YENİ SENTEZ EDİLEN PALLADYUM (II) BİLEŞİĞİNİN OTOFAJİ İNHİBİTÖRLERİ İLE
KOMBİNASYONUNUN
PROSTAT KANSER HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI
Merve ERKISA
T.C.
ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YENİ SENTEZ EDİLEN PALLADYUM (II) BİLEŞİĞİNİN OTOFAJİ İNHİBİTÖRLERİ İLE KOMBİNASYONUNUN
PROSTAT KANSER HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ SİTOTOKSİK ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Merve ERKISA
Doç. Dr. Ferda ARI
İkinci Danışman: Prof. Dr. Engin ULUKAYA
YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BURSA–2016 Her Hakkı Saklıdır
U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında;
- tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,
- başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,
- atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,
- ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı
beyan ederim.
03/06/2016 Merve ERKISA
i ÖZET Yüksek Lisans Tezi
YENİ SENTEZ EDİLEN PALLADYUM (II) BİLEŞİĞİNİN OTOFAJİ İNHİBİTÖRLERİ İLE KOMBİNASYONUNUN
PROSTAT KANSER HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ SİTOTOKSİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI
Merve ERKISA Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Ferda ARI
İkinci Danışman: Prof. Dr. Engin ULUKAYA
Prostat kanseri dünyada erkeklerde en sık rastlanan ikinci kanser türüdür. Kemoterapi tedavisine karşı gelişen direnç bu kansere bağlı ölümlerin ana nedenlerinin başında gelmektedir. Bu nedenle prostat kanseri tedavisine yönelik olarak yeni terapötik hedeflerin araştırılması halen araştırmacıların ilgi odağı olup, bu hedeflerin etkileşime girdikleri hücresel sinyal yolakları aydınlatılmaya çalışılmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, kanser tedavisinde kullanılan metal bileşiklerin umut verici etkilerinden dolayı ilaç olarak kullanımının yaygınlaştığını göstermektedir. Çoğunlukla bir stres yanıtı ve hayatta kalma mekanizması olarak işleyen otofaji, kanser gelişimi ve tedavisi sürecinde önemli bir role sahiptir. Prostat kanseri üzerinde yapılan araştırmalar otofajinin genellikle bir hayatta kalma mekanizması olarak rol aldığını göstermektedir. Dolayısıyla bu tez çalışmasında, Palladyum (II) bileşiği [[Pd(bpma)(barb)]Cl.H2O] ile otofaji inhbitörleri (3-Metiladenin ve klorokin) kombinasyonunun insan prostat kanseri hücre soyları (LNCaP, PC-3) ve sağlıklı prostat hücre soyu (PNT1A) üzerine sitotoksik etkileri araştırılmıştır. Pd (II) bileşiğinin ve otofaji inhibitörlerinin hücre canlılığı üzerine olan etkileri MTT canlılık testi ile belirlenmiştir. Kombinasyon tedavisi (Pd (II) bileşiği ve otofaji inhibitörleri) için belirlenen dozların bu hücre soyları üzerine olan etkileri önce MTT testi ile belirlenmiştir. Daha sonra da bu etkiler ATP canlılık testi ile doğrulanmıştır.
Kombinasyon tedavisinin sitotoksik etkilerinden sorumlu hücre ölümü (apoptozis/nekrozis/otofaji) mekanizmasının belirlenmesi amacıyla akım sitometri sistemi ve M30 antijen yöntemi kullanılmıştır. Hücrelerde apoptoz varlığı Hoechst 33342/Anneksin- V/Propidyum İyodür üçlü boyama yöntemi ile asidik veziküler organellerin varlığı ise akridin boyaması ile floresan mikroskopta görüntülenerek desteklenmiştir. Son olarak otofaji ve hücre ölümü ile ilişkili proteinlerin ekspresyon seviyeleri Lumineks uygulaması ve immunoblotlama yöntemi ile gösterilmiştir. Sonuç olarak, Pd (II) bileşiği ve otofaji inhibitörleri kombinasyonunun özellikle metastatik prostat kanseri hücre soyunda (PC-3) sitotoksik aktivitenin artışına ve apoptozise neden olduğu bulunmuştur. Pd (II) bileşiğinin otofaji inhibitörleri ile kullanımının yeni umut verici bir tedavi seçeneği olarak kullanılabileceği öngörüsüyle ileri in vivo deneylerin yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Prostat kanseri, Apoptoz, Otofaji, Palladyum (II) bileşiği 2016, xii + 150 sayfa.
