REPEAT BREEDER İNEKLERDE TOHUMLAMAYI İZLEYEN FARKLI GÜNLERDE PRID ve GnRH ile SAĞALTIM
GİRİŞİMLERİ
Osman ERGENE
DOĞUM ve JİNEKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Erol ALAÇAM
2009- ANKARA
REPEAT BREEDER İNEKLERDE TOHUMLAMAYI İZLEYEN FARKLI GÜNLERDE PRID ve GnRH ile SAĞALTIM
GİRİŞİMLERİ
Osman ERGENE
DOĞUM ve JİNEKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN Prof. Dr. Erol ALAÇAM
2009- ANKARA
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii
İçindekiler iii
Önsöz
Simgeler ve Kısaltmalar
vi vii
Şekiller viii
Çizelgeler ix
1. GİRİŞ 1
1.1. Embriyonik Dönem 1
1.2. Gebeliğin Anne Tarafından Tanınması 3
1.3. Erken Gebelikte Endokrin Düzen 10
1.4. Repeat Breeder İnekler 17
1.4.1. Embriyonik Ölümler 18
1.5. Embriyonik Yaşamın Desteklenmesine Yönelik Girişimler 27
1.5.1. Progesteron Hormonu Uygulamaları 27
1.5.2. GnRH Uygulamaları 34
1.5.3. hCG Uygulamaları 37
2. GEREÇ ve YÖNTEM 39
2.1. Gereç 39
2.1.1. Materyalin Seçimi ve Özellikleri 39
2.1.2. Çalışmada Kullanılan Hormon ve Hormon Kitleri 40
2.1.3. Jinekolojik Muayenede, Sun’i Tohumlamada ve Kan Örneklerinin Toplanmasında Kullanılan Gereçler
40
2.1.4. Çalışmada Kullanılan İneklerin Gruplandırılması 40
2.2. Yöntem 41
2.2.1. Kan Örneklerinin Değerlendirilmesi 42
2.2.1.1. Progesteron Hormonu Ölçüm Testinin Yapılışı 42 2.2.2. Fertilite Ölçütlerinin Değerlendirilmesi
2.2.3. Bulguların İstatistiksel Değerlendirilmesi
43 44
3. BULGULAR 45
3.1. Fertilite Ölçütleri 45
3.1.1. Grup-I Fertilite Ölçütleri 45
3.1.2. Grup-II Fertilite Ölçütleri 47
3.1.3. Grup-III Fertilite Ölçütleri 49
3.1.4. Grup-IV Fertilite Ölçütleri 51
3.2. Progesteron Hormonu Değerlendirmeleri 53 3.2.1. Gebe (+) ve gebe olmayan (-) ineklerde 21. günde progesteron
değeri ortalamaları
53
3.2.2. Uygulama grupları ile kontrol grubu arası, uygulama günü ve yedi gün sonraki progesteron değerlerinin karşılaştırılması
53
3.2.3. Grup içi, gebe (+) ve gebe olmayan (-) ineklerin uygulama günü, yedi gün sonraki ve 21. gün progesteron değerlerinin karşılaştırılması
55
3.2.4. Uygulama gruplarındaki gebe (+) hayvanların progesteron 56
değerlerinin kontrol grubu gebe (+) hayvanlar ile karşılaştırılması
4. TARTIŞMA 58
5. SONUÇ ve ÖNERİLER 65
ÖZET 67
SUMMARY 69
KAYNAKLAR 71
ÖZGEÇMİŞ 79
ÖNSÖZ
Son yıllarda gerçekleştirilen yoğun tedavi seçeneklerine rağmen, repeat breeder ineklerde ulaşılan gebelik oranları ve diğer fertilite parametrelerinde yeterli düzeyde olumlu sonuç elde edilememiştir. Halen, devam eden araştırmalara paralel olarak. yeni veya modifiye tedavi seçenekleri ortaya çıkmaya devam etmektedir. Repeat breeder olgusunun önemli bir nedeni olarak gösterilen erken embriyonik ölümlere karşı geliştirilen, erken luteal dönemdeki doğrudan progesteron desteği veya progesteron üretimin uyarılması da üzerinde sıklıkla durulan bir seçenektir.
Bu çerçevede tohumlama sonrası doğrudan progesteron uygulamaları yapılmakta veya endogen progesteron üretimini uyaran GnRH, hCG gibi gonadotropik hormonlar kullanılabilmektedir.
Sunulan çalışmada da tohumlama sonrasında kan progesteron hormonu düzeylerini yüksek tutmak amacı ile blastogenez döneminde progesteron (PRID) ve erken embriyonik dönemde PRID veya GnRH hormonları kullanılmış olup; anılan dönemlerdeki kan progesteron değerleri ölçülerek ve gebe kalma oranları belirlenerek gruplar arasında ve gebeliğin aynı dönemlerindeki tedavisiz kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır.
Doktora programım süresince değerli öneri ve yardımlarıyla her konuda destek olan danışman hocam Prof. Dr. Erol Alaçam’a, tez izleme komitesi üyelerine, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı öğretim elemanlarına, Levent Sanayi İnekçilik Ltd.
sahibi Özer Boyacı’ya ve Veteriner Hekimi Şifa Berkan Demirpençe’ye, Hasan Haydaroğluları ve Mustafa Korkmazhan işletmeleri’ne, hormon preparatlarını temin eden DİF-Sanofi İlaç Firmasına, tüm yaşamım ve doktora eğitimim boyunca maddi ve manevi desteği ile her zaman yanımda olan, başta babam Veteriner Hekim Nazım Ergene’ye ve bütün aileme teşekkürü bir borç bilirim.
SİMGELER ve KISALTMALAR
β Beta
bIFN- τ Sığır interferon tau bTP-1 Sığır trofoblastik protein
CIDR Kontrollu intravaginal ilaç salınımı
Cu Bakır
GnRH Gonadotropin salınım hormonu hCG İnsan koryonik gonadotropini IGF İnsülin benzeri büyüme faktörü LH Luteinleştirici hormon
OTR Oksitosin reseptörü PAF Platet aktive edici faktör PGE1 Prostaglandin E1
PGF2α Prostaglandin F2 alfa PGF2 Prostaglandin F2
PGI2 Prostaglandin I2
PRID Progesteron salan intravaginal spiral RIA Radio Immunoassay
Se Selenyum
τ Tau
Zn Çinko
ŞEKİLLER
Şekil 3.1 Grup I (GnRH) ile Grup IV (Kontrol) gebelik oranlarının karşılaştırılması
46
Şekil 3.2 Grup II (PRID, 4-11. gün ) ile Grup IV (Kontrol gebelik) oranlarının karşılaştırılması
48
Şekil 3.3 Grup III (PRID, 11-18. gün ) ile Grup IV (Kontrol) gebelik oranlarının karşılaştırılması
50
Şekil 3.4 Grup I (GnRH), Grup II (PRID, 4-11. gün ), Grup III (PRID, 11-18. gün) ile Grup IV (Kontrol) gebelik oranlarının karşılaştırılması
52
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1 Tohumlamayı izleyen farklı günlerde progesteron uygulamalarının gebelik oranlarına etkilerine ilişkin araştırma bulguları
30
Çizelge 1.2 Tohumlama sonrası 11-13. günler arası uygulanan GnRH’nın gebelik oranlarına etkisine ilişkin özet araştırma bulguları
35
Çizelge 2.1 Tedavi sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan fertilite ölçütlerinin hesaplanması
44
Çizelge 3.1 Grup-I Fertilite Ölçütleri 45
Çizelge 3.2 Grup-II Fertilite Ölçütleri 47
Çizelge 3.3 Grup-III Fertilite Ölçütleri 49
Çizelge 3.4 Grup-IV Fertilite Ölçütleri 51
Çizelge 3.5 Gebe (+) ve gebe olmayan (-) ineklerde 21. günde progesteron değeri ortalamaları
53
Çizelge 3.6 Grup I - Kontrol Grubu arası uygulama ve 7 gün sonraki P4 değerlerinin karşılaştırılması
54
Çizelge 3.7 Grup II - Kontrol Grubu arası uygulama ve 7 gün sonraki P4 değerlerinin karşılaştırılması
54
Çizelge 3.8 Grup III - Kontrol Grubu arası uygulama ve 7 gün sonraki P4 değerlerinin karşılaştırılması
54
Çizelge 3.9 Grup I, gebe (+) ve gebe (-) hayvanlarda progesteron değerlerinin karşılaştırılması
55
Çizelge 3.10 Grup II, gebe (+) ve gebe (-) hayvanlarda progesteron 55
değerlerinin karşılaştırılması
Çizelge 3.11 Grup III, gebe (+) ve gebe (-) hayvanlarda progesteron değerlerinin karşılaştırılması
56
Çizelge 3.12 Grup IV, gebe (+) ve gebe (-) hayvanlarda progesteron değerlerinin karşılaştırılması
56
Çizelge 3.13 Grup I ile kontrol grubundaki gebe (+) hayvanları progesteron değerlerinin karşılaştırılması
57
Çizelge 3.14 Grup II ile kontrol grubundaki gebe (+) hayvanları progesteron değerlerinin karşılaştırılması
57
Çizelge 3.15 Grup III ile kontrol grubundaki gebe (+) hayvanları progesteron değerlerinin karşılaştırılması
57
1.GİRİŞ
1.1. Embriyonik Dönem
Embriyonik dönem, fertilizasyondan sonra zigotun bölünerek embriyoyu oluşturması ile başlar. Zigot, ortalama 0.2 mm çapında, zona pellucida içerisinde tek hücresi olan ve bölünüp çoğalarak buzağıya dönüşebilecek potansiyele sahip bir organizmadır. İlk bölünme sonrası iki hücreli embriyo şekillenir ve bu hücreler blastomer olarak adlandırılırlar. Daha sonra bölünmeye devam eden blastomerler sırasıyla 4, 8, ve daha sonra 16 hücreli bir yapıya (morula) dönüşürler. Bu döneme kadar hücre sayısı artmakla birlikte, embriyo halen aynı hacimde bir sitoplazmaya sahip bulunmaktadır. Morula aşamasında hücreler iç taraf ve dış taraf hücreler olmak üzere ayrılmaya başlarlar. İç taraftaki hücreler arasında gap junction, dış taraftaki hücreler arasında ise tight junction şekillenmeye başlamaktadır. Tight junction şekillenmesi sonucu, embriyo içerisine sıvı toplanması başlar ve zona pellucida içerisinde sıvı ile dolu bir boşluk şekillenir. Bu boşluk blastosel olarak adlandırılır. Blastosel farkedilir büyüklüğe ulaşınca embriyo blastosist olarak adlandırılmaktadır. Blastosist aşamasında polar kısımda bir grup hücre ileride embriyo taslağını oluşturmak üzere değişikliğe uğrarken (inner cell mass: iç hücre kümesi), diğer hücreler (trofoblast) ekstra embriyonik zarlar ve plasentanın oluşumuna katılmak üzere blastosel’in etrafını sararlar. Devam eden mitozis ve blastosel içerisine sıvı akımı, embriyonun büyümesine ve basıncın artmasına neden olmaktadır. Bunun yanında trofoblastik hücreler tarafından proteolitik enzimler salgılanır ve bu enzimler sayesinde zona pellucida direnci zayıflamaya başlar ve blastosistin
kontraksiyonları sonucu yırtılır. Bu açıklık içerisinden blastosist hücreleri dışarıya çıkarlar ve uterus içerisinde serbest yüzen bir yapı kazanırlar (hatching: sarkma) (Senger, 2005). Genişlemeye (ekspansiyon) devam eden embriyo yaklaşık 13. günde hızla uzayarak (elongation) sırasıyla küresel, oval, ve filamentöz biçimlere değişimler gösterir. Gebeliğin 13. gününde ortalama 5 mm uzunluğunda, 1 mm çapındaki embriyo, 16. günde gebe kornunun tamamını kaplar (Morris ve ark., 2003).
