‹nsan Makrofajlar› ‹çindeki Salmonella Typhi Üzerine
Ampisilin, Siprofloksasin Ve Ofloksasin’in Etkileri (*)
Bora EK‹NC‹ (**), Belma DURUPINAR (**)
ÖZET
Enterik atefl geliflmekte olan birçok ülkede hala ciddi bir sa¤l›k sorunudur. Di¤er hücre içi patojenlerin neden oldu-¤u infeksiyonlardaki gibi, Salmonella türlerinin fagositer hücrelerde geliflimi önemli bir patojenite kriteridir. Konak hücreye girerek, fagolizozomlarda geliflebilirler ve anti-bakteriyel ajanlar›n etkisinden kurtulurlar, dolay›s›yla an-tibiyotiklerin in-vivo etkileri, in-vitro etkinlikleri gibi iyi de¤ildir.
Bu çal›flmada ampisilin, siprofloksasin ve ofloksasin’in in-san monosit kökenli makrofajlar› içindeki iki Salmonella typhi suflu (klinik ve standart) üzerine etkinli¤i incelendi. ‹nsan monosit kökenli makrofajlar, 10 bakteriye bir mak-rofaj olacak flekilde S. typhi sufllary ile infekte edildi. An-tibiyotikler MYK ve 10 X MYK de¤erlerinde ortama eklen-di. Örnekler hem kültür yöntemi, hemde direk olarak canly ve ölü bakterileri görmemize olanak sa¤layan LIVE/DE-AD BacLight boyama yöntemi ile incelendi. MYK de¤erin-de hücre içi en az etkin ajan ampisilin ve 10 X MYK de¤erin- de¤e-rinde ise her üç antibiyoti¤in de iyi aktiviteye sahip oldu-¤u bulundu. Örnekler kültür yöntemi ile saptanamayan canl› bakterilerin gözlenmesine olanak sa¤layan BacLight boyama yöntemi ile de de¤erlendirildi. Her üç antibiyotik hücre içi S. typhi üzerinde 10 X MYK de¤erinde iyi etkin-li¤i sahipken ampisilin’in MYK de¤erinde etkinetkin-li¤inin iyi olmad›¤› saptand›.
Anahtar Kelimeler: Makrofaj, Salmonella typhi, BacLight boyama yöntemi, Kinolonlar.
SUMMARY
In Vytro Effects Of Ampycyllyn, Cyprofloxacyn And Of-loxacyn On Salmonella Typhy Wythyn Human Monocy-te-Deryved Macrophages
Enteric fever is still a serious health problem in most de-veloping countries. Like other infections caused by intra-cellular pathogens, growing ability of Salmonella species in phagocytes is an important pathogenicity criteria. By entering host cell, they grow in phagolisosomes and are protected from effects of antibacterial agents, thus the ef-fectiveness of antibiotics can not be good in-vitro as in-vi-vo.
In this study, we examined the killing effects of ampicillin, ciprofloxacin and ofloxacin to two Salmonella typhi stra-ins (clinical and a standard), within human monocyte-de-rived macrophages. Human monocyte demonocyte-de-rived macropha-ges were infected by two S. typhi strains at a cell ratio of 10 bacteria per one macrophage (10:1). Antibiotics were added at MIC and 10 X MIC. Specimens were examined by both culture and LIVE/DEAD BacLight staining system which allow us to see dead and live bacteria directly. At MIC the least potent intracellular agent was ampicillin and at 10 X MIC all three had good activity. When speci-mens were estimated by using BacLight staining system, made possible us to see directly live bacteria, which could not be detected by culture method. All three antibiotics had good effects on intracellular S. typhi at 10 X MIC, where-as ampicillin had not at MIC.
Key words: Macrophage, Salmonella typhi, BacLight stai-ning system, Quinolones.