ii ABSTRACT Master's Thesis
CYTOTOXIC EFFECTS OF COMBINATION WITH NOVEL SYNTHESIS PALLADIUM COMPLEX
WITH AUTOPHAGY INHIBITORS ON PROSTATE CANCER CELL LINES Merve ERKISA
Uludag University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ferda ARI Second Supervisor: Prof. Dr. Engin ULUKAYA
Prostate cancer is the second most common cancer in men worldwide. The development of resistance to chemotherapy is one of the main causes of cancer death. Therefore, the search for new therapeutic agents for the treatment of cancer is still the focus of researchers with an aim to understand cellular signaling pathways. Studies in recent years have shown the widespread use of metal complexes as it has promising potential in cancer treatment. Autophagy has an important role in cancer development and treatment often as a stress response and survival mechanism. Studies on prostate cancer have shown that autophagy usually works as a survival mechanism. In this research, the cytotoxic effects of combination of palladium (II) complex [[Pd(bpma)(barb)]Cl.H2O] and autophagy inhibitors (3-methyladenine and chloroquine) are investigated on human prostate cancer cell lines (LNCaP, PC-3) and healthy prostate cell line (PNT1A). Effects of Pd(II) complex and autophagy inhibitors on cell viability were determined separately by MTT viability assay. For the combinatorial treatment (Pd (II) complex and autophagy inhibitors), effects at indicated doses on cell lines were firstly determined by MTT viability assay. Then ATP viability assay was used to confirm MTT results.
Flow cytometry and M30 antigen method was used to determine the mode of cell death (apoptosis/necrosis/autophagy) responsible for the cytotoxicity in combinatorial treatments.
Apoptosis is supported by fluorescence images using triple staining method (Hoechst 33343, Annexin V, and Propidium iodide). Formation of acidic vesicular organelles was observed by fluorescence microscopy using acridine orange staining. Finally, protein expression levels associated to autophagy and cell death were determined by immunoblotting method and Luminex assay. As a conclusion, the combination of Pd (II) complex and autophagy inhibitors results to increased cytotoxic activity especially in metastatic prostate cancer cell line by inducing apoptosis. This combination may be a promising new treatment option. It was concluded that it is necessary to carry out further in vivo experiments.
Keywords: Prostate Cancer, Apoptosis, Autophagy, Palladium (II) Complex 2016, xii + 150 pages.
iii TEŞEKKÜR
Yüksek lisans çalışmalarımda danışmanlığımı yapan, eğitimimin düzenli işleyişi için büyük bir özveri gösteren ve her konuda desteğini benden esirgemeyen değerli hocam Sayın Doç. Dr. Ferda ARI’ya,
Yüksek lisans öğrenimimin her aşamasında sonsuz anlayış ve desteğiyle hep yanımda olan, benim için çok değerli olan bilgi ve tecrübeleriyle bana her daim yol gösteren, ilgi ve yardımlarını benden hiç eksik etmeyen değerli hocam Sayın Prof. Dr. Engin ULUKAYA’ya,
Çalışmalarım süresince bana her konuda yardımcı olan, sorularımı asla yanıtsız bırakmayan, hocalarım, Sayın Doç. Dr. Arzu YILMAZTEPE ORAL, Sayın Doç. Dr.