Gelişmenin ilk haftası sonunda embriyo blastosist aşamasındadır ve bilimsel kaynaklar bu dönemde % 7-16 arasında bir embriyonik ölüm ya da dejenerasyon görülebileceğini bildirmektedirler (King, 1991). İkinci haftanın sonunda bildirilen embriyo ölümleri %6-44 arasında değişiklik göstermektedir. Gelişimin üçüncü haftası gebeliğin anne tarafından tanınması ve gelişimin devamı için kritik bir dönemdir. Yapılan çalışmalar 16. günden önce uterustaki embriyonun uzaklaştırılması sonrasında ineklerin hiç tohumlanmamış gibi östrus gösterdikleri; daha sonraki günlerde yapılan uzaklaştırmalarda ise iki östrus arası sürenin uzadığını ortaya koymuştur. Araştırmalar, embriyo tarafından üretilen interferon-τ’nun korpus luteum regresyonunu engellediğini ve endometriumdan 17. günde PGF2α salgısını sınırladığını göstermektedir. Bu mekanizmanın bozulması veya eksojen PGF2α
uygulamaları gebeliği sonlandırmaktadır. Üçüncü hafta sonundaki embriyonik kayıpların %3-33 oranında olduğu bildirilmiştir. Dört ve sekizinci haftalar arasındaki gelişme ise organların şekillenmesi ile karakterizedir. Bu gelişme boyunca embriyonik ölümlerin %19-42 oranında olduğu tespit edilmiştir. Embriyonik dönem (45 gün) sonundaki gebelik oranlarının yaklaşık buzağılama oranları ile aynı olduğu bildirilmiştir (King, 1991).
İntrauterin serbest yaşam döneminde embriyonun beslenmesi histiotrofik olup, uterus sekresyonlarına dayanmaktadır.
Endometriyal sekretorik aktivitenin önemli bir kısmı siklusun luteal fazında şekillenmekte ve progesteron tarafından kontrol edilmektedir (Guillomot, 1995).
Konseptus uterustan, trofoblast’a zarar verilmeden, en geç 18.
günde toplanabilmektedir. Bu günden sonra trofoblast ve uterus epitelyumu arasında hücresel bağlantılar kurulmaya başlamaktdır (apozisyon). İnterkarunkular endometrium ile karşı karşıya gelen trofoblastta küçük çıkıntılar oluşur ve uterus bezlerinin açıklıklarına doğru ilerler. Böylece trofoblast ve uterus epitelyumu arasında bir hareketsizlik sağlanır. Apozisyon, embriyonik alanda başlar, konseptusun uçlarına doğru yayılarak gebeliğin 21-22. günlerde tamamlanır. Daha sonra uterus mikrovilluslarının trofoblastik hücrelerinin plazma zarlarına penetrasyonu ile karakterize adezyon aşamasına geçilir. Plasentanın şekillenmesi ile embriyonal dönem, 42-45. günlerde tamamlanır (Guillomot, 1995).
1.2. Gebeliğin Anne Tarafından Tanınması
Embriyo, gelişimini devam ettirirken bunun yanında anneye varlığını belli eden sinyaller de göndermektedir. Gebeliğin maternal tanınması sürecinde önemli olgular; östrus siklusunun baskılanması, embriyonik beslenme ve fötüsu reddedecek immunolojik gelişimin baskılanmasını sağlamaktır. Normal siklus sırasında luteolizis 18-19.
günler civarında şekillenmeye başlar, ancak anne embriyo
bağlanması 20-22. günlerden önce şekillenmez. Bu durumda embriyo tarafından üretilen sinyallerin ilk görevi anne ile embriyo arasında fiziksel bağlanmanın gelişimini sağlamak değil, şekillenen korpus luteumun siklik regresyonunun engellenmesidir. Embriyo, 18-19.
(apozisyon) veya 20-22. günlerden (bağlanma) önce varlığını sürdürebilmek için anneye 16. gün civarında sinyaller göndermek zorundadır. Onaltıncı günün önemini belirtmek için bir grup araştırıcı bazı deneysel çalışmalar yapmışlardır. Bu amaçla 16.
günden önce senkronize uteruslara yapılan embriyo transferlerinde başarılı gebelikler elde edilirken, 16. günden sonraki embriyo transferlerinde aynı başarı sağlanamamıştır. Yine benzer olarak 16.
günden önce uzaklaştırılan embriyoların siklus uzunluğunu etkilemediği, ancak bu günden sonraki uzaklaştırmalarda siklusun uzadığı belirlenmiştir (Betteridge ve ark., 1980; Northey ve French, 1980).
Erken embriyogenezis sürecindeki aşamaların devamının sağlanabilmesi ve gebeliğin tanımlanabilmesi için luteolizis engellenmelidir. Embriyogenezisin devamı ve gelişen konseptusun endometrium ile etkileşime girmesi için progesteron konsantrasyonunun yeterli bir seviyeye yükselmesi zorunludur.
Embriyo, uterusa ovulasyonu izleyen 2-5 günler arasında ulaşmaktadır. Konseptus, gebeliğin devamlılığını sağlamak için başlangıçta varlığını belli eden sinyaller gönderir ve bu olgu gebeliğin maternal tanınması olarak isimlendirilir. Eğer gerekli zamanda yeterli sinyal oluşmazsa luteolizis şekillenmekte, progesteron konsantrasyonu düşmekte ve gebelik sonlanmaktadır. Bu nedenle gebeliğin anne tarafından tanınması luteolizis’ten önce şekillenmelidir (Senger, 2005).
Ruminant korpus luteumu, endometrial hücrelerden PGF2α
sentezini stimüle eden oksitosin hormonunu üretmektedir. PGF2α
üretimi, östrus siklusundaki kritik zamanda endometriyal hücrelerden yeterli sayıda oksitosin reseptör oluşumuna gereksinim duymaktadır. Bu reseptörler yeterli sayıda bulunduklarında, pulsatil PGF2α sekresyonu, luteal oksitosin salgısına cevap olarak şekillenir ve bunu luteolizis izler. Başarılı bir gebeliğin şekillenmesi için bu mekanizma engellenmelidir (Senger, 2005; Spencer ve ark. 2004).
Uterus endometriumu, araşidonik asidin PGF2α’ya dönüştürülebilmesi için gerekli olan fosfolipid stoklarını ve siklooksijenaz enzim aktivitesini, progesteron tarafından uyararak artırır. Progesteron, reseptörlerine bağlanır ve endometrial epitelden oksitosin reseptör oluşumunu 10-12 gün boyunca engeller. Bu süreç
“progesteron-blok” dönemi olarak isimlendirilir. Bu dönemin sonlarında progesteron konsantrasyonu düşer ve östrojenin etkisi ile birlikte endometrial oksitosin reseptörleri (OTR) hızlı bir artış gösterir.
Siklik ineklerde endometrial oksitosin reseptörleri ve progesteron reseptörleri 0-10. günler arasında en yüksek miktardadır, daha sonra 13. günde ikisinde de azalma görülür. Ondört-15. günlerde östrojen reseptörleri artış göstermekte ve bunu endometrial oksitosin reseptörlerinin 17-21. günler arasındaki hızlı artışı izlemektedir.
