NKUBAP.00.901.AR.15.01 nolu proje
İnsan Yumurtalık Kanseri Hücre Soylarında CIP2A Onkogeni Mutasyonlarının Taranması
Yürütücü: Doç. Dr. Türker BİLGEN Araştırmacı: Yrd. Doç. Dr. Duygu YAŞAR ŞİRİN
2016
İnsan Yumurtalık Kanseri Hücre Soylarında CIP2A Onkogeni Mutasyonlarının Taranması
Proje No: NKUBAP.00.901.AR.15.01
Yürütücü: Doç. Dr. Türker BİLGEN
Araştırmacı: Yrd. Doç. Dr. Duygu YAŞAR ŞİRİN
Mart 2016 Tekirdağ
i ÖNSÖZ
CIP2A onkoproteini birçok kanser türünde hastalığın değişik özellikleriyle ilişkilendirilmiştir. Kanser dokularında CIP2A ifadesindeki artış gösterilmiş olmakla birlikte bu artışın temelinde yer alan moleküler mekanizmalar aydınlatılamamışıtr.
Projemizin amacı, insan kanserlerinde tanı, tedavi ve hastalığın seyri açısından klinik önemi olabilecek CIP2A genindeki genomik değişimleri açığa çıkarabilmekti. Bu potansiyeldeki genomik değişimlerin ileride yapılabilecek çalışmalarla klinik öneminin ortaya konması mümkün olabilecektir. Dolayısıyla kanser hücre soylarında gerçekleştirdiğimiz projemiz ileride yapılabilecek fonksiyonel çalışmalara temel teşkil edebilecek verilerin toplanması açısından yapılması zorunlu bir çalışmaydı.
Projemizde saptanan CIP2A onkogenindeki genomik kanserde sağ kalım oranlarının artırılmasında, hastalıksız yaşam ve toplam yaşam sürelerinin uzatılmasında doğru tanının konması, tedavinin planlanması ve hastalığın seyrinin öngörülmesi açısından kullanışlı bilgiler sağlamasını ve benzer yöndeki diğer araştırmalara ışık tutmasını dilerim.
Bu araştırma projesini NKUBAP.00.901.AR.15.01 proje numarası ile destekleyen Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü, Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne (NKU BAP) teşekkürlerimi sunarım.
Ayrıca, bu projenin yürütülmesinde destek ve yardımlarını gördüğüm Uzm.
Duygu KORUCU’ya teşekkür ederim.
Doç. Dr. Türker BİLGEN Proje Yürütücüsü
Mart 2016
ii İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ ... i
İÇİNDEKİLER ... ii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... iii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... iv
SIMGELER VE KISALTMALAR ... v
ÖZET ... vi
ABSTRACT ... vii
1. GİRİŞ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 2
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 4
3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile CIP2A geninin ilgilenilen bölgelerinin çoğaltılması ... 4
3.2. PCR ürünlerinin saflaştırılması ... 6
3.3. DNA Dizi Analizi ... 6
3.4. DNA dizi analizi sonrası saflaştırma ... 7
4. BULGULAR ... 8
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 11
6. KAYNAKLAR ... 12
iii ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 3.1. CIP2A geni DNA dizi analizi için kullanılan primer dizileri ... 4
Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan optimize edilmiş PCR koşulları ... 5
Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan PCR döngüleri ... 6
Çizelge 3.4. Çalışmada kullanılan optimize edilmiş PCR koşulları ... 6
Çizelge 4.1. DNA dizi analizi sonuçları ... 10
iv ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 4.1. Ekson 3’teki rs2278911 değişimi (Heterozigot formda) ... 8
Şekil 4.2. 4. İntrondaki +206 (TA)n(TG)n (Heterozigot formda) ... 8
Şekil 4.3. 5. İntrondaki +46/47/…/54insT (Heterozigot formda) ... 8
Şekil 4.4. İntron 6’daki +212A>G değişimi (Heterozigot formda) ... 9
Şekil 4.5. 8. İntrondaki -105A>G değişimi (Heterozigot formda) ... 9
v SİMGELER ve KISALTMALAR
Simgeler
A Adenin
C Sitozin
dk Dakika
G Guanin
µl Mikrolitre (10-6 Lt) µM Mikromolar (10-6 M) mM Milimolar (10-3 M) ng Nanogram (10-9 g) pmol Pikomol (10-12mol)