Serap ÇELİKLER KASIMOĞULLARI ve Sayın Yar. Doç. Dr. Egemen DERE’ye, Tez çalışmam boyunca bilgi, deneyim ve önerilerini benimle paylaşarak bana yol göstermiş olan tüm çalışma arkadaşlarıma,
Hayatım boyunca manevi anlamda her zaman yanımda olan benim canım dostlarım Burcu AZAK ve Burcu ÖZDAMAR GÜNGÖR’e,
Eğitimimin her aşamasında maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen ve hayatım boyunca hiçbir fedakârlıktan kaçınmayarak her zaman yanımda olan, bugünlere gelmemde en büyük emeğin sahibi, her zaman iyi ki benim babam dediğim sayın Hüseyin Nüvit ERKISA’ya, benim güleryüzlü her daim benimle olan canım annem İlknur ERKISA’ya ve yaşama daha sıkı tutunmamda en büyük payı olan benim en değerlim canım kardeşim Begüm ERKISA’ya sonsuz teşekkürü bir borç bilirim.
Merve ERKISA 03/06/2016
iv
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET………....i
ABSTRACT………...ii
TEŞEKKÜR………...iii
İÇİNDEKİLER………..iv
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ………...vii
ŞEKİLLER DİZİNİ………...ix
ÇİZELGELER DİZİNİ………....xii
GİRİŞ ... 1
1. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3
1.1. Prostat Kanseri ... 3
1.1.1. Hormonal Etkiler ... 5
1.1.1.1. Androjen ... 5
1.1.1.2. Prostat Spesifik Antijen (PSA) ... 6
1.1.2. Diyet ve Çevresel Faktörler ... 7
1.1.3. Genetik Faktörler ... 7
1.2. Prostat Kanseri Tedavi Yöntemleri ... 8
1.3. Prostat Kanseri Moleküler Biyolojisi ... 9
1.4. Apoptozis ... 10
1.4.1. Apoptozis-Nekrozis ... 11
1.4.2. Kaspazların Apoptozis Sürecindeki Rolü ... 14
1.4.3. Mitokondrinin Apoptozis Sürecindeki Rolü ... 16
1.4.4. Bcl-2 Ailesinin Apoptozisdeki Rolü ... 16
1.4.5. Apoptozisin Mekanizmaları ... 18
1.4.5.1. Ekstrinsik (Dışsal) Yolak ... 18
1.4.5.2. İntrinsik (İçsel) Yolak ... 20
1.4.5.3. Endoplazmik Retikulum Aracılı Apoptozis Oluşturulması ... 22
1.5. Apoptozis-Karsinogenez İlişkisi ... 22
1.6. Otofaji ... 24
1.6.1. Otofajinin Fizyolojik ve Patolojik Görevleri ... 26
1.6.2. Otofajinin Moleküler Mekanizması ... 27
1.7. Otofaji-Apoptozis İlişkisi ... 30
1.8. Hücre Ölümü ve Sağ Kalımı ile İlişkili Sinyal Yolakları ... 32
1.8.1. mTOR Sinyal Yolağı... 32
1.8.2. PI3K/Akt Sinyal yolağı ... 33
1.8.3. Otofaji ve Apoptotik Yolak Arasındaki Önemli Oyuncular: Bcl-2 ve Bcl-xL ... 34
1.9. Metal Bazlı Bileşikler ... 35
1.9.1. Palladyum (II) Bileşiklerinin Kanser Tedavisindeki Yeri ... 35
1.9.2. Palladyum (II) Bileşiklerinin DNA Üzerindeki Etki Mekanizması ... 39
1.9.3. Tez Çalışmasında Kullanılan Palladyum (II) Bileşiğinin Biyokimyasal Yapısı ... 40
2. MATERYAL ve YÖNTEM ... 42
2.1. Materyal ... 42
2.1.1. Kimyasal maddeler... 42
2.1.2. Sarf malzemeler ... 43
v
2.1.3. Cihazlar ... 43
2.2. Yöntemler ... 44
2.2.1. Uludağ Üniversitesi Tarafından Sentez Edilen Pd (II) [[Pd(bpma)(barb)]Cl.H2O] Bileşiğinin Hazırlanması ... 44
2.2.2. İnhibitörlerinin Hazırlanması ... 44