Luteolitik dönem boyunca inek endometriumu düşük progesteron reseptörüne ve artan östrojen ve oksitosin reseptörlerine sahiptir.
Daha sonra salgılanan oksitosin endometrial oksitosin reseptörlerine etki ederek inositol fosfolipid ikinci uyarı sistemini harekete geçirir ve PGF2α’nın luteolitik dalgalarının salgılanması ile sonuçlanır. İneklerde endometrial oksitosin reseptörleri östrusta ve siklusun 4-5.
günlerinde yüksek miktarda, 5-13. günlerde az miktarda bulunmakta
ve 17-20. günlerde tekrar hızlı bir yükseliş ile artmaktadır.
Oksitosinin luteolitik dönemi düzenlemeden sorumlu olduğu dönemde, oksitosin salgısı ile birlikte PGF2α salgısı da şekillenmektedir. Luteolizisin başlaması için 25 saat içinde uterustan beş adet PGF2α dalgasının şekillenmesi gereklidir (Bazer ve ark, 1994;
Spencer ve ark. 2004).
İneklerde blastosist, uterus oksitosin reseptör oluşumunu engelleyen bazı maddeler salgılar. Blastosist tarafından üretilen bu spesifik proteinler, luteolizisi engelleyen sinyalleri sağlarlar. Bu spesifik protein önceleri sığır trofoblastik protein (bTP-1) olarak isimlendirilmiştir. Daha sonra bu proteinin antiviral etkiye sahip olması ve aynı intra-uterin reseptörlere etki etmesinden ötürü interferon olarak bilinen maddeler grubuna uygun olduğu anlaşılmıştır. Çoğu interferonlar; lökositler, fibroblastlar, lenfositler ve trofoblastik hücreler tarafından üretilen non-spesifik glikoproteinlerdir. İnterferonlar antiviral etkiye sahip olup, hedef hücrenin fonksiyonunu değiştirirler. Trofoblastik protein (bTP-1) ayrı bir interferon sınıfı oluştururlar ve sığır interferon-τ (bIFN- τ) olarak isimlendirilir. Yunan alfabesinden alınan “τ” bu proteinin trofoblastik kökenli olduğunu anlatmaktadır (Senger, 2005; Bılodeau-Goeseels, 2006; Spencer ve ark. 2004).
Blastosistin trofoblastik hücreleri tarafından sentezlenen interferon-τ ovulasyon sonrası 13-21. günleri arasında uterusta bulunur. İnterferon-τ korpus luteumdan progesteron sentezini artırmaz, bu nedenle luteotropik bir etkisi yoktur. İnterferon-τ endometriuma bağlanır ve endometrial hücrelerden oksitosin reseptör
oluşumunu engeller. İnterferon-τ’ nun oksitosin reseptör oluşumunu engellemesinin yanı sıra, uterus bezlerine bağlandığı ve preimplantasyon öncesi embriyonik yaşam için kritik olan protein sentezini artırdığı bildirilmektedir. Uterus lumenine salgılanan bu proteinler erken dönemde konseptusun beslenmesi için önemlidir (Senger, 2005).
Mann ve Lamming, (2001), gebeliğin 16. gününde uterustan toplanan embriyolarda interferon-τ üretimini ölçmüşler ve maternal endokrin düzen ile interferon aktivitelerini karşılaştırılarak embriyonik gelişme üzerine etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada kullanılan hayvanlar iki gruba ayrılmış, ilk gruptaki hayvanlara (n=23) PGF2α enjeksiyonunu takiben 72 veya 96 saat sonra tohumlama yapılmıştır. Kontrol grubundaki hayvanlara (n=10) ise tohumlama uygulanmamıştır. Tohumlama gününden 16. güne kadar 24 saat ara ile plazma örnekleri alınmış, daha sonra hayvanlar 16.
günde kesime gönderilmiş, üreme organları yıkanarak embriyolar toplanmış ve yıkantıda interferon-τ aktivitesi ölçülmüştür. Onaltıncı günde embriyonal gelişme tespit edilmeyen tohumlanmış hayvanlarda (n=5) östradiol konsantrasyonundaki düşüşün gecikmesine bağlı ovulasyon gecikmesi ve progesteron konsantrasyonunda geciken bir artış tespit edilmiştir. Embriyonal gelişme belirlenen hayvanların (n=15) bir kısmında ovulasyon sonrası geciken progesteron konsantrasyon artışına bağlı zayıf gelişmiş embriyo ve belirlenemeyen interferon-τ üretimi olduğu tespit edilmiştir. İyi gelişmiş embriyoların ise ölçülebilir miktarda interferon-τ ürettikleri bildirilmiştir (n=8). Embriyo bulunan hayvanlarda oksitosin enjeksiyonu sonrası kontrol grubu ve embriyo bulunmayan hayvanlara oranla 13, 14-dihydro-15-keto PGF2α’nın, yani PGF2α’nın temel metabolitinin düşük olduğu
tespit edilmiştir. Çalışmada embriyo bulunan hayvanlarda, embriyonik interferon-τ üretimi karşılaştırıldığı zaman, ölçülebilir interferon-τ aktivitesi bulunan hayvanlarda PGF2α’nın oksitosine yanıtının azaldığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, araştırıcılar gebeliğin anne tarafından tanınmasının başarılı olabilmesi için iyi gelişmiş bir embriyonun yeterli miktarda interferon-τ üretmesi gerektiğini ve bunlar için de maternal progesteron sekresyonunun önemli bir faktör olduğunu bildirmişlerdir. Çalışma bu konuda yapılan ilk çalışmalardan biri olurken, progesteron’un embriyo üzerine uyarıcı bir etkisi olduğuna dair kanıt belirlenememiştir. Progesteron ile embriyonik gelişimin artırılması yönündeki ilişkinin bu hormonun uterus ortamı üzerindeki etkisine bağlı olabileceği bildirilmiştir.
Garret ve ark., (1988), luteal fazın erken döneminde progesteron ile yapılan tedavilerin hem embriyo gelişimini hem de interferon-τ üretimini artırdığını bildirmişlerdir.
Araştırıcılar, erken dönemdeki embriyodan interferon-τ dışında farklı maddelerin de salındığını bildirmektedirler. Bu maddeler üzerine yapılan araştırmalar sonrası bunların antiluteolitik etkili ya da en azından luteal aktiviteyi koruyucu etkileri olduğu bildirilmiştir.
Kemirgenlerde, eter fosfolipid yani platet aktive edici faktör (PAF) erken gebelik faktörünün bir bileşeni olarak görülmektedir. Bu faktörün embriyonik gelişmeyi ve implantasyonu kolaylaştırdığı bildirilmiştir. Platet aktive edici faktör koyun embriyolarından da elde edilmiş fakat bu türlerde etkileri tam olarak açıklanamamıştır. Non- ruminant türlerde yapılan son çalışmalar platet aktive edici faktörün,
luteal fonksiyona oranla uterusun vasküler veya mikrosirkülasyon dinamiğinde rol oynadığı göstermektedir (Parkinson, 1992).
Gebe hayvanların endometriumundan ve erken dönem embriyolardan üretilen yüksek seviyedeki PGF2’nin fonksiyonları üzerine birçok görüş bulunmaktadır. PGF2 birçok durumda PGF2α
antagonisti gibi davranmaktadır. PGF2α adenilat siklaz aktivitesini inhibe ederken, PGF2 bu aktiviteyi stimüle edici bir etkiye sahiptir.
Birçok araştırmada korpus luteumun ömrünün PGF2’nin farmakolojik dozlarının intrauterin infüzyonları ile uzatıldığı bildirilmiştir. Ancak yapılan diğer çalışmalarda in vivo ortamda PGF2’nin luteotrofik role sahip olduğu hipotezi gerçek bulmamıştır.
PGF2 güçlü bir immunsupresif ajan olarak da bilinmektedir. Erken gebelikte uterus lumeninde ve endometriumunda PGF2 yüksek konsantrasyonda bulunmakta, bunun sonucunda uterus ortamı güçlü bir immunsupresif etkiye sahip bulunmaktadır (Parkinson, 1992).
PGE1, PGF2 ve PGI2 gibi diğer moleküller de maternal tanınma sürecine dahil olmaktadırlar. Bilindiği gibi konseptus genomlarının yarısı boğadan orijin almakta ve bu yüzden konseptus uterus içerisinde yabancı bir cisim gibi algılanmaktadır. Bu nedenle immun sistem de konseptusun reddedilmemesi için gerekli koşulları sağlayarak, gebeliğin maternal tanınması sürecinde rol oynamaktadır. Birçok immun büyüme faktörü (zararlı sitokinler), embriyonik hayatın devamı için olumsuz etkilidir. Bu yüzden konseptusun immunolojik reddedilmesi de embriyonik ölüm nedeni olarak da gösterilebilir (Bilodeau-Goessells, 2006).
Domuzlarda erken dönem embriyodan sentezlenen steroidlerin, özellikle de östrojenlerin gebeliğin gelişmesi için çok önemli olduğu ve bu türlerde antiluteolitik mekanizmayı sağladıkları bildirilmiştir.
Bunun yanı sıra erken dönem plasental progesteronun embriyonun beslenmesinde etkili olduğu bildirilmiştir (Parkinson, 1992).