T Timin
U Ünite (enzim birimi) Volt Voltaj
% Yüzde
º Derece
ºC Santigrat derece Kısaltmalar
bç Baz çifti
Bkz. Bakınız
CIP2A Cancerous Inhibitor of PP2A geni DNA Deoksiribonükleik asit
dNTP Deoksi Nükleotid Tri-Fosfat MgCl2 Magnezyum Klorür
Na Gözlenen allel sayısı
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu vd Ve diğerleri
vi ÖZET
CIP2A geni son dönemde tanımlanmış bir insan proto-onkogenidir. CIP2A proteininin birçok farklı tipte insan kanser dokusunda ve kanser hücre hatlarında ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. Ancak bu artışın temelinde yatan moleküler mekanizmalar henüz aydınlatılamamıştır. CIP2A genindeki promotor ve gen içi genomik değişimlerin bu artışın temelindeki rolü araştırılmamıştır. Projemizde, farklı düzeyde CIP2A proteini ifadesine sahip olan, 10 farklı insan yumurtalık kanseri hücre soyunda, CIP2A onkogeni mutasyonlarının DNA dizi analizi yöntemiyle taranması planlanmıştır. Bu amaçla, öncelikle elimizde mevcut olan 10 farklı insan yumurtalık kanseri hücre soyuna ait genomik DNA üzerinden CIP2A geni 12 bölgeye ayrılarak özgün primerlerle çoğaltıldı. PCR ürünleri, agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilmelerini takiben, DNA dizileme işlemleri için Namık Kemal Üniversitesi, Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Uygulama ve Araştırma Merkezi’ne (NABİLTEM) gönderildi. Elde edilen DNA dizileri referans dizilerle karşılaştırılarak CIP2A geni üzerindeki değişimler tespit edildi. CIP2A ifadesinin yüksek olduğu bilinen hücre soylarından Ov-CAR3’da düşük olanlardan farklı olarak rs2278911, intron 4’te +206 (TA)n(TG)n, intron 6’ da +212A>G ve Caov-3 hücre soyunda ise intron 4’te +206 (TA)n(TG)n, intron 6’ da +212A>G değişimleri heterozigot formda bulunmuştur. Bu proje ile ortaya konan genomik değişimlerin insan kanserlerine ait klinik örneklerde tanı, tedavi ve hastalığın seyrinin öngörülmesi açısından araştırılması gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: CIP2A, Yumurtalık Kanseri, Mutasyon, Onkogen, DNA sekanslama.
vii ABSTRACT
CIP2A is a recently identified human proto-oncogene. CIP2A over expressions have been found in many different types of human cancers and cancer cell lines. However, underlying molecular mechanisms have not been elucidated. Genomic variations within the gene and its promoter region have not been studied yet. In our project, mutation screening of the CIP2A gene by sequencing has been planned in 10 different human ovarian cancer cell lines having different levels of CIP2A expression.
For this purpose, we amplified the CIP2A gene with specific primers by dividing into 12 regions in 10 different human ovarian cancer cell lines. PCR products were checked by agarose gel electrophoresis and have been sent to the Research and Application Center for Scientific and Technological investigations of Namik Kemal University (NABILTEM) for DNA sequencing. The DNA sequencing results were compared with the reference sequence of the CIP2A gene. rs2278911, +206 (TA)n (TG)n in intron 4, + 212 A>G in intron 6 and +206 (TA)n (TG)n in intron 4, + 212 A>G in intron 6 have been detected as heterozygous form at the high CIP2A expressor cell lines Ov-car3 and Caov-3, respectively. The genomic changes found by this project should be investigated in human samples for potential clinical relevance at the diagnosis, treatment and prediction of prognosis of the disease.
Keywords: CIP2A, Ovarian Cancer, Mutation, Oncogene, DNA sequencing.
1 1. GİRİŞ
CIP2A, birçok insan kanserlerinde hastalığın bütün evreleri ile ilişkilendirilmiş yeni tanımlanmış bir onkoproteindir. Projenin amacı insan yumurtalık kanseri hücre soylarında CIP2A genindeki genomik değişikliklerin belirlenmesidir. İnsan kanserlerinde tanı, tedavi ve hastalığın seyri açısından klinik önemi olabilecek genomik değişimlerin tespit edilmesi, karmaşık ve heterojen bir hastalık olan kanserde tedavi için yeni hedeflerin belirlenmesi açısından önemlidir. Projemiz CIP2A genindeki genomik değişimlerin, daha önce CIP2A protein düzeyleri belirlenmiş olan on farklı yumurtalık kanseri hücre soyunda DNA dizi analizi ile araştırılmasıyla, düşük ve yüksek miktarda CIP2A proteini varlığıyla ilişkilerinin belirlenmesiyle sınırlıdır. Projenin nihai amacı, insan kanserlerinde tanı, tedavi ve hastalığın seyri açısından klinik önemi olabilecek CIP2A genindeki genomik değişimleri açığa çıkarabilmektir. Bu potansiyeldeki genomik değişimlerin ileride yapılabilecek çalışmalarla fonksiyonel etki mekanizmasının belirlenmesi, klinik öneminin ortaya konması mümkün olabilecektir. Projemiz, ileride yapılabilecek fonksiyonel çalışmalara temel teşkil edebilecek verilerin toplanması açısından yapılması zorunlu bir öncü çalışmadır.
2 2. GENEL BİLGİLER
Kanser tüm dünyada kardiyovasküler hastalıklardan sonra en çok ölüme sebebiyet veren ikinci hastalıktır (Oliveira, 2007) Kanser, çok sayıda genetik değişimin aynı hücrede birikmesiyle, hücrenin sınırsız bölünme yeteneği kazanmasıyla ortaya çıkan, tek bir hücreden köken alan klonal bir hastalıktır.
Kanserle ilişkili genetik değişimlerin belirlenmesi erken tanı, hastalığın takibi ve hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi açısından önemlidir (Croce, 2008).
Kanser ilişkili genetik değişimlerin belirlenmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, Jian- Ying Zhang ve arkadaşları 1999 yılında 90 kDa moleküler ağırlığındaki bir intra- stoplazmik tümör ilişkili otoantijenin hepatosellüler karsinomda ekspresyon düzeyindeki artışını göstermişler ve bu proteini "p90 proteini" olarak isimlendirmişlerdir. Linda Soo Hoo ve arkadaşları 2002 yılında hepatosellüler karsinomda artışı görülen bu p90 proteinini klonlamış ve moleküler karakterizasyonunu yapmışlardır (Soo Hoo, 2002). p90 proteininin ifadesindeki artış yoluyla kanserde rolü olabileceği akla yatkınsa da, Dr. Jukka Westermarck ve arkadaşları p90 proteininin ekspresyonundaki artışın, PP2A aracılı c-Myc Serin(62) defosforilasyonunu engellemek suretiyle c-Myc degredasyonunu engellediğini, böylelikle hücrede artmış onkojenik sinyale neden olduğunu göstermişlerdir.
Westermarck ve arkadaşları aynı zamanda veri tabanlarında KIAA 1524 ön isimlendirmesiyle tanınan p90 proteinini, PP2A’nın c-Myc Serin(62) defosforilasyonu aracılığı ile gerçekleştirdiği tümör supresör görevini inhibe etmesinden yola çıkarak CIP2A (Cancerous Inhibitor of PP2A) olarak isimlendirmişler ve literatürde bu isimle tanınmasını sağlamışlardır (Junttila, 2007). CIP2A geni kromozomal olarak 3q13.13 bölgesinde lokalize, yaklaşık 40 kb’ lik bir bölgede bulunur, negatif zincir üzerindedir ve 905 amino asitlik bir proteini kodlar (Soo Hoo, 2002). CIP2A proteini testis, beyin ve kemik iliği gibi sınırlı sayıdaki normal dokunun dışındaki diğer dokularda az miktarda sentez edilir ve hücredeki biyolojik rolü bilinmemektedir. CIP2A geninin kanser hücre soylarında yeni bir onkogen olarak tanımlanmasının ardından, çalışmalar hastalardan elde edilen klinik örneklerde ve farklı kanser tiplerinde tanı, prognoz ve tedavi yönünden önemini araştırmaya yönelmiştir. Bu kapsamda yapılan çalışmalarda; CIP2A proteininin mide kanserinde arttığı ve prognoz açısından öngörüde bulunmaya yardımcı bir faktör olduğu gösterilmiştir (Li, 2008; Khanna, 2009; Zhao, 2009). 2009 yılında yapılan bir çalışmada, CIP2A ifadesindeki artış meme kanserinde agresiviteyi artıran bir faktör olarak tanımlanmıştır (Come, 2009).
Ayrıca prostat kanseri, özofarengial kanserler ve küçük hücreli olmayan akciğer kanserlerinde de CIP2A ifadesinin arttığı ve kötü prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Dong, 2010; Qu, 2010; Vaarala, 2010). CIP2A'nın solid tümörlerdeki rolüne ilave olarak Akut myeloid Lösemide de ifadesinin arttığı gösterilmiştir (Coenen, 2010). Ayrıca CIP2A’ nın Hepatosellüler karsinoma hücrelerinde AKT sinyal yolağı üzerinden bortezomib indüklü apoptozisi inhibe ettiği ve dirençlilikten sorumlu olduğu da gösterilmiştir (Chen, 2010). Yapılan bu çalışmaların yanı sıra, CIP2A geninin kanser hücrelerinde ifadesinin artmasına neden olan moleküler mekanizmalara yönelik çalışmalar da diğer koldan ilerlemektedir. Mide kanserinde rolü olan Helicobacter pylori tarafından üretilen Cag A proteininin Src ve MEK/ERK sinyal yolları aracılığı ile CIP2A ifadesinde artışa neden olduğu gösterilmiştir (Zhao, 2009).
Ayrıca EGFR-MEK1/2 sinyal yolu ve ETS1 transkripsiyon faktörü aracılığı ile CIP2A ifadesinin arttığı yine Westermarck ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. Aynı zamanda bu çalışmada AGS, HeLa, HT1080 gibi değişik kökenlerden gelen kanser hücre hatlarında CIP2A geni promotor mutasyonlarının varlığı ve CIP2A protein miktarı arasındaki ilişki rapor edilmiştir (Khanna, 2011).
3
Bu proje ile tasarlanan çalışma; temelde CIP2A geninin kanserdeki artışına ilişkin moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yöneliktir. Bu güne kadar AGS, HeLa, HT1080 kanser hücre soylarında CIP2A promotor bölge mutasyonlarının araştırıldığı ve tarafımızdan yapılmış olan bir çalışma dışında herhangi bir kanser tipinde CIP2A geninin kodlayan dizilerindeki mutasyonlarını araştıran kapsamlı bir çalışma yapılmamıştır.
Bu amaçla; değişken oranlarda CIP2A geni ifadesine sahip insan yumurtalık kanseri hücre soylarında NCBI (National Certer for Biotechnology Information) ve UCSC (University of California, Santa Cruz) gibi veri tabanlarında yer alan CIP2A’nın genomik varyantları arasından biyoinformatik yaklaşımlarla CIP2A fonksiyonunu etkileyeceği öngörülen genomik varyantlar ile genin kodlayan dizileri olası yeni genomik değişiklikler açısından DNA dizi analizi yöntemi ile taranacaktır. CIP2A geninde daha önce tanımlanmış genomik değişikliklerden olası fonksiyonel önemi olan 30 genomik varyant tespit edilmiştir. Bu genomik varyantları içine alacak şekilde her biri 600-800 bp uzunluğunda olan 12 sekans bölgesi tarafımızdan belirlenmiştir.
Böylelikle CIP2A geni daha önce tanımlanmış genomik varyantlar açısından tarandığı gibi DNA dizi analizi yöntemi ile genin kodlayan dizilerinin yaklaşık % 90 kadarı taranarak literatürde henüz bildirilmemiş genomik değişiklikleri de tanımlamamız mümkün olacaktır. Böylelikle CIP2A’nın onkogenik etkisinin oluşmasında rolü olması muhtemel gen içi mutasyonlar belirlenerek sonrasında yapılması planlanan fonksiyonel çalışmalar için gerekli veriler elde edilecektir.
4 3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile CIP2A geninin ilgilenilen bölgelerinin çoğaltılması
CIP2A geni, daha önce düşük ve yüksek miktarda CIP2A proteini tespit edilmiş olan 10 farklı insan yumurtalık kanseri hücre soyunda (Yüksek; SK-OV-3, Ov-CAR3, Caov-3, OV-90, Caov-4. Düşük; PA-1, SW 626, TOV-21G, TOV-112D, A2780) promotor ve kodlayan dizilerini içine alacak şekilde 12 bölgeye ayırarak DNA dizi analizi yöntemiyle analiz edildi. Böylelikle CIP2A geninin fonksiyonel açıdan önemli bölgeleri, düşük ve yüksek protein düzeyleriyle ilişkilendirilebilecek genomik değişimler açısından değerlendirildi. Yukarıda tanımlanan yumurtalık kanseri hücre soylarına ait genomik DNA’ lar elimizde mevcuttur. CIP2A geni üzerinde ilgilenilen gen bölgelerinin PCR yöntemiyle çoğaltılmasında kullanılması planlanan primer dizileri Çizelge 3.1’ de verilmiştir. PCR ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildikten ve manuel yöntemle saflaştırıldıktan sonra DNA dizi analizi işlemi hizmet alımı yoluyla NABİLTEM’den sağlandı.
Çizelge 3.1. CIP2A geni DNA dizi analizi için kullanılan primer dizileri 1. Bölge
Forward primer GCAGAAGGGGCGGGTGTAGG
Reverse primer CGCCACTCCTCGGCCTCACT
2. Bölge
Forward primer GGCCGACCGAACTGAGATGGT Reverse primer CCACCGCCCTGCCCCAAATT
3. Bölge
Forward primer AGTTTGCCCACTCTGTGCAAGA
Reverse primer TGGAGAATGGCACAACCCTATTGA
4. Bölge
Forward primer CCTCTGAGGTTCTCACAGTCCTGC
Reverse primer ACTATCCCCAGTAGTCAGGCAACAA
5. Bölge
Forward primer TCACAGGAGACTTAGGTCAATGGCA
Reverse primer ACTGATCGTCCGTCCAGGGGA
6. Bölge
Forward primer TGCCTAAGGTTACCGTCTGTTGTTG
Reverse primer AGGAAAAGGCTGAGGAAGCAGCA
7. Bölge
Forward primer ATGAGAATGCTGATGGTGTGCACA
Reverse primer TCGGGTCTCAGAAAAGAAATGCTGC
5 8. Bölge
Forward primer ACCACATCAGTCAACCAAAACATGT
Reverse primer AGCAATTGCCTGTAACTTCCACCA
9. Bölge
Forward primer ACTTGCCTTAGAGCGCAGGCA
Reverse primer TGCACACTTGAAAATACCAGGTGCT
10. Bölge
Forward primer CCCAATTCCTTAGGCTTCCT Reverse primer GGCAAAACAGAATAGAAAGCAA
11. Bölge
Forward primer TTGGATTCTACTCTTGCTGCAT Reverse primer GCACTAGGCTAGGCTGTCTCA
12. Bölge
Forward primer TGTCTCTGAAGAAGCACAAAAGA Reverse primer TGCATGCAATTTCAAAAGAGA
PCR işlemi için karışım hazırlanırken öncelikle seyreltilmiş olan DNA’dan 5 µl (20 ng/µl) PCR tüplerine konmakta ve daha sonra ise hazırlanan karışımdan (mastermix) 21 µl koyulup toplam hacim 25 µl olarak ayarlandı (Çizelge 3.2). DNA amplifikasyonları Çizelge 3.2 ve 3.3’de verilen koşullarda Applied Biosystems®
ProFlex™ 3 x 32-well PCR System kullanılarak sağlandı. DNA amplifikasyonları sonucunda elde edilen PCR ürünleri (her biri için 5 µl) ve 1 µl Yükleme boyası (Loading dye) karıştırılarak %2’lik agaroz jellerde yürütüldü. Jeller 1X TBE tamponunda 120 Voltta 20 dakika yürütülerek UV ışığı altında Gel Imaging System Vilber Lourmat ile görüntülenerek PCR ürünleri kontrol edildi. Bütün şekillerde ilk kuyucukta (soldaki ilk örnek) DNA merdiveni olarak bilinen ve 100 ile 3000 baz çifti arasında bantlar içeren DNA standardı (GenerulerTM 100 base pair DNA ladder plus, MBI Fermantase, Litvanya) kullanıldı.
Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan optimize edilmiş PCR koşulları
PCR Karışımı Son Konsantrasyon
10X PCR Buffer 1X
MgCl2 1.5 mM
dNTPs 0.4 mM
Primerler 10 pmol
Taq DNA Polimeraz 1 U
Genomik DNA 100 ng
6 Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan PCR döngüleri
Basamak Sıcaklık Süre Döngü sayısı
1 94o C 4 dk 1
2
94o C 56-62o C
72o C
1 dk 1 dk 1.5 dk
35
3 72o C 10 dk 1
4 4o C bekle
3.2. PCR ürünlerinin saflaştırılması
PCR ürünleri Agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildikten sonra manuel yöntemle saflaştırılmıştır. Bu işlem için izlenen yol aşağıda özetlenmektedir.
Prosedür:
PEG solüsyonu 1:1 oranında PCR ürünü ile karıştırılır.
Hızlı şekilde vortekslenir.
20 dakika oda sıcaklığında beklenir.
14000 rpm 20 dakika santrifüj edilir.
Üst faz atılır.
100 µl %70’lik alkol eklenir.
14000 rpm’de 10 dakika santrifüjlenir.
Üst faz atılır.
20 µl distile su ile çözülür.
Çözünen örnekten 2 µl %2’lik jelde yürütülür, görüntülenir.
3.3. DNA Dizi Analizi
Saflaştırılan PCR ürünleri Agaroz jel elektroforezi ile tekrar kontrol edilerek DNA dizi analizi reaksiyonları gerçekleştirildi. DNA dizi analizi koşulları Çizelge 3.4’de verilmiştir.
Çizelge 3.4. Çalışmada kullanılan optimize edilmiş PCR koşulları
Miktar
Primer 3.2 pmol
Quick start enzim miksi 4 µl
PCR ürünü 20-50 ng
7 3.4. DNA dizi analizi sonrası saflaştırma
Dizi analizi reaksiyonu sonrası kullanılan malzemeler ve saflaştırma prosedürü aşağıda özetlenmiştir.
Kullanılan Malzemeler:
3M NaAc (pH 5.2)
100mM Sodyum EDTA (pH 8.0)
20 mg/mL Glikojen Prosedür:
0.5 ml’lik steril ependorf tüpler örneklere uygun bir şekilde etiketlenir.
Taze stop solüsyonu hazırlanır (3 M Sodyum Asetattan (NaAc) (pH 5.2) 2µL, 100mM Sodyum EDTA’ dan 2µL(pH 8.0), 1µL 20mg/ml Glikojen).
Numune üzerine 5µl stop solüsyonu ilave edilir.
60µL soğuk etanol her bir örneğin üzerine ilave edilir, tüpler vortekslenir ve 14000 rpm’de 4o C’de 15 dk santrifüj sonrasında üstteki sıvı kısım çökeltiye dikkat edilerek atılır.
%70’lik soğuk etanolden 200µL ilave edildikten sonra tüpler alt-üst edilerek 14000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir ve üstteki sıvı tekrar atılır.
Kalan kısım 10 dk karanlık ortamda oda sıcaklığında kurumaya bırakılır.
Kurutulmuş örnekler 30ul SLS ile çözülerek Beckman Coulter Genome lab GeXP cihazında kapiller elektroforezi gerçekleştirildi. Sonuçlar CIP2A geni referans dizilerine kıyaslanarak değerlendirildi ve genomik değişimler saptandı.
8 4. BULGULAR
Yumurtalık kanseri hücre soylarında tespit edilen CIP2A genindeki genomik değişimlere ait sonuçlar aşağıda verilmiş Çizelge 4.1’de özetlenmiştir.
Şekil 4.1. Ekson 3’ teki rs2278911 değişimi (Heterozigot formda)
Şekil 4.2. 4. Introndaki +206 (TA)n(TG)n (Heterozigot formda)
Şekil 4.3. 5. Introndaki +46/47/…/54insT (Heterozigot formda)
9
Şekil 4.4. İntron 6 daki +212A>G değişimi (Heterozigot formda)
Şekil 4.5. 8. Introndaki -105A>G değişimi (Heterozigot formda)
10 Çizelge 4.1. DNA dizi analizi sonuçları
Hücre soyu
adı
Bölge 1
Bölge 2
Bölge 3
Bölge 4
Bölge 5
Bölge 6
Bölge 7
Bölge 8
Bölge 9
Bölge 10
Bölge 11
Bölge 12 SK-OV-
3 - - - - - - - - - - - -
Ov-
CAR3 - -
rs2278 911 G>A /
N
+206 (TA)n (TG)n
+46/47/
…/54ins T / N
+212A>
G / N - -
- 105A>
G/N
- - -
Caov-3 - - -
+206 (TA)n (TG)n
+46/47/
…/54ins T / N
+212A>
G / N - -
- 105A>
G/N
- - -
OV-90 - - - -
+46/47/
…/54ins T
/ +46/47/
…/54ins T
- - -
- 105A>
G/
- 105A>
G
- - -
Caov-4 - - - - - - - - - - - -
A2780 - - - -
+46/47/
…/54ins T / N
- - -
- 105A>
G/N - - -
TOV-
112D - - - - - - - - - - - -
TOV-
21G - - - -
+46/47/
…/54ins T / N
- - -
- 105A>
G/N - - -
SW 626 - - - -
+46/47/
…/54ins T / N
- - -
- 105A>
G/N - - -
PA-1 - - - -
+46/47/
…/54ins T / N
- - -
- 105A>
G/N
- - -
11 5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Bu proje kapsamında, CIP2A geninin kodlayan dizileri, ekson-intron bağlantı bölgeleri ve promotor bölgesi DNA dizi analizi yöntemiyle 10 farklı yumurtalık kanseri hücre soyunda taranmıştır. Kanser hücre soylarından elde edilen CIP2A geni DNA dizileri NIH ve UCSC veri tabanlarından elde edilen referans diziler ile karşılaştırılmıştır. Toplam 5 farklı genomik değişiklik tespit edilmiştir. CIP2A geninde tespit edilen 5 farklı genomik değişimden bir tanesinin kodlayan diziler üzerinde yer aldığı belirlenmiştir. rs2278911 (NM_020890.2:c.686G>A.
NP_065941.2:p.Arg229Gln) referans numarasıyla daha önce bildirilmiş olan bu değişim cDNA üzerinde 686. pozisyona denk gelmekte ve peptit üzerinde 229. amino asiti değiştirmektedir. rs2278911’nin avrupa toplumları için sıklığı 0.08 olarak bildirilmektedir. Kodlayan diziler üzerinde yer alarak amino asit değişimine neden olan bu değişimin literatürde bildirilmiş olması bu değişimin kansere özgü bir mutasyon olmayıp normal dokularda da bulunabildiğini göstermektedir. Germline olarak taşınan bu değişimin kansere yatkınlıkla ilişkilendirilmesi muhtemeldir. Böyle bir etkiye sahip olduğunun test edilmesi için klinik örneklerde çalışılması gerekmektedir. Diğer yandan gen ifadesi üzerine belirleyici etkisi olan genin regülatör dizilerinde her hangi bir değişim saptanmamıştır. Promotor bölgedeki değişimlerin transkripsiyon faktörlerinin bağlanma yeteneklerini etkilemek suretiyle gen ifadesini değiştirebildikleri bilinmektedir. Regületör diziler üzerinde yer alan aynı zamanda da transkribe olan dizi üzerinde bulunan genomik değişimlerin mRNA’ nın bazı özelliklerini değiştirmek suretiyle genin ifadesini değiştirdiği de bilinmektedir. Ancak çalışmamızda CIP2A geninin regülatör dizileri üzerinde herhangi bir değişim saptanmamıştır. Tespit edilen diğer 4 değişim daha önce hiç bildirilmemiş genomik değişimlerdir ve intronik diziler üzerinde yer almaktadır. Bu değişimlerin 1 tanesi (+206 (TA)n(TG)n) dinükleotid tekrar dizileri üzerinde yer almaktadır. Bir diğeri (+46/47/…/54insT) poli T dizisinde yer almaktadır. Diğer ikisi (intron 6’ daki +212A>G ve intron 8’ deki -105A>G ) ise tek nükleotid değişimi şeklindedir.
SK-OV-3, Ov-CAR3, Caov-3, OV-90, Caov-4 hücre soylarında CIP2A ifadesinin diğer yumurtalık kanseri hücre soylarına kıyasla yüksek olduğu bilinmektedir. CIP2A ifadesinin yüksek olduğu bilinen hücre soylarından Ov-CAR3’da, düşük olanlardan farklı olarak rs2278911, intron 4’te +206 (TA)n(TG)n, intron 6’ da +212A>G ve Caov- 3 hücre soyunda ise intron 4’te +206 (TA)n(TG)n, intron 6’ da +212A>G değişimleri heterozigot formda bulunmuştur. Bu genomik değişimlerin yüksek CIP2A ifadesi ile ilişkisinin ortaya konması için fonksiyonel çalışmalara gereksinim vardır. CIP2A onkoproteinini yüksek düzeylerde ifade eden hücrelerde bu duruma neden olabilecek diğer mekanizmaların da araştırılması gerekmektedir.
12 6. KAYNAKLAR
1- Chen, K. F., C. Y. Liu, et al. (2010). "CIP2A mediates effects of bortezomib on phospho- Akt and apoptosis in hepatocellular carcinoma cells." Oncogene 29(47): 6257-66.
2- Coenen, E. A., C. M. Zwaan, et al. (2010). "KIAA1524: A novel MLL translocation partner in acute myeloid leukemia." Leuk Res 35(1): 133-5.
3- Come, C., A. Laine, et al. (2009). "CIP2A is associated with human breast cancer aggressivity." Clin Cancer Res 15(16): 5092-100.
4- Croce, C. M. (2008). "Oncogenes and cancer." N Engl J Med 358(5): 502-11.
5- Dong, Q. Z., Y. Wang, et al. (2010). "CIP2A is Overexpressed in Non-Small Cell Lung Cancer and Correlates with Poor Prognosis." Ann Surg Oncol 18(3): 857-65.
6- Junttila, M. R., P. Puustinen, et al. (2007). "CIP2A inhibits PP2A in human malignancies."
Cell 130(1): 51-62.
7- Khanna, A., C. Bockelman, et al. (2009). "MYC-dependent regulation and prognostic role of CIP2A in gastric cancer." J Natl Cancer Inst 101(11): 793-805.
8- Khanna, A., J. Okkeri, et al. (2011). "ETS1 Mediates MEK1/2-Dependent Overexpression of Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A (CIP2A) in Human Cancer Cells." PLoS One 6(3): e17979.
9- Li, W., Z. Ge, et al. (2008). "CIP2A is overexpressed in gastric cancer and its depletion leads to impaired clonogenicity, senescence, or differentiation of tumor cells." Clin Cancer Res 14(12): 3722-8.
10- Oliveira, P. A., A. Colaco, et al. (2007). "Chemical carcinogenesis." An Acad Bras Cienc 79(4): 593-616.
11- Qu, W., W. Li, et al. (2010). "CIP2A is overexpressed in esophageal squamous cell carcinoma." Med Oncol.
12- Soo Hoo, L., J. Y. Zhang, et al. (2002). "Cloning and characterization of a novel 90 kDa 'companion' auto-antigen of p62 overexpressed in cancer." Oncogene 21(32): 5006-15.
13- Vaarala, M. H., M. R. Vaisanen, et al. (2010). "CIP2A expression is increased in prostate cancer." J Exp Clin Cancer Res 29: 136.
14- Zhao, D., Z. Liu, et al. (2009). "Helicobacter pylori CagA upregulation of CIP2A is dependent on the Src and MEK/ERK pathways." J Med Microbiol 59(Pt 3): 259-65.