2.2.3. Hücre kültürü ... 44
2.2.3.1. Hücre Soylarının Stoktan Çıkartılması ... 45
2.2.3.2. Hücre Soylarının Pasajlanması ... 45
2.2.3.3. Hücre Soylarının Stoklanması... 46
2.2.3.4. Kullanılan Besiyerinin Hazırlanması ... 46
2.2.3.5. Hemositometre ile Hücrelerin Sayımı ... 46
2.2.4. MTT (Metiltiazotetrazolium) Canlılık Metodu ... 47
2.2.5. ATP (Adenozin Trifosfat) Canlılık Metodu ... 49
2.2.6. Floresan Boyama Yöntemi ile Ölüm Modunun Belirlenmesi ... 50
2.2.6.1. Anneksin-V Boyama Metodu ... 50
2.2.7. M30-Antijen Testi ile Ölüm Modunun Belirlenmesi ... 53
2.2.8. Akım Sitometri Analizleri ... 54
2.2.8.1. Kazpaz 3/7 Testi ... 54
2.2.8.2. Anneksin-V Testi ... 56
2.2.8.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi ... 57
2.2.8.4. Gamma H2A.X Aktivasyonu ile DNA Hasarının Belirlenmesi ... 58
2.2.8.5. Oksidatif Stres Belirlenmesi ... 61
2.2.8.6. LC3-II Belirlenmesi ... 62
2.2.8.7. PI3K (Fosfatidilinositol 3 kinaz) Aktivasyonunun Belirlenmesi ... 64
2.2.9. Akridin Boyama ... 66
2.2.10. Lumineks uygulaması ... 67
2.2.11. Western Blot Analizi ... 67
2.2.10.1. Protein İzolasyonu ... 70
2.2.10.1.1. Çözeltiler ... 70
2.2.10.2. Proteinlerin Biçinkoninik asit (BCA) Yöntemi ile Konsantrasyonlarının Ölçülmesi ... 70
2.2.10.2.1. Çözeltiler ... 70
2.2.10.2.2.BSA Standartlarının Hazırlanması ... 71
2.2.10.2.3. BCA Ölçümünün Yapılması ... 71
2.2.10.3. Western Blot Yöntemi ile Proteinlerin Nitroselüloz Membrana Aktarılması... 71
2.2.10.3.1. Çözeltiler ... 71
2.2.10.3.2. Proteinlerin Yüklenmesi ve Jelde Yürütülmesi... 72
2.2.10.3.3. Proteinlerin Transferi ... 72
2.2.10.3.4. Proteinlerinin Belirlenmesi ... 72
2.2.10.3.4.1. Bloklama ... 72
2.2.10.3.4.2. Birincil Antikor ... 73
2.2.10.3.4.3. İkincil Antikor ... 73
2.2.10.3.4.4. Görüntüleme ... 73
2.2.10.3.4.5. Birincil ve İkincil Antikorların Membrandan Uzaklaştırılması... 73
vi
2.2.11. İstatistiksel Analiz ... 74
3. BULGULAR ... 75
3.1. MTT Canlılık Testi Bulguları ... 75
3.2. ATP Canlılık Testi Bulguları ... 86
3.3. Anneksin-V Boyama Yöntemi Bulguları ... 89
3.4. M30 Antijen (Kaspazla Kırılmıs Sitokeratin 18) Bulguları ... 95
3.5. Akım Sitometri Bulguları ... 97
3.5.1. Kaspaz 3/7 Testi ... 97
3.5.2. Anneksin-V Değerlendirilmesi ... 101
3.5.3. Mitokondri Membran Potansiyel Değişiklikleri ... 104
3.5.4. DNA Hasarının Belirlenmesi ... 105
3.5.5. Oksidatif Stresin (ROS) Belirlenmesi ... 107
3.5.6. Önemli Bir Otofaji Proteini Olan LC3-II Seviyesinin Belirlenmesi ... 109
3.5.7. PI3K Aktivasyonunun Değerlendirilmesi ... 110
3.6. Aktif Lizozom Boyaması (Akridin) ... 112
3.7. Lumineks Bulguları ... 114
3.8. Western Blot Bulguları ... 116
4. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 121
KAYNAKLAR DİZİNİ ... 133
ÖZGEÇMİŞ ... 155
vii
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ (A-diol-g): Androstenidol glukuronide
3-MA:3-Metiladenin 5-FU:5-Flurourasil