(*) Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Bakteriyoloji ve ‹n-feksiyon Hastalıkları AD
(**) ‹stanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Mikrobiyoloji ve Mikrobiyoloji AD
G‹R‹fi
Enterik atefl günümüzde, birçok ülkede mortalite ve morbidite ile iliflkili sa¤l›k sorunu olarak önemini
sürdürmektedir (1). Salmonellalar’›n etken oldu¤u infeksiyonun patogenezinde bakterinin barsak mu-kozas›n› geçerek makrofajlar içerisinde de yaflam›n› sürdürmesi önemlidir (2). Dolay›s›yla konak savun-mas›nda konak hücreye invaze olan Salmonella’lar›n fagositik hücrelerce fagosite edilmesi önem kazan›r. Salmonella türlerinin hücre içine girdikten sonra ko-nak hücrenin fagolizozomlar›nda üreyebilme
özel-likleri gösterilmifltir (3,4).
Salmonella infeksiyonu tedavisinde kullan›lan anti-biyotiklerin ortam flartlar›na dayan›kl›l›klar›n›n yan›-s›ra hücre içerisinde yeterli ve etkin konsantrasyona ulaflmalar› önemlidir. Salmonella türlerinin hücre içinde üremeleri sonucu hücre içi daha asidik ve da-ha viskoz da-hale gelir ve bu durum antibiyotiklerin et-kinli¤inin azalmas›na neden olur (1). S.typhi’nin ne-den oldu¤u enterik atefl ve tafl›y›c›lar›n tedavisinde kullan›lan antibiyotiklerin in vitro etkinliklerinin iyi olmas›na karfl›n in vivo etkileri beklendi¤i kadar iyi de¤ildir (1,5).
Çal›flmada ampisilin (amp), siprofloksasin (cip) ve ofloksasin (ofx)’in in vitro insan monosit kökenli makrofajlar taraf›ndan fagosite edilmifl S.typhi sufl-lar›na etkileri, kültür yöntemi yan›s›ra bakteri popu-lasyonunda canl› ve ölü bakterilerin görsel olarak ay›r›m›n› sa¤layan BacLightTM boyama yöntemi ile de araflt›r›lm›fl ve sonuçlar karfl›laflt›r›lm›flt›r. MATERYAL VE METOD
Sufllar: S.typhi-42 TA (2-1) standart suflu, Ankara Refik Saydam H›fz›ss›hha Enstitüsü’nden, klinik izolat, O.M.Ü. Typ Fakültesi, Merkez Lab., Bakteri-yoloji Ünitesi’ne gelen gaita örneklerinden elde edil-di. Sufllar kullan›l›ncaya kadar %20 gliserollü Brain-Heart Infusion (BHI) besiyerinde (Difco) sakland›. Bakteri say›s› yumuflak agar kat yöntemiyle nutrient agarda saptand›. Çal›flmada mililitrede 1 X 106 kolo-ni oluflturan bakteri (kob) kullan›ld›.
‹nsan Monosit Kökenli Makrofajlar:‹nsan mono-sit kökenli makrofajlar; HIV, Hepatit ve herhangi bir infeksiyon hikayesi olmayan kiflilerin periferal kan-lar›ndan Ficoll-Hypaque density gradient yöntemi ile
Türk Kimya”, ofx “Hoechst Marion Roussel”, ve Gentamisin (gen) “Bilim Ylaç San.” firmalaryndan sa¤land›. Uygun çözücülerde ( amp, pH 8.0 Fosfat tuz tampon solusyonu (PBS); ofx ve gen distile su; cip, 0.1 N NaOH ) çözüldü (8). MYK de¤erleri kat-yon eklenmifl Mueller Hinton besiyerinde (MHB) (Difco) makrodilusyon yöntemiyle saptand› (8,9). Makrofajlaryn Ynfekte Edilmesi:Makrofajlar buz so¤uklu¤undaki %0.02 EDTA/PBS’te 10 dakika bekletildikten sonra hücre kaz›y›c›s› yard›m› ile kül-tür fliflelerinden (Costar) ayr›ld› (6).
