.3.Karaciğerin Histolojisi… ...8
2.2.MAST HÜCRELERİ………...14
2.2.1.Mast hücrelerinin fonksiyonları………... ...17
2.3. ENDOTOKSEMİ VE LİPOPOLİSAKKARİT (LPS)………….……...18
2.4. PROPOLİS………...21
2.4.1.Propolis’in Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri………...… ...21
2.4.2. Propolisin Biyolojik Özellikleri………... ..23
2.4.3. Propolisin Hastalıkların Tedavisinde Kullanımı………....24
2.5. LİPİD PEROKSİDASYON VE MALONDİALDEHİT (MDA)……... ....25
2.6. GLOBAL DNA METİLASYONU………...26
2.6.1. Genomik Hipermetilasyon………...27
2.6.2. Genomik Hipometilasyon………...28
2.6.3. Modifiye Restriksiyon Endonükleazlar……….... ...29
2.7. GENOMİK KARARLILIK ………...30
3. GEREÇ VE YÖNTEM ...31
4. BULGULAR ...44
5. TARTIŞMA-SONUÇ ...62
6. KAYNAKLAR ...72 ÖZGEÇMİŞ
KISALTMALAR
SER : Düz Endoplazmik Retikulum GER : Granüler Endoplazmik Retikulum LPS : Lipopolisakkarit
SIRS : Systemic Inflammatory Response Syndrome NO : Nitrik oksit
i NOS : İnorganik nitrik oksit sentaz EEP : Propolisin etanolik ekstraktı VİP : Vazoaktif intestinal peptit TNF-αααα :Tümör nekrozis Faktör alfa
CTMC : Connective tissue mast cell(bağ doku mast hücresi) MMC : Mucosal mast cell (mukozal mast hücresi)
RMCP I: Sıçan mast hücresi proteinaz I RMCP II: Sıçan mast hücresi proteinaz II IL : İnterlökin
CD : Cluster of differentiation TLR : Toll-like receptor LBP : Lipit bağlayıcı protein Pro : Propolis
MDA : Malondialdehit 5-mC : 5-metilsitozin
CpG : Sitozin fosfo Guanin
ICF : İmmün yetmezlik, sentromerik instabilite, fasial dismorfizm
LOH : Heterozigozite kaybı
GTS : Genomik Template Stability TMCS : Trimetilklorosilan
BSTFA : Bis-trimetilsilil trifloroasetamide GC-MS : Gas kromatografi-mass spectrometri
RAPD-PCR : Rastgele arttırılmış polimorfik DNA- polimeraz zincir reaksiyonu SDS : Sodyum dodesil sülfat
RE : Restriksiyon enzimi
ROS : Reactive oxygen species, Serbest oksijen radikalleri LİNE-1 : Long Interspersed Nuclear Element type 1
TABLO, GRAFİK VE ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa No
Tablo 2.1. Propolis’in kimyasal bileşimi ...22
Tablo 2.2. Propolisin yapısındaki bileşiklerin biyolojik aktiviteleri...24
Tablo 3.1. Kayseri Propolisinin Etanolik Ekstraktının Kimyasal Analizi...32
Tablo 3.2. Parafin doku takip yöntemi aşamaları ...34
Tablo 3.3. Hematoksilen-Eozin Boyama Yöntemi ...35
Tablo 3.4. Toluidin blue boyama prosedürü ...36
Tablo 3.5. RAPD-PCR’ da kullanılan primerler ve dizileri ...39
Tablo 4.1. Gruplara göre portal alanlardaki ortalama mast hücre sayısı...48
Tablo 4.2. Gruplar arasındaki mast hücre sayıları ...49
Tablo 4.3. Hesaplanan MDA (nmol/mg protein) değerleri ...49
Tablo 4.4. Kontrole göre MDA değerlerinin karşılaştırılması...51
Tablo 4.5. Kontrol grubuna göre RAPD profillerindeki değişimler ...56
Şekil 2.1. Karaciğerin embriyonik gelişimi ...5
Şekil 2.2. Karaciğerin anatomik bölgeleri ...7
Şekil 2.3. Rat karaciğeri...8
Şekil 2.4. Karaciğer lobül modelleri ...10
Şekil 2.5. Kupffer hücrelerinin elektron mikroskobik görüntüsü ...12
Şekil 2.6. İri büyük granüllerle dolu mast hücresinin görünümü . ...14
Şekil 2.7. Lipopolisakkarit(LPS)’in yapısı ...19
Şekil 2.8. Endotoksinlerin etki mekanizması ...20
Şekil 2.9. Tümör supresör genin epigenetik olarak inaktive edilmesi ...28
Şekil 2.10. Hpa II enzim çalışma mekanizması ...29
Şekil 2.11. Msp I enzim çalışma mekanizması...29
Şekil 3.1. MDA standart grafiği ...38
Şekil 4.1. Kontrol grubundaki karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü...44
Şekil 4.2. Grup 2’ye ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü……..45
Şekil 4.3. Grup 3’e ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü………45
Şekil 4.4. Grup 4’e ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü………46
Sayfa No
Şekil 4.5. Grup 5’e ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü………46
Şekil 4.6. Grup 6’ya ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü…….47
Şekil 4.7. Grup 7’ye ait karaciğer dokusunun normal ışık mikroskobik görünümü……..47
Şekil 4.8. Mast hücresi A: kontrol grubu B: Grup 2’ye ait doku...48
Şekil 4.9. OPU16 ile elde edilen RAPD profilleri ...52
Şekil 4.10. B18 ile elde edilen RAPD profilleri ...53
Şekil 4.11. OPB05 ile elde edilen RAPD profilleri ...54
Şekil 4.12. OPB08 ile elde edilen RAPD profilleri ...55
Şekil 4.13. M13 ile elde edilen RAPD profilleri ...55
Şekil 4.14. Kontrol grubundaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...58
Şekil 4.15. Grup 2’ye ait dokudaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...58
Şekil 4.16. Grup 3’e ait dokudaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...59
Şekil 4.17. Grup 4’e ait dokulardaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...59
Şekil 4.18. Grup 5’e ait dokulardaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...60
Şekil 4.19. Grup 6’ya ait dokulardaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...60
Şekil 4.20. Grup 7’ye ait dokulardaki DNA örneklerine ait Msp-I ve Hpa-II Restriksiyon enzim kesim ürünleri...61
Grafik 4.1. Gruplara göre ölçülen MDA (nmol/mg protein) değerleri ...50
Grafik 4.2. Propolis ve farklı dozlarda LPS uygulanmış sıçanlarda genom stabilite değerleri ...57
1.GİRİŞ VE AMAÇ
Endotoksin, Gram negatif bakterilerin hücre dış duvarının en önemli bileşeni olup temel olarak lipopolisakkarit (LPS) ve çeşitli oranlarda bakteri duvar komponentlerini içerir (1-3). Escheriachia coli (E.coli), Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa gibi çok sayıda Gram (-) bakteriden elde edilmesine rağmen deneysel septik şok çalışmaları E.coli’den elde edilen LPS’ler üzerinde yoğunlaşmıştır (2-7). LPS saflaştırılmış glikolipit yapısına sahiptir. Endotoksin ise LPS’ye ek olarak az miktarda hücre duvarı proteinleri, lipitler, proteinler ve polisakkarit içerir. LPS toksisitesi çoğunlukla içerdiği Lipit A’dan kaynaklanır (1-3). Lipit A'nın başlıca etkisi, makrofajları etkinleştirmesi ve yangıya neden olan olayları tetiklemesidir. Monositler, makrofajlar, nötrofiller ve endotel hücreleri enfeksiyona karşı gelişen yanıtta önemli rol oynarlar(8). Sıçanlara yüksek doz endotoksin uygulanması vazodilatasyon, kardiyovasküler kollaps (şok) ve erken ölüme neden olmaktadır. Düşük doz uygulama ise hiperdinamik cevap ve kardiyak debi artışı yapar. Deneysel model sonucu oluşan tablo ‘enfeksiyona karşı sistemik inflamatuvar yanıt (SIRS)’ benzeridir. SIRS ise endotoksemi, bakteriyemi, viremi, fungemi, sepsis, septik şok ve çoklu organ yetmezliği gibi birçok patolojinin ortak klinik görüntüsüdür. Sepsis ‘enfeksiyona sistemik inflamatuvar yanıt’ olarak tanımlanabilir. Özellikle Gram (-) bakterilerin meydana getirdiği SIRS; sık görülmesi, yüksek ölüm oranı (%30-90) ve kolay deneysel metodlar kurulabilmesi nedeniyle Gram (+)’lere göre daha çok araştırma konusu olmuştur (1-3).
Karaciğerin sepsis tarafından en çok etkilenen organ olduğu düşünülmektedir. Çünkü organizmanın immünolojik savunma mekanizmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır (9- 12). Karaciğer sepsiste iki zıt role sahiptir: bunlarda birincisi inflamatuvar mediyatörlerin bir kaynağı gibi iş görmesi diğeri ise inflamatuvar mediyatörlerin etkileri için bir organ olmasıdır (13).
Karaciğer aynı zamanda vücuttaki makrofajların (Kupffer hücreleri) büyük bir kısmını oluşturduğu için ciddi enfeksiyonlara yanıt verilmesinde ve organizmanın immünolojik savunma mekanizmalarında çok önemli görevler üstlenmesi sebebiyle, sepsisten en çok etkilenen organlardan birisidir. İn vitro ve in vivo deneyler sonucunda, sepsis sırasında oluşan hemodinamik ve metabolik değişikliklerin; nitrik oksit (NO), sitokinler ve eikosanoidlerin (prostaglandin öncülü maddeler) üretimindeki belirgin artışlarla ilişkili olduğu gerçeği ortaya çıkmıştır. Sepsisteki hiperdinamik yanıt ve artmış sitokin düzeylerinin; birçok dokunun endotel hücrelerinde inorganik nitrik oksit sentaz (i NOS) uyarılmasına yol açtığı her ne kadar faydalıymış gibi görünse de akut sepsiste i NOS artışının gerçekte organizma için zararlı sonuçlara yol açabildiği bilinmektedir (2-7).
Günümüzde giderek artan bir önem kazanan ve doğal bir ürün olan propolis bal arıları (Apis mellifera L.) tarafından çeşitli bitki kaynaklarından toplanan reçineli, yapışkan maddenin genel ismidir. Arılar kovan içerisinde mikroorganizmaların gelişimini önlemek, kovandaki kırık ve çatlakları kapatmak, kovan içerisinde ölen ve kovan dışına taşınamayacak kadar büyük ölü böcek ve hayvanları kaplayarak kokuşmasını önlemek için propolis kullanmaktadır. Ayrıca petek gözündeki yavruların (larva ve pupa) çeşitli enfeksiyonlardan korunması amacıyla petek gözlerini ince bir tabaka halinde propolis ile sıvamaktadırlar. Sonbaharda ise kovanın giriş deliğini propolis ile küçülterek soğuk havanın kovana girişini önlemektedirler. Çerçevelerin arasında ve kovanın içerisinde propolis biriktirerek antibakteriyel, antifungal ve antiviral bir ortam sağlamaktadırlar.
Propolisin rengi, bitki kaynağı ve tazeliğine bağlı olarak sarı-yeşilden koyu kahverengiye kadar değişmektedir. Ham propolisin kompozisyonu arılar tarafından kullanılan bitki kaynağına göre değişmekle birlikte, genel olarak % 50 reçine ve bitkisel balsam, % 30 balmumu, % 10 esansiyel ve aromatik yağlar, % 5 polen ve % 5 diğer organik maddelerden oluşmaktadır. Propolisin etanolik ekstraktında (EEP) 200’ün üzerinde bileşik tespit edilmiş olup bu en yaygın olarak kullanılan preparattır. EEP üzerine yoğun olarak yapılan araştırmalarla, onun antibakteriyel, antifungal, antiviral,
antiprotozoal, antiinflamatuvar, antikarsinojenik, antioksidan, anestezik ve immünostimülatör özellikler gösterdiği tespit edilmiştir (14). Propolis sahip olduğu önemli biyolojik aktiviteler nedeniyle, popüler bir ilaç olarak halk tıbbında, apiterapide, biokozmetikte ve ilaç sanayiinde çeşitli amaçlarla kullanılmaktadır. Propolis balsamı, % 95 etanolde çözünen ham propolisten oluşmakta, sonra bu tentür filtre edilerek mum ve diğer katı maddeler uzaklaştırılmaktadır. Propolis balsamının en önemli bileşikleri;
aminoasitler, organik asitler, alifatik asitler, fenolik asitler ile onların esterleri, alkoller, aldehitler, kalkonlar, dihidrokalkonlar, flavonoidler, flavanonlar, flavonlar hidrokarbonlar, ketonlar, terpenoidler ve diğer bileşiklerdir. Bu bileşiklerden flavonoidler en fazla çalışılan bileşik gurubudur ve bu bileşik gurubunun antibakteriyel, antifungal, antiviral, antiprotozoal ve anti tümör özelliklere sahip olduğu tespit edilmiştir. Aromatik asitler ve onların esterlerinin de antifungal, antiviral ve antibakteriyel özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir (15-19).
Bu çalışma ile son yıllarda antibakteriyel, antioksidan, antiinflamatuvar ve antitümoral etkinliklerine dair çok sayıda araştırmaya konu olan propolisin sıçanlarda oluşturulacak deneysel endotoksemideki karaciğeri koruyucu etkinliğini araştırmayı amaçladık.
böylece septik şok üzerinde karaciğer koruyucu etkinliğini belirleyerek propolisin bir tedavi seçeneği olup olamayacağı sorusuna ışık tutmak istenmiştir.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. KARACİĞER
2.1.1.Karaciğerin Embriyolojisi
Karaciğer, insanda gelişimin üçüncü haftasının ortasında, duodenumda hepatopankreatik halka adını alan bölgenin ön bölümünde endodermin kalınlaşmasıyla ortaya çıkar. Daha sonra derinleşerek hepatik divertikulum veya karaciğer tomurcuğu olarak adlandırılan yapıyı oluşturur (20). Karaciğer tomurcuğu olarak bilinen bu çıkıntı perikard boşluğu ve yolk sapı arasında mezodermal plağı yani septum transversumu penetre eden, hızlı proliferasyon gösteren hücrelerden meydana gelir. Karaciğer hücreleri septumun içine girmeye devam ederken, hepatik divertikül ile ön barsak (duedonum) arasındaki bağlantı daralarak safra kanallarını oluşturur. Safra kaynaklarından kaynaklanan küçük bir ventral çıkıntı safra kesesi ve sistik kanal haline gelir. Gelişimin daha sonraki dönemlerinde epitelyal hücre kordonları vitellin ve umblikal venlere karışarak hepatik sinüzoidleri meydana getirir. Karaciğer kordonları parankime farklılaşır ve safra kanallarının iç yüzünü döşer (21). Karaciğerin fibröz dokusu hematopoietik dokusu ve Kupffer hücreleri septum transversumdaki mezenşimden (22) hepatositler ise ön bağırsağın (duedonum) endoderminden gelişir (20). Karaciğer hücreleri septum transversumun tümünü işgal ettiğinde, organ karın boşluğunda kaudale doğru büyür. Aynı anda karaciğerle ön bağırsak ve karaciğerle karın duvarı arasında yer alan septum transversum mezodermi membranöz hale gelerek
sırasıyla küçük omentum ve falsiform ligamenti oluşturur. Bu iki ligament birlikte ön bağırsakla karın ön duvarı arasındaki peritoneal bağlantıyı oluştururlar ve ventral mezogastrium adını alır (21). Karaciğer yüzeyindeki mezoderm, küçük bir alan dışında farklılaşır ve visseral peritonu oluşturur. Bu küçük alanda septum transversum ile olan temas devam ettirilir. Septumun bu parçası yoğun bir mezenşimal doku halindedir ve ileride diyaframın tendinöz parçasını oluşturacaktır. Gelecekteki diyaframla temas eden karaciğerin bu yüzeyi peritonla örtülmez ve karaciğerin çıplak yüzeyi olarak bilinir (21,22).
Şekil 2.1. Karaciğerin embriyonik gelişimi (21)
Karaciğer 5. hafta ile 10. hafta arasında hızla büyüyerek üst abdominal boşluğun büyük bir kısmını doldurur. Karaciğerin gelişimini ve segmentasyonunu umbilikal vendeki kanın oksijen miktarı belirler. Başlangıçta sağ ve sol lob aynı büyüklüktedir, ancak kısa bir süre sonra sağ lob daha fazla büyür. Altıncı haftada başlayan hematopoiesis karaciğere parlak kırmızı bir renk verir. Karaciğerin 7. ve 9. haftalar arasındaki büyüklüğünden de bu hematopoietik aktivite sorumludur. Dokuzuncu haftada karaciğer total vücut ağırlığının %10’u kadardır (22). Karaciğer 6-22 haftalık insan embriyosu ve fetusunda hematopoietik organ olarak işlev görür (20). Karaciğerde kan yapımı intrauterin hayatın son iki ayı içerisinde giderek azalır ve doğumda sadece küçük hematopoietik adacıklar halinde kalır. Doğumda karaciğerin ağırlığı vücut ağırlığının
%5’i kadardır (21). Karaciğerin önemli bir fonksiyonu da safra üretimidir. Karaciğer hücreleri 12. haftadan itibaren safra üretmeye başlar. Üretilen safra, sistik kanal ve hepatik kanalın birleşmesiyle oluşan koledok kanalından bağırsağa akar. Sindirim
kanalı içi safra içeriğinden dolayı koyu yeşil bir hal alır (21,22). Duodenumda meydana gelen değişiklikler sonucu, koledok kanalının duodenuma giriş yeri başlangıçtaki anterior pozisyonundan posteriora doğru yer değiştirir ve koledok kanalı duodenumun arkasına geçer (21- 23).
2.1.2. Karaciğerin Anatomisi
Vücudun deriden sonra en büyük organı olan karaciğer, diafragmanın altında abdominal boşlukta yerleşmiştir (24). Ortalama ağırlığı 1400 gr olan karaciğer, erişkinlerde vücut ağırlığının % 2’sini oluşturmaktadır (25). Karaciğerin vücut ağırlığına göre oranı fetusta daha fazladır. Kırmızımtrak kahverengi olan karaciğer bol damarlı ve kolaylıkla yırtılabilen bir dokuya sahiptir (26). Karaciğer topografik olarak epigastriumun büyük bölümü, sağ hipokondrium ve sol hipokondriumun üst kısmının medialini kaplamaktadır (25). Karaciğer 4 lobtan oluşur. Lobus hepatis dexter ve lobus hepatis sinister büyük loblar, lobus caudatus ve lobus quadratus ise küçük loblardır. Karaciğerin diafragmatik yüzünde lobus hepatis dexter ve sinisterin sınırını lig. falciforme hepatis, visseral yüzde ise fissura ligamenti teretis ve fissura ligamenti venozi oluşturur (25).
Karaciğerin iki yüzü bulunmaktadır. Anterior, süperior ve posterior yönlerde olan yüzlere facies diafragmatica adı verilirken inferior yöndeki yüzüne ise facies visceralis adı verilir (27). Facies diaphragmatica’nın büyük bir bölümü periton ile örtülüdür ve periton ile kaplı bu kısımlarına pars libera adı verilir. Bu yüzün pars posterioru ile lig.
falciforme hepatis in iki yaprağı arasında kalan bölge ise peritonsuzdur ve bu bölge pars nuda (pars affixa) olarak adlandırılır (25). Facies visseralis karaciğerin iç organlarla komşu olan yüzüdür. Bu yüzün de büyük bir kısmı periton ile örtülüdür. Sadece fissura ve fossaların bulunduğu kısımlar peritonla örtülü değildir. Bu yüzde fissura ve fossalar bulundukları yer itibariyle H harfini andırır (25). Lig. teres hepatis, lig. falciforme hepatis ve lig. coronarium karaciğerin önemli ligamentleridir (25).
Şekil 2.2. Karaciğerin anatomik bölgeleri (28)
Karaciğer hilumunda, hepatik arter, portal ven ve safra kanalı sağ ve sol dallara ayrılır ve iki bölüm arasında çok az anastomoz bulunmaktadır (29).
Karaciğerin sempatik innervasyonu, medulla spinalisin torakal 7-10 seviyeleri arasında columna intermediolateralis kaynaklıdır. Bu sinir lifleri plexus coeliacus’ta sinaps yaparak N. splanchnicus major ile karaciğere gelir. Karaciğerin parasempatik innervasyonunu ise truncus vagalis anterior ve posteriorun rr. hepatici’leri sağlar (25).
Şekil 2.3. Rat karaciğeri (30)
2.1.3. Karaciğerin Histolojisi
Dört adet zayıfça sınırlanmış lobdan oluşan karaciğerde (31) loblar arasında H harfi şeklinde porta hepatis (karaciğer hilusu) bulunur. Organa giren ve çıkan büyük damarlar, lenf yolları, sinirler ve safra kanalı bu bölgeden geçer (32). Karaciğer, safra kanalları yolu ile salgısını duodenuma boşaltması nedeniyle ekzokrin, sentezlediği maddeleri doğrudan kana vermesinden dolayı da endokrin bez özelliği taşır (32).
Karaciğere kan portal ven ve hepatik arter olmak üzere iki damar yolu ile gelmektedir.
Gelen kan hacminin % 75-80’ini sağlayan portal ven, sindirim yolu, dalak ve pankreastan gelen kanı taşırken, çölyak hattın bir dalı olan hepatik arter ise oksijenlenmiş kanın % 20-25’ini taşımaktadır (31). Portal ven ve hepatik arterin dallarından gelen kan, karaciğer lobüllerinin sinüzoidlerinde birbirlerine karışır (31).
Bağırsaklarda absorbe edilen ve kan yolu ile gelen sindirim ürünleri karaciğerde metabolize edilir, değişime uğratılır, sonra depolanır veya diğer organlarda kullanılmak üzere kana verilir (32). Karaciğer dıştan visseral peritonla örtülüdür. Peritonun altında Glisson kapsülü adı verilen, elastik fibrillerden zengin bir kapsül bulunur (32). Glisson kapsülü sıkı bağ doku yapısındadır. Ortalama kalınlığı 70- 100 µm kadardır. Kapsülün peritona bakan yüzünü seröz mezotel örter. Mezotel, patojen ve diğer zararlı maddelere karşı bir kalkan vazifesi görür. Mezotel yapısında kollajen ve elastik fibriller bulunur.
Glisson kapsülü karaciğere dışarıdan destek verir, organın şeklini korur ve bunun yanında karaciğer parankimine uzantılar göndererek destek stromasına katkıda bulunur (33,34). Porta hepatis bölgesinde kapsülden ayrılan ince bağ dokusu septumları organ
içine doğru girerek, karaciğeri lob ve lobüllere ayırır (32). Karaciğer lobülü karaciğerin yapısal bir birimidir ve ortalama 0.7x2 mm boyutlarında poligonal bir doku kitlesidir.
Bazı hayvanlarda (domuz gibi) bu lobüller bir bağ dokusu bölmesi ile birbirinden ayrılırlar ama insanda bu söz konusu değildir, lobüller çoğu bölümlerinde birbirleriyle yakın temasta oldukları için kesin sınırlarını belirlemek oldukça güçtür (24). Lobüllerin birleştiği bölümlerde bağ dokusu artarak üçgen bir yapı oluşturur. Portal kanal, Glisson üçgeni, Kiernan aralığı ya da Portal aralık olarak adlandırılan bu bölgede portal venin bir dalı, bir hepatik arter, bir safra duktusu ve lenf damarı bulunur. Hepatik arter, portal ven ve safra duktusundan oluşan üçlü yapıya ’portal triad’ adı verilir (32). Venül, genelde çapı en büyük olandır. Venül duvarı ince ve lümen düzensizdir. Superior ve inferior mezenterik ve splenik venlerden gelen kanı taşır. Arter, venüle göre daha düzgün lümenli ve daha kalın duvarlıdır. Çapı venüle göre daha küçüktür. Abdominal aortun çölyak dalından gelen kanı taşır. Safra kanalı ise belirgin tek katlı kübik epitel ile örtülü (35,36) olup hepatositlerden gelen safrayı hepatik kanal içine boşaltır (24).
Portal kanalı lobülün dışında yer alan hepatositler çevreler. Bağ dokusu stroması ile hepatositler arasındaki alan Mall bölgesi olarak tanımlanmaktadır ve bu bölgenin karaciğer lenf yapım bölgeleri olduğu düşünülmektedir (32). Portal alanlarda bu üçlü yapının yanı sıra lenf damarları ve sinir fibrilleri de bulunur. Portal alanda yer alan sempatik (postganlionik) sinir fibrilleri çölyak gangliondan, parasempatik (preganglionik) sinir fibrilleri ise N. Vagus'tan kaynaklanır. Her iki sistem de portal alandaki arteriyal kasların innervasyonunu sağlar (35,36). Karaciğerin yapısal organizasyonunu ve fonksiyonlarını açıklamak için üç farklı karaciğer lobülü tanımlanmıştır (Şekil 2.4). Bunlar; yapısal parametrelere dayalı olan karaciğer lobülünün klasik kavramı, birbirine komşu lobüllerden aynı safra kanalına safra boşalımı yaklaşımına dayalı portal lobül kavramı ve birbirine komşu lobüllerin venöz sinüzoidleri boyunca oksijenin dağılım derecelendirilmesine dayalı karaciğer asinusu (hepatik asinus, portal asinus) kavramıdır (31).
Klasik karaciğer lobülü poligonal şekilde olup merkezde vena centralis ve köşelerde portal alan bulunur. Sinüzoidlerden gelen kan lobülün merkezinde bulunan v. centralise drene olur. Hepatositler ışınsal olarak dizilmiş ve bir duvarın tuğlaları gibi düzenlenmişlerdir. Bu hücre plakları lobulün periferinden merkezine doğru yönelmişlerdir. Labirent şeklinde ve sünger benzeri bir yapı oluşturacak biçimde serbestçe anastomozlaşırlar. Bu plaklar arasında sinüzoid kapillerler uzanır. Klasik
karaciğer lobülünde kan akışı periferden merkeze doğrudur. Safra ise kan akışının tam tersi yönde akar. Safra, safra kanaliküllerinden intralobüler safra kanallarına; daha sonra Herring kanalına geçerek portal alandaki safra kanallarına boşaltır (31).
Safranın salgılanışı dikkate alınarak yapılan bir diğer lobülasyon tipi olan portal lobülde, merkezde portal kanal, üçgen biçimindeki lobülün köşelerinde birer santral ven bulunmaktadır (32). Portal lobül de kan akışı merkezden perifere, safra akışı ise periferden merkeze doğrudur (31).
Karaciğer asinüsü kavramı karaciğerin yenilenme koşullarını, metabolik aktiviteyi ve siroz gelişimini tanımlamak açısından daha uygundur. Karaciğer asinüsü interlobuler damarlar ekseninde iki santral ven ve iki portal triad arasında yer alan oval biçimli bölgedir. Burada kan asinüsün merkezinden v. centralise doğru akar (37).
Şekil 2.4. Karaciğer lobül modelleri (36)
Karaciğer asinusunda sınırlar bir hepatik arterin son dalı ile belirlenebilmektedir.
Arterden gelen kanın venöz sinüzoidler boyunca akışı oksijenlenmede ve beslenmede zon I, zon II ve zon III olarak adlandırılan bir derecelendirme oluşturur (31).
Zon I (periferik zon); gerek besin, gerekse oksijenden en zengin bölgedir. Zon I’ deki hücreler damarlara en yakın hücrelerdir. Bu bölgede kan lobülün merkezinden perifere doğru ilerlediğinden oksijen ve besinden zengin kanla karşılaşan zon 1 hücreleri sürekli aktivite gösterirler. Bu bölge kanla karşılaşan ilk bölge olduğu için kanda bulunacak olası bir toksik maddede etkilenecek ilk bölge de yine zon I’ dir (38,39).
Zon III merkezi vene en yakın olan bölümdür ve bu bölge oksijenden en fakir bölümdür. Dolayısıyla hipoksi durumunda ilk etkilenecek bölge zon’ III tür (31).
Karaciğerde oluşan fizyolojik ve patolojik yağlanmanın ilk görüldüğü bölge de zon III tür (39). Zon II, ise gerek besin maddeleri gerekse oksijen miktarı bakımından ara bir durumdadır (31).
Bu şekilde zonlara ayrılarak yapılan tanımlama ile hepatositlerin çeşitli toksik maddelere karşı farklı derecelerde gördükleri hasarın nedeni açıklanmaya çalışılmıştır (33, 34, 40). Karaciğerdeki patalojik değişiklikler genelde klasik lobül ile ilişkili olarak tanımlansa da (31) karaciğerin fonksiyonlarını açıklamada birbirlerinin tamamlayıcı unsurları olduğu belirtilmektedir (32).
Santral venden başlayarak perifere doğru anastomozlaşarak ilerleyen hepatosit kordonları arasında sinüzoid kapillerleri yer alır (33, 34, 36). Karaciğerin önemli yapılarından olan sinüzoidler, geniş lümenli 9- 12 mikron çapa sahip ve düzensiz şekilli özel tipte kapillerlerdir (32). Karaciğerdeki sinüzoidal kapillerler kesintili pencereli endotel tabakasından oluşan düzensiz olarak genişlemiş damarlardır. Endotel hücrelerinin altındaki bazal lamina kesintilidir ve sinüzoidler ince bir retiküler lif ağıyla desteklenir (24). Sinüzoidler v.porta ve a. hepaticadan gelen kanı alır ve v. centralise açılırlar (39). Zon I’de sinüzoidler kıvrımlı, dar ve anastomotik olup zon III’e göre daha paralel ve genişleme eğilimindedir (41-43). Kan akışı tek yönlü olarak sinüzoidlerde zon I’den zon III’e doğru olur. Sinüzoidlerde mikrosirkülasyonda değişiklik gösterir (41, 44, 45). Sinüzoidlerde endotel hücreleri, Kupffer hücreleri ve perisinüzoidal yağ depolayıcı hücreler (ito hücreleri) bulunur (32). Sinüzoidal hücreler lobüler parankimanın % 6’sını (% 2,5 endotelyal, % 2 kupffer ve % 1,4 ito hücreleri) ve karaciğer plazma membranının % 26,5’ini temsil eder (41, 44, 45).
Endotel hücreleri sinüzoid duvarında bulunan ince sitoplazmalı, heterokromatik çekirdekli hücrelerdir (39). Sitoplazmasında çok sayıda delikler bulunması nedeniyle pencereli tiptedir. Az miktarda organel bulunan sitoplazmasındaki pinositotik veziküller pinositoz aktivitesine sahip olduklarının göstergesidir (32). Gerek endotel hücrelerinin aralıklı yerleşimi, gerekse endotel hücrelerinin altındaki bazal laminanın kesintili olması kandan Disse aralığına madde geçişini kolaylaştırır (24).
Sinüzoid duvarında endotel hücrelerine ek olarak mononükleer fagositer sistem hücresi olan Kupffer hücreleri olarak adlandırılan makrofajlar da bulunmaktadır (24).
1876 yılında Von Kupffer isimli araştırmacı tarafından karaciğer perisinüzoidal bağ dokusunda altın kloroid yöntemi ile gösterilmiştir (28,36). Çevreye stoplazmatik
uzantıları olan yıldız biçimini andıran hücrelerdir. Lümene ve sinüzoid duvarını sınırlayan endotele doğru uzanan stoplazmik çıkıntıları vardır (Şekil 2.5). Belli aralıklarla endotel hücreleri arasında bulunurlar. Kan monositlerinden köken alırlar ve fagositoz yetenekleri vardır (46). Zon I’de zon III’den daha fazla bulunan (41) Kupffer hücreleri, oval şekilli büyük bir çekirdeğe sahiptirler. Granüllü endoplazmik retikulum ve golgi aygıtı iyi gelişmiştir. Bu da aktif şekilde protein sentezi yaptıklarını gösterir.
Sitoplazmada bol lizozom bulunur (31,36,47). Kupffer hücrelerinin başlıca görevleri yaşlanmış eritrositleri ortadan kaldırmak, kalın bağırsaktan portal kan yoluyla gelen bakterileri fagosite etmek ve immunolojik olaylarla ilgili proteinleri salgılamaktır.
Karaciğer hücrelerinin %15’i Kupffer hücreleridir (24). Kupffer hücreleri KP1 (anti- CD68) gibi monoklonal antikor ile tanımlanabilir (41).
Şekil 2.5. Kupffer hücrelerinin elektron mikroskobik görüntüsü (48)
Sinüzoid duvarında yer alan diğer bir hücre tipi de yağ depolayıcı hücrelerdir. Bu hücreler sıklıkla inter hepatositik girintide yer alarak lipit ve vitamin A içerirler.
Endotelyal hücreleri çevreleyen ince ve uzun sitoplazmik bir yapıdadır (49). Sağlıklı karaciğerde bu hücreler, retinoidlerin alınması, depolanması ve salınması, bazı ekstrasellüler matriks proteinlerinin ve proteoglikanların sentezi ve salgılanması ve çeşitli düzenleyici maddelere (örneğin prostaglandinler ve tromboksan A2) yanıt olarak sinüzoid lümen çapının düzenlenmesi gibi bazı işlevler görür (24). Ayrıca retiküler ve
kollagen lif yapımına katıldıkları, fetal dönemde hemopoiesis için kök hücreler oldukları düşünülmektedir (32).
Hepatositler ile sinüzoid endoteli arasında kalan bölge Disse aralığı, perisinüzoidal aralık veya subendotelyal aralık olarak tanımlanır. Retiküler fibriller ve az miktarda da kollagen fibril içerir. Hepatositlerin bu aralığa bakan yüzlerinde bol miktarda mikrovillus bulunur. Ara madde içermeyen bu bölge kanın şekilli elemenlarını da bulundurmaz. Ancak kan plazmasının varlığı, kan ile hepatositler arasında metabolitlerin aktif değişiminin gerçekleştiği ve karaciğer hücre yüzeyinde bulunan mikrovillusların bu değişimi artırıcı rol oynadıkları belirtilmektedir (32).
Hepatositler lobül içerisindeki fonksiyonel parankim hücreleridir (46). Karaciğer hücre topoluluğunun % 80 kadarını oluşturan bu hücrelerin yaşam süresinin 200-400 gün olduğu belirtilmektedir. 20-30 mikrometre çapındaki bu hücreler poligonal biçimli olup, dallanma, anastomozlaşma gösteren plakalar şeklinde düzenlenmişlerdir. Hepatositler;
kan damarları ile safra kanalikülü arasında madde transferinde önemli rol oynayan sinüzoidal, kanaliküler ve intersellüler olmak üzere üç yüzeye sahiptir. Hepatosit yüzeyinin %70’ini oluşturan sinüzoidal yüzey hepatositlerin Disse aralığına bakan bol mikrovillus içeren yüzeyi olup, sinüzoidler ve hepatositler arasında materyal transferinin yapıldığı alanlardır. Birbirine komşu iki hepatosit arasında bulunan kanaliküler yüzey hepatosit yüzeyinin yaklaşık %15 kadarıdır ve hepatositlerden kanalikül içine safranın verildiği yüzeydir. Safra kanalikülü komşu iki karaciğer hücresinin düzgün seyreden membranları arasındaki 0.5- 2.5 µm çapındaki tübüler bir aralıktır. Bu bölgeyi sınırlayan hepatosit membranları lümen içerisine uzanan mikrovillusları oluşturur. Hepatositlerin intersellüler yüzeyleri sinüzoidler veya kanaliküllerle temasta olmayan, komşu hepatositler arasındaki yüzeydir ve hepatosit yüzeyinin diğer %15’lik bölümüdür (32).
Hepatositler büyüklüğü hücreden hücreye değişen, merkezi yerleşimli, büyük yuvarlak ve düzgün yüzeyli nükleuslara sahiptir. Çoğunlukla tek nükleus içeren karaciğer hücrelerinin % 25 kadarı çift nükleuslu olabilir. Nükleus birkaç dağınık kromatin grubu ile birlikte bir ya da daha çok veziküler nükleolus içerir (32). Portal alanlardan farklı uzaklıklarda bulunan hepatositler yapısal, biyokimyasal ve histokimyasal farklılık gösterirler. Yani hepatosit sitoplazması, işlevsel durumuna bağlı olarak farklı oranda organel ve inklüzyon içerir. Sitoplazmada yuvarlak, uzun şekilli, yassı veya tübüler
kristaya sahip çok sayıda mitokondri çeşitli hücre işlevlerinde kullanılmak üzere ATP sentezler. Hepatosit sitoplazması bol miktarda lizozom içerir. Hepatosit lizozomları hücre içi organellerin yıkım ve dönüşümü için önemlidir (28,50). Bazofilik karakterde olan sitoplazmasında hem granüler hem de agranüler endoplazmik retikulum (GER, SER) bulunur. Dallanma gösteren tübüler bir ağ yapısında olan SER glikojen yapımında fonksiyon görmektedir. Birbirine paralel sisternalar şeklinde izlenen GER, protein sentezinden sorumlu organeldir (32). Hepatositler, çapları 0,2-1 µm arasında değişen yaklaşık 200-300 adet peroksizom içerirler (31,35). Golgi kompleksi hepatositlerde tipik olarak safra kanaliküllerine yakın ve çekirdek etrafında yerleşmiştir. Salgılanan proteinlerin glikolizasyonuna ve lizozomal enzimlerin çeşitlenmelerine katkı sağlar. Lizozomun oluşumu, plazma proteinlerinin sentezi, glikoprotein ve düşük dansiteli lipoproteinlerin salgılanması fonksiyonlarını görürler. Hepatositlerde glikoz, glikojen olarak depo edilir.
Elektron mikroskobik incelemelerde glikojen, düz endoplazmik retikulum kümeleri içinde toplanmış granüller halinde görülür (28, 31, 33).
2.2.MAST HÜCRELERİ
Granüllü mast hücreleri ilk defa 1879 yılında Paul Ehrlich tarafından tanımlanmış ve adlandırılmıştır. Kemik iliğindeki CD34 (+) hematopoetik kök hücrelerden köken alırlar, fakat kemik iliğini terk etmeden olgunlaşmaz ve dolaşıma progenitor hücreler olarak girerler. Periferik dokulara ulaşıncaya kadar periferik kanda dolaşır, vaskularize dokulara gider, mikro çevresel faktörlerin etkisi altında fenotipik ve işlevsel olarak olgun mast hücrelerine farklılaşırlar (51-53). Mast hücreleri; yerleşimlerine göre yuvarlak, oval veya mekik şeklinde ortalama 15-30 µm büyüklüğünde olan, sitoplazması bazofilik granüllerle dolu (Şekil 2.6), küçük çekirdekli hücrelerdir (54,55).
Şekil 2.6. İri büyük granüllerle dolu mast hücresinin görünümü (56).
Normal karaciğerin içinde, insanda milimetre kare başına (~1.2- 3.9/mm²) mast hücrelerinin yoğunluğu, nadir olmasına rağmen sıçan karaciğerinde daha boldur (~1.8- 12/mm²). Mast hücre proteazlarına karşı kullanılan antikorlar veya metakromatik boyalar; karaciğer mast hücrelerinin genellikle insan ve sıçan karaciğerinde portal alanların safra kanalları, venler ve hepatik arterlere bitişik bağ dokusunda yerleştiğini göstermiştir. Fakat karaciğer mast hücrelerinin %10’u insan karaciğerinde perisinüzoidal yerleşime sahiptir (57- 59). Bağ dokularında özellikle mukozal yüzeylerde kan ve lenf damarları ile periferik sinirlere yakın yerleşimli olarak yer alırlar. Bu stratejik yerleşimlerinden ötürü, allerjenler ve mikroorganizmalar gibi çevresel uyarılara maruz kalırlar, dakikalar veya saatler sonrasında daha önceden hazırlanmış veya yeni sentezlenmiş medyatörlerini salgılayabilirler. Bugün mast hücreleri ve içerdikleri çok sayıdaki mediatörlerin doğal ve kazanılmış immunite, enfeksiyonlar, alerji, bazı kardiyovasküler ve nörolojik hastalıkların yanı sıra, yara iyileşmesi, fibrozis, anjiyogenezis ve otoimmun hastalıklarda da rolleri olduğu düşünülmektedir (51). Mast hücreleri granüllerinde 20’den fazla maddeyi sentezleyip depo edebilirler. Mast hücrelerinin mediyatörleri başlıca iki grup altında incelenmektedir:
1) Mast hücresinde uygun uyaranlar sonucu sentezlenip; granüllerde daha önceden depolanan biyoaktif moleküller (kemotaktik maddeler, sitokinler, heparin, histamin, kininler, proteazlar ve peptitler) gibi,
2) Immünoglobülün E (IgE), antijen veya diğer uyarılardan sonra sentezlenip derhal serbest bırakılan (de novo sentezlenen), lökotrienler, prostaglandinler, platelet aktive edici faktör, gibi kısa ömürlü moleküller. Mast hücreleri ayrıca nitrik oksit (NO) ve vazoaktif intestinal peptit (VIP) gibi çeşitli fizyolojik etkileri olan maddeleri de salgılarlar (60,61). Bunlara ilaveten mast hücreleri bir çok biyojenik amini alma, depolama ve salgılama özelliğine de sahiptirler (51,61-63). Mast hücrelerinin granüllerindeki mediatörlerinin büyük bir kısmını histamin ve serotonin oluşturur.
İnsanda yalnızca histamin bulunurken kemiriciler de serotonin ile birlikte histamin de bulunur. Bunun yanında heparin ve kondroitin sülfat proteoglikanları da bulunur. Nötral proteazların (kimaz, triptaz, karboksipeptidaz-A gibi) miktarları ve tipleri türlere ve farklı mast hücre populasyonlarına göre değişir. Aktive olan mast hücresi
membranlarında bulunan öncül maddelerden lipit mediatörleri sentezlerler. Duruma göre değişen bu mediatorlerin bugün bilinenleri arasidonik asit türevleri, prostaglandin D2, tromboksanlar, lökotrienler ve trombosit aktive edici faktor (PAF)’lerdir. Mast hücreleri fenotipine ve uyarıya göre çeşitli sitokinler ve kemokinler de sentezlerler (interlokin- 1, 3, 4, 6, 9, 10, 13, TNF-α v.b.) ve bunlardan bazıları otokrin etkiye de sahiptirler (51, 64, 65).
Mast hücreleri, uygun koşullarda metakromazi gösteren sitoplazmik granüllere sahip bağ doku hücreleridir. Farklı yerleşim gösteren mast hücreleri farklı histokimyasal, sitokimyasal, yapısal ve fonksiyonel özelliklere de sahiptirler. Memeli mast hücreleri ve bazofillerin birçok sitokimyasal ve fonksiyonel özellikleri benzer olmasına karşın birbirinin aynı hücreler değillerdir. Mast hücreleri kökenleri, yerleşim yerleri, kullanılan tespit solüsyonuna verilen cevap, taşıdığı glikozaminoglikanların türü, intragranüler serin proteinazın türü, histokimyasal farklılıklar, fonksiyonel kriterler ve hücrelerin morfolojik ozellikleri gibi unsurlar göz önüne alındığında, bağ doku mast hücresi (connective tissue mast cell - CTMC ) ve mukozal mast hücresi (mucosal mast cell - MMC) olmak üzere iki alt gruba ayrılmaktadır. Mast hücre populasyonları arasındaki heterojenitenin tanımlanmasında Enerback’ın sıçan bağırsaklarında tanımladığı adlandırma yaygın olarak kullanılmaktadır. Mukozalarda, özellikle de sindirim ve solunum sistemi mukozalarında bulunan mast hücreleri, diğer bölgelerde bulunan mast hücrelerinden daha küçük ve daha az granül içermektedirler. Bu bölgelerde bulunan mast hücreleri “ atipik ya da mukozal mast hücresi (MMC)” olarak adlandırılmaktadır.
Diğer yandan deride, damar yakınlarında ve organ serozalarında yerleşen ve daha iri hücreler ise“tipik ya da bağ doku mast hücresi (CTMC) olarak isimlendirilmektedir (61,66-69). CTMC’ lerine spesifik proteoglikan molekülü heparindir. MMC’lerinde bulunan proteoglikan molekülü ise kondroitin sülfattır. Bu iki molekülün alcian blue- safranin boyalarına verdikleri reaksiyon farklıdır. Işık mikroskopik incelemelerde CTMC’ leri içerdikleri heparine bağlı olarak safranin ile kırmızı boyanmaları ile ayırt edilirken, MMC’ leri içerdikleri kondroitin sülfata bağlı olarak alcian blue ile mavi boyanmaktadırlar (61, 69, 70). Mast hücrelerindeki bir başka durum ise bu iki tip mast hücresinin proteaz içeriklerinin farklı oluşudur. Sıçanlarda bu farklıklık mast hücre populasyonlarının taşıdıkları intrasitoplazmik granüller biyokimyasal olarak incelendiğinde, sıçan mast hücrelerinin iki farklı kimotripsin benzeri mast hücre proteinazını içerdiği görülmektedir. Bunlar sıçan mast hücresi proteinaz I (RMCP I) ve
sıçan mast hücresi proteinazı II (RMCP II) olarak adlandırılmaktadır. CTMC’i sıçan proteaz I (RMCP I), MMC’i ise sıçan proteaz II (RMCP II) olarak tanımlanan proteaz molekülünü içermektedir. Proteaz moleküllerinin immunohistokimyasal olarak işaretlenmesi tekniği ile mast hücrelerinin alt tip ayrımları yapılabilmektedir (52,53,68,71-73).
2.2.1.Mast Hücrelerinin Fonksiyonları
Mast hücrelerin en iyi bilinen fonksiyonu IgE aracılığı ile alerjik reaksiyonlara katılmasıdır. Anjiogenez ve yara iyileşmesi gibi olaylarda da rollerinin olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Ayrıca stres koşullarında mast hücrelerin aktive olarak degranülasyona uğradıkları ve granüler içerikleriyle farklı kaskatlara karıştıkları yine yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (69,74-76). Aktive olmuş mast hücreleri eozinofillerin kemotaksisi, aktivasyonu ve yaşamasına yardım eden mediatörler salgılarlar. Mast hücreleri, makrofajları ve epitel hücrelerini de lenfosit ve eozinofiller için kemotaktik maddeler oluşturmaları konusunda uyarırlar (51,77). Mast hücreleri esas olarak mikroorganizmaların vücuda girebildikleri yerlerde bulunduğu için patojenlerle direkt temas kuran ilk iltihabi hücrelerden biri olarak değerlendirilebilir.
Mast hücresinin enfeksiyon bölgesine TNF-α salgıladığı, bunun dolaşımdaki nötrofiller gibi bakterisidal özellikleri olan lökositleri enfeksiyon bölgesine topladığı gösterilmiştir (78). Mast hücreleri vasküler permeabiliteyi arttıran ve enfeksiyon bölgesine iltihabi hücrelerin toplanmasını sağlayan mediatörler salgılayarak kazanılmış bağışıklıkta yer alırlar. T hücrelerinin farklılaşması için gerekli IL- 4, mast hücrelerinden salgılanmaktadır. Mast hücresi sitokinlerinin, B hücrelerinde IgE yapımını uyardığı, mast hücrelerinin antijen işleyebilen ve sunabilen hücreler olarak da kazanılmış bağışıklıkta rol oynadığı bildirilmiştir (51,79,80). Morfolojik ve biyokimyasal çalışmaların her ikisinde de açık olarak ortaya çıkan fibrosis; mast hücreleri, onların sitokinleri (IL- 3, IL- 4) ve büyüme faktörleri ve ayrıca T hücreleri ve makrofajlar gibi inflamatuar hücrelerin bir çesidinin etkileşiminden ortaya çıkan kollajen birikiminin sonucudur. Mast hücreleri fibrozisin esas sorumluları olan fibroblastları direkt etkileme potansiyeline sahiptirler. Histamin ve heparin fibroblastların çoğalmasını ve kollajen sentezini arttırmaktadır. Mast hücresindeki triptaz ve kimazın her ikisinin de fibronektin, laminin, kollajen tip IV ve V’i yıkıma uğratabildiği gösterilmiştir. Triptaz normal akciğer ve deri fibroblastlarında tip I kollajen yapımını uyarmaktadır. Proteazlar veya histamin gibi mast hücre mediatörlerinin mitogenesis veya fibroblast
proliferasyonuna yardım ettiği gösterilmiştir (51,81-85). Son bulgular, mast hücrelerinin, nitrik oksit sentaz ürettiğini ve endojen nitrik oksitin bir kaynağı olduğunu göstermektedir (86).
2.3. ENDOTOKSEMİ VE LİPOPOLİSAKKARİT (LPS)
İnflamasyon, inflamatuar bir stimulusa cevap olarak ortaya çıkan dinamik olaylar zinciridir. İnflamasyon alanında vazodilatasyonu takiben kan akımı değişiklikleri, damar permeabilite artışı, ödem oluşumu, lokal lökosit birikimi gözlenir.
SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome; SIRS), endotoksemi, bakteriyemi, viremi, fungemi, sepsis, septik şok ve çoklu organ yetmezliği gibi birçok patojenin ortak klinik görüntüsüdür. Sepsis “enfeksiyona sistemik inflamatuar yanıt” olarak tanımlanabilir. Özellikle Gram (-) bakterilerin meydana getirdiği SIRS, sık görülmesi, yüksek ölüm oranı (%30- 90) ve kolay deneysel metodlar kurulabilmesi nedeniyle Gram (+)’lere göre daha çok araştırma konusu olmuştur. Aslında SIRS çoğu zaman “endotel disfonksiyonu” ile beraber seyretmektedir (2-7).
Sepsis patofizyolojisinde bazı önemli olaylar gelişmektedir. Bunlardan birincisi monosit, makrofaj, nötrofil ve endotel hücrelerinin sepsise karşı yanıtın başlatılması ve sürdürülmesinde önemli rol oynamasıdır (87-92). Sepsis patofizyolojisinde yer alan öteki önemli olaylar ise yangı ve koagülasyonun başlamasıdır (93). Yangı ve koagülasyon olayları bir kez başladığında birbirleri ile etkileşerek konakçının sepsise karşı olan yanıtını güçlendirirler; örneğin, yangının gelişmesine neden olan mediyatörler, dolaşımda bulunan monositlerin, doku makrofajlarının, nötrofillerin ve endotel hücrelerinin yüzeyinde bulunan doku faktörünün ekspresyonunu indükleyerek koagülasyon olayını artırabilmektedirler (94-100). Yangının başlaması ile birlikte sitokinler, kemokinler, adhezyon molekülleri, reaktif oksijen ve nitrojen türleri gibi mediyatörlerin aşırı ve kontrolsüz bir biçimde oluşumunun artması (Şekil 2.8) sepsisin patofizyolojisine katkıda bulunmaktadır (101).
Endotoksin gram negatif bakterilerin hücre duvarının bir parçasını oluşturur ve canlı dokuya girdikten sonra akut bir yangı başlatılmasından sorumludur (102). Gram negatif bakteri hücre duvarı; içte peptidoglikan tabaka, dışta lipopolisakkaridler, proteinler ve fosfolipitlerden oluşur. Lipopolisakkarid tabaka da bulunan endotoksin molekülü, hücre membranında kaldığı sürece inaktiftir. Hücrenin hızlı büyümesi veya hücre yıkımı
sırasında açığa çıkan endotoksin sepsis/endotoksemide olaylar dizisini başlatan anahtar moleküldür (103).
LPS genelde liyofilize toz halinde ticari olarak temin edilir. Escheriachia coli (E.coli), Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa gibi birçok Gram (-) bakteriden elde edilmesine rağmen deneysel septik şok çalışmaları E. coli’den elde edilen LPS’ler üzerinde yoğunlaşmıştır. Toz halindeki LPS planlanan deneysel çalışma protokolleri esas alınarak, suda çözülerek deney hayvanlarına periton veya damar içine tek doz ve/veya infüzyon şeklinde verilir. Literatür incelendiğinde uygulanacak dozun 1 mg/kg ile 80- 100 mg/kg gibi geniş bir doz aralığına sahip olduğu gözlenebilir. Sağkalım (survival) çalışmalarında dozlar genelde yüksektir (2- 7).
LPS; lipit A, çekirdek oligosakkarit ve yineleyen polisakkarit zincirlerinden oluşmaktadır (Şekil 2.7). Dış kısmında bulunan O-antijen yapısının bakteri türlerine bağlı olarak antijenitesi bulunmaktadır. Orta kısımda yer alan çekirdek bölge daha az antijenik değişkenlik göstermektedir. En içteki bölgede ise lipit A yapısı bulunmaktadır (87).
Şekil 2.7. Lipopolisakkarit(LPS)’in yapısı (87)
Lipit A, yüksek derecede immünreaktiftir ve Gram negatif sepsiste gözlenen toksik etkilerin birçoğundan sorumludur. Lipit A'nın başlıca etkisi, makrofajları etkinleştirmesi ve yangıya neden olan olayları tetiklemesidir. Monositler, makrofajlar, nötrofiller ve endotel hücreleri enfeksiyona karşı gelişen yanıtta önemli rol oynarlar; ayrıca, bu hücrelerde LPS için reseptörler bulunur. Cluster of differentiation (CD)14 ve Toll benzeri receptor (TLR) bütün bakteriyi veya LPS gibi bakteriyel ürünleri tanıyan ve onlara bağlanan hücre yüzeyindeki reseptörlerdir (8). LPS, lipit bağlayıcı protein (LBP) adı verilen yaklaşık 55 kDa molekül ağırlığında ve hepatositler tarafından sentezlenen bir protein ile etkileşmektedir. Bu kompleks daha sonra makrofaj yüzeyindeki LPS reseptörlerinden CD14 ile etkileşir (101). LPS, CD14 molekülleri sayesinde yangı hücrelerine tutunur ve böylece çeşitli sitokinleri ve kemokinleri (ön aracı ürünler) üretime geçirir (Şekil 2.8). Septik şokta görülen lezyonlara LPS’nin uyarımı sonucu
makrofajlardan salgılanan üç tip yangı mediatörü neden olur. Yangı sitokinleri (IL- 1, IL-6, IL-12, TNF-a), reaktif oksijen ve nitrojen metabolitleri ve araşidonik asit metabolitleridir (prostaglandinler, leukotrienler) (104). Bu ara ürünler dolaşımda hemodinamik dengesizliğe, hücre-organ işlev bozukluğuna neden olarak apoptozise, nekroz ile de hücre ölümüne neden olurlar (105).
Şekil 2.8. Endotoksinlerin etki mekanizması (104)
Karaciğerin, sepsis tarafından en çok etkilenen organ olduğu düşünülmektedir. Çünkü, organizmanın immunolojik savunma mekanizmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır (9- 12).
Karaciğer, sepsiste 2 zıt role sahiptir: bunlardan birincisi; inflamatuar mediatörlerin bir kaynağı gibi iş görmesi, ikincisi ise inflamatuar mediatörlerin etkileri için hedef bir organ olmasıdır (13).
Karaciğer aynı zamanda vücuttaki makrofajların (Kupffer hücreleri) büyük bir kısmını oluşturduğu için ciddi enfeksiyonlara yanıt verilmesinde ve organizmanın immünolojik savunma mekanizmalarında çok önemli görevler üstlenmesi sebebiyle, sepsisten en çok etkilenen organlardan birisidir. İn vitro ve in vivo deneyler sonucunda, sepsis sırasında
oluşan hemodinamik ve metabolik değişikliklerin; nitrik oksit (NO), sitokinler ve eikosanoidlerin (prostaglandin öncülü maddeler) üretimindeki belirgin artışlarla ilişkili olduğu gerçeği ortaya çıkmıştır. Sepsisteki hiperdinamik yanıt ve artmış sitokin düzeylerinin; birçok dokunun endotel hücrelerinde inorganik nitrik oksit sentaz (i NOS) uyarılmasına yol açtığı her ne kadar faydalıymış gibi görünse de akut sepsiste i NOS artışının gerçekte organizma için zararlı sonuçlara yol açabildiği bilinmektedir (2-7).
2.4. PROPOLİS
Günümüzde giderek artan bir önem kazanan ve doğal bir ürün olan propolis; etimolojik olarak, pro- (savunmada ve savunma için) ve -polis (şehir ya da topluluk) kelimelerinden türetilmiştir ve ’şehrin (veya kovanın) savunulmasındaki madde’
anlamına gelmektedir (14,106,107). Propolis bal arıları (Apis mellifera Linneaus) tarafından bitki ve ağaçların yaprak ve sürgünlerinden toplanan reçineli bir karışımdır.
Propolis üretimi için arılar tarafından kullanılan materyal, bitkilerin yara bölgelerinden salgılanan maddeler olabildigi gibi, yapraklardaki lipofilik materyaller ile reçine, bal mumu, müsilaj, zamk gibi maddeler de olabilmektedir. Arılar bu salgıya daha sonra çeşitli enzimler ile polen kaynaklı maddeler de katmaktadırlar (106).
Propolisin kaynağını oluşturan bitkiler; kavak (Populus spp.), kayın (Fagus sylvatica) huş (Betula alba), kestane (Castanea sativa), at kestanesi (Aesculus hippocastanum), akçaağaç (Alnus glutinosa) ve çeşitli koniferlerdir (108). Kavak türü propolis hem kimyasal hem de tıbbi açıdan en iyi bilinen ve en yoğun şekilde incelenmiş olan arı reçinesidir (109).
Arılar, propolisi kovanlarındaki oyukları kapatmak, kovanın iç duvarlarını sıvamak, kovandaki çatlak ve yarıkları kapamak, girişi davetsiz misafirlere karşı korumak ve kovan içindeki ölmüş istilacıların cesetlerini mumyalamak için kullanırlar (14,106,107,110). Propolis, kovan içi sıcaklığın korunmasına yardımcı olur ve mikrobiyal kontaminasyona karşı en iyi savunmayı sağlar (111), antiseptik yararları ile de koloniyi hastalıklardan korur (107).
2.4.1.Propolis’in Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri
Propolis toplanma zamanına ve toplandığı alanın coğrafik yapısına, iklimi ve botanik kaynağına bağlı olarak koyu sarı, yeşil ve koyu kahverengi gibi değişik renklerde olabilir (112,113). Genel olarak 60- 69 0C arasında erime noktasına sahiptir (114).
Düşük sıcaklıklarda sert, donmuş halde bulunabilir ve 0 0C ‘de kırılgan özelliğe sahiptir.
Propolis yaşlandıkça rengi koyulaşabilir ve kırılganlaşabilir (14).