7-AAD : 7-Aminoaktinomisin D
AIF : Apoptozis indükleyici faktör (Apoptosis inducing factor) Apaf-1 :Apoptotik proteaz aktive eden faktör
AR:Androjen reseptörü
ASAP:Atipik küçük asiner proliferasyon
ATP :Adenozin trifosfat (Adenosine triphosphate) ATP:Adenozin Trifosfat
BCA:Biçinkoninik asit BH:Bcl-2 homoloji bölgeleri BSA:Sığır serum albümin
CAD :Kaspaz aktive edici DNaz CK18:Sitokeratin 18
DAPK:Ölüm ilişkili protein kinaz DD :Ölüm alanı (Death domain) DHEA:Dehidroepiandrosteron DHT:Dihidrotestosteron
DISC :Ölüm indükleyici sinyal kompleksi (Death inducing signalling complex) DMSO:Dimetilsulfoksit
DNA :Deoksi ribonükleik asit (Deoxyribonucleic acid)
DNA-PK :DNA bağımlı protein kinaz (DNA-dependent Protein Kinase) EDTA :Etilen Diamin Tetraasetik Asit
EGFR :Epidermal büyüme faktör reseptörü(Epidermal growth factor receptor) ER:Endoplazmik retikulum
FADD :Fas ilişkili ölüm alanı (Fas associated death domain) FBS :Fetal sığır serumu (Fetal bovine serum)
FITC : Fluoresin izotiyosiyanat GST:Glutatyon S-transferaz GTP :Guanozin trifosfat
ICAD :Kaspazla aktive edilmiş
viii IGF :İnsülin benzeri büyüme faktörü
Kbp:Klikobaz çifti kDa:KiloDalton
MOMP:Mitokondri dış membran permeabilizasyonu mTOR:Rapamisin hedefi (Target of rapamycin) MTT:Metilltiazoldifeniltetrazolyum bromür NAC:N-asetil-L-sistein
PARP :Poli(ADP-riboz)polimeraz (Poly ADP-ribose polymerase) PBS :Fosfat tuz tamponu (Phosphate buffered saline)
PBS:Fosfat tamponlu tuz çözeltisi
PCR :Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR; polymerase chain reaction) Pd :Palladyum
PerCP: Peridinin klorofil
PI :Propidyum iyodür (Propdium iodide) PIN:Prostatik epitelyal neoplazi
PS :Fosfatidil serin (phosphatidylserine) PSA:Prostat spesifik antijen
Pt :Platin
PTEN:Fosfataz ve tensin homolog proteini Rb :Retinoblastoma
RNA :Ribo nükleik asit (Ribonucleic acid) ROCK1:Rho ilişkili sarmal oluşturan kinaz 1 ROS:Reaktif oksijen türleri
RPMI :Roswell Park Memorial Institute Medium SDS :Sodyum dodesil sülfat (Sodium dodecyl sulfate) SDS-PAGE:SDS- Poliakrilamid Jel Elektroforezi SHBG:Seks hormon bağlayıcı globülin
SRB :Sulforhodamine B TCA :Trikloroasetik asit
TdT :Terminal deoksinükleotidil transferaz TNF :Tümör nekrozis faktör
TRAIL :TNF-ilişkili apoptozis indükleyici ligand VEGF:Vasküler endotelyal büyüme faktörü z-VAD-FMK: Genel kaspaz inhibitörü
ix
ŞEKİLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 1.1. Prostat bezinin şematik görüntüsü ... 3
Şekil 1.2. Erkekler arasında yıla bağlı kanser ölüm oranları, Amerika Birleşik Devletleri, 1930-2007. ... 4
Şekil 1.3. Apoptotik hücre ile nekrotik hücrenin morfolojik açıdan farkı. ... 12
Şekil 1.4. Apoptozis ve Nekrozun şematik karşılaştırılması ... 13
Şekil 1.5. Kaspazların aktifleşme mekanizması ... 14
Şekil 1.6. Başlatıcı ve efektör kaspazlar. ... 15