1.3. Erken Gebelikte Endokrin Düzen
Sağlıklı bir gebelik için başta endokrin düzen olmak üzere birçok faktör rol oynamaktadır. Embriyonik-fötal kayıplar genellikle gebeliğin ilk 40 gününde, daha çok embriyonik dönemde şekillenmektedir. Embriyonik ölümlerin ortalama %30’u yedinci gün ve % 40’ı 8-17. günler arasında şekillenmektedir. Fötal kayıplar (42.
gün sonrası) ise genellikle %10’dan azdır (Thatcher ve ark.,1994, Mann, 2002).
İneklerde siklusun luteal dönemi ortalama 17 gün sürmekte, bunu 3-4 günlük kısa bir folliküler dönem takip etmektedir.
Progesteron konsantrasyonundaki değişiklikler, korpus luteumdaki fiziki değişimin yansıması şeklindedir. Östrusta periferal kan serumunda progesteron düzeyi 1 ng/ml’den düşüktür ve beşinci güne kadar önemli düzeye yükselmemektedir. Bu zamandan sonra 16 veya 17. güne kadar düzenli olarak artıp siklusun luteal dönemi boyunca ortalama 5,4 ve luteal dönemin sonunda ise ortalama 6-7 ng/ml olan zirve değere ulaşır. Siklik hayvanlarda, progesteron değerindeki düşüş, gebeliğin 16-19. gün civarında başlar.
Progesteron değerleri bazal seviyeye düştüğü zaman adenohipofiz üzerindeki baskı ortadan kalkar. Böylece gonadotropinlerin salınımı başlamış olur. Progesteron konsantrasyonundaki düşüşten östrüsün
meydana gelmesine kadar geçen süre bir günden beş güne kadar değişiklik gösterir (Hunter, 1980).
Endometrium’un luminal epitelium katında gelişen oksitosin reseptörleri, luteolitik mekanizmanın önemli bir parçası olarak kabul edilmektedirler. Bu reseptörler oksitosin kullanarak PGF2α
sekresyonu üzerine uyarıcı bir etki oluştururlar. İneklerde erken gebelik boyunca embriyo, oksitosin reseptör gelişimini inhibe ederek PGF2α üzerindeki oksitosin etkisini de engellemektedir. Embriyo bunları interferon-τ proteinini üreterek başarmaktadır. İneklerde interferon-τ üretimi için gerekli mRNA ilk trophektoderm’de 12. gün civarlarında, maksimum olarak ise 15-16. gün civarlarında tespit edilmiştir (Mann ve Lamming, 1999). Yapılan bir çalışmada uterus yıkamaları sonucu embriyonun uzamaya (elongation) başladığı dönemde, 14-16. günler arasında, yeterli miktarda interferon-τ üretimi tespit edilmiştir (Mann ve ark., 1999). Luteolizisin engellenebilmesi için embriyonun uygun oranda gelişimini tamamlaması ve yeterli miktarda interferon-τ sekresyonu gerçekleşmesi gerekmektedir. Anılan mekanizmalar ve bunların kontrolü yüksek orandaki embriyonik ölümlerin azaltılması ve fertilitenin yükseltilmesi bakımından önemlidir. Bu olayları kontrol eden ana hormon ise progesterondur (Mann ve Lamming, 1999).
Gebe olmayan ineklerde ortalama 16. gün civarında PGF2α
sentezlenmekte ve luteolizis şekillenmektedir. Konseptusun şekillendiği hayvanlarda ise PGF2α sekresyonu engellenmektedir.
Gebe ineklerde 15-23. günler arasında konseptus interferon-τ üretmekte ve bu da oksitosin reseptörleri için gerekli gen kopyalamasını azaltmakta ve PGF2α salınımı gerçekleşmemektedir.
İnterferon-τ’nun embriyo tarafından düşük miktarda üretilmesi veya uterusun bu sinyalleri tanımaması ya da bu sinyallere cevap vermemesi de embriyonik ölüm nedenleri arasında gösterilebilir.
İnterferon-τ sentezi ortalama 15. gün civarında başlamakla birlikte, en az 15 mm uzunluğundaki embriyoların interferon sentezleyebildikleri bildirilmiştir (Thatcher ve ark.,1989).
Luteal fonksiyonlarının belirlenmesindeki en etkili yol kan- sütteki progesteron konsantrasyonunun ölçülmesidir. Ovulasyon sonrası şekillenen korpus luteum progesteron sentezlemekte ve bu hormon siklik aktiviteyi ve gebe hayvanlarda da embriyo gelişimini kontrol etmektedir. Kan veya sütten progesteron ölçümü kolayca yapılabilmekte ve reprodüktif aktivite hakkında dikkate değer bilgiler vermektedir. Bu yaklaşımla luteal aktivitenin çiftleşmeyi takiben ne zaman şekillendiğini, aktivitenin normal veya ineğin luteal fonsiyonlarında bir bozukluk olup olmadığını belirlemek mümkündür. Çiftleşmiş hayvanlarda gebelikle ilgili sonucu da belirlemek mümkün olmaktadır. Gebe bir hayvanda progesteron konsantrasyonu belli bir seviyeyi korumaktadır, ancak gebelik şekillenmeyen hayvanlarda üç hafta sonra progesteron konsantrasyonu düşmekte ve inekte tekrar ovulasyon şekillenmektedir. Ayrıca, süt progesteron konsantrasyonu incelenerek erken gebelik boyunca yeterli bir luteal fonksiyonun varlığı ve bunun gebeliğin sonuçlanması üzerine olan etkilerinin de belirlenebildiği bildirilmektedir. Süt progesteron ölçümleri kullanılarak luteal fonksiyonun başlamasına ilişkin problemleri, uzayan luteal fonksiyonları (luteal kist) veya geçici luteal fonksiyona ara verilmesi gibi reprodüktif problemlerin de tespit edilebildiği belirlenmiştir (Mann, 2002).
Yapılan çalışmalar, tohumlama sonucunda gebe kalmayan ineklerde hem süt hem de plazma progesteron konsantrasyonunun tohumlamayı izleyen 10-12. günler civarında gebe kalan hayvanlara kıyasla daha düşük seviyede olduğu ortaya koymuştur. Siklus süresince düşük seyreden progesteron konsantrasyonu gebeliğin başarısızlığı ile ilişkilendirilmektedir. Bunun yanında belirli bir progesteron konsantrasyonu seviyesine ulaşmanın, gebeliğin başarısı için yeterli olmadığı, ancak önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir (Mann, 2002). Yapılan bir çalışmada tohumlamayı izleyen beşinci günde süt progesteron konsantrasyonları ölçülmüş ve düşük progesteron konsantrasyonlarının düşük gebelik oranları ile sonuçlandığı tespit edilmiştir. Yeterli düzeyde progesteron konsantrasyonu (>3ng/ml) tespit edilen ineklerde %50-55 oranlarında bir gebelik elde edilirken, zayıf düzeyde progesteron konsantrasyonuna (<1ng/ml) sahip ineklerde gebelik oranları %10’un altında kaldığı bildirilmiştir (Starbucks ve ark., 2001).
Ovulasyon sonrası progesteron konsantrasyonundaki artış gecikmesinin, gebelik oranlarında da göze çarpan bir gerileme ile sonuçlandığı yapılan çalışmalar sonrası kanıtlanmıştır (Lamming ve Darwash, 1995).
Darwash ve Lamming, (1998), yaptıkları bir çalışmada tohumlanan hayvanlarda dördüncü gündeki progesteron konsantrasyon artışının (>3ng/ml’ye kadar) gebelik ile sonuçlandığını; buna karşılık beşinci gündeki progesteron konsantrasyon artışının düşük gebelik oranına neden olduğunu ileri sürmektedirler. Sonuç olarak, anılan araştırıcılar ovulasyon sonrası progesteron konsantrasyonundaki artışın bir günlük gecikmesinin
bile gebelik oranlarına önemli olumsuz etkisi olabileceğini ileri sürmektedirler.
Mann ve ark., (1999), maternal progesteron sekresyonunun embriyo gelişimi üzerindeki önemini araştırmışlar, tohumlamayı izleyen 16. günde yetersiz gelişen embriyoları taşıyan ineklerin az veya hiç interferon-τ üretmediklerini ve bunun ovulasyon sonrası progesteron konsantrasyon artışının gecikmesi ve zayıf luteal faz konsantrasyonuna bağlı ortaya çıktığını belirlemişlerdir. Progesteron konsantrasyonundaki erken artış ve yüksek luteal faz konsantrasyonu embriyoların iyi gelişmesine ve yeterli uzamasına (elongation) neden olmakta, bunun sonucunda da yeterli miktarda interferon-τ üretimi şekillenmektedir.
Garrett ve ark., (1988), gebeliğin 2-5. günleri arasında artan progesteron konsantrasyonu sonrası 14. gündeki embriyonun gelişiminin yeterli düzeye ulaştığını, konseptus uzunluğunda 10 katlık bir gelişme olduğunu bildirmişlerdir.
Kerbler ve ark., (1997), gebeliğin beşinci gününde hCG uyguladıkları ineklerden topladıkları embriyolarda interferon-τ üretiminde az miktarda bir artış tespit etmişlerdir. Bunu destekleyen bir diğer çalışmada 5-9. günler arası ek progesteron uygulamasının, 16. günde interferon-τ üretiminde yeterli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir (Mann ve ark.,1998). Bunların yanında belirli gıdaların ve büyüme faktörlerinin de embriyo gelişimini kontrol ettikleri bildirilse de bunların salınım mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Yeni çalışmalar sonrası uterus IGF sisteminin de
erken embriyo gelişimini kontrol eden önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir (Mann ve Lamming, 1999).