Makrofajlar, S.typhi ile infekte edilmeden 1 gece ön-ce 96 kuyucuklu plaklara (Greiner), 104 hücre/kuyu-cuk olacak flekilde eklendi. 1 gece 37C’de, %5’lik CO2’li nemli inkübatörde inkübe edildi. S.typhi sufl-lary %10 insan serumu içeren ortamda 37ºC’de 30 dakika opsonize edildi. Makrofajlaryn bulundu¤u or-tamdaki besiyeri de¤ifltirildikten sonra her kuyucu¤a makrofaj/bakteri 1:10 olacak flekilde S.typhi sufllar› (105 bakteri/kuyucuk) eklendi. Plak 200 rpm’de 5 dk rotatorda homojen yay›l›m için çevrildikten sonra, fagositoz için 37C’de, %5’lik CO2’li nemli ortamda 30 dak. inkübe edildi. Kuyucuklar fagosite olmayan bakterilerin uzaklaflt›r›lmas› için PBS ile y›kan-d›(1,7,10,11,12). Antibiyotikler kontrol kuyucuklar› d›fl›ndaki kuyucuklara MYK ve MYK’in 10 kat› de-¤erlerinde eklendi. Hücre d›fl› bakterilerin öldürül-mesi amac› ile 10 g/ml gentamisin eklendi (1,11). Örneklerin Al›nmas›:Örnekler 0, 3, 6 ve 24. saat-lerde al›nd›. Besiyerleri uzaklaflt›r›larak %0.5’lik sodyum deoksikolat eklendi (Sigma) (4,7,10). Daha sonra kuyucuklardaki örnekler topland›. 100 l’si yu-muflak agar kat yöntemi ile nutrient agara ekildi ve üremeler de¤erlendirildi (13). BacLight boyama iflle-mi için geri kalan örnek solusyonlar›, 10000 X g’de
ki amp, cip ve ofx’in makrofajs›z ortamda S.typhi üzerine direkt etkileri de araflt›r›ld›.
LIVE/DEAD BacLight Boyama Yöntemi
LIVE/DEAD BacLight boyama kiti “Molecular Pro-bes Inc.,Oregon A.B.D.” firmas›ndan sa¤land›. Sonuçlar kültür yan›s›ra canl› ve ölü bakterilerin di-rekt olarak ay›r›m›n› sa¤layan LIVE/DEAD Light boyas› ile boyanarak da de¤erlendirildi. Bac-Light boyas›, k›rm›z› floresan veren, ölü bakterilerin ay›r›m›n› sa¤layan propidyum iodid ve yeflil floresan veren, canl› bakterilerin ay›r›m›n› sa¤layan SYTO 9 boyalar›ndan oluflan bir boyad›r. Bakterilerin boyan-mas› hücre membranlar› ile iliflkilidir. Hücre zar› za-rar görmüfl ölü bakteriler propidyum iodid ile boya-narak k›rm›z›, canl› bakteriler ise SYTO 9 ile boyan-malar› nedeniyle yeflil renkte gözlenirler.
BULGULAR
Çal›flmada ayn› alanda mevcut canl› ve ölü bakteriler BacLight boyas› ile boyanarak saptanm›flt›r (Resim 1 ve 2). Amp, cip ve ofx’in standart ve klinik sufl-lar için saptanan MYK de¤erleri Tablo I’de sunul-mufltur.Amp, cip ve ofx’in makrofaj içeren ve içer-meyen ortamlarda, MYK ve 10 X MYK de¤erlerin-de standart ve klinik sufllara etkileri kültür sonuçlar› esas al›narak de¤erlendirilmifltir (flekil 1-8 ). Antibiyotikler makrofajs›z ortamda ve MYK de¤er-lerinde standart sufla benzer etki gösterirken klinik suflta amp’in etkisi cip ve ofx’den daha düflük (p<0.05) olmufltur. Amp, cip ve ofx 10 X MYK de-¤erlerinde ise, standart ve klinik sufl üzerinde benzer etki göstermifllerdir (flekil 1-4).
Çal›flmada makrofajlar›n trypan mavisi ile canl›l›kla-r› %90 olarak saptanm›flt›r.
Amp, cip ve ofx’in makrofaj içeren ortamda MYK ve 10 X MYK de¤erlerinde standart ve klinik suflla-ra etkileri flekil 5-8‘ de sunulmufltur.