Şekil 1.7. Apoptozisin mitokondri yolunda yer alan Bcl-2 ailesi üyeleri. ... 17
Şekil 1.8. Apoptozom oluşumu ve kaspaz aktivasyonu. ... 18
Şekil 1.9. Reseptör aracılı kaspaz aktivasyonu. ... 20
Şekil 1.10. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması. ... 21
Şekil 1.11. Kanser hücresinin özellikleri. ... 23
Şekil 1.12. Otofajinin gerçekleşme mekanizması. ... 25
Şekil 1.13. Otofaji Mekanizmaları. ... 26
Şekil 1.14. Otofajinin düzenlenmesi ... 29
Şekil 1.15. mTOR sinyal yolağı. ... 33
Şekil 1.16. PI3K/AKT yolağı ... 34
Şekil 1.17. Palladyum (II) bileşiğinin kimyasal yapısı ... 41
Şekil 2.1. MTT reaksiyon şeması. ... 47
Şekil 2.2. ATP elde edilme reaksiyonu. ... 49
Şekil 2.3. Apoptotik hücrelerde fosfotidil serin translokasyonu ... 52
Şekil 2.4. Kaspaz 3/7 Aktivitesinin Ölçülmesi ... 55
Şekil 2.5. Anneksin-V Boyama ... 57
Şekil 2.6. Mitokondri Membran Potansiyelinin Ölçülmesi ... 58
Şekil 2.7. DNA Hasarının (γ-H2AX) Ölçülmesi (Anonim 2013d). ... 60
Şekil 2.8. Oksidatif Stres Miktarının (ROS) Ölçülmesi ... 62
Şekil 2.9. LC-3 miktarının belirlenmesi ... 64
Şekil 2.10. PI3K/AKT sinyal yolağı ... 65
Şekil 2.11. p-Akt (Ser473) düzeyinin ölçülmesi ... 66
Şekil 2.12. Western Blot Aşamalarının Şematik Gösterimi ... 69
Şekil 3.1. PC-3 ve LNCaP hücre soylarının faz görüntüleri ... 75
Şekil 3.2. Pd (II) bileşiği uygulanan LNCaP (A), PC-3 (B) ve PNT1A (C) hücre soylarının canlılık yüzdelerinin grafiği. Her bir veri noktası 3 bağımsız çalışmanın ortalamasını temsil etmektedir. ... 77
Şekil 3.3. Otofaji inhibitörleri uygulanan LNCaP (A), PC-3 (B) ve PNT1A (C) hücre soylarının canlılık yüzdelerinin grafiği ... 81
Şekil 3.4. Rapamisin’in (0,3-20 µM) LNCaP (A) ve PC-3 (B) insan prostat kanseri hücrelerinin canlılığa etkisinin doza bağlı olarak değisimi... 82
Şekil 3.5. Pd(II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile kombinasyon tedavisi sonucu LNCaP (A) ve PC-3 (B) hücrelerinin canlılık yüzdelerinin grafiği ... 86
Şekil 3.6. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile kombinasyon tedavisi sonucu LNCaP (A) ve PC-3 (B) hücrelerinin canlılık yüzdelerinin grafiği. ... 87
x
Şekil 3.7. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon tedavisi sonucu PNT1A hücresinin canlılık yüzdelerinin grafiği ... 88 Şekil 3.8. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon LNCaP hücrelerinde 12 saatlik tedavi sonrası floresan mikroskop
görüntüleri. ... 90 Şekil 3.9. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon LNCaP hücrelerinde 24 saatlik tedavi sonrası floresan mikroskop
görüntüleri ... 91 Şekil 3.10. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon PC-3 hücrelerinde 12 saatlik tedavi sonrası floresan mikroskop
görüntüleri. ... 93 Şekil 3.11. Pd (II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon PC-3 hücrelerinde 24 saatlik tedavi sonrası floresan mikroskop
