AHMET GÜL

Doç. Dr. Ahmet Gül

MFTP-D, Perinatal Tıp Toplantısı İzmir, 28-29 Nisan 2017

Maternal kanda fetal DNA tabanlı testler

cfDNA ile tarama:

Kime? Nasıl?

 cfDNA yöntemleri

 cfDNA testinin özellikleri/duyarlılığı ?

 Hangi durumda, kime ?

 Dünyadaki uygulamalar, öneriler ?

 Günlük pratikte durum ?

cfDNA ile tarama: Kime ? Nasıl ?

 “Cell free DNA”: Hücre dışı serbest DNA, trofoblast hücre-plasenta kökenli

 Maternal ve fetal DNA karışık

 cffDNA oranı %2-20 arasında

 cffDNA parçaları genel olarak 140-160 bp, tümü <300 bp

 cf-maternal DNA görece daha büyük, %20’i

>300 bp

cfDNA: “cell free DNA”

1997, Lo YMD et al., Lancet Maternal kanda fetal DNA Oxford, İngiltere

cfDNA: Kısa tarihçesi

1948-serum

1951-Romatoid sera 1966-SLE

1977-Kanser

1989-Kanser

 “Non-invasive prenatal diagnosis”

(NIPD)

 “Non-invasive prenatal testing” (NIPT)

 cfDNA testi (Hücre dışı serbest DNA testi)

 Fetal DNA testi

Terminoloji

 MPSS (Massively paralel shotgun sequencing”

 Hedeflenmiş dizileme (Targeted sequencing)

 SNP (Single nucleotid polymorphism)

cfDNA testi için kullanılan yöntemler

Benzer sonuçlar!

• cffDNA > %4 cfDNA raporlanıyor

• SNP ile %3 cffDNA ile çalışabiliyor

• Bazı testler %3-<%4 ile raporlama yapıyor, literatürde buna ilişkin bir bilgi yok.

Hangi cffDNA oranında

raporlanıyor

• cffDNA oranı (ortalama %10-20)

• cffDNA oranı artıyor

• Gebelik haftası ile

• PAPPA, HCG, T21 ile artıyor (T18, T13 ve X0’da görece az artıyor)

• cffDNA oranı düşük

• Kilo arttıkça

• < 10 hf Yaş, etnik köken etkilemiyor

Rava RP, Bianchi DW et al., 2014

Ashoor G. Et al., 2013, FMF

Temel etkenler Gebelik haftası Kilo

cffDNA oranı ve

etkileyen faktörler

• 10-21 hf cffDNA %10,

%0.10/hf. artıyor.

%2’de cffDNA < %4

• >21 hf, % 1/hf. artıyor.

2013, ABD

cfDNA: Sensivite ve Spesifite ?

• Yanlış pozitiflik ve negatiflik<%0.5-1

• Tanı testi değil, pozitif olması halinde karyotip çalışması ile teyit edilmeli.

• Gebelik terminasyonu için kullanılmamalı

T21: %99 T18: %97 T13: %93

Sensivite:

Spesifite:%99

CARE Study, ABD, 2014 cfDNA ve 1.tr. / 2.tr.

T21 için

PPV: % 45.5 NPV >%99

NEXT Study, ABD, 2015 cffDNA ve 1.tr.

T21 için

PPV: % 80 NPV >%99

cfDNA: PPV, NPV ?

T18, T13 için:

PPV: %30-40 NPV %99

T21 için

PPV: % 40-80

ACOG, 2015

Tahmin edilen cffDNA oranı Gerçek cffDNA oranı

cfDNA oranı %4-8 arasında duyarlılık?

Fetal anomali / bulgu varsa dikkat !

• ACOG – SMFM, 2012, 2014, 2015

• TJOD İstanbul, 2013 ve 2014

• RCOG – İngiliz KD, 2014

• SOGC – Kanada KD, 2014

• ISPD – Uluslararası Prenatal Tanı Birliği, 2013

• ASMG ve ESMG – Amerika ve Avrupa Genetik Dernekleri , 2015

• ISUOG – Uluslararası KD USG Birliği, 2014

• İsrail Genetik Birliği, 2014

• FMF, 2015

cfDNA kime önerelim ?

2012, 2014, 2015 ACOG, SMFM ve

diğer dernekler

Düşük risk grubu, ikiz gebelikler ve mikrodelesyon

sendromları için rutin cfDNA önermiyor. Cinsiyet

kromozomları için bilgilendirme sonrası seçenek

M aternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffDNA) ile

“Non-I nvasive Prenatal Test (NI PT)”

Uzman Görüşü

Katkıda bulunanlar (Soyadı sırasına göre); ASLAN Halil, BAKSU Başak, BAŞARAN Seher, BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GÜL Ahmet, HAS Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, ŞAHİNOĞLU Zeki, ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan, YÜKSEL Atıl

Yayınlanma tarihi: Ocak 2014

Fetal kromozomal hastalıklar için tarama programları 30 yıl önce biyokimyasal testler olarak başlamış, daha sonraları ultrasonografi ve biyokimyasal testlerin birlikte kullanımı şeklinde devam etmiştir. Aynı dönemde maternal kandan elde edilen fetal hücrelerde prenatal tanı çalışmaları yapılmış ancak klinik uygulamaya geçecek bir başarı elde edilememiştir. Lo YM ve arkadaşları¹, 1997 yılında maternal kanda hücre dışı serbest fetal DNA (cffDNA) tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Son 15 yılda, özellikle 2011-2012 yıllarında cffDNA çalışmaları artmış ve klinik uygulamaya girmeye başlamıştır. Önümüzdeki yıllarda günlük klinik kullanımının giderek artması beklenmektedir.

Maternal kandaki cffDNA oranı 11-13 gebelik haftalarında yaklaşık %10 iken, ilerleyen gebelik haftası ile artmakta ve genel olarak %3-20 arasında değişmektedir^2,3. Doğum sonrası maternal kandaki düzeyi hızla azalmakta ve postpartum iki saat sonra ise tespit edilememektedir. Başlangıçta maternal kanda prenatal tanı sözcüğü kullanıldı ise de, testin pozitifliği durumunda amniyosentez (AS) ve koryon villus biyopsisi (KVB) gibi yöntemlerle elde edilen fetal hücrelerde geleneksel kromozom analiz tekniklerinin uygulanması gerektiğinden ve henüz %100 duyarlılık ve özgüllüğe sahip olmadığından, yöntem ileri tarama testi olarak kabul edilmektedir ve genel olarak“non-invasive prenatal test” (NI PT) olarak adlandırılmaktadır^4,5. “cffDNA ile prenatal tarama”, “Fetal DNA (fDNA) ile prenatal tarama”, “Maternal kandan fDNA ile prenatal tarama” olarak da adlandırmak mümkündür.

Henüz tarama testi ise de, önümüzdeki yıllarda tanı testi olması beklenmektedir.

NIPT, genel olarak Trizomi 21 (T21), Trizomi 18 (T18), Trizomi 13 (T13) gibi daha sık görülen kromozom anomalileri için ileri tarama testi olarak kullanılmaktadır^4-6. cffDNA ile NIPT T21 ve T18’de görece daha başarılıdır, tespit etme oranı (Detection rate: DR)>%99 ve yanlış pozitiflik (False positivity: FP) <%1, T13’de ise DR %80 olarak bildirilmektedir^5,6. Şu ana kadar yapılan çalışmalarda yanlış negatiflik nadiren bildirilmiştirse de konu henüz tam bir netlik kazanmamıştır. Vakaların %2.2’de, cffDNA miktarı % 4’den daha az ve ayrıca

%2.6’sında test başarısız olduğundan vakaların % 4-5’de NIPT ile sonuç elde edilememektedir⁴.

cffDNA’nın kaynağı trofoblast hücreleri olduğundan %1-1,5 oranında plasentada gözlenen plasenta ile sınırlı mozaisizmin yanlış pozitif ya da yanlış negatif tanıya yol açabileceği kabul edilmektedir⁷. Yeterli deneyim sağlandıktan sonra bu tespit etme oranları ile

TJOD İstanbul, Nisan 2013 ve

2014

cfDNA’nın olası kullanım alanları

ASMG ve ESMG Mart 2015

• Sensivitesi ve spesifitesi yüksek, >%99 (rapor verilenlerde), PPV %45-80 arası.

• T21:Yanlış pozitiflik oranı <%0.5 (90-100 kat az), yanlış negatiflik <%1 (Next study, 2015)

• Pozitif cfDNA testi, amniosentez ile teyit edilmeli.

• Rutin öneri yok, Birincil veya ikincil test olarak

kullanılması ülke şartları ve maliyet benzeri etkilere göre karar.

• Seks kromozom anomalileri (SCA) ve mikrodelesyon sendromları için rutin önerilmiyor.

• Mikrodelesyon sendromlarının rutin taranması halinde

%3 yanlış pozitiflik, girişim oranının artması beklenir.

NHS / FMF, populasyonun %20-25’i cfDNA

1/101-2500, cfDNA veya izlem, S:%98

>1/100, CVS/cfDNA, (FMF, >1/10 CVS)

“Intermediate” – Ara grup ?

Avusturya/Almanya/İsviçre: cfDNA birincil veya ikincil test,

>1/1000 veya FMF-D:>1/500

Genel olarak 1/1000 içindeki ara grup

Düşük riskli grupta

cfDNA’nın durumu ?

ACOG, 2015

X0, XXY için sensivite %91, PPV %20-40

Düşük ve yüksek risk grubunda sensivite ve spesifite

benzer, %99 ancak PPV %33 (25y) ve %87 (40y)

Sonuç veremeyen cfDNA testi:

Ne yapmalıyız?

Sonuç veremeyen cfDNA testi:

Sıklık ve Nedenleri

Sonuç veremeyen: %2-5, (tekrar sonrası<%1-3)

Nedenleri:

 cfDNA oranı <%4

 Gebelik haftası

 Obezite

 T13, T18, T21, Triploidi vb.

 Kan almada teknik sorunlar

 Kan transfer sorunları

 Yeterli cfDNA kopya elde edilememesi...

 Neden sonuç verilemediği rapor edilmeli !

• >9 hf çalışmaya dahil edilmiş

• Sonuç verilemeyen: %23 anöploidi

(%75’i düşük cffDNA oranı) SNP yöntemi

Sonuç verilemeyen

(%6), >7 hf itibaren

• 15,841 vaka, anöploidi:%0.4

• cfDNA sonuç yok, anöploidi:%2,7

• ccfDNA <%4 ve cfDNA sonuç yok, anöploidi oranı: %4.7

Sonuç veremeyen cfDNA testi

Norton M et al., 2015

Hedeflenmiş MPSS Sonuç verilemeyen (%3)

Sonuç veremeyen cfDNA testi:

Ne yapmalıyız?

 Tekrar test / Genetik danışmanlık

 Detaylı fetal USG-Eko

 Tanı testi, AS (CVS?)-karyotip / mikroarray

 AS-karyotip, ISPD, ACMG 2015

ACOG, SMFM, 2015

ISPD, 2015

cfDNA ile

Mikrodelesyon/Mikrodublikasy on Sendromları (MDS/MDbS)

ve Cinsiyet Kromozom Anomalileri (CKA)

Taranmalı mı?

MDS / CKA taraması yapalım mı?

 Prenatal tanı konulması halinde

terminasyon gerektiren durumlarda terminasyon seçeneği ?

 Prenatal tanı ile postnatal erken tedavi ve izlem planı yapılabilmesi...

 Bazı firmalar MDS/CKA’ni rutin olarak çalışıyor

 MDS ve CKA çalışmama seçeneği

olmalı !

MDS ve sıklık

 22q11 del., 1/2000-4000 sıklık...

 (refere vakalarda 1/1000)

 Diğer taranan MDS sıklığı <1/5,000- 10,000

 Prader-Willi:1/15,000-30,000

 Angelman : 1/12,000-20,000

 5p del., Cri du chat: 1/15,000-50,000

 1p36 del.: 1/5000-10,000

 2q33.1 del.: ?

 16p12.2 del.: 1/15,000

 11q del., Jacobsen : 1/100,000

 10p del.: ?

 Van Der Woude: 1/35,000 -100,000

 Görece nadir sendromlar...