Amp, cip ve ofx makrofaj içeren ortamda MYK ve 10 X MYK de¤erlerinde standart sufl üzerinde ayny etkiyi göstermifllerdir (flekil 5 ve 6). Klinik suflta, MYK de¤erinde ofx daha fazla etkili, standart sufla ise amp daha az etkili olmufl ancak bu fark anlaml› bulunmam›flt›r (p>0.05) ( flekil 7 ve 8).
Çal›flmada makrofaj içeren ve içermeyen ortamlarda antibiyotiklerin etkileri BacLight boyama yöntemiy-le de de¤eryöntemiy-lendirilmifl ve sonuçlar kültür iyöntemiy-le uyumlu bulunmufltur (Tablo 2 ve 3). Ancak, kültürde üreme gözlenmemesine karfl›, BacLight boyas› ile canl› ola-rak saptanan bakterilerin varl›¤› dikkati çekmifltir. Özellikle MYK de¤erlerinde canly› olarak saptanan bu bakterilerin antibiyotiklerin etkisi azald›ktan son-ra say›ca artt›klar› gözlenmifltir. BacLight boyama yönteminin özellikle kob say›s›ny› düflük oldu¤u du-rumlarda canl› bakterilerin saptanmas›na olanak ver-di¤i görülmüfltür.
TARTIfiMA
Hücre içi patojeni olan S.typhi’nin neden oldu¤u
ti-Antibiyotik Ampisilin Siprofloksasin Ofloksasin Klinik Sufl 1.0 0.06 0.250 Standart Sufl 1.0 0.0075 0.06 MYK (g/ml.) Tablo1. Amp, cip ve ofx’in MYK de¤erleri
fo birçok ülkede sorun olmayy sürdürmektedir. S.typhi’nin kona¤a girdikten sonra yay›larak
infeksi-yon oluflturabilmesi için öncelikle makrofajlara inva-ze olup, makrofajlar›n bakterisidal etkilerinden ko-runmas› gerekmektedir (14).
Hücre içi infeksiyon oluflturan böyle bir patojenin te-davisinde, hücre içinde oldukça aktif ve hücre içi pe-netrasyonu iyi olan ilaçlar›n kullan›m› yan›s›ra anti-biyotik direnç sorunu önemli olmaktad›r. Özellikle Hindistan, Pakistan, Vietnam gibi ülkelerde direnç problemi oldukça s›k karfl›lafl›lan bir sorundur (15,16). S.typhi infeksiyonu tedavisinde hücre içine iyi penetre olabilen amp, kloramfenikol ve trimetop-rim-sulfametaksazol (tmt-sxt) öteden beri kullan›l-maktad›r. Ancak son y›llarda bu antibiyotiklere karfl› direnç geliflmesi, yeni ilaç aray›fllar›n› bafllatm›fl, ye-ni kinolonlar ve 3. kuflak sefalosporinler tedavide kullan›lm›fl ve baflar›l› olmufllard›r (15,16,17). Çal›flmada S.typhi infeksiyonlar›nda günümüze ka-dar kullan›lmakta olan amp yan›s›ra kinolon grubun-dan cip ve ofx’in hücre içi ve hücre d›fl› etkinlikleri makrofaj içeren ve içermeyen ortamlarda çal›fl›larak araflt›r›lm›flt›r.
Çalyflmada MYK de¤erlerindeki amp’in özellikle makrofajsyz ortamdaki bakterilere etkisi cip ve ofx’ten düflük (p<0.05), makrofajl› ortamda ise ofx daha etkili bulunmufltur. 10 X MYK de¤erlerinde ise aralar›nda fark saptanmam›flt›r. Antibiyotiklerin maksimum etkisi MYK de¤erlerinde 6., 10 X MYK de¤erlerinde ise 3. saatte gözlenmifltir. Sonuç-larymyz Van Den Broek ve ark. (18)’nyn Staphylo-coccus aureus ile yapt›klar› çal›flma ile uyumludur (18).
Kinolon grubu antibiyotik olan ofx ve cip, MYK de-¤erlerinde 3. saatten itibaren hücre içi ve hücre d›fl› bakterilerin üremelerini inhibe etmifller, 6. saatte maksimum etkilerini göstermifllerdir (p<0.001). 10 X MYK de¤erlerinde ise maksimum etkinli¤e 3. sa-atte ulafl›lm›flt›r. Ofx ve cip’in hücre içi ve hücre d›-fl› etkinlikleri aras›nda anlaml› fark saptanmam›fl an-cak ofx’in hücre içi etkinli¤inin cip’den daha yüksek oldu¤u görülmüfltür.
Une T ve Osada Y (19), ofx, norfloksasin ve cip’in hücre içi birikimlerini epitelyal hücrelerde ve makro-fajlarda karfl›laflt›rm›fllar ve ofx’in di¤er antibiyotik-lere oranla hücre içine penetrasyonunun daha iyi ol-du¤unu gözlemifllerdir (19). Pascual ve ark. (20)’da
benzer flekilde kinolonlar›n hücre içi penetrasyon-larynyn iyi oldu¤unu saptam›fllard›r (20).
Antibiyotiklerin hücre içi ve hücre d›fl› etkileri kon-santrasyonlar›na ba¤l› olarak farkl› olmufltur. 24.saat sonunda MYK de¤erlerinde hücre içi etkinlikleri fazla (p<0.05), 10 X MYK de¤erlerinde ise hücre içi ve hücre d›fl› etkinlikleri benzer bulunmufltur. S. aureus ile yap›lan bir çal›flmada amp yan›nda bir grup antibiyoti¤in hücre içi etkinlikleri araflt›r›lm›fl ve MYK de¤erlerinde antibiyotiklerin etkileri daha az olarak saptanm›flt›r (21). Bizim çal›flmam›zda da antibiyotiklerin özellikle 24. saat sonundaki etkileri-ne bak›ld›¤›nda MYK de¤erlerindeki etkilerinin 10 X MYK’e oranla daha az oldu¤u gözlenmifltir. Amp, Cip ve Ofx’in makrofajlar içerisindeki bakte-rilere etkilerinin kesin olarak saptanabilmesi için benzer çal›flmalar›n, in vivo hayvan deneyleri ile de desteklenmesi ve sonuçlar›n bir arada de¤erlendiril-mesi yararl› olacakt›r.
Çal›flmada BacLight boyas› ile canl› olarak gözlenen ancak kültürde üreme oranlar› düflük olan veya üre-me gözlenüre-meyen bakteriler de saptanm›flt›r (Tablo 2,3). Antibiyotik etkisi ile üreme yeteneklerini kay-beden bu bakterilerin membran yap›lar› bozulmam›fl olan canl› bakteriler oldu¤u sonucuna var›lm›flt›r. Antibiyotiklerin hücre içi etkinliklerinin araflt›r›lma-s›nda canl› ve ölü bakterilerin bir arada bulunmalar› nedeniyle kültür sonuçlar›n›n tek bafl›na yeterli ol-mad›¤› ve BacLight boyama yöntemi gibi bir tekni-¤in kullan›m›n›n uygun olaca¤› görülmüfltür. KAYNAKLAR
1.Chang HR, Vladoianu IR, Pechere JC: Effects of Am-picillin, Ceftriaxone, Pefloxacin, and Trimethoprim-Sulp-hamethoxazole on Salmonella typhi within Human Mo-nocyte-Derived Macrophages, J Antimicrob Chemother 26:689 (1990).
2.Sizemore DR, Elsinghorst EA, Eck LC, Branstorm AA, Hoover DL, Warren RL, Rubin FA:Interaction of Sallmonella typhi Strains with Cultured Human Monocy-te-Derived Macrophages, Infec Immun 65(1):309 (1997). 3.Arias M, Rojas M, Zabaleta J, Rodriguez JI, Paris SC, Barrera LF, Garcia LF:Inhibition of Virulent Myco-bacterium tuberculosis by Bcgr and Bcgs Macrophages Correlates with Nitric Oxide Production. J Infect Dis,
4. Fields PI, Swanson RV, Haidaris CG, Heffron F: Mu-tants of Salmonella typhimurium that cannot survive wit-hin the macrophage are avirulent, Proc Natl Acad Sci USA 83:5189 (1986).
5. Balland O, Pinto-Alphandry H, Viron A, Puvion E, Andremont A, Couvreur P:Intracellular Distribution of Ampicillin in Murine Macrophages Infected with Sallmo-nella typhimurium and Treated with (3H)ampicillin-Loa-ded Nanoparticles, J Antimicrob Chemother 37:105 (1996).
6.Coligan JE, Kruisbeek AM, Morgulies DH, Schevach EM, Strober:Current Protocols in Immunology, sect 7.0-7.5, W. John Wiley & Sons Inc., USA (1994).
7.Buchmeier NA, Heffron F: Intracellular Survival of Wilde-Type Salmonella typhimurium and Macrophage-Sensitive Mutants in Diverse Populations of Macrophages, Infect Immun 57(1):1 (1989).
8. Isenberg HD:Clinical Microbiology Procedures Hand-book, American Society for Microbiology. Washington D.C. (1992).
9. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenber-ger PC, Winn Jr WC: Color Atlas and Textbook of Di-agnostic Microbiology, pp171-251, 5th Ed, Lippincott, Philadelphia (1997).
10. Buchmeier NA, Libby SJ:Dynamics of growth and death within a Salmonella typhimurium and population during infection of macrophages, Can J Microb 43:29 (1997).
11. Oh YK, Aranda CA, Berthiaume E, Jinks T, Miller SI, Swanson JA:Rapid and Complete Fusion of Macrop-hage Lysosomes with Phagosomes Containing Salmonella typhimurium, Infect Immun 64(9):3877 (1996).
12. Shiloh MU, Ruan J, Nathan C: Evaluation of
Bacte-rial Survival and Phagocyte Function with a Fluorescence-Based Microplate Assay, Infect Immun 65(8):3193 (1997). 13. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tan›, 2. Bask›, s.133 Baryfl Yay›nlar›, ‹zmir (1995).
14. Buchmeier NA, Heffron F:Induction of Salmonella Stress Proteins upon Infection of Macrophages, Science 248:730 (1990).
15. Bhat KG, Andrade AT, Kardesa-i SG, Hemashethar BM, PatKardesa-il CS: AntKardesa-imKardesa-icrobKardesa-ial Suscep-tibility of Salmonella typhi to Quinolones & Cephalospo-rins, Indian J Med Res 107:247 (1998).
16. Topçu AW, Söyletir G, Do¤anay M:‹nfeksiyon Has-tal›klar›, s.491, Nobel T›p Kitabevleri, ‹stanbul (1996). 17. Ünal S, Hayran M, Tuncer S, Gür D, Uzun Ö, Ako-va M, Akalyn HE:Treatment of Enteric Fever with Peflo-xacin for 7 Days versus 5 Days: Randomized Clinical Tri-al, Antimicrob Agents Chemother 40(12):2898 (1996). 18. Van Den Broek PJ, Buys LFM, Van Den Barselaar MT, Leyjh PCJ, Van Furth R:Influence of Human Mo-nocytes on the Antibacterial Activity of Kanamycin and Gentamicin for Staphylococcus aureus, Antimicrob Agents Chemother 29(6):1032 (1986).
19. Une T, Osada Y:Penetrability of Ofloxacin into Cul-tured Epithelial Cells and Macrophages. Arzneimittel-Forschung, (Abstracts) 38(9):1265 (1988).
20. Pascual A, Garcia I, Perea EJ:Entry of Lomefloxa-cin and TemafloxaLomefloxa-cin into Human Neutrophils, Peritoneal Macrophages, and Tissue Culture Cells, Diag Microb In-fect Dis 15(5):393 (1992).
21. Vosbeck K, James PR, Zimmermann W:Antibiotic Action on Phagocytosed Bacteria Measured by a New Method for Determining Viable Bacteria, Antimicrob Agents Chemother 25(6):735 (1984).