görüntüleri. ... 94 Şekil 3.12. LNCaP ve PC-3 hücre soyları ile yapılan çalışmanın M30-Antijen standart eğri grafiği ... 95 Şekil 3.13. Pd(II) bileşiği, Klorokin, 3-MA ve inhibitörlerin Pd (II) bileşiği ile
kombinasyon tedavilerinin 48 saatte LNCaP (A) ve PC-3 (B) hücre soylarında M30 seviyeleri üzerine etkisi. ... 96 Şekil 3.14. Klorokin (5µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve
klorokin kombinasyonunun LNCaP insan prostat kanseri hücrelerinde kaspaz 3/7 değerlendirmesi ile elde edilen apoptotik yüzde değerlerinin 24 (A) ve 48 (B) saatlik histogramları ... 98 Şekil 3.15. Klorokin (5µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5µM) ve
klorokin kombinasyonunun PC-3 prostat kanseri hücrelerinde kaspaz 3/7
değerlendirmesi ile elde edilen apoptotik yüzde değerlerinin 24 (A) ve 48 (B) saatlik histogramları ... 99 Şekil 3.16. Pan-kaspaz inhibitörü ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin (5 µM) kombinasyonunun LNCaP (A) ve PC-3 (B) prostat kanseri
hücrelerinde canlılık yüzdelerinin grafiği. ... 101 Şekil 3.17. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5µM) ve
klorokin kombinasyonunun LNCaP prostat kanseri hücrelerinde Anneksin-V
değerlendirmesi ile elde edilen apoptotik yüzde değerlerinin 24 (A) ve 48 (B) saatlik histogramları ... 102 Şekil 3.18. Klorokin (5µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12.5µM) ve
klorokin kombinasyonunun PC-3 prostat kanseri hücrelerinde Anneksin- V
değerlendirmesi ile elde edilen apoptotik yüzde değerlerinin 24 (A) ve 48 (B) saatlik histogramları ... 104 Şekil 3.19. Klorokin (5µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12.5µM) ve
klorokin kombinasyonunun LNCaP (A) ve PC-3 (B) prostat kanseri hücrelerinde mitokondri membran potansiyel değişimi yüzde değerlerinin 12 saatlik histogramları ... 105 Şekil 3.20. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP prostat kanseri hücrelerinde p-γH2AX yüzde
değerlerinin 24 saatlik histogramı ... 106 Şekil 3.21. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun PC-3 prostat kanseri hücrelerinde p-γH2AX yüzde
xi
değerlerinin 24 saatlik histogramı (Q1= γH2AX, Q2= p-γH2AX, Q3= γH2AX eksprese etmeyen) ... 107 Şekil 3.22. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP (A) ve PC-3 (B) prostat kanseri hücrelerinde ROS yüzde değerlerinin 24 saatlik histogramı. ... 108 Şekil 3.23. ROS süpürücüsü olarak bililinen N-asetil-L-sistein (NAC) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun PC-3 prostat
kanseri hücrelerinde canlılık yüzdelerinin grafiği... 109 Şekil 3.24. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP (A) ve PC-3 (B) insan prostat kanseri hücrelerinde LC3-II ifadesinin 24 saatlik histogramı. ... 110 Şekil 3.25. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP prostat kanseri hücrelerinde p-AKT yüzde
değerlerinin 48 saatlik histogramