• Sonuç bulunamadı

Depresif hastaların eritrosit membran fosfolipid kompozsiyonun araştırılması

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Depresif hastaların eritrosit membran fosfolipid kompozsiyonun araştırılması"

Copied!
62
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

DEPRESİF HASTALARIN ERİTROSİT MEMBRAN FOSFOLİPİD

KOMPOZSİYONUN ARAŞTIRILMASI Meryem BULUT DUMANLI

Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Necmettin Yılmaz

2008 Her hakkı saklıdır

(2)

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DEPRESİF HASTALARIN ERİTROSİT MEMBRAN FOSFOLİPİD KOMPOZİSYONUNUN ARAŞTIRILMASI

Meryem BULUT DUMANLI

TOKAT 2008

(3)

Doç. Dr. Necmettin YILMAZ danışmanlığında, Meryem BULUT DUMANLI tarafından hazırlanan bu çalışma 15/04/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

Başkan : Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK İmza :

Üye : Doç. Dr. Necmettin YILMAZ İmza :

Üye : Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ İmza :

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Metin YILDIRM Enstitü Müdürü

(4)

TEZ BEYANI

Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.

(5)

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

DEPRESİF HASTALARIN ERİTROSİT MEMBRAN FOSFOLİPİD KOMPOZİSYONUNUN ARAŞTIRILMASI

Meryem BULUT DUMANLI

Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Necmettin YILMAZ

Bu çalışmada depresif hastaların eritrosit membran fosfolipid kompozisyonu araştırılmıştır. Bu amaçla; ilaç kullanmayan 30 kişilik depresif hasta grubundan ve 30 sağlıklı, gönüllü kontrol grubundan kan örnekleri alınmıştır. Kan numuneleri alındıktan sonra eritrosit paketi hazırlanmıştır. Bu paketten 0.5 ml alınarak eritrosit sayımı yapılmıştır. Sayımı yapılan paketten Rose-Oklander metoduyla lipidler ekstrakte edilmiştir. Bu ekstraksiyon kullanılarak iki yönlü İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) ile fosfolipidler belirlenmiştir. Fosfolipid standartları kullanılarak major fosfolipidlerden fosfatidilkolin (FK), fosfatidiletanolamin (FE), fosfatidilserin (FS) ve sfingomiyelinin (SM) yerleri tesbit edilmiştir. Membranda yer alan fosfolipid miktarlarını belirlemek için her bir örneğe fosfor tayini yapılmıştır. Hasta gruplarında tüm major fosfolipid miktarlarında hastalığa bağlı olarak bir azalma gözlenmiştir. Hasta grubunda kontrol grubuna göre fosfatidiletanolamin ve sfingomiyelin miktarları bakımından önemli oranda düşüş görülmesine rağmen (p<0.05), fosfatidilserin ve fosfatidilkolin miktarlarında istatistiki olarak önemli bir düşüş gözlemlenmemiştir.

2008; 49 sayfa

Anahtar Kelimeler: Depresyon, Hücre Membranı, Fosfolipid, Sfingomiyelin

(6)

ABSTRACT

Ms Thesis

INVESTIGATION of ERYTHROCYTE MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS COMPOSITION of DEPRESSIVE PATIENTS

Meryem BULUT DUMANLI

Gazi Osmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Assoc.Prof.Dr. Necmettin YILMAZ

In this research, the erythrocyte membrane phospholipids composition of depressive patients were investigated. To pursue this goal, blood samples were taken from 30 depressive patients who don’t use medication and 30 healthy volunteers, control subject. After blood samples were taken, erythrocyte package were prepared. 0.5 ml of sample was taken from this package, and then, erythrocyte count was done. Lipids were extracted from the counted packets using Rose-Oklander method. By using this extraction, two-sided TLC and PL were determined. To determine the PL quantities placed in membrane, each samples phosphorus indication was found and The position of major phospholipids such as PC, PE, PS, ve SM were determined by using PL standarts. To determine the amounts of phospholipids in the membrane, phosphors assignment have been done for each sample. A decrease was observed in the amounts of all major phospholipids in the group of patients depending on the disease. Although a significant decrease has been observed in the amounts of PE and SM in the patients compared to control group (p<0.05), a significant decrease has not been observed in the amounts of PS and PC.

2008, 49 pages

Keywords: Depression, Cell Membrane, Phospholipid, Sphingomyelin

(7)

TEŞEKKÜR

Çalışmalarım sırasında her türlü desteğini esirgemeyen değerli hocam Doç.Dr. Necmettin YILMAZ’a, kan numunelerimizin teminini sağlayan sayın Yrd.Doç.Dr. Feryal ÇELİKEL ve Doç.Dr. Şule ASLAN’a, laboratuvar çalışmalarında yardımlarını esirgemeyen hocam Doç.Dr. Mahfuz ELMASTAŞ’a, her zaman her konuda varlıklarıyla yanımda olan sevgili aileme, eşim Hasan DUMANLI’ya ve çalışmamda emeği geçen tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

(8)

İ

ÇİNDEKİLER

Sayfa ÖZET……… i ABSTRACT………. ii TEŞEKKÜR……… iii İÇİNDEKİLER……….. iv SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ………. v ŞEKİLLER DİZİNİ……… vi ÇİZELGELER DİZİNİ………. vii 1.GİRİŞ ve KAYNAK ÖZETLERİ……… 1

1.1. Hücre Membran Yapısı ve Fonksiyonları………. 4

1.2. Hücre Membranında Yer Alan Lipid Çeşitleri………. 8

1.2.1. Lipidler……… 8 1.2.1.1. Nötral Yağlar..……….. 10 1.2.1.2. Yağ Asitleri……… 11 1.2.1.3. Fosfolipidler……….. 12 1.2.1.4. Glikolipidler……….. 12 1.2.1.5. Mumlar……….. 13 1.2.1.6. Steroid ve Terpenler………. 13

1.3. Biyolojik Membranlarda Yer Alan (Değişik Canlılardaki) Fosfolipid Yapıları ve Çeşitleri………. 14 1.3.1. Fosfogliseridler………... 15 1.3.1.1. Fosfatidilkolin (Lesitin) ………... 16 1.3.1.2. Fosfatidiletanolamin (sefalin)……….. 17 1.3.1.3. Fosfatidilserin……… 18 1.3.1.4. Fosfatidilinositol……… 19 1.3.1.5. Difosfatidilgliserol………. 19 1.3.1.6. Plazmalojen………... 20 1.3.2. Sfingomiyelinler………. 21

1.4. Biyolojik Membranların Yapısında Bulunan Proteinler……… 22

1.5. Eritrosit Membranlarında Yer Alan Fosfolipidler………. 24

1.6. Fosfolipidlerin Fonksiyonları Ve Haberleşmedeki Rolleri………. 27

1.7. Depresyon Hakkında Genel Bilgi………. 28

2. MATERYAL ve YÖNTEM……… 30

2.1. Materyal……….. 30

2.1.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler……… 30

2.1.2 Kullanılan Alet ve Cihazlar………. 31

2.2. Yöntem………. 31

2.2.1. Kan Örneklerinin Alınması……….. 31

2.2.2. Kan Hücrelerinin Ayrılması………. 32

2.2.3. Eritrosit Paketinin Hazırlanması………. 32

2.2.4. Eritrosit Membran Total Lipid Ekstraktının Hazırlanması……. 32

2.2.5. Eritrosit Membran Fosfolipidlerinin Analizi………. 33

(9)

2.2.7. İstatistik Analiz………... 34 3. BULGULAR ve TARTIŞMA………35 3.1. Eritrosit Membran Total Fosfolipid Değerleri İle İlgili Sonuçlar…….. 36 4. KAYNAKLAR………... 45 ÖZGEÇMİŞ

(10)

SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simge Açıklama gr gram ml mililitre µg mikrogram µl mikrolitre Kısaltmalar Açıklama ATP Adenozintrifosfat BHT Bütillenmiş hidroksitoluen CH Hidrokarbon FE Fosfotidiletetanolamin FK Fosfotidilkolin FL Fosfolipit FS Fosfotidilserin

GOÜ Gazi Osmanpaşa Üniversitesi N Azot

OH Hidroksit P Fosfat

PAF Trombosit Aktive edici Faktör RBC Eritrosit (Kırmızı Kan Hücresi) S Kükürt

SM Sfingomyelin

TLC İnce Tabaka Kromatografisi (Thin Layer Chromotography)

(11)

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil Sayfa

Şekil 1.1. Biyolojik membranların akıcı-mozaik zar modeli (Nelson ve Cox, 2005)…. 6

Şekil 1.2. Başlıca depo ve zar lipidleri (Nelson ve Cox, 2005)……… 8

Şekil 1.3. Nötral lipid yapısı (Anonim, 2007a)………. 11

Şekil 1.4. Doymuş ve doymamış yağ asidi yapısı (Anonim, 2007b)………. 11

Şekil 1.5. Genel bir fosfolipid yapısı (Anonim, 2007c)………. 12

Şekil 1.6. Kolesterol ve D3 vitamini (Anonim, 2007d)……….. 13

Şekil 1.7. Fosfatidat yapısı (Anonim, 2007e)………. 15

Şekil 1.8. Lipid bilayerde bulunan fosfolipid yapısı (Anonim, 2007f)……….. 16

Şekil 1.9. Fosfatidilkolin yapısı (Anonim, 2007g)………. 17

Şekil 1.10. Fosfatidiletanolamin genel yapısı (Anonim, 2007h)……… 18

Şekil 1.11. Fosfatidilserin genel yapısı (Anonim, 2007ı)……….. 18

Şekil 1.12. Fosfatidilinositol genel yapısı (Anonim, 2007i)……….. 19

Şekil 1.13. Difosfatidilgliserol genel yapısı (Anonim, 2007j)………20

Şekil 1.14. Plazmalojen genel yapısı (Anonim, 2007k)………. 21

Şekil 1.15. Sfingomiyelin genel yapısı (Anonim, 2007l)………... 21

Şekil 1.16. İnsan kırmızı kan hücre zarında lipidlerin asimetrik dağılımı(Güneş 2003) 26 Şekil 3.1. Ölçümler sonucu elde edilen fosfor standart grafiğinin bir doğru haline getirilmiş şekli……… 36

(12)

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge Sayfa

Çizelge 1.1. Farklı hücre zarlarındaki lipid yüzdeleri (Güneş, 2003)……… 14 Çizelge 1.2. Eritrosit plazma zarında iç ve dış tekli tabakalarda fosfolipidlerin asimetrik dağılımı (Nelson ve Cox, 2005)………. 25 Çizelge 3.1. Hasta ve kontrol gruplarındaki kişilerin major fosfolipid gruplarına ait (FE, FS, FK ve SM) µg/ml cinsinden fosfor miktarları……….. 38 Çizelge 3.2. Hasta ve kontrol gruplarındaki kişilerin major fosfolipidlerin (FE, FS, FK ve SM) % değerleri………. 39 Çizelge 3.3. Kontrol grubu ve depresif hasta grubunun eritrosit membran fosfolipid fraksiyonu değerlerinin varyans analizi ve T testi sonuçları……….. 40

(13)

Hücre canlının en küçük birimi olup, burada tüm biyokimyasal ve fizyolojik olaylar bağımsız olarak cereyan eder. Bir hücre, yaşayabilmesi için gerekli tüm faaliyetleri gerçekleştirebilir. Hücre ve birçok organel ince bir zarla çevrilmiştir. Tüm hücreyi saran bu zar, plazma membranı (hücre zarı, hücre membranı) olarak isimlendirilir (Robert, 1999; Güneş, 2003).

Hücresel membran hemen bütün hücresel aktivitelerde önemli role sahiptir. Hücre membranı, hücrenin iç ortamını regüle eder ve çeşitli maddelerin hücre içine veya dışına taşınmasını sağlar. Hücre içi membranları, örneğin çekirdek, endoplazmik retikulum, mitokondri kloroplast membranları bu organellerin fonksiyonlarında önemli rol oynarlar. Örneğin mitokondri membranı ATP sentezler, kloroplast membranı fotosentez olayını yürütür. Hücre membranı ile organellerin membranları esas itibariyle birbirine benzerler ve lipidlerle proteinlerden kurulmuşlardır. Memeli hayvanların hücre membranlarında az miktarda da karbonhidratlar glikolipid ya da glikoprotein bileşikleri halinde bulunur. Proteinlerin ve glikoproteinlerin membranda çeşitli fonksiyonları vardır. Bunlar membranın yapı bütünlüğünü sağlarlar, enzim olarak iş görürler, maddeleri hücre veya organellerin içine veya dışına iletirler (Noyan, 2000).

Hücreyi, hücre çekirdeğini ve çeşitli organelleri çevreleyen membranlar lipidler, proteinler ve karbonhidrat moleküllerinden yapılmışlardır. Bu membranların fonksiyonları, membran proteinlerinin türleri, dağılışları, membranda yer alışları ve birbiri ile bağlantı kuruluşlarına göre değişir. Membran lipidlerinin yapısı tayin edilmiştir. Bazı önemli proteinlerin yapıları ve fonksiyonları da saptanmıştır. Hücre membranı bugün için ortasında lipidlerin bulunduğu 75–100 Angstrom kalınlığında dinamik bir yapı olarak kabul edilmektedir. Membran içinde protein bölgeleri ve şeker ucu membranın dış yüzeyine bakan glikoprotein bölgeleri vardır (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Noyan, 2000).

Membran yapısındaki lipidler genellikle fosfolipidlerdir. Fosfolipid molekülünün yağ asitlerini taşıyan tarafı polarize olmamıştır ve suda erimez hidrofobiktir.

(14)

Fosfolipidlerden olan fosfatidilkolin’deki nitrojen pozitif, fosfatın oksijeni negatif elektrik yüklüdür. Su molekülleri ile polarize olmuşlardır. Bu nedenle, polarize(su molekülleri gibi iki kutuplu) olmuş moleküllerin zıt elektrik yükü taşıyan uçları birbirini çeker ve fosfolipidin hidrofil ucu suda çözünür (Noyan, 2000).

Fosfolipidler tüm hücre membranlarının temel elemanıdır ve membranların yapısal bütünlüğü ve fonksiyonel özellikleri için gereklidir. Fosfolipidler; fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol ve sfingomiyelinleri içerir. Membran fosfolipidleri, reseptör aktivasyonu, sinyal transdiksiyonu ve iyon transportu gibi çok önemli hücresel fonksiyonlara katılırlar. Kendileri direkt ikincil haberci fonksiyonuna sahip olabilirler (Freitas, 1999).

Fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin ve fosfatidilinozitol seviyelerinde değişken değişiklikler ve fosfolipid anormallikleri ilaç kullanmayan şizofreni hastalarında bulunmuştur ve dört membran fosfolipidlerinde azalma, şizofrenilerde nöroplastik fibroblastlar da bulunmuştur. Bu son bulgular fosfolipid ve yağ asidi anormalliklerinin hastalıkla ilişkili olabileceğini ileri sürmektedir (Jeffrey ve ark. 2000).

Fosfolipid metabolizmasındaki azalma özellikle negatif belirtili hastalarda daha belirgindir (Shioiri ve ark., 1997).

Maes ve ark. (1999) depresif hastaların RBC membranlarında yaptıkları çalışmada major depresyon fosfolipidlerde C20:4 w–6 C20:5 w–3 oranında artış ve C20:5 w–3 ve C22:5 w–3 fraksiyonlarında bir azalma ile ilişkilendirilmiştir.

Plazma membranı aynı zamanda diğer lipidleri de içerir. Örneğin, kolesterol bir steroid lipiddir, fosfolipid yapılarında küçük bölgeleri dolduran harç olarak görev alır ve böylece glukoz gibi suda çözünen moleküllere geçirgenlik sağlar. Plazma membranlarının tam lipid kompozisyonu bir hücre tipinden diğerine değişir ve her bir hücre tipi organel membranlarında da değişir (Robert, 1999; İnal ve ark., 2007).

(15)

Hücre membranının akışkanlığının diyet ve hastalıklara bağlı olarak değişmesi doğrudan membran geçirgenliğini etkilemekte bu da membranda fonksiyon yapan enzimlerin aktivitelerini ve hormon reseptörlerini etkilemektedir. Çünkü eritrosit membranının akışkanlığı, oksijen transportunu, mekanik özellikleri gibi önemli fonksiyonel özellikleri düzenlemektedir. Fosfolipidlere bağlı yağ asitlerinin doymamışlığının artması membran lipid akışkanlığını artırmaktadır (Popp Snijder ve ark., 1984).

Lipid metabolizması ile insan davranışları ve duygu durumu arasındaki ilişki ilgi çekici bir konudur. Psikiyatrik bozukluklarla lipidlerin önemli bir ilişki içinde olduklarının anlaşılmasıyla çalışmalar bu konuyla ilgili çeşitli araştırmalara yönelmiştir. Yapılan çalışmalarla mizaç bozukluklarında membran lipid metabolizmasındaki değişiklikleri destekleyen sonuçlara ulaşılmıştır (Sevinçok ve Büyüköztürk, 1999).

Depresif hastalıklarda, membran fosfolipidleri ile ilgili çalışmaların çoğu eritrosit, lenfosit ve trombosit gibi periferik hücrelerde yapılmıştır. Şizofrenide hem beyin hem de bu kan hücrelerinde fosfolipid metabolizmasının bozuk olduğuna dair veriler saptanmıştır (Oldham ve Riba.,1994).

Parker ve ark. (2006) yaptıkları bir çalışmada deniz ürünleri ve depresyon arasındaki bağlantıyı indirekt olarak gözlemlemişlerdir. Depresif semptomların olma olasılığının düzenli balık tüketenlere göre, düzensiz balık tüketenlerde daha yüksek olduğunu göstermiştir.

Hibbeln balık tüketimi ve majör depresyon arasındaki güçlü negatif ilişkiyi belirtmiştir. Yapılan diğer çalışmalar da deniz ürünleri ve depresyon arasındaki bağlantıyı indirekt desteklemektedir (Parker ve ark., 2006).

3204 Finli yetişkinde yapılan bir araştırmada Tanskanen ve ark. depresif semptomların olma olasılığının düzenli balık tüketenlere göre, düzensiz balık tüketenlerde daha yüksek olduğunu göstermiştir (Parker ve ark., 2006).

(16)

Biyolojik hayatın devamı önce kana ve kanın akıcı canlı kıvamının korunmasına bağlıdır. Eritrosit membran yapısındaki fosfolipid miktarı, çeşidi ve yerleşimi membran fonksiyonları ile yakından ilgili olup membran transportunu, pompaları ve enzimleri etkileyerek akışkanlıkta önemli rol oynamaktadır (Geoffrey, 1997).

Bu amaçla çalışmamızda Psikiyatri polikliniğine başvuran majör unipolar depresyon tanısı almış ve henüz antidepresan ilaç tedavisi başlamamış belirli bir yaş grubundaki 30 kişinin eritrosit membran fosfolipid kompozisyonları ile depresyon belirtileri taşımayan ve aynı yaş grubundaki 30 sağlıklı birey grubu arasındaki fosfolipid kompozisyonu karşılaştırılacaktır. Böylece depresyonun eritrosit membranlarında fosfolipid kompozisyonunu üzerine olan etkileri incelenmiş olacaktır.

1.1. Hücre Membran Yapısı ve Fonksiyonları

Hücre çeşidine göre morfolojik yapılarında bir kısım farklılıklar gözlenen hücre zarları yarı geçirgen özelliğe sahip olup, bir bariyer oluşturarak hücrenin dış ve iç yüzeylerini sınırlarlar. Böylece belirli besin maddelerinin, suda çözünmüş halde bulunan elementlerin hücreye alınmasına, hücrede üretilen salgı granüllerinin ve hücresel metabolizma sonucu üretilen artık maddelerin hücre dışına atılmasını sağlarlar. Ayrıca hücrelerdeki reaksiyonlar için gerekli iyonların hücreden ayrılmalarını önlerler. Bu yolla hücre sitoplazmasında belirli bir iyon kompozisyonun, pH değerinin ve hücre içi osmotik basıncın korunmasına yardımcı olurlar. Hücre zarında bulunan taşıyıcı proteinler, bazı küçük moleküllerin geçişine izin vermelerine rağmen, diğer bir kısım molekülün geçişine izin vermezler (Geoffrey, 1997).

Hücre zarlarının parçalara ayrıştırma tekniği yardımıyla incelenmesi sonucu, hücre zarlarının yapılarında bulunan proteinlerin ve lipidlerin özellikleri ortaya çıkartılmıştır. Buna göre, protein ve lipidlerden meydana gelen hücre zarlarında bulunan protein-lipid oranı çeşitlerine göre büyük oranda değişim gösterir. Örneğin mitokondri zarında protein oranının %76 sinir hücrelerinde ise bu oranın %18 olduğu saptanmıştır. Hücre zarlarında bulunan lipid miktarlarında da farklılıklar olduğu, tüm hücrelerin ortak

(17)

özellikleri olarak zarlarında fazla miktarda fosfolipid bulunduğu gösterilmiştir (Robert, 1999).

Membran lipidlerinin çoğu fosfolipidlerdir. Bunlar bir polar baş gruba ve iki hidrofobik hidrokarbon kuyruklara sahiptir. Bu kuyruklar genellikle yağ asidleridir ve uzunlukları farklıdır (14–24 karbon). 16–18 karbonlu yağ asitleri en yaygın olanlarıdır. Yağ asidi kuyruklarından biri çift bağ (doymuş yağ asidi, sature fatty acid) içermezken, diğeri bir veya daha fazla çift bağ (doymamış yağ asidi, unsature fatty acid) içerir. Her bir çift bağ kuyrukta küçük bir bükülmeye neden olur. Bu çift bağ zar akıcılığını arttırır. Yağ asidi kuyruklarındaki doymuşluk ve uzunluk farkı önemlidir. Çünkü fosfolipid moleküllerinin birbirlerine paketlenme yeteneğini ve membran akışkanlığı etkilenir (Güneş, 2003).

Bütün biyolojik zarlar belirli hayati önemi olan özellikleri paylaşır. Çoğu polar veya yüklü katılara geçirgen değildir, fakat polar olmayan bileşiklere geçirgendir; 5–8 nm kalınlıktadır ve elektron mikroskopisiyle incelenen kesitlerde üç tabakalı görülür. Elektron mikroskopisi ve kimyasal bileşime çalışmalarından, biyolojik zarların geçirgenliğine ait ve zarlarda protein ve lipid moleküllerinin hareketine fiziksel çalışmalardan elde edilen veriler, biyolojik zarların yapısı için sıvı-mozaik modelinin geliştirilmesine neden olmuştur (Şekil 1.1.). Fosfolipidler ve steroller, merkezde lipid moleküllerinin polar olmayan bölgeleri ve birbirlerine ve polar baş grupları ise dışa bakacak şekilde bir lipid ikili tabakayı oluşturur. Bu ikili tabakalı yapıda, zar lipidleri ve proteinlerin hidrofobik kısımları arasındaki hidrofobik etkileşimlerle tutunan proteinler düzensiz aralıklarla gömülü olarak bulunurlar. Bazı proteinler zarın sadece bir tarafından dışarıya doğru çıkıntı yaparken; diğerlerinin her iki tarafta da parçaları vardır. İkili tabakanın bir tarafında bulunan protein kısmı diğer tarafında bulunan protein kısmından farklıdır (Geoffrey, 1997; Nelson ve Cox, 2005).

(18)

Şekil 1.1. Biyolojik membranların akıcı-mozaik zar modeli (Nelson ve Cox, 2005).

Hücre membranlarının her iki yüzeyi de suyla çevrili olduğu için lipid molekülleri, iç tarafta hidrofobik kuyruklarını gömerek, dış tarafta hidrofilik baş kısımları suya dönerek kendiliğinden bir araya toplanmıştır. Böylece fosfolipid molekülleri sulu ortamda bilayeri kendiliğinden oluşturur (Robert, 1999).

Biyolojik membranlar ibaret organize yapılardır. Membranların yürüttüğü fonksiyonların canlılığın varlığı ve devamı için hayati önemi vardır. Membranların yürüttüğü bu fonksiyonlar şu şekilde özetlenebilir:

• Çeşitli çift yönlü taşıma olaylarında rol alırlar. Örneğin kas hücreleri emilim sonrasında plazmadan amino asitleri alırken açlıkta ise plazmaya amino asitleri verirler. Bu çift yönlü mekanizma insülin gibi hormonlar ile kontrol edilir.

• Yarı geçirgen bir bariyer olduğu için hücreye gerekli metabolitleri alırken istenmeyen bileşikleri de hücre dışına bırakır.

• Glikoproteinleri ve glikolipidleri aracılığı ile diğer hücrelerle iletişim kurulmasına ve hücrelerin birbirleri ile etkileşmesine olanak sağlar. Böylece hücreler bir doku organizasyonu sağlamış olur.

(19)

• Membranlar biyolojik haberleşmede önemli rol oynamaktadır. Hücre membranı hormonlar gibi bazı hücre dışı sinyalleri tanır. İnsülin gibi birçok hormonun hücre membranında reseptör proteini bulunmaktadır. Reseptör protein kendisine özgü hormonu tanır ve hücre içine sinyal gönderir.

• Bağışıklık sistemi hücrelerin membranlarında yer alan yabancı bileşeni tanıyan reseptörleri ile vücudun savunmasında rol alır.

• Eritrositlerin membranlarındaki karbonhidrat antijenleri kişinin kan grubu özelliğini belirler.

• Metabolizma atıklarının dışarı atılmasını sağlayarak iç ortamı düzenler.

• Membranın amacı, hücreye giriş çıkışları kontrol etmektir. Hücreye giren elemanlar yüksek seviyede regüle edilirler. Hücre yüzeyinde bulunan reseptörlerle diğer hücrelere iletilirler.

• Bilayerde bulunan proteinler, su ve çözünür moleküllerin membrana hareketini düzenleyen transport proteinleri, tanıma ve iletişim proteinleri ile ilgilenen reseptör proteinlerdir. Membranlar sayesinde hücreler birimler halinde birbirinden ayrılır ve hücreye şekil verir.

• Üreme, büyüme ve hareket gibi hücrenin birçok davranışını kontrol eder.

• Spesifik moleküler pompa, taşıyıcı ve kanallar aracılığıyla son derece seçici geçirgen özelliktedir.

• Membranlar hücreler ve kendi çevreleri aralarındaki bilgi akışını kontrol eder. Dıştan gelecek uyarıları algılayacak reseptörler sayesinde, biyolojik haberleşmede önemli rol oynamaktadır (Noyan, 1986; Onat ve ve Sözmen, 2002; Tokullugil ve ark. 1997; Demirsoy ve Türkan 1999; Keha ve Küfrevioğlu 2000; Güneş, 2003).

(20)

1.2. Hücre Membranında Yer Alan Lipid Çeşitleri

Biyolojik membranların ana yapısını, fosfolipidler, glikolipidler ve kolesterol oluşturur. Bu bileşiklerin miktarı hücreden hücreye, alınan diyete ve çevreye göre değişir (Onat ve Sözmen, 2002; Robert, 1999; Keha ve Küfrevioğlu. 2000).

Şekil 1.2. Başlıca depo ve zar lipidleri (Nelson ve Cox, 2005).

Major membran lipidleri 16- 18 karbon uzunluğunda yağ asitlerini içeren fosfolipidleridir. Fosfolipid zincirleri, hidrofilik veya polar bir uç ve hidrofobik veya non-polar bir uca sahip olan amfipatik moleküllerdir. Bunlar bir polar baş gruba ve iki hidrofobik hidrokarbon kuyruğa sahiptir. Bu kuyruklar genellikle yağ asitleridir ve uzunlukları farklıdır (14–24 karbon). Bir kuyruk genellikle bir veya daha fazla cis- çift bağ içerir. Her bir çift bağ yağ asidi kuyruğunda küçük bir bükülme yapar. Yağ asidi kuyruklarındaki doymuşluk ve CH zinciri uzunluğu önemlidir. Çünkü fosfolipid moleküllerinin birbirlerine paketlenme yeteneğini etkiler, o sebeple membran akışkanlığı etkilenir (Freitas, 1999).

1.2.1. Lipidler

Başlıca karbon ve hidrojen atomlarından oluşan lipidler, suda çözünmeyen biyomoleküllerdir. Karbon ve hidrojene oranla çok daha az miktarlarda bulunan

(21)

oksijenin yanı sıra fosfor (P), azot (N) ve kükürt (S) ise ancak bazı lipid türlerinde bulunmaktadır. En basit formlarında lipidler bir uçlarında bir karboksil grubu bulunan hidrokarbonlardır. Yapılarında önemli miktarda hidrokarbon (C,H) zincir taşıyan lipidler, nonpolardır ve hidrofobik özellik göstermektedirler (Demirsoy ve Türkan, 1999; Keha ve Küfrevioğlu 2000; Yılmaz, 2007).

Lipidler genel olarak suda çözünmezler, buna karşılık eter, aseton, benzen, kloroform gibi organik çözücülerde çözünürler. Lipidlerin metabolizma için gerekli yakıtın deposunu oluşturmak, membranlarda yapıtaşı olarak görev yapmak, bakterilerin hücre duvarları, bazı bitkilerin yaprakları ve cilt için koruyucu madde olmak gibi fonksiyonları vardır. Lipidlerin önemli kısmı organizmaya dışarıdan alınır, bir kısmı ise doğrudan doğruya organizmada yapılırlar (Demirsoy ve Türkan, 1999; Yıldırımkaya, 2000).

Lipidlerin başlıca biyolojik fonksiyonları şunlardır:

• Membranların yapı elemanlarıdır.

• Metabolik yakıtın hücre içi depolanma şeklidir.

• Metabolik yakıtın bir taşınma formudur.

• Birçok bakterinin, yüksek bitki yapraklarının, böcekkabuklarının ve omurgalı derilerinin hücre çeperleri için koruyucu bileşiklerdir.

• Vücuttaki lokalizasyonları itibariyle elektrik ve termal izolatör görevleri vardır. Elektriksel izolasyon maddesi olarak sinir impulslarının taşınmasında görev alırlar.

• Lipidler grubuna dahil edilen bileşiklerden vitamin ve hormonların da etkili biyolojik aktiviteleri vardır.

• Kendileri de lipid ürünü olan safra asidleri lipidlerin sindirimi ve emilimi için gereklidir.

(22)

• Işık absorblayan pigmentleri oluşturur.

• Emilsüfiye ajanlardır, yani dağıtılmış olarak küme oluşumunu engellerler.

• Sfingolipidler ABO kan grubu antijenlerinin membran yüzeyini oluşturur (Yılmaz, 1995; Keha ve Küfrevioğlu 2000; Yılmaz, 2007).

Lipidleri birçok şekilde sınıflamak mümkündür. Yaygın olarak aşağıdaki sınıflama şekli kullanılmaktadır:

1. Nötral Yağlar ( triaçilgliseroller, trigliseridler) 2. Yağ Asitleri 3. Fosfolipidler 4. Glikolipidler 5. Mumlar 6. Steroid ve Terpenler 1.2.1.1. Nötral Yağlar

Açilgliserol veya gliserid olarak bilinen bu bileşikler, yağ asidlerinin gliserolle meydana getirdikleri esterlerdir. Hayvan ve bitki hücrelerindeki yağ depolarının başlıca bileşenleridir. Monoaçilgliseroller gliserolün sadece bir karbon hidroksilinin yağ asidleri ile esterleşmesi sonucu ortaya çıkar. Bitki ve hayvan dokularında en az bulunan yapıdır. Diaçilgliseroller gliserolün iki hidroksil grubunun iki uzun zincirli yağ asidi ile esterleşmesi sonucu oluşur. Bu moleküller triaçilgliserolden elde edilir ve başta fosfolipidler olmak üzere birçok bileşiğin ara ürünüdür. Gliserolun üç hidroksil grubu yağ asitleriyle esterleştiği bileşikler triaçilgliserollerdir. Trigliseridler tabiatta nötral yağların büyük bir kısmını oluşturur. Bunun yanı sıra monoaçilgliserol ve diaçilgliserollerde bulunur (Yılmaz, 2007).

(23)

Şekil 1.3. Nötral lipid yapısı (Anonim, 2007a).

1.2.1.2. Yağ Asitleri

Yağ asitleri bitki ve hayvan organizmasında gerek serbest gerekse bileşikler halinde bulunur. Yağ asitlerinin birçok hücre ve dokularda serbest haldeki konsantrasyonları çok düşük olmasına rağmen nötral yağlar, fosfogliseridler, glikolipidler, kolesterol esterleri ve bazı mumların yapı taşlarıdır. Yağ asidleri 4 ten 36 ya kadar uzunlukta karbon içeren hidrokarbon zincirli karboksilik asidleridir. Yağ asitleri R-COOH kapalı formülüyle gösterilen monokarboksilik asitlerdir. R grubu doymuş ya da bir ya da daha fazla sayıda C-C çift bağı yapmış doymamış uzun bir hidrokarbon zinciri olabilir. Doymuş yağ asidlerinde her karbona mümkün olan en fazla sayıda hidrojenle bağlıdır ve bu nedenle C-C arasında hiç çift bağ bulunmaz. Doymamış yağ asitleri (oda sıcaklığında sıvıdırlar) en azından bir tane C-C arası çift bağa sahiptir. Hemen hemen hepsi çift sayıda karbon atomu bulundurup, zincir uzunlukları 14–22 arasındadır ve 16 -18 C en bol bulunanlarıdır (Yılmaz, 2007).

(24)

1.2.1.3. Fosfolipidler

Biyolojik membranların en önemli bileşenleridir. Gliserol ve sfingozin alkol türevleridir. Gliserolden türetilen fosfolipidlere fosfogliseridler denir, bir gliserol omurgası, iki yağ asidi ve fosforillenmiş alkolden oluşurlar. Sfingomiyelinden türetilen fosfolipidlere sfingomiyelinler denir, gliserolden türetilmez ve özellikle sinir hücre membranlarında bulunur. Uzun ve doymamış bir hidrokarbon zinciri bulunduran, bir amino alkol olan, palmitat ve serinden çıkarak sentezlenen sfingozin teşkil eder (Keha ve Küfrevioğlu, 2000).

Şekil 1.5. Genel bir fosfolipid yapısı (Anonim, 2007c).

1.2.1.4. Glikolipidler

Karbonhidrat ihtiva eden lipidlerdir. Sfingomiyelin gibi seramidden türemiştir. Primer hidroksil grubu bir veya daha fazla sayıda monosakkarit ile birleşmiştir. En basit glikolipidler, yalnız tek bir glikoz ya da galaktoz ile bağlı bileşikler olup serebrositler denir (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Yılmaz, 2007).

(25)

1.2.1.5. Mumlar

Yapıları uzun zincirli doymuş ya da doymamış yağ asidi ile uzun zincirli alkollerin birbirine ester bağı ile bağlanmasıyla oluşur. Bu bileşikler deri, kürk ve tüylerin koruyucu örtüsünü teşkil ederken, yüksek bitkilerin meyve ve yapraklarının ve birçok böceğin kutikulalarında bulunur. Yağlar gibi kolay hidroliz olamayıp, enzimlerle sindirilemezler, deniz canlılarında bol bulunur. Planktonlarda, balinalar, ringa balıkları, alabalık diğer deniz canlılarında bulunmaktadır (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Yılmaz, 2007).

1.2.1.6. Steroid ve Terpenler

Hücrelerde sıcak alkali ortamda hidroliz sonucu sabun oluşturmayan lipidlerdir. Beş karbonlu izopren türevleridir. Steroidler, 4 halkadan ve 17 karbondan oluşan aktif yağda çözünür amfipatik moleküllerdir. Androjenler, östrojenler, kortizol, D vitamini, safra asidleri bu gruba girerler. Tabii steroidler içinde kolesterol ile bundan sentezlenen safra asitleri ve steroid hormonlardır. Terpenler, 5 karbonlu izopren alt birimlerinin polimerizasyonu ile sentezlenir. Bitkilerde, esansiyel yağlarda, büyüme hormonu gibi etki eden bileşenlerde görülür (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Yılmaz, 2007).

(26)

1.3. Biyolojik Membranlarda Yer Alan (Değişik Canlılardaki) Fosfolipid Yapıları ve Çeşitleri

Hücre membranı lipid çift katmanı esas olarak fosfolipidlerden yapılmış olup bunlar hidrofilik kısmı sulu ortama bakacak şekilde, hidrofobik kısımlar ise iç kısımda toplanacak şekilde düzenlenmişlerdir. Molekülün hidrofobik bölümü membranların diğer polar olmayan bileşikleri olan glikolipidler, protein ve kolesterol ile birlikte bulunur. Fosfolipidlerin hidrofilik başı membranın dışına doğru uzanır. Fosfolipidler gliserol ve sfingozin alkol türevleridir. Her iki sınıfta membranın bir bileşeni olarak bulunur, ancak gliserol içeren fosfolipidlerin vücutta ek olarak başka rolleri de vardır. Örneğin; kolesterolün çözünebilmesinde yardımcı olan deterjan özelliklerinin bulunduğu safranın esansiyel bileşenidir, bazı proteinlerin hücre membranına tutunmasını sağlarlar, membran boyunca yayılan sinyal geçişinde yer alırlar ve akciğer surfaktanının bir bileşenidirler. Zardaki başlıca fosfolipidler, fosfatidilkolin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin ve sfingomiyelindir. Lipid bileşimi Çizelge 2.1.’de gösterildiği gibi farklı hücre tiplerinde değişiklik göstermekte olup, hücre tiplerinin çoğunda ana plazma zar lipidi fosfatidilkolin iken, sfingomiyelinler en değişken grubu oluşturur (Tokullugil ve ark., 1997; Keha ve Küfrevioğlu 2000; İnal ve ark., 2007).

Çizelge 1.1. Farklı hücre zarlarındaki lipid yüzdeleri (Güneş, 2003)

Lipid Karaciğer Eritrosit Myelin Mitokondri E.retikulum E. coli

Kolesterol 17 23 22 3 6 0

Fosfatidil etonolamin 7 18 15 35 17 70

Fosfatidil serin 4 7 9 2 5 eser

Fosfatidil kolin 24 17 10 39 40 0

Sfingomiyelin 19 18 8 0 5 0

Glikolipid 7 3 28 Eser eser 0

(27)

1.3.1. Fosfogliseridler

Bir gliserol omurgası, iki yağ asidi zinciri ve bir de fosforillenmiş alkolden yapılmışlardır. Gliserolün bir ve iki nolu karbonlarındaki hidroksil grubu, iki yağ asidinin karboksil grubuyla, üç nolu karbon hidroksili de fosforik asitle esterleşmiştir. Oluşan bileşiğe fosfotidat denir ve en basit fosfogliserittir.

Şekil 1.7. Fosfatidat yapısı (Anonim, 2007e).

Bitki ve hayvanlarda en önemli sentez yolu glikozun yıkılması ile elde edilen alfa-gliserofosfatın kademeli olarak açillenmesiyle oluşur. Fosfatidik asid ayrıca sindirim kanalı ile dokularda bulunan fosfolipaz D enziminin çeşitli fosfolipidleri hidrolizi sırasında da ortaya çıkar. Fosfatidik asid hücrelerde nörotransmitter ve ikinci haberci olarak da görev yaptığı belirlenmiştir. Hücre zarı geçirgenliğinin düzenlemesinde etkilidir. Membranlarda çok az miktarda bulunur ve fosfotidatlar diğer fosfogliseridlerin biyosentezinde önemli ara bileşiklerdir (Keha ve Küfrevioğlu 2000; Yılmaz, 2007).

Fosfogliseridler, fosfatidatlardaki fosfat grubunun bir takım alkollerin hidroksil grubuyla esterleşmesi sonucu ortaya çıkar. Bu alkoller serin, etanolamin, kolin, gliserol ve inositoldür. Fosfotidat molekülünün bu alkollerle esterleşmesiyle sırasıyla, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilkolin fosfatidilgliserol ve fosfatidilinozitol meydana gelir. Fosfat grubu bu alkollerle birleşirken hidrojen iyonunu kaybetme eğiliminde olduğu için oksijenlerden bir tanesi negatif yüklenir, benzer şeklide elektronegatif olan azot hidrojen iyonunu çekme eğilimindedir ve bu nedenle pozitif yüklenir. Kısacası fosfolipidlerin fosfat ve azotlu grup içeren ucu çok kuvvetli iyoniktir

(28)

ve bu nedenle suda çözünür, yağ asidinin iki uzun hidrokarbon kuyruğunu içeren diğer ucu nonpolardır ve suda çözünmez (Demirsoy ve Türkan, 1999; Keha ve Küfrevioğlu 2000).

Şekil 1.8. Lipid bilayerde bulunan fosfolipid yapısı (Anonim, 2007f).

Fosfogliseridlerde en az bir tane doymamış yağ asidi bulunur. Genellikle birinci karbona bağlı yağ asidi doymuş, ikinci karbona bağlı yağ asidi doymamıştır. İçerdiği yağ asitlerinin farklılığından dolayı kimyasal olarak birbirinden çok farklı özellikte çok sayıda fosfogliserid bulunur (Tokullugil ve ark., 1997; Murray ve ark, 2004).

1.3.1.1. Fosfatidilkolin (Lesitin)

Bitki ve hayvanlarda en çok bulunan total fosfolipid konsantrasyonunun %50’ sinden fazlasını oluşturan doğal hücre zarında en bol bulunan fosfolipiddir. Özellikle plazma zarı dış katmanında yüksek oranda bulunur. Başta HDL olmak üzere kanda dolaşan lipoproteinlerin en önemli bileşenidir. Gliserolün üç nolu karbonuna bağlı fosfatın –OH ile kolinin esterleşmesiyle oluşur. Fizyolojik pH da zwitter iyon şeklinde olup bir nolu

(29)

karbonunda genellikle palmitik (16:0) veya stearik asit (18:0); iki nolu karbonunda oleik(18:1), linoleik(18:2) ve linolenik(18:3) asitler bulunur. Vücudun kolin deposunun büyük bir kısmını oluşturur. Akciğer alveollerinde yüzey gerilimine bağlı olarak birbirine yapışmasını önleyen surfaktan’ın yapıtaşıdır. Erken doğan bebeklerin akciğerinde bunun bulunmaması sıkıntılı solunum sendromuna neden olur. Fosfatidilkolinlerde doymamış yağ asidinin varlığı fizyolojik olarak önemlidir. Enzimatik olarak parçalanması sonucu oluşan lizofosfatidilkolin şiddetli hemolitik olup eritrositleri parçalar. Ayrıca emilsüyonlaşmayı (lipidleri küçük parçalara ayırma) sağlayarak, lipidlerin sindirimini kolaylaştırır. Hücre zarlarında sinyal iletiminde ve bazı reseptörlerin aktivitesi için gereklidir. Lesitin hazır gıdalarda emilgator olarak fonksiyon yapar, en fazla yumurta sarısında bulunur (Konukoğlu, 2000; Murray ve ark., 2004).

Şekil 1.9. Fosfatidilkolin yapısı (Anonim, 2007g).

1.3.1.2. Fosfatidiletanolamin (sefalin)

En çok beyin ve sinir dokusunda bulunur. Biyolojik membranlardaki miktarı fosfatidilkolinde sonra gelir. Bakteri hücre duvarının en önemli lipid bileşenidir.

(30)

Fosfatidattaki fosforik asidin –OH grubuna etanolamin bağlanmıştır. Fizyolojik pH da zwitter iyon halindedir ve yağ asidi bileşimi lesitinlere benzer. Birinci karbon atomuna bağlı yağ asidi doymuş, ikinci karbon atomuna bağlı yağ asidi doymamış(araşidonik asid, omega–6 esansiyel yağ asidi) haldedir (Keha ve Küfrevioğlu 2000; Murray ve ark., 2004; Yılmaz, 2007).

Şekil 1.10. Fosfatidiletanolamin genel yapısı (Anonim, 2007h).

1.3.1.3. Fosfatidilserin

Alkol gurubu olarak üç nolu karbonda serin amino asidini bulunduran tek fosfolipidlerdir. Yaygın olarak tüm mikroorganizmalar, bitkiler, hayvanlar, insanlar ve dokuların çoğunda bulunan fosfolipid konsantrasyonu içinde %10’un altındadır. Hücrelerin plazma ve endoplazmik retikulum fosfolipidleri içindeki oranı %10–20 arasında değişir. Plazma membranı ve diğer hücre membranlarında fosfatidilserin bütünü membran iç yüzeyine yerleşmiştir. Zayıf asidik karakterlidir. Fizyolojik pH da -1 yüklüdür (Keha ve Küfrevioğlu 2000; Murray ve ark., 2004).

(31)

1.3.1.4. Fosfatidilinositol

İnositol, fosfatidilinositol içerisinde stereoizomeri olan miyoinositol halinde bulunur. Tamamına yakını birinci karbonda daima stearik (18:0) asit, ikinci karbonda daima araşidonik asit (20:4) bulundurur, böylece membranlarda araşidonik asid deposu olarak işlev görür. Fizyolojik pH da – yüklüdür. PI ların inositol üzerinden fosforillenmiş türevlerine fosfainositidler denir ve hücre sinyalizasyonunda önemli fonksiyonları vardır. Birinci membrana bağlı fosfatidilinositol fosforilasyonuyla; çeşitli nörotransmitterlerin, hormonların ve büyüme faktörlerinin membran reseptörlerine bağlanmasına cevap olarak oluşur. PI ların yıkımı Ca++ mobilizasyonu ve protein kinaz C aktivasyonu ile sonuçlanır. Böylece membran boyunca sinyal geçişi gerçekleşir. Spesifik proteinler membrana bağlı fosfatidilinositole bir karbonhidrat köprüsü ile bağlanır. Aynı zamanda, hücre dışı sinyallerin plazma zarının dış yüzeyinde bulunan özgül reseptörler etkileşime tepki olarak, hücre içinde salgılanan haberci moleküllerin deposu olarak görev yapar (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Murray ve ark., 2004; Nelson ve Cox, 2005).

Şekil 1.12. Fosfatidilinositol genel yapısı (Anonim, 2007i).

1.3.1.5. Difosfatidilgliserol

Gliseroldeki birinci ve üçüncü karbondaki hidroksil grubunun iki adet fosfatidatla esterleşmesi sonucu difosfatidilgliseroller ya da kardiolipinler meydana gelir. İlk defa

(32)

kalp hastalarından izole edildiği için bu isim verilmiştir. Bu lipidler sadece mitokondri iç membranlarında ve bakterilerde bol bulunur. Fizyolojik pH da -2 yüklüdür. Antijenik etkisi bilinen tek lipiddir ve sifiliz (frengi) tanı testlerinde kullanılmaktadır (Konukoğlu, 2000; Murray ve ark., 2004).

Şekil 1.13. Difosfatidilgliserol genel yapısı (Anonim, 2007j).

1.3.1.6. Plazmalojen

Değişik canlı türlerinde yapılan gözlemler sırasında yapılarında bulunan lipidlerin bir kısmında yağ asidlerinin gliserolle ester bağı yerine eter bağı ile bağlanmasıyla oluşan yapılardır. Yani birinci karbonda cis konfigürasyonunda doymamış HC zinciri bulunur. Kara memelilerinde karaciğerde yağ dokuda, tümör hücrelerinde ve deniz canlılarında bulunur. Kalp ve sinir hücre zarında özellikle beyin, mitokondri, miyelin ve kalp kasında bol bulunur. Plazmalojen fosfatidiletanolamin içinde daha fazla, fosfatidilkolin içinde daha az bulunur. Fosfatidilinozitol ve diğer fosfolipidlerde bulunmazlar. Merkezi sinir sisteminde sinirlerin miyelin kılıfını oluşturmasında ve iletiminde özellikle önem taşır. Hücre içi sinyal iletim molekülleri olarak görev yapan çoklu doymamış yağ asidi depolarıdır. Bir plazmalojen olan 1-alkenil–2-asetil-fosfatidilkolin çok güçlü kimyasal mediatördür ve kan trombositlerinin agregasyonuna ve degranülasyonuna sebep olur. Bu yüzden başlangıçta trombosit aktive edici faktör (PAF) olarak adlandırıldı. PAF’ın diğer etkileri akciğerlerde ödemi arttırmak, aşırı duyarlılık, akut iltihabi reaksiyonlar, trombosit kümeleşmesini ve trombositlerden salgılanmasını tetikler. Ayrıca nötrofiller ve alveoller makrofajların süper oksit radikalleri üretmelerine neden olmak gibi etkileri bulunmaktadır (Konukoğlu, 2000; Murray ve ark., 2004).

(33)

Şekil 1.14. Plazmalojen genel yapısı (Anonim, 2007k).

1.3.2. Sfingomiyelinler

Gliserolden türetilmezler. Sfingomiyelin omurgasını, sfingozinler oluştururlar. Sfingomiyelin omurgası uzun ve doymamış bir hidrokarbon zinciri (C,H) ihtiva eden amino alkol olan, organizma tarafından palmitat ve serinden çıkartılan sfingozin oluşturur. Sfingomiyelin, sfingozinin amino grubu bir yağ asidine amid bağıyla bağlanır ve bu yapıya seramid denir. Seramidin primer hidroksil grubu –OH fosfarilkolin ile esterleşerek sfingomiyelin oluşturur. Sfingomiyelinler hidroliz edildiklerinde;

• Yağ asidi • Fosforik asit • Kolin

• Sfingozin oluşur.

(34)

Sfingomiyelinlerin genel özellikleri, üç boyutlu yapısı ve baş gruplarında net yük olamamasıyla fosfatidilkolinlere çok benzer. Hayvan hücre zarlarında en yaygın bileşenlerden biridir. Fosfatidilkolinden sonra en yaygın bulunana lipiddir. Hayvan dokularında özellikle sinir hücrelerinde bulunurlar. Bitki ve bakterilerde bulunmaz. Sfingomiyelinler memeli birçok hücresinde bulunur, en çok sinir sistemi miyelin kılıfında ve eritrosit membranlarında yer alır. Sfingomiyelin lizozomal bir enzim olan sfingomiyelinaz ile fosfatidilkolini sfingomiyelinden ayırır. Enzim eksikliğine Niemann-Pick hastalığı örnek oluşturur. Mental gerilik, lipidle dolu dalak, büyük karaciğer, retinada kiraz kırmızısı benekler ve erken yaşta ölüm izlenir (Konukoğlu, 2000; Murray ve ark., 2004; Yılmaz, 2007).

1.4. Biyolojik Membranların Yapısında Bulunan Proteinler

Membranlar tarafından yürütülen dinamik fonksiyonlardan membran proteinleri sorumludur. Membran lipidleri bir geçirgenlik engeli olup, hücre birimi ve hücre içi kompartımanlarını oluştururken, proteinler de transport, haberleşme ve enerji dönüşümü gibi çok özel membran fonksiyonlarını yerine getirir. Membran lipidleri aynı zamanda bu proteinlerin görevlerini en verimli şekilde yapmak için uygun bir ortam sağlarlar (Keha ve Küfrevioğlu 2000).

Bazı membran proteinleri, iyonik şiddeti yüksek çözücülerle (NaCl) kolayca serbest hale geçirilebildiği halde, bazılarını membran yapısından ayırabilmek için deterjan veya organik çözücülerin kullanılması gerekmektedir. Membrandan ayrışma farklılığına göre membran proteinleri periferal ve integral olmak üzere ikiye ayrılır:

İntegral (iç) proteinler, membran lipidlerinin hidrokarbon zinciriyle büyük miktarda etkileştiği için zara sıkıca bağlıdır, bunları membrandan ayrıştırmak bu apolar etkileşmeleri deterjan veya organik solventlerle yenmek suretiyle olur. Periferal (yüzeysel) proteinler ise, membranda bulunan lipidlerin polar baş gruplarıyla integral proteinlerin hidrofilik kısımlarıyla elektrostatik ve hidrojen bağları gibi non-kovalent

(35)

etkileşmelerle bağlandığından, bu etkileşmeler tuz ilavesi veya pH değişiklikleri ile ortadan kaldırılabilir (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; Nelson ve Cox, 2005).

Periferal proteinler zara bağlı enzimlerin düzenleyicisi olarak görev yaparlar veya integral proteinlerin hücre içi yapılara tutunmalarını sağlayarak onların hareketlerini kısıtlayabilirler. İntegral proteinlerin zara sıkıca tutunması zar lipidleri ve proteinin hidrofobik kısımları arasındaki hidrofobik etkileşimler sonucudur (Keha ve Küfrevioğlu, 2000; İnal ve ark., 2007).

İntegral proteinler birçok hücresel olayda rol oynarlar. Hücreler arası veya hücre dışı matriks arası proteinler arasında özgül bağlanma noktaları sağlarlar, taşıyıcılar ve iyon kanalları hormonlar için reseptörler, nörotransmitörler ve büyüme faktörleri olarak görev yaparlar. Oksidatif fosforillenme, fotosentez için ve immün sistemde hücre-hücre, antijen-hücre tanınmasında önemlidirler (Nelson ve Cox, 2005).

Karbonhidratlar, hücre zarlarının diğer önemli yapı moleküllerinden olup proteinler ve lipidlerle glikoproteinler ve glikolipidleri yaparlar. Karbonhidratların özellikle hücrelerin yüzey kısımlarında reseptör olarak görev yapmaları nedeniyle hücrelerin dış yüzeylerinde yoğun olarak bulunmalarına rağmen, mitokondri ve kloroplast gibi hücre içi organellerde daha az miktarda bulunurlar. Karbonhidratların hücre zarının yapısına girmeleri lipid ve proteinlerin hidrofobik özellik kazanmalarına ve hücre zarlarının kararlı yapılar haline dönüşmelerine neden olur. Hücre zarlarının dış yüzeylerinde bulunan glikoproteinlerin serbest yüzeyleri anten gibi iş görerek, hücreye alınacak ve hücreden atılacak maddelerin tanınmasını sağlarlar. Ayrıca hücrelerin birbirlerini tanıyarak, dokular meydana getirmelerine yardımcı olurlar (Robert, 1999)

Hücre zarında bulunan proteinlerin tümü yapısal özellikte olmayıp bir kısmı hücresel faaliyetlere katılırlar. Örneğin taşıyıcı proteinler bu özellikte olup, hayvansal hücrelerde dış ortamdan madde alınımı hücre zarı vasıtasıyla (endositoziz), hücrede sentezlenen salgı granülleri ve artık ürünlerin dışarıya atılması ise ekzositozizle olur. Hücre zarları dış yüzeylerinde bulunan reseptörler yardımıyla hormonlar gibi çok özel hücreler tarafından salgılanan kimyasal maddeleri tanıyabilirler. Hücre yüzeyinde bulunan

(36)

reseptörler spesifik hormonu tanıyarak, hormonların hücrelere alınabilmesi için hücre zarında bir kısım modifikasyonlar meydana getirirler. Hücre zarları yüzeylerinde meydana gelen modifikasyonlarla farklı görevleri yerine getirebilirler.

Strayer (1988)’e göre glikoproteinlerin ve glikolipidlerin şeker birimleri ise membran dış yüzeyinde yer alır ve hücrelerin birbirini tanımasını sağlamaktadır. Tüm proteinlerin membrandaki yerleşimleri, membranın iç ve dış yüzeyleri arasında bir asimetrinin olduğunu göstermektedir (Yılmaz, 1995).

1.5. Eritrosit Membranlarında Yer Alan Fosfolipidler

Kan, ekstrasellüler bir sıvı ve bu sıvı içerinde özelleşmiş hücrelerden meydana gelmektedir. Ergin bir insanda hücrelerarası sıvının 1/3’ünü kan oluşturmaktadır. Kanın % 55’ i plazma, % 45 ‘i de hücrelerden oluşmuştur. Kan hücreleri eritrositler, lökositler ve trombositlerdir. Plazma ve hücrelerin özgül ağırlıkları farklıdır. Bu özelliğinden dolayı kan hücreleri ve plazma santrifügasyon ile birbirinden kolaylıkla ayrılabilmektedir. Santrifüj işlemi sonunda eritrositler en altta kalın bir tabaka oluşturur (Demirsoy ve Türkan, 2000; Toker, 2000).

Eritrositler disk biçimli iki tarafı çukur bir yapıya sahip olup geniş bir yüzey alanına sahiptir. Eritrositlerin membranları bu yapıları sayesinde fazla gerilmeden şişebilir ve bol miktarda CO2 ve O2 taşıyabilir. Bütün memeli hayvanların olgun eritrositleri çekirdeksiz ve hemoglobin taşır. Balıkların, amfibilerin, sürüngenlerin, kuşların eritrositleri hem çekirdek bulundurur, hem de hemoglobin taşır. Memeli hayvanlarda olgun eritrositler çekirdek taşımadığı gibi mitokondri ve ribozomda bulundurmaz. Bu sebeple enerji sağlamak ve kendini oksidasyona karşı korumak için sitoplâzmada meydana gelen glikoliz ve pentoz fosfat yolunu kullanırlar. Eritrositler fötal hayatın üçüncü ayından beşinci ayına kadar dalak ve karaciğerde yapılır. Fötal hayatın yarısından sonra kemik iliğinde yapılır ve yapımı hayat boyu devam eder (Demirsoy ve Türkan, 2000; Noyan, 2000).

(37)

Kan dolaşımına yeni giren genç eritrositler( çekirdeksiz ve ribozom vardır) retiküler bir yapı gösterdiğinden bunlara resitülosit denir ve bunlar tüm alyuvarların %1 ini oluşturur. Kemik iliğinde kan yapımı devamlı olduğu için yaşlanıp dolaşımdan uzaklaştırılan eritrositlerin yerini yenileri yapılır. Kan kaybı olduğunda yapımı artar, kan nakli ile sayısı artarsa bu sayı normale dönünceye kadar kan yapımı durur. Kan yapımı tiroid bezi, adrenal korteks, cinsel hormonlarda etkilidir (Noyan, 2000).

Eritrosit membranı 150–200 kadar farklı lipid ve 20’ye yakın protein ve mukopolisakkaritler (glikoproteinler) ihtiva eder. İnsan eritrosit membranında nötral lipidler, glikolipidler ve fosfolipidler yer almaktadır. Değişik kaynaklara göre fosfolipid miktarı ve çeşidi türden türe değişmektedir (Şekil 2.1.). İnsan eritrosit membranında %28,3–29,5 fosfatidilkolin, %26,7–31,5 fosfatidiletanolamin, %24,1–26,9 sfingomiyelin, %12,7–14,8 fosfatidilserin, %0,6- fosfatidilinozitol, %1-1,9 fosfatidat, %0,6-2,2 poligliserofosfolipid, %1-1,4 oranında lizofosfatidilkolin bulunur (Muray ve ark., 1993; Geoffrey, 1997; Noyan, 2000).

Çizelge 1.2. Eritrosit plazma zarında iç ve dış tekli tabakalarda fosfolipidlerin asimetrik dağılımı (Nelson ve Cox,

(38)

İnsan eritrosit membranlarının yağ asidi muhtevası fosfolipid çeşitlerine göre farklılık göstermektedir. İnsan eritrositlerinde 35 yağ asidi bulunmuştur. Fosfatidilkolinde palmitat, linoleat; fosfatidilserin de 18:0, 20:4 yağ asidleri; sfingomiyelin de ise 20 karbon atomuna sahip yağ asidleri %50’ den fazladır (Van Denen ve De Giier, 1974).

Lipid çift tabakanın her iki yarı parçasının lipid kompozisyonu çarpıcı olarak birbirinden farklıdır. Örneğin; insan kırmızı kan hücre zarında, lipid tabakanın dış yarısındaki lipid moleküllerinin hemen hemen hepsi baş gruplarında fosfatidilkolin veya sfingomiyelin ihtiva ederken, iç yarısındaki bütün fosfolipidler fosfatidiletanolamin ve fosfatidilserin ihtiva eder. Bunun yanında, zarın stoplazmik yüzü az da olsa fosfatidilinozitol taşır. Fosfatidilkolin ve sfingomiyelin yağ asidi kuyrukları daha fazla doymuş haldedir. Bu nedenle baş grupların yanında hidrokarbon kuyruklarda da bir asimetri ortaya çıkar. Bu özellik iç yüzeyin daha akışkan olmasına neden olur. Ayrıca fosfatidilserin negatif yüklü olması, iki tabakanın elektrik yükü bakımından farklı olmasını sağlar (Güneş, 2003).

Şekil 1.16. İnsan kırmızı kan hücre zarında lipidlerin asimetrik dağılımı (Güneş, 2003).

Eritrositler plazma lipidleriyle en fazla etkileşen hücrelerdir. Dolayısıyla diyetle alınan yağların ve kandaki lipidlerin bileşimi öncelikle eritrosit bileşimini etkileyecektir (Yılmaz, 1995).

(39)

2.6. Fosfolipidlerin Fonksiyonları Ve Haberleşmedeki Rolleri

• Fosfolipid ve glikolipidlerin suya afinitesi olan polar baş grupları membranın ekstraseluler ve sitosolik dış yüzeye dönük, hidrokarbon kuyruk kısımları ise sudan kaçtıkları için biomoleküler tabakanın iç tarafına dönük oldukları için membran lipid ikili tabakayı meydana getirirler. Böylece hücre membranı hücre dışındaki sulu ortam ile hücre içindeki sulu ortam arasında bir set oluşturur.

• • •

• Lipoproteinlerin yapısında bulunan fosfolipidler amfipatik özellikte olduklarından trigliseridler ve kolesterol esterleri gibi polar olmayan lipidlerin plazma içinde çözünür halde tutulmasını sağlar.

• • •

• Fosfolipidler sulu ortamda polar grupları yüzeyde, hidrofobik kuyrukların da iç kısımda yer aldığı küresel yapılar (miçeller) oluştururlar.

• • •

• Membrandaki fosfolipid ve glikolipidler ikili tabakada proteinler için iyi bir çözücüdür ve geçirgenlik engeli vardır.

• • •

• Membran fosfolipidleri, reseptör aktivasyonu, sinyal transdiksiyonu ve iyon transportu gibi çok önemli hücresel fonksiyonlara katılırlar. Kendileri direkt ikincil haberci fonksiyonuna sahip olabilirler. Bazıları bir dokudan başka bir dokuya kanda taşınan hormonlar veya hücre dışı bir sinyale tepki olarak üretilen hücre içi haberciler olarak etkin bir sinyal görevi yapmaktadır.

• • •

• Fosfolipidler biomoleküler tabaka sayesinde akışkan olmalarına rağmen geçirgenlik engeli görevini görürler.

• • •

• Fosfatidilinozitoller ve fosforlanmış türevleri, hücre yapısını ve metabolizmayı düzenlemek için pek çok aşamada görev yapar. Plazma zarının iç yüzeyinde bulunan bu fosfolipidlerin özel bazı proteinleri bağlama yerleri vardır. Bu da hücre içi sinyal iletiminde görev oluşturmaktadır.

• • •

• Kolesterolün çözünebilmesinde yardımcı olan deterjan özelliklerinin bulunduğu safranın esansiyel bileşenidir. Safra asidleri suda çözünmeyen lipidleri dağıtarak emilsüyon (küçük parçalara ayırarak) oluşturarak ince bağırsakta lipidlerin

(40)

sindirilmesini ve emilmesini kolaylaştırırlar. Ayrıca lipidlerin emilimi sırasında misel oluşumunda önemli katkısı vardır.

• • •

• Fosfolipidler akciğerlerin iç yüzeylerinin, yüzey gerilimine bağlı olarak birbirine yapışmasını önleyen surfaktanının ana yapıtaşıdır.

• • •

• Glikolipidler hücre membranlarının dış yüzeyindeki spesifik reseptör bölgeleri önemli yapısal elemandır. Mesela nörotransmitter maddelere bağlanarak impulsun bir sinirden diğerine geçmesini sağlarlar. Eritrositlerin dış yüzeyinde bulunarak kan gruplarına özgüllük kazandırır (Noyan, 1986; Robert, 1999; Keha ve Küfrevioğlu 2000; Murray ve ark., 2004; Nelson ve Cox, 2005).

1.7. Depresyon Hakkında Genel Bilgi

Psikiyatrik bozukluklar içinde en sık görüleni depresyondur. Tıptaki ve teknolojideki ilerlemelere bağlı olarak birçok hastalık ya ortadan kaldırılmış ya da etkin tedavilerle kontrol altına alınmışken, depresyon özellikle endüstrileşmiş batı ülkeleri başta olmak üzere bütün dünyada hızla artmakta ve büyük bir sağlık sorunu haline gelmektedir. Depresyona bağlı işgücü kayıpları, verimlilikteki düşüşler büyük bir ekonomik kayba sebep olmaktadır. Depresyon sıklığındaki artışın yanı sıra başlama yaşı da düşmüştür. Tedavi edilmemiş depresyonun bir diğer önemli komplikasyonu (karmaşıklık) da intiharlardır. Bütün bunlardan depresyonun büyük bir problem olarak karşımıza çıktığı görülmektedir (Savrun, 1999).

Tüm bu gelişmelerin yanında depresyon etiyolojisi halen tam olarak aydınlatılamamıştır. Bunun en önemli nedeni oluşumunda çoğul etkenlerin rol alması olabilir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda mizaç bozukluklarında membran fosfolipid metabolizması düzensizliği olduğu hipotezini destekleyen sonuçlar elde edilmiştir (Yemez ve Alptekin, 1998).

Bunun yanı sıra lipid düşürücü tedavilerin duygu durum ve davranış üzerine etkilerinin rapor edilmesi dikkatlerin lipid metabolizmasına çevrilmesine sebep olmuştur. Bu

(41)

konuya odaklanmadaki önemli faktörlerden biri de beyin ve nöron yapısında lipidlerin önemli rollerinin bulunmasıdır (Yemez ve Alptekin, 1998).

Major depresif hastalıkların yıllık sıklığı son yıllarda yaklaşık 60 kat değişim göstermektedir. Epidemiyolojik bilgilere dayanarak yüksek miktarda w-3 PUFA içeren balık tüketiminin yüksek olduğu toplumlarda majör depresif hastalıkların prevalansının düşük olduğu görülmektedir (Su ve ark, 2003).

Lipid metabolizması ile insan davranışları ve duygu durumu arasındaki ilişki ilgi çekici bir konudur. Psikiyatrik bozukluklarla lipidlerin önemli bir ilişki içinde olduklarının anlaşılmasıyla çalışmalar bu konuyla ilgili çeşitli araştırmalara yönelmiştir (Sevinçok ve Büyüköztürk, 1999).

Yağ asidi metabolizmasının yanında serum ve membran fosfolipid kompozisyonlarındaki değişikliklerin major depresyon patofizyolojisinde rolü olduğu düşünülmektedir (Maes ve ark., 1999).

(42)

3. MATERYAL ve YÖNTEM

2.1. Materyal

“Depresif hastaların eritrosit membran fosfolipid kompozisyonu araştırılması” isimli araştırma için 30 kişilik hasta grubu ile 30 kişilik kontrol grubundan kan numuneleri alınmıştır.

Hasta grubu, Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Tıp fakültesi Psikiyatri AD polikliniği’ne başvurarak majör unipolar depresyon tanısı almış ve henüz antidepresan tedavisi başlamamış 23–65 yaş grubu hastalardan izin ve bilgileri dahilinde kan örnekleri alınmıştır.

Kontrol grubu, Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Tıp fakültesi Fiziksel Tıp ve Rehabilitasyon AD polikliniğine başvuran, depresyon semptomları olmayan ve Psikiyatri Polikliniği’nde değerlendirildikten sonra depresyon saptanmayan, son iki hafta içinde NSAİİ (steroid olmayan anti-inflammatuaz ilaç) kullanmayan 23-65 arası 30 kontrol grubundan izin ve bilgilendirme yapılarak alınmıştır.

2.2.7. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler

Yaptığımız çalışmada kullanılan kimyasal maddeler ve firmaları aşağıda verilmiştir:

Kloroform Merck

İzopropil Alkol Merck

Metanol Merck

% 0.9’luk NaCl Eczacıbaşı

BHT Merck

İyot Merck

Glasiyal Asetik Asit Merck

Petrol Eteri Merck

(43)

%72’lik Perklorik asit Merck

%5’lik Amonyum molibdat Merck

Amidol Merck

20%lik Sodyum metabisülfid Merck

KH2PO4 Merck

Silika Jel Kaplı Alüminyum Tabaka Merck Azot gazı

2.1.2 Kullanılan Alet ve Cihazlar

Santrifüj Nüve

Soğutmalı santrifüj Hettich

Vorteks Velp

Hassas terazi Scaltec SPB 54

Etüv Termal

TLC Tankı Sigma

Otomatik pipetler Eppendorf

UV Spektrofotometre Jasco V-UV/VIS

Buzdolabı Regal

Manyetik karıştırıcı Heidolp

2.3. Yöntem

2.3.1. Kan Örneklerinin Alınması

Kan örnekleri, her bir hasta ve kontrol grubu için, içinde 5 mg/mL Na2 EDTA bulunan iki tüpe, 12 saatlik açlık sonrası 8 – 10 ml alınmıştır. Gazi Osmanpaşa Üniversite Hastanesi kan alma laboratuarında alınan kanlar ileriki aşamalarda kullanılmak üzere GOÜ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyokimya Araştırma laboratuvarına getirilmiştir.

(44)

Kan numuneleri aç olan katılımcılardan EDTA’lı tüplere bu konuda eğitimli kişiler tarafından alınmıştır. Alınan kan örnekleri Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Laboratuvarına getirilerek ilerleyen aşamalar burada tamamlanmıştır.

2.3.2. Kan Hücrelerinin Ayrılması

Alınan kan örnekleri, 4000 rpm’de 10 dk. santrifüj edilerek plazmaları ve kan hücreleri birbirinden ayrılmıştır. Kan hücrelerinden arınmış plazma kısmı ileriki bir çalışma için -20 C’de muhafaza edilmiştir.

2.3.3. Eritrosit Paketinin Hazırlanması

Araştırmada membran fosfolipid kompozisyonu belirleneceği için eritrosit paketi hazırlandı. Bu amaçla kan numunelerinin plazmaları alındıktan sonra kalan hücre kısmı eritrosit paketi hazırlamak için kullanıldı. Yukarda belirtildiği gibi plazma kısmı uzaklaştırılan hücre kısmına yaklaşık 10 mL % 0,9’luk NaCl ilave edilerek 4 kez yıkandı. Böylece trombosit ile lökositler uzaklaştırıldı. Bu şekilde temiz bir eritrosit paketi elde edildi. Hazırlanan bu eritrosit paketinden 0,5 mL alınmak suretiyle Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuarında eritrosit sayımı Rose-Oklander Yöntemine göre yapıldı.

2.2.4. Eritrosit Membran Total Lipid Ekstraktının Hazırlanması

Eritrosit paketinden 0,5 ml alındı ve temiz bir tüpe konuldu. Üzerine 0,5 ml distile su ilave edildi, vorteksle hemoliz yapıldı. Sonra üzerine 5,5 ml İzopropil alkol ilave edildi ve 15 dk arayla tüpler çalkanarak 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Koyulaşmaya ve kümeleşmeye başlayan bu hemolizat üzerine daha sonra 3,5 ml kloroform ilave edilmek suretiyle yeniden inkübasyona bırakıldı. Hemolizat 4000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi ve süpernatant temiz bir tüpe alındı. Sonradan oluşabilecek oksidasyonu önleyebilmek için 0,1 g/L BHT (Butillenmişhidroksitoluen) çözeltisinden ilave edilerek -20 C’de saklandı.

(45)

2.2.5. Eritrosit Membran Fosfolipidlerinin Analizi

Total lipid ekstraktından İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) yöntemiyle total fosfolipid ve fosfolipid fraksiyonları yapıldı. Bunun için 20 cm* 20 cm ebatlarında hazır silika jel plakları etüvde 110 C’de bir saat bekletilerek nemi giderildi (Kates, 1991).

Eppendorf tüplerine 1 ml lipid ekstraktından alındı ve azot gazı altında çözücüsü uçuruldu. Üzerine 0,5 ml Kloroform: Metanol (2:1) karışımından ilave edildi ve bu nemi giderilen plakaya ekim yapıldı. Plak dışarıda bir müddet bekletmek suretiyle Kloroform: Metanol karışımı kurutuldu.

Ekim yapılmış olan plak, içinde Petrol eteri: Dietel eter: Glasiyal asetik asit (30:20:1) çözeltisinin bulunduğu TLC tankına ekim yapılan kısım sağ alt tarafta olacak şekilde yerleştirilir ve kapağı sıkıca kapatıldı. Bu aşamada fosfolipidler ekim noktasında kalarak lipidlerden ayrılması sağlandı.

Sonra plak tanktan çıkartılarak kurumaya bırakıldı ve çözücüsü böylece uçuruldu. Kloroform: Metanol: Glasiyal asetik asit: Su (25:15:4:2) çözeltisi tanka ilave edildi. Lipidlerin fosfolipidlerden ayrılması yapıldıktan sonra plak ekim noktası çözelti içinde olacak şekilde 90 0C çevrildi ve içinde çözelti bulunan tanka yerleştirilip ağzı kapakla iyice sıkıca kapatıldı. Böylece fosfolipidler ekim noktasından yukarı doğru yürüyerek fraksiyonlara ayrıldı. Plak tanktan çıkartılarak kurumaya bırakıldı. Kurumuş olan plak iyot içine konarak fosfolipidlerin yerleri belirlenerek işaretlendi.

Bu işlemler 30 kişilik hasta grupları ve 30 kişilik kontrol gruplarında ayrı ayrı yapıldı. Daha sonra, fosfolipidler yerlerinden kazınarak her biri temiz bir tüpe alındı.

Ayrı tüplere alınan fosfolipidler üzerine 1 ml Kloroform:Metanol (2:1) çözeltisi ilave edilerek 4000 rpm de 5 dk santrifüj edildi. Bu işlem 4 kez tekrarlanarak fosfolipidlerin silika jelden tamamen ayrılması sağlandı. Bu yöntemle elde edilen örnekler fosfor tayini için hazır hale getirildi.

(46)

2.2.6. Fosfolipid Miktarının Belirlenmesi

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) yapılarak fosfolipid fraksiyonlarına ayrılan örneklerin miktarı fosfor tayini ile belirlendi (Kates, 1991).Bu işlem için; %72’lik Perklorik asit, %5’lik Amonyum molibdat, Amidol (2,4-Diaminofenoldihidrochloride) reaktifi ve standart fosfat çözeltisi kullanıldı.

Amidol reaktifi, 0,5 gr amidolün 100 ml %20’lik Sodyum metabisülfid çözeltisinde çözülmesiyle hazırlandı. Standart fosfat çözeltisi, 1,097 gr KH2PO4 ‘ ı 250ml saf suda çözerek stok çözelti hazırlandı. Bu stok çözelti saf su ile seyreltme yapılarak ml’sinde 0,1 mikrogram, 0,2 mikrogram, 0,3 mikrogram, 0,4 mikrogram, 0,6 mikrogram ve 1 mikrogram fosfor bulunan standart çözeltiler hazırlandı.

Total fosfor tayini için; TLC ile elde edilen saf fosfolipid ekstraktından 1 ml alındı ve azot gazı basıncı altında Kloroform: Metanol çözücüsü uçuruldu. Saf fosfolipid üzerine 0,4 ml Perklorik asit ilave edildi. 4 dakika bekletildikten sonra tüpe 4,2 ml saf su, 0,2 ml Amonyum molibdat ve 0,2 ml Amidol reaktifi katılarak vorteksle iyice homojen edildi. Tüpün ağzı kapatılarak su banyosuna 7 dakika inkübasyona bırakıldı. Su banyosundan sonra oda sıcaklığına getirildi. Sonra spektrofotometrede köre karşı 830 nm absorbans değeri okutuldu. Aynı işlem fosfat standartları içinde yapıldı. Örneklerdeki fosfor miktarını bulmak için Beer formülü kullanıldı (Kates, 1991).

2.2.7. İstatistik Analiz

Kontrol ve hasta grubundaki farklılıklar Bağımsız örnek T testine göre p<0,05 önemlilik değerinde yapılmıştır. İstatistiki analizler SPSS for Windows 11.5.0. Standart Version paket programı ile yapıldı (Duncan, 1955).

Örnek absorbansı x Standardın fosfat miktarı µg P =

Referanslar

Benzer Belgeler

Bu çalýþmada zamanýnda doðan bebeklerin doðumdaki ortalama aðýrlýk, boy, baþ çevresi deðerlerinin erkeklerde daha fazla, fetal malnütrisyon oraný zamanýnda doðan

Erciyes Oniversilesi T1p FakOitesi GogOs ve Kalp-Damar Cerrahisi Anabifim Dafl'nda 1982·1988 y1ffan arasmda Perthes Sendromu tams1yla takip ve tedavi edilen 16

• Bundan sonra, DHAF’ın ikinci karbonuna (keton grubu indirgendikten sonra) bir yağ asidi bağlanır ve üçüncü karbonuna bağlı fosfat grubu uzaklaştırılır.. • Daha

Yaşamsal 7’ye göre yüksek oranda önlenebilir olduğu tespit edilen hastaların %76’sının Fisher Önlenebilir İnme Skoru göre skorlandığında yüksek oranda

Zarardan kaçınma mizaç özelliği ile depresif belirtiler arasındaki ilişkide tekrarlayıcı düşünmenin aracı ve dışsal kontrol odağı değişkeninin

Mean Value Theorem, Techniques of

Bu çalışmamızda kliniğimize başvuran diyabetik hastalarda, mikrovasküler veya makrovasküler hasara bağlı olarak, gelişebile- cek olan koroner iskemi mevcudiyetini

makla beraber; dünyada kolon kan- seri insidansının yüksek olduğu böl- gelerde, lifli besin alımı ve dışkı ağırlığı belirgin bir biçimde daha. c!ü~üktür