Erken embriyonik ölüm oranlarındaki artış gebeliğin ilk haftasındaki yetersiz progesteron konsantrasyonu ile ilişkilendirilmektedir. Green ve ark., (2005) yaptıkları çalışmada, erken maternal progesteron konsantrasyonu ile gebeliğin ilk haftasında, özellikle östrustan sonraki beşinci günde, embriyo gelişimi arasındaki ilişkiyi incelemişlerdir. Yirmi inek östrusta tohumlamış ve östrus sonrası beşinci günde reprodüktif kanal embriyo varlığı ve gelişme dönemini belirlemek için yıkanmıştır. Üç ineğin değerlendirilemediği çalışmada geri kalan 17 inekten 11’inde (%65) embriyo toplanmış ve morula (n=3), 9-16 hücreli (n=3) ve 8 hücreli (n=5) aşamalarda oldukları tespit edilmiştir. Plazma progesteron konsantrasyonu veya korpus luteum büyüklüklerinde gebe (n=11) ve gebe olmayan (n=6) hayvanlar arasında beşinci günde istatistiksel olarak bir fark tespit edilememiştir. Sekiz hücreli gelişme aşamasından ileri bulunan embriyolarda, 8 hücreli embriyolara oranla plazma progesteron konsantrasyonu ve korpus luteum ağırlığı daha yüksek bulunurken, plazma insülin konsantrasyonunun daha düşük olduğu bildirilmiştir.
Gebe hayvanlarda plazma progesteron ile plazma insülin konsantrasyonları arasında negatif bir ilişki olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, araştırıcılar beşinci gün gibi erken bir dönemde de maternal progesteron konsantrasyonu ile embriyo gelişimi arasında bir ilişki olduğunu ileri sürmektedirler.
Ovulasyon sonrası progesteron konsantrasyonu artışındaki gecikme ineklerde zayıf gelişen embriyolar ile ilişkilendirilmektedir;
ancak anormal luteal sürecin nedeni tam olarak anlaşılamamıştır.
Robinson ve ark., (2005), folliküler dinamiğin manipülasyonu ile progesteron konsantrasyon artışındaki gecikme arasında yeni bir ilişki belirleyebilmek için bir çalışma yapmışlardır. Ultrasonografi ile ovulasyon anında 20 inekte büyük follikül: >10mm (BF, n=11) ve küçük follikül: <10mm (KF, n=9) ayrımı yapılmış ve korpus luteum büyüklüğü belirlenmiştir. Daha sonra luteolizis indüklenmiştir.
Plazma progesteron ve östradiol konsantrasyonları günde üç kez ölçülmüştür. Ovulasyon sonrası inekler ya dördüncü günde (her grup için 4 inek) ya da yedinci günde (KF, n=5; BF, n=7) kesime gönderilmiştir. Ovulasyon öncesi follikül, büyük follikül grubundan küçük follikül grubuna oranla luteolizis anında (13,5±0.4mm;
6.7±0.7mm) ve ovulasyon anında (16.7±0.3mm; 13.6±0.6mm) daha büyük bulunmuştur. Büyük follikül grubunda folliküler fazın daha kısa sürdüğü ve küçük follikül gruba oranla follikülün 36 saat daha erken ovule olduğu bildirilmiştir. Luteolizis sırasında plazma östradiol konsantrasyonu büyük follikül grubunda daha yüksek bulunurken, zirve konsantrasyon oranlarında bir fark bulunamamıştır. Büyük follikül grubunda erken luteal faz boyunca daha yüksek progesteron konsantrasyonları ve luteal ağırlık ile plazma progesteron konsantrasyonları arasında 5. günde pozitif bir
ilişki olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, ovulasyon öncesi dönemde follikül gelişme dinamiğinin, korpus luteum gelişimi ve fonksiyonu için önemli bir belirleyici olduğu bildirilmiştir.
1.4. Repeat Breeder İnekler
Repeat breeder inekler pratikte, üç veya daha fazla tohumlandıkları halde gebe kalmayan hayvanlar olarak tanınırlar. Bu sorun konusunda yapılan daha geniş bir tanımlamada ise; on yaşından daha küçük ve en az bir doğum yapmış, seksüel siklusları düzenli olan, genital organlarında klinik bir bozukluk fark edilmeyen ve anormal bir akıntı göstermeyen, ancak fertil bir boğayla üç defa veya daha fazla sayıda çiftleştiği ya da sun’i tohumlama yapıldığı halde gebe kalmayan hayvanlara çeviren hayvanlar adı verilmektedir (Alaçam, 1997).
Süt ineklerinde her tohumlama sonrasında gebe kalma oranı ortalama olarak %60 kabul edilmektedir. Buna göre üç tohumlama sonrasında ineklerin %93.6’sında gebelik şekillenirken %6.4’ü repeat breeder olarak kalmaktadır. Hartigan (1995), dört tohumlama sonrasında repeat breeder oranını ise %2.6 olarak bildirmektedir.
Ancak bu oranlarda normal olarak kabul edilen çeviren hayvan olguları, olumsuz koşullarda çok daha yüksek boyutlarda bir sorun olarak ortaya çıkabilmektedir.
Repeat breeder sendromunun başlıca iki nedeni, erken embriyonik ölümler veya fertilizasyonun şekillenmemesidir. Bu iki temel nedene eşlik eden ya da yol açan bazı risk faktörleri repeat breeder sorununun ortaya çıkmasında önemli rol oynamakta ve üzerlerinde dikkatle durulması gerekmektedir (Lafi ve Kaneene, 1988).
Fertilizasyonun şekillenememesi; ovulasyon gecikmesine veya anovulasyona, erken postpartum dönemde veya ovulasyondan sonra yapılan tohumlamaya, fekondasyondan önce oositin ölmesine, uterus enfeksiyonlarına, oosit ve spermatozoonun morfolojik ve fonksiyonel anomalilerine, gametlerin fekondasyon bölgesine taşınmasına olanak vermeyen yapısal engellere, ovulator mekanizma bozukluklarına, polispermiye, çift dişi pronukleusu taşıyan yumurtanın monospermik fertilizasyonuna, pronukleus formasyonunun şekillenmemesine, androgenezise, yaşlanmaya, yüksek süt verimine, immunulojik tepkilere ya da bazı çevresel faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan atipik fertilizasyon gibi olgulara bağlı olabilmektedir (Gunther, 1981; King, 1991; Hartigan, 1995).
1.4.1. Embriyonik Ölümler
Lineras (1981), embriyonik ölümleri repeat breeder sendromunun esas nedeni olarak bildirmektedir. Kastelic (1994), embriyonik ölümleri, ilk tohumlaması yapılan ineklerde %15, repeat breeder ineklerde ise %28.5 oranlarında belirlemiştir.
Embriyonik ölüm nedenleri arasında birçok etmen bildirilirken, bunlar genel anlamda genetik ve çevre faktörleri olarak ikiye ayrılabilirler. Daha sonra bu faktörler de kendi içerisinde embriyoyu etkileyen iç nedenler ve dış nedenler olmak üzere alt faktörler olarak değerlendirilebilir (King, 1991).
Embriyonik ölümlerin olası sebepleri olarak; yaşlanmış oositin fertilizasyonu, letal kromozomal anomalileri, yüksek çevre ısısı,
rasyonlarda bazı temel ve özel besin maddelerindeki yetersizlikleri, siklik östrojen-progesteron hormonlarının dengesizliği, progesteron yetersizliği ve subklinik uterus enfeksiyonları gibi etmenler sıralanmaktadır (King, 1990; Ahmad ve ark., 1995; Dunne ve ark., 1999; Humblot, 1999; Wolfenson ve ark., 2000; Boland ve ark., 2001;
Bilodeau-Goeseels, 2006; Lamb, 2006).
Enfeksiyöz hastalıklar da embriyonik ölüm nedenleri arasında gösterilmektedir. Enfeksiyöz hastalıklar spermatozoo’nun dişi genital kanalındaki canlılığını ve taşınmasını sekteye uğratarak, fertilizasyon oranının düşmesine yol açmaktadır. Enfeksiyöz hastalıkların embriyo, fötus ve plasenta üzerine doğrudan olumsuz etkileri bulunmaktadır. Bunun sonucunda embriyonik ölüm, abortus, ölü doğum veya zayıf buzağı doğumu olguları ortaya çıkabilmektedir.
Enfeksiyöz hastalıklar, uterus fonksiyonlarını bozarak embriyo ve fötüsün canlılığını dolaylı olarak etkilemekte ve embriyonik ölüm, abortus, mumifikasyon ve ölüm doğum şekillendirebilmektedir (Parkinson, 1992).
Embriyonik ölüm nedenleri araştırılırken göz önünde bulundurulması gereken önemli nokta kaybın ne zaman gerçekleştiğinin bilinmesidir. Progesteron ölçümleri ile bu konuda yeni bilgiler elde edilmiştir. Morfolojik olarak normal olan embriyoların transferi sonrası 24. günden önce %25 oranında bir kayıp bildirilmiştir. Otuz-60. günler arasında ise gebeliğin %10 oranında sonlandığı belirtilmiştir. Embriyonik ölüm zamanı hakkındaki en kesin bilgi, ineklerin kesime sevk edildiği çalışmalardan elde edilmiştir. Düve ve normal ineklerde embriyoların, 12-16. günler arasında, %20 oranında dejenere olduğu bildirilmiştir.
Repeat breeder gibi fertilite düşüklüğü olan hayvanlarda ise
kayıpların 4-7. günler arası şekillendiği ileri sürülmektedir (Wathes, 1992).
Peters (1996), yaptığı bir çalışmada tohumlama sonrası %90 oranında fertilizasyon oranı tespit etmiştir. Daha sonra 10-13. günler civarında gebelik oranın, embriyo gelişmesinin başarısız olması sonucu, %80’e düştüğünü gözlemiştir. Ondokuzuncu gün civarında bu oranının, luteolizisin embriyo tarafından engellenememesi ve embriyo gelişimi için yeterli progesteron sekresyonunun olmaması sonucu, %60-65’lere gerilediğini belirlemiştir. Bunlara ek olarak %25- 30 oranında gebeliklerin embriyonik ölümlere bağlı sonlandığını gözlemiştir. Yüzde 5-10 fötal kayıp ve %5 oranında da abort hesaplandığı zaman gebelik oranının %50 civarında olduğunu bildirmektedir. Araştırıcı, erken embriyonik ölümlerin embriyo gelişim bozukluğu sonucu ortaya çıksa da, daha sık olarak embriyonun luteolizisi engelleyememesi sonucu şekillendiğini ileri sürmektedir.
Embriyonik ölümler bazı araştırıcılar tarafından genetik olarak uygun olmayan embriyoların doğumdan önce eleminasyonu olarak da tanımlanmaktadır (King, 1991). Gebeliğin şekillenmesi ve gelişimi embriyo, uterus ve ineği içeren komplike bir süreçtir. Embriyonal yaşamı sürekli etkileyen tek bir faktörden bahsedilemezken, genetik, hormonal etkilerin, beslenmenin, stres ve hayvan sağlığı gibi faktörlerin düzenlenmesiyle embriyonik kayıp rastlantısının düşürülebileceği bildirilmiştir (Lamb, 2006).
İneklerde ilk tespit edilen kromozomal anomali iki nonhomolog akrosentik kromozom arasında şekillenen birleşme sonucunda ortaya çıkan 1/29 translokasyonudur. Bunun sonucunda bir
submetasentrik kromozom şekillenmektedir. Normal bir inek 60 kromozoma sahip iken homozigot veya heterozigot bireyler bu translokasyon sonucu 58-59 kromozoma sahiptirler (King, 1991). En belirgin kromozomal anomali ise 1/29 Robertsonian translokasyonudur. Bu anomalide iki kromozom (1 ve 29) arasında bir yapışma söz konusudur ve bu yapışma sonrası tek kromozom şeklinde ortaya çıkmaktadır. Bu şekilde bir traslokasyondan altı değişik tipte gamet şekillenebilmektedir. Şekillenen gametlerden sadece iki tip yaşamını sürdürebilen embriyo oluşturabilmektedir.
Diğer dört tipten şekillenen embriyolar ise gelişimlerinin birinci ya da ikinci haftasında ölmektedirler (Bilodeau-Goeseels, 2006).
Repeat breeder olgusuna neden olan erken embriyonik ölümlerde, diğer etmenlerin yanısıra özellikle luteal fonksiyonun yetersizliği de önemli bir sebep olarak bildirilmektedir. Erken gebelik süreci bütünüyle korpus luteumun desteğindedir. Herhangi bir nedenle korpus luteumun prematüre regresyonu veya fonksiyonun kısa-uzun süre yetersizliği embriyonik ölüm veya abortus ile sonlanır (Alaçam, 1997).
Oosit kalitesi folliküler ve hormonal etki ile ilişkilidir. Östrus siklusu boyunca düşük progesteron etkisi altında olan veya senkronizasyon için düşük dozda progesteron uygulaması sonrası dominant follikül persiste hale gelebilmekte ve östradiol sekresyonu yükselmektedir. Persiste follikülden ovule olan oosit ileri olgunlaşma safhasında olabilir. Bu oositin fertilize olabilme yeteneğinin olduğu bildirilirken, gelişen embriyoların 16 hücreli aşamadan önce öldükleri bildirilmektedir (Ahmad ve ark., 1995). Bu tarz folliküllerden şekillenen oositlerde prematüre mayozis, perivitellin boşlukta
genişleme, intraselüler vakuoller ve lipid damlacıklarının sayısında artış gözlenmektedir (Mihm ve ark. 1999).
İneklerde her seksüel siklus sırasında genelikle 2 ya da 3 folliküler dalga şekillenmektedir. Folliküler dalgalar bir grup follikülün gelişimi ile başlar fakat bunlardan yalnızca biri dominant hale gelir. Sonuç olarak, iki ve üç dalgalı sikluslarda sadece son dalganın dominant follikülü ovulasyon gösterir. Siklus uzunlukları benzer olmakta bu yüzden iki folliküler dalga sonucu gelişen ovulatorik follikülün baskınlık dönemi daha uzun, çapı büyük, östradiol üretimi yüksek olmaktadır. Bu bilgiden yola çıkarak etçi ineklerde yapılan bir çalışmada gebelik oranları 2 dalgalı siklusa sahip hayvanlarda (%82) 3 dalgalı siklus gösterenlere oranla (%100) daha düşük bulunmuştur. Sütçü ineklerde yapılan bir başka çalışmada ise gebelik oranları sırasıyla %58 ve %95 olmuştur (Inskeep, 2000).
Kısa ömürlü korpus luteuma pubertal düvelerde ve postpartumdan normal aktiviteye dönen ineklerde rastlanabilir.
Postpartum dönem boyunca inek infertil bir hayvandan fertil bir hayvana dönüşmektedir. Yapılan bir çalışmada, sırasıyla postpartum
<31, 31-50, 51-90 ve >90 günlerde yapılan tohumlamalarda sırasıyla
% 15, 55, 64 ve 86 gebelik oranları elde edilmiştir. Bu yüzden postpartum birinci ovulasyon fertil karakterde olamayabilir. Birinci korpus luteum progesteron salgılamaya başladığı zaman, uterustan PGF2α salgılanması daha erken şekillenmekte ve erken luteolizis şekillenmektedir (Bilodeau-Goessels, 2006).
Birçok çalışma beslenme fertilite ilişkisini konu almış ancak bunlardan sadece birkaçı embriyonik ölümler üzerine spesifik etkilere yoğunlaşmıştır. Bu çalışmalarda da, muhtemelen farklı deneysel koşullar ve beslenmenin etkilerinin çok sayıda mekanizma yoluyla şekillenebilecek olmasından ötürü birbiri ile uyumsuz sonuçlar elde edilmiştir (Humblot, 1999). Her ne kadar beslenmenin fertilite üzerine olumsuz etkilerinin sonucu embriyonun ölümü şekillenebilirse de beslenmenin embriyo kalitesini folliküler çevre, oositin gelişimsel kapasitesi ya da erken embriyonik gelişim esnasındaki değişimler yoluyla mı etkilediği açık değildir (Boland ve ark., 2001). Lamb (2006), vücut kondüsyon skoru artan ineklerde embriyonik ölümlerin azaldığını ileri sürmektedir.
Yapılan çalışmalarda rasyonlardaki protein fazlalığının embriyonik mortaliteyi artırdığını ileri sürülmektedir. Yüksek seviyelerdeki protein uterustaki progesteron konsantrasyonu veya kan üre konsantrasyonu gibi sekresyonları değiştirebilmektedir. Bu değişimlerin ise embriyonik gelişme üzerine toksik etkili olabileceği bildirilmiştir (Blanchard ve ark., 1990; Elrod ve Butler, 1993; Lamb, 2006).
Ham protein içeriği farklı iki (%15.5 ve %21.8) rasyonun düvelerde konsepsiyon oranlarına etkilerinin incelendiği bir çalışmada, ilk tohumlamada konsepsiyon oranları ilk grup için %82, ikinci grup için %62 olmuş; iki grup arasında ortaya konan bu farklılık, geç embriyonik ölümlere bağlanmıştır (Elrod ve Butler, 1993).
Enerji alımında kısa süreli değişimler embriyo üzerine olumsuz etkilerde bulunmaktadır. Rasyondaki enerji miktarının tohumlamanın hemen sonrasında, iki hafta süreyle, yaşama payı gereksiniminin iki katından 0.8 katına indirildiğinde toplanan embriyo sayısının kontrol grubuna oranla % 30 azaldığı izlenmiştir.
Araştırıcılar, tohumlama sonrası dönemde ani rasyon değişikliklerinden kaçınılması gerektiğini de vurgulamışlardır (Dunne ve ark., 1999).
Toksik bitkilerin etkileri çevre ile birlikte çeşitlilik göstermektedir. Bazı toksinler yılın belli sezonlarında toksik etki gösterirken, bazıları ise embriyonun farklı gelişim aşamalarında etkili olmaktadırlar. Toksik bitkiler boğalarda spermatogenezisi, ineklerde ise oogenezisi etkileyerek fertiliteyi düşürmektedirler. Toksik bitkilerin embriyonik ölümlerin yanı sıra abortlara, iskelet anomalilerine ve fötal büyüme geriliğine de neden oldukları bildirilmektedir (James ve ark., 1992).