Propolis su ve hidrokarbon çözücülerde düşük, alkollerde ise yüksek oranda çözünürlük gösterir (115). Propolisin kimyasal bileşimi toplandığı alanın vejetasyonuna bağlıdır (116). Propolisin toplanma sezonu da, aynı bölgeden toplanan propolisin kimyasal yapısını etkileyebilmektedir (117).
Ham propolisin bileşimi kaynağına göre değişmekle birlikte, genellikle % 45- 50 reçine,
% 30 mum, % 10 esansiyel ve aromatik yağlar, % 5 polen ve % 5 diğer organik maddelerden oluşmaktadır (Tablo 2.1) (14).
Tablo 2.1. Propolis’in kimyasal bileşimi (107,118- 122)
Dünyanın değişik bölgelerinden toplanan propolis örneklerinde 200’den fazla kimyasal bileşik tanımlanmıştır (123). Propolis; polifenoller (flavonoid aglikonlar, fenolik asitler ve onların esterleri, fenolik aldehitler, alkoller ve ketonlar), seskuiterpen kinonlar, kumarinler, steroidler, aminoasitler ve inorganik bileşikler gibi çeşitli kimyasal bileşikler içermektedir (116,123). Propolisin yapısında pinosembrin, akasetin, krisin, rutin, katesin, naringenin, galangin, luteolin, kamferol, apigenin, mirisetin, kuarsetin gibi flavonoidlerin yanı sıra kafeik asit ve sinnamik asit gibi fenolik asitler de saptanmıştır (116,123). Ayrıca propoliste magnezyum (Mg), kalsiyum (Ca), iyot (I), potasyum (K), sodyum (Na), bakır (Cu), çinko (Zn), manganez (Mn) ve demir (Fe) gibi
mineraller, A, B1, B2, B6, C ve E vitaminleri ile çok sayıda yağ asidi tanımlanmıştır (123). Türkiye’nin farklı bölgelerinden toplanmış propolislerin ana bileşenlerinin naringenin, galangin, krisin, pinobaksin, kuarsetin gibi flavonoidler ve kafeik asit gibi fenolik asitler içerdiği rapor edilmiştir (124). Propolis örneklerinden izole edilen bileşiklerin en önemli grup, bitki aleminde oldukça yaygın olan flavonoid pigmentleridir (14,125). Flavonoidler, bitkisel orijinli, düşük molekül ağırlıklı, genellikle flavon çekirdeğine sahip olan bileşiklerdir. Bugüne kadar bitkisel orijinli 4.000’den fazla flavonoid türü tanımlanmıştır. Bitkilerin sahip oldukları renk, koku ve aromalardan da büyük oranda flavonoidler sorumludur (126). Bu bileşikler, sekonder bitki metabolitleri olduğu için, insanlar tarafından sentezlenemezler ve insan beslenmesi için önemlidir (125).
2.4.2. Propolisin Biyolojik Özellikleri
Propolisin tıbbi özellikleri tarihsel olarak çok eski zamanlardan beri bilinmektedir.
Yıllar boyunca propolis insanlar tarafından değişik hastalıkların tedavisinde kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalarla propolisin etanolik özütünün antibakteriyel, antifungal, antiviral, antiprotozoal, antienflamatuvar, antikarsinojenik, antioksidan, lokal-anestetik ve immünostimülatör özellikler gösterdiği tespit edilmiştir (14).
Araştırmalarda en çok kullanılan propolisin etanolik ekstraktının, gram pozitif bakterilere daha belirgin olan antibakteriyel (127-130), en fazla Candida albicans’a olmakla birlikte Candida türleri ve dermatofitlere karşı antifungal (128,131-136), influenza (128), Herpes simpleks ve reovirüs üzerine antiviral (137), antiinflamatuvar (138,139), antioksidan (125,128,140-142), nöroprotektif (141), radyoprotektif (143), kardioprotektif (144), hepatoprotektif (145), immünostimülatör (146,147), sitotoksik (148), yara iyileşmesi (138,149) ve gastrik ülser üzerine olumlu etki gösterdiği (150) belirlenmiştir.
Farklı orijine sahip propolis örneklerinin biyolojik aktiviteleri ile ilgili olarak çok sayıda çalışma yapılmıştır. Brezilya propolisinin antibakteriyel, tümör hücreleri için sitotoksik, antifungal (130, 135, 151), Bulgar propolisinin antifungal, bakterisidal aktivitesi ve Helicobacter pylori’nin çoğalmasını engelleyici etkisi belirlenmiştir (135,152,153).
Günümüze kadar, Türk propolisinin ise antibakteriyel (15, 154,155,), antifungal (136) antioksidan (140), antikarsinojenik (156) gibi çok sayıda biyolojik aktivitesi
gösterilmiştir. Propolisin yapısında bulunan bileşiklerin biyolojik aktiviteleri Tablo 2.2’
de özetlenmiştir (106, 118, 157,158).
Tablo 2.2. Propolisin yapısındaki bileşiklerin biyolojik aktiviteleri
Tek bir propolis bileşeni total ekstraktınkinden daha büyük bir aktiviteye sahip değildir.
Bu nedenle propolisin genel biyolojik özelliklerinin kendi bileşenlerinin doğal karışımından dolayı olduğu ileri sürülmektedir (107).
2.4.3. Propolisin Hastalıkların Tedavisinde Kullanımı
Propolisin kullanımı M.Ö 300 gibi çok eski zamanlara kadar dayanmaktadır. Dünyanın birçok bölgesinde internal ve eksternal olarak yöresel halk ilacı olarak kullanılmıştır (107). Son zamanlarda, propolis sağlığı geliştirmek ve hastalıkları önlemek için yiyecek ve içecekler içinde kullanılmaktadır (159).
Propolis günümüzde krem, merhem, losyon, jel, sprey, şurup, tablet, şampuan, diş macunu, kapsül, propolis tentürü, kozmetik ürünler şeklinde piyasalarda bulunabilmektedir (106). Propolis içeren merhemin genital herpetik lezyonları
iyileştirdiği ve lokal semptomları azalttığı gösterilmiştir (160). Propolis merhemleri veya ekstraktları ile topikal tedavi sadece Herpes enfeksiyonlarında değil aynı zamanda diş hekimliği, dermatoloji ve kulak- burun- boğaz’da da kullanılmaktadır (106).
Propolisin düşük dozlarda güvenilir olduğu düşünülmektedir (106). Burdock’a göre propolis toksik değildir ve insanlar için güvenli konsantrasyonunun 1.4 mg/kg/gün veya ortalama 70 mg/gün olabileceğini önermektedir (14). Bununla birlikte, günde 15 gramın üstündeki dozlarda yan etkiler görülebilmektedir. Çok sık karşılaşılan yan etkiler deri ve mukoza irritasyonları gibi alerjik reaksiyonlardır. Ekzema ve ürtiker hastalarında ve astım hastalarının tedavisinde kullanırken dikkatli olunmalıdır (106).
2.5. LİPİD PEROKSİDASYONU VE MALONDİALDEHİT (MDA)
Lipid peroksidasyonu, membranlarda bulunan poliansatüre (çoklu doymamış) yağ asitlerinin serbest oksijen radikalleri tarafından peroksitler, alkoller, aldehitler gibi çesitli ürünlere yıkılması reaksiyonuna verilen isimdir. Lipid hidroperoksitleri yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşurlar. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından genişleyip hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar. Böylece birçok hastalığa ve doku hasarına sebep olurlar (161).
Peroksidasyon sırasında açığa çıkan malondialdehit (MDA) gibi yıkım ürünleri, çeşitli hücre bileşenleriyle reaksiyona girebilmekte ve böylece hücre yapısı ve fonksiyonunu bozabilmektedir. Lipid peroksidasyonunun bilinen en yaygın son ürünü olan MDA, ikiden fazla çift bağ taşıyan doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonu ile oluşmaktadır.
Nispeten küçük yapısı ve nonpolar özellikte olması; MDA’nın biyomoleküllerle etkileşimini kolaylaştırmakta ve başta membranlar olmak üzere, asağıda sıralanan yapısal ve fonksiyonel değişikliklere yol açmaktadır.
Membran permeabilite, deformabilite, akışkanlık gibi özelliklerin değişmesi sonucunda iyon transportunun ve buna bağlı olarak intrasellüler iyon dengesinin bozulması;
oksidatif hasar nedeniyle enzim aktivitesine sahip bazı membran proteinlerinde aktivite kaybı; nükleer membrandan kolayca diffüze olabilmesi nedeniyle DNA ile etkileşimi:
DNA zincirinin kırılması (162,163).