MDS ve cfDNA literatür

 Sensivite, spesifite, PPV, NPV net değil

 Literatürde yeterli veri yok (1 çalışma)

 %0,5-3 yanlış pozitif oranlar

bildirilmekte

2016

%0,5 yüksek risk olarak raporlanmış

SNP yöntemi ile

 11 gerçek pozitif, 9/11 (%82) anomali (+)

 SNP yöntemi ile 22q11’in büyük delesyonları tespit edilmiş

 22q11’in %87’ini kapsıyor ! ?

2016

• PPV %18 bildirilmiş !

• NPV, Sensivite, Spesifite

bilinmiyor

• Diğer MDS’ları ile ilgili veri yok

2016

ACOG, SMFM 2015

ISPD, 2015 ESHG, ASHG, 2015

MDS taraması bu aşamada önerilmiyor

Cinsiyet kromozom anomalileri (CKA)

 X0 – Turner sendromu

 XXY – Klinefelter sendromu

 XYY – Jacobs sendromu

 XXX – Trizomy (triple) X sendromu

CKA: Sıklık

 1/500, X0, XXY, XYY, XXX Nicolaides K et al., 2013

 %1,1, cfDNA ile X0, XXY, XYY, XXX, (gebeliklerin %1-1,5 X0) Bianchi D et al., 2015

 XXX, XXY, XYY cinsiyet kromozom trizomileri, %36 terminasyon oranı, Boyd AP et al., 2011, Eurocat study-2.5

milyon

 Genel olarak hafif klinik bulgu ancak bazı durumlarda

ögrenme ve infertilite sorunları

ACOG, SMFM 2015 ACMG, 2016

ISPD, 2015 ESHG, ASHG, 2015

 Potansiyel yanlış pozitif, negatif sonuçlar, girişim gerektiren durumlar, anneye

ilişkin genetik bilgi

 Bilgilendirme sonrası seçenek

 %1’e yakın yanlış pozitif ^, ACMG, 2016

ACOG, SMFM, 2015

CKA için: PPV%20- 40

NPV: %99 CKA için:

Sensivite: %91 Spesifite: %99,6

CKA

MDS/CKA: Pratik durum nedir?

 Test yapılmış ve MDS/CKA için pozitif

veya yüksek risk olarak rapor edilmiş ise;

 Detaylı fetal USG-Eko

 Teyit edilmesi veya dışlanması için

 AS / CVS seçeneği

22q11: Pratik durum nedir?

 USG’de konotrunkal anomaliler vb...

(TOF, DORV, TA, dTGA-kompleks kardiak, Damak yarığı (%2.8), Velocardio-Facial Synd.)

 RAA

Durumunda cfDNA yerine, AS (CVS)- karyotip, 22q11, FISH/Array

 İzole ARSA: cfDNA çalışması yeterli

olabilir

İkiz gebeliklerde cfDNA ?

İkiz gebeliklerde cfDNA testi önerilmiyor İkizlerde sensivite %90-95...

Yeterli veri yok

Koryonisite’den bağımsız çalışılıyor MK ikizler tekiz gibi

“vanishing” ikiz, test sonuçlarını etkiliyor

cfDNA testi pozitif- kaybolan ikiz

Kaybolan ikiz (vanishing), cfDNA testi

yanlış pozitif. Fetal karyotip normal

cfDNA: Sonuçlar

• cfDNA testi: T21 için %99, T18 için %97, T13 için %91 duyarlılık

• CVS-AS ile teyit edilmesi gerekiyor

• Majör anomali varsa ve NT>3.5 mm, CVS/AS

• Yüksek risk grubunda olası kullanım alanı

• Düşük risk grubunda taramadan önce

bilgilendirme yapılabilir

cfDNA: Sonuçlar

• Şu aşamada cinsiyet kromozomları, 22q11 ve benzeri MDS’da önerilmiyor

• %1-3 sonuç veremiyor ki bu grup riskli grup olarak kabul edilmeli, ek çalışma yapılmalı

• Birinci / ikinci trimester tarama >1/10 CVS/AS

• Ara grup nasıl olmalı: 1/1000 (veya 1/500?)

içersinde aileye seçenek olarak sunulması –

sınır değerler tartışılmakta...

TEŞEKKÜRLER