Östrojenik etkili yem maddeleri embriyonik ölümlere sebep olabilmektedir. Tohumlama gününde periferal östrojen konsantrasyonlarının gebelik oranları ve embriyonik kayıplara etkilerinin izlendiği bir çalışmada, rasyonlarında 1-2 kg/gün oranında fiğ (Vicia Sativa) bulunan ineklerde östrojen konsantrasyonlarının ve embriyonik ölüm oranlarının yüksek olduğu bildirilmiştir (Shore ve ark., 1998). Baklagiller familyasına ait birçok bitki türü yapısında fitoöstrojenler içermektedir. Yonca, üçgül gibi bitkilerde, soya fasülyesi, pamuk tohumu, keten tohumu, kolza tohumu gibi yağlı tohumlarda soya ve mısır yağında, patates, şeker pancarı, arpa, pirinç, çavdar, mercimek, fiğ gibi birçok yem
maddesinde biyolojik etkileri birbirine benzer östrojenik bileşikler bulunmaktadır (Yalçın, 2002).
Mineral maddelerden birinin veya birkaçının yetersizliği ve dengesizliği ile gebeliğin olumsuz yönde etkilenebileceği bildirilmiştir.
İneklerde embriyonik ölümün makrominerallere kıyasla, mikrominerallerin özellikle Cu, Zn ve Se yetersizliğinden meydana geldiği ifade edilmiştir (Erkal, 1984; Doyle ve ark., 1990; Clark ve ark., 1995; Yıldız ve Balıkçı, 2004).
Aslan ve ark. (1998) erken gebelik ve embriyo/fötal kayıplarda periferal kanda progesteron, vitamin E, vitamin B12, β-karoten ve folik asit konsantrasyonlarını incelemişler; gebe hayvanlarda gebe olmayan ve embriyo/fötal kayıp şekillenenlere kıyasla korpus luteum çapının daha büyük, progesteron, β-karoten ve vitamin E konsantrasyonlarının daha yüksek olduğunu, vitamin B12 ve folik asit konsantrasyonlarının ise farklılık göstermediğini bildirmişlerdir.
Isı stresi dinlenme halindeki homeotermik bir hayvanın vücut ısısını arttıracak dış etkenlerin toplamı olarak ifade edilmektedir. Isı stresinin başarılı gebelik şekillenmesi için gerekli faktörler üzerine olumsuz etkili olduğu tespit edilmiştir. Isı stresi altındaki hayvanlarda folliküler dinamiğin etkilendiği, tersiyer follikülün dominant folliküle büyüyebilme olasılığının zayıfladığı bildirilmiştir.
Bunun ikinci folliküler dalgadaki dominant follikülün erken ortaya çıkması ile ilişkili olduğu ileri sürülmüştür (Wolfenson ve ark., 1995).
Erken ortaya çıkan bu follikül ovule olduğu zaman ısı stresi altında olmayan ineklerde ovule olan folliküle oranla daha yaşlı olduğu tespit
edilmiş ve preovulatorik follikülün dominantlaşma sürecinin fertilite ile negatif ilişkili olduğu bildirilmiştir (Mihm ve ark., 1994).
Sığırlar için nem oranı elemine edildiğinde ideal termonötral aralık 16-25 C˚’ dir (Smith ve ark.,1998).
Isı stresi altında folliküler hücrelerin steroidogenik kapasiteleri azalmaktadır. Granuloza hücrelerinden östradiol sentezi için gerekli olan androjen üretiminin azaldığı bildirilmiştir. Bununla birlikte plazma progesteron konsantrasyonlarının da ısı stresi altındaki ineklerde azaldığı belirtilmiştir (Wolfenson ve ark.,1997). Düşük progesteron konsantrasyonu ise dominant follikülde ve korpus luteumdaki steroidogenezisi etkilemekte ve anormal oosit maturasyonuna neden olmakta, endometrial morfolojiyi etkilemekte ve embriyo ölümlerine neden olabilmektedir (Ahmad ve ark., 1995).
Bir çok araştırıcı ısı stresi altında plazma progesteron konsantrasyonunun düştüğüne inanmaktadır. Yapılan laboratuar çalışmalarında da luteal hücrelerin 40oC’de 38oC’ye maruz kalan hücrelere göre %30 daha az progesteron ürettikleri gözlemlenmiştir.
Düşük progesteron konsantrasyonu folliküler gelişimi bozmakta, anormal oosit maturasyonuna ve erken embriyonik ölüme sebep olmaktadır. Ayrıca düşük progesteron konsantrasyonu, endometriyumun morfolojisini ve fonksiyonunu değiştirmektedir (Wolfenson ve ark., 2000).
1.5. Embriyonik Yaşamın Desteklenmesine Yönelik Girişimler
Erken embriyonik ölümlerde diğer faktörlerin yanısıra luteal fonksiyonun yetersizliği de önemli bir sebep olarak bildirilmektedir.
Herhangi bir nedenle korpus luteumun prematüre regresyonu veya fonksiyonun kısa-uzun süre yetersizliği embriyonik ölüm veya abortus ile sonlanmaktadır. Böyle durumlarda gebeliğin anne tarafından tanınma süreci tamamlanıncaya kadar (<18 gün) geçen sürede, PGF2α salgılanmasını engellemek ve yeterli progesteron desteği sağlamak üzere progesteron, GnRH veya hCG hormonu uygulamaları önerilmektedir (King, 1990; Mann, 2002).
1.5.1. Progesteron Hormonu Uygulamaları
İneklerde embriyonik ölümlerin azaltılmasına yönelik girişimlerden bir tanesi, tohumlama sonrası doğrudan progesteron uygulamaları olarak ortaya çıkmıştır. PRID (progesteron salan intravaginal gereç), CIDR (kontrollu intravaginal ilaç salınımı), Repositol ve Syncro-mate kulak implantları uygun progesteron hormonu seçenekleridirler (Bilodeau-Goeseels, 2006; Shams-Esfanabadi ve Shirazi, 2006).
İnekler üzerinde yapılan birçok çalışmanın bulgularına göre, östrusu izleyen diöstrus döneminde düşük progesteron konsantrasyonuna sahip ineklerde konsepsiyon oranları da düşük olarak bulunmaktadır (Lopez-Gatius ve ark., 2004; Shams- Esfanabadi ve Shirazi, 2006). İneklerde progesteron uygulanmasının gebelik oranları üzerine etkilerini kapsamlı olarak araştırmak üzere birçok araştırma ve yayın yapılmış ve yapılmaya da devam
edilmektedir. Bu çalışmalarda birçok değişik ırktaki inek, farklı gebelik dönemlerinde progesteron ile tedavi edilmişlerdir.
Çalışmaların bazılarında ekzojen progesteronun gebelik üzerine olumlu etkileri tespit edilirken bazılarında herhangi bir olumlu etki bildirilmemiştir (Mann, 2002 ; Shams-Esfanabadi ve Shirazi, 2006).
Shams-Esfanabadi ve Shirazi (2006) tohumlama sonrası CIDR uygulamalarının repeat breeder Holstein ineklerde gebelik oranlarına etkisini araştırmışlardır. Çalışma, laktasyondaki 600 baş Holstein ırkı inek üzerinde, Nisan-Haziran ayları arasında yapılmıştır. İnekler iki gruba ayrılmış ve tedavi grubundaki hayvanlara tohumlama sonrası 5. günden 19. güne kadar CIDR uygulanmıştır. Kontrol grubundaki hayvanlara ise herhangi bir uygulama yapılmamıştır.
Hayvanlar tohumlama sonrası 45-50. günlerde gebelik yönünden kontrol edilmişlerdir. Tedavi grubundaki 60 inekten 28’i, kontrol grubundaki 54 inekten ise 20’si gebe olarak tespit edilmiştir.
Araştırıcılar sonuç olarak, iki grup arasında istatistiksel olarak bir fark olmadığını bildirmişlerdir.
Larson ve ark. (2007) yüksek süt verimli ineklerde düşük konsepsiyon oranlarının önemli bir nedeninin yetersiz progesteron konsantrasyonuna bağlı olarak implantasyon öncesi yetersiz embriyo gelişimi olarak bildirmişlerdir. Yapılan çalışmada embriyo gelişimine yardımcı olmak amacı ile tohumlama sonrası 3., 5. ve 10. günler arası progesteron uygulaması yapılmıştır. Kontrol grubundaki hayvanlara herhangi bir uygulama yapılmazken, tedavi grubundaki hayvanlara tohumlama sonrası 3,5. günden 10. güne kadar CIDR uygulaması yapılmıştır. Progesteron analizi için tohumlama gününde, tohumlama sonrası 2. veya 3. gün, 4. gün ve 22. gün süt örnekleri toplanmıştır. Araştırıcılar çalışma sonucunda CIDR uygulanan tedavi
grubundaki hayvanlarda progesteron konsantrasyonunda 4. günde kontrol grubuna göre 0.7 ng/ml’lik bir artış hesaplamışlardır. Gebelik oranları kontrol grubunda %35 (22/63) hesaplanırken, tedavi grubunda %48 (32/67) oranında gebelik bildirilmiştir. İlk ve ikinci laktasyonda bulunan ineklerde yapılan tedavi değerlendirilmesinde ise gebelik oranlarında ciddi bir fark bildirilmiştir. Bu gebelik oranları kontrol grubunda %33 (18/55) iken tedavi grubunda gebelik oranları
%51 (31/61) olarak bildirilmiştir. Sonuç olarak araştırıcılar özellikle ilk ve ikinci laktasyondaki ineklerde gebelik gelişimi için eksojen progesteron etkisinin önemli olduğunu ileri sürmektedirler.
Carothers (2006) ısı stresi altındaki sütçü ineklerde gebelik oranlarını ve serum progesteron konsantrasyonunu artırmak için CIDR uygulamasının etkisini araştırmıştır. Bu amaçla yapılan birinci uygulamada tedavi grubuna tohumlama sonrası 5 ile 12. günler arası, ikinci uygulamada ise tedavi grubuna tohumlama sonrası 5 ile 19. günler arası CIDR uygulaması yapılmıştır. İki uygulamada da kontrol gruplarına herhangi bir uygulama yapılmamıştır. Uygulama günü ve takip eden hergün uygulama yapılan hayvanlarda rektal ısı ölçülmüş ve kan örnekleri toplanmıştır. Toplanan kanlarda serum progesteron konsantrasyonları RIA yötemi ile ölçülmüştür. Gebelikler ortalama 30. gün ultrasonografi ile tespit edilmiştir. Çalışmalar sonucunda iki tedavi grubu ile kontrol grupları arasında serum progesteron değerleri arasında istatistiksel olarak bir fark olmadığı bildirilmiştir. Birinci uygulamada tedavi grubunda % 33.3 oranında gebelik tespit edilirken, kontrol grubunda ise % 31.8 gebelik oranı bildirilmiştir. İkinci uygulamada tedavi grubunda % 26.7 oranında gebelik tespit edilirken, kontrol grubunda ise % 33.3 gebelik oranı bildirilmiştir. İki uygulamada da tedavi ile kontrol gruplarında gebelik oranları bakımından istatistiksel bir fark bulunamamıştır. Sonuç olarak araştırıcı sıcaklık stresi altındaki sütçü ineklerde tohumlama
sonrası progesteron uygulamalarının gebelik oranları ve serum progesteron konsantrasyonunu artırmada bir etkisi olmadığı ileri sürmektedir.
Macmillan ve ark. (1991) ise tohumlamayı izleyen 5. ve 7.
günler arasında başlayarak 6 veya 12 gün uygulanan CIDR gruplarındaki ineklerde, kontrol grubuna göre daha yüksek gebelik oranları elde etmişlerdir. Çizelge 1.1’de tohumlamayı izleyen farklı günlerde progesteron hormonu uygulanan araştırmaların özet bulguları verilmektedir.
Çizelge 1.1. Tohumlamayı izleyen farklı günlerde progesteron uygulamalarnın gebelik oranlarına etkilerine ilişkin araştırma bulguları (Mann ve Lamming 1999)
Kaynak
Progesteron Uygulama
Günleri
Deneme Grubu
Kontrol
Grubu Etki
Walton ve ark.
(1990)
PRID 5-12
%68 %57.1 +%10.9
Van Cleef ve ark.
(1991)
CIDR 7-13
%57.9 %53.6 +%4.3
Mann ve ark.
(2001)
CIDR 10-17
%56.0 %53.3 +%2.7
Larson ve ark.
(2007)
CIDR 3,5-10
%48 %35 +%13
Mann ve Lamming (1999) yaptıkları bir dizi çalışmayı değerlendirerek, progesteron uygulamalarını takiben gebelik
oranlarında genel olarak %5’ lik bir artış olduğunu bildirmektedirler.
Daha sonra yapılan çalışmalarda ise progesteron uygulanma zamanının başarıda kritik bir faktör olduğu tespit edilmiştir.
Tohumlama sonrası 6. günden önceki progesteron uygulamalarının gebelik oranlarında %10’ luk bir artma ile sonuçlandığı bildirilmiştir.
Araştırıcılar, yaptıkları bir başka değerlendirmeye göre ise progesteron tedavisinin sadece düşük fertiliteye (<%50) sahip ineklerde fayda ve %20 oranında bir artış sağladığını ileri sürmektedirler.
Starbucks ve ark. (2001) süt progesteron analizi ile düşük progesteron konsantrasyonuna sahip olduğu belirlenen hayvanlarda yapılan progesteron tedavileri ile gebelik oranının %29’dan %58’e yükseltildiğini ileri sürmektedirler.
Lopez-Gatius ve ark., (2004) embriyonik ve erken fötal dönemde normalin altındaki progesteron konsantrasyonunun sütçü ineklerde konseptusun gelişimini olumsuz etkilediği bildirmektedirler.
Yaptıkları çalışmada da bu hipotezi test etmek için gebeliği belirlenen hayvanlara ekzojen progesteron uygulaması yapmışlardır. Gebe bulunan hayvanlar tedavi uygulanmayan kontrol grubu (n=549) ve tedavi grubu (n=549) diye iki gruba ayrılmışlardır. Gebelik tespiti tohumlamayı izleyen 36. ve 42. günlerde ultrasonografi ile yapılmıştır. Tedavi grubunda bulunan gebe ineklere 28 gün boyunca PRID uygulaması yapılırken, kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmamıştır. Gebeliğin 90. gününde rektal palpasyon ile yapılan tekrar kontrollerde 95 (%8.7) hayvanda gebeliğin sonlandığı tespit edilmiştir. Sonlanan gebelikler kontrol grubunda 66 (%12) inekte, tedavi grubunda ise 29 (%5.3) inekte belirlenmiştir. Araştırıcılar, sonuçların yüksek süt verimli ineklerde normalin altındaki
progesteron konsantrasyonunun konseptus gelişimini olumsuz etkilemesi konusundaki hipotezi desteklediğini bildirmişlerdir.
Araştırıcılar ayrıca intravaginal progesteron uygulamalarının embriyonik ve erken fötal dönemde gebelik kayıp rastlantısını düşürmede önemli bir etkisi olduğunu eklemektedirler.
Carter ve ark. (2008) ineklerde tohumlama sonrası erken dönemde yüksek sistemik progesteron konsantrasyonunun embriyonik büyümeyi, interferon-τ üretimini ve gebelik oranlarını artırdığını bildirmektedirler. Araştırıcılar 3. günde progesteron konsantrasyonu artışının embriyonik yaşama ve gelişimine etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada kullanılan hayvanlar senkronize edilip, yaklaşık 2/3’üne suni tohumlama yapılmış, geri kalanlar ise tohumlanmamıştır. Birbirinden farklı sistemik progesteron konsantrasyonuna sahip inekler elde edebilmek için çalışma grubundaki hayvanların yarısına tohumlama sonrası 3. günden itibaren PRID takılmış ve hayvanlar kesime gönderilene kadar uygulanmıştır. Tedavi grupları 4’e ayrılarak, (i) yüksek progesteron düzeyi olan gebe hayvanlar, (ii) normal progesteron düzeyi olan gebe hayvanlar, (iii) yüksek progesteron düzeyi olan gebe olmayan hayvanlar ve (iv) normal progesteron düzeyi olan gebe olmayan hayvanlar olarak sınıflandırılmışlardır. Tüm hayvanlardan 0. ile 8.
günler arası günde iki kez ve kesime gidene kadar günde bir kez kan örnekleri toplanmıştır. Hayvanlar, embriyonal gelişim aşaması olarak 16 hücreli aşamaya, blastosist aşamasına, embriyonik uzamanın başladığı aşamaya ve gebeliğin anne tarafından tanınması aşamasına denk gelen 5., 7., 13. veya 16. günlerde kesime gönderilmişlerdir.
Embriyolar uterustan flushing yöntemi ile elde edilmişler ve gelişim aşaması açısından değerlendirilmişler, 13. ve 16. günler arasında olanlarda embriyonik ölçüm de yapılmıştır. Araştırıcılar 3. günde uygulanan PRID’in progesteron konsantrasyonunu yükselttiğini
bildirmektedirler. Beşinci ve 7. günlerde yapılan değerlendirmelerde tedaviler arasında embriyo gelişimi açısından bir fark olmadığını bildirmektedirler. İstatistiksel olarak bir fark olmasa da araştırıcılar varlığını sürdüren embryo oranının yüksek progesteron grubunda 13.
ve 16. günlerde sayısal olarak yüksek olduğunu bildirmektedirler.
Çalışmadaki en önemli sonuçlardan bir tanesi progesteron konsantrasyon düzeyindeki yükselmenin istatistiksel olarak 13. ve 16. günlerde embriyonik uzunluğu artırdığının izlenmesidir. Sonuç olarak seksüel siklusun 3. gününde PRID uygulamasının siklusu takip eden günlerde progesteron konsantrasyonunu yükseltiğini bildirilmektedir. Bu yükselmenin 5. ve 7. günlerde embriyo gelişimi üzerine herhangi bir fenotipik gelişim sağlamadığı ancak 13. ve 16.
günlerde embriyonik uzunluk üzerinde bir artış sağladığı eklenmektedir.
Villarroel ve ark. (2004) repeat breeder ineklerde tohumlama sonrası 14 gün boyunca uygulanan ekzojen progesteronun gebelik üzerine etkisini araştırmışlardır. Tedavi grubundaki ineklere tohumlama sonrası 5. günde PRID uygulanmış ve 19. günde uzaklaştırılmıştır. Kontrol grubudaki hayvanlara ise herhangi bir uygulama yapılmamıştır. Araştırıcılar, yaptıkları değerlendirmede progesteron uygulamasının, genel olarak, gebelik oranlarına bir etkisi olmadığını ileri sürmektedirler. Ancak doğum sayısına ve laktasyon dönemlerine göre yapılan değerlendirmede, ilk ve ikinci doğumunu yapmış, geç laktasyon döneminde olan hayvanlarda progesteronun gebelik oranlarında önemli bir etkisi olduğuna dikkat çekmektedirler.
Stevenson ve Michael (1991) Holstein ineklerde tohumlamayı izleyen 5-13 ve 13-21. günlerde PRID uygulamaları ile gebelik oranlarını arttırdıklarını ileri sürmektedirler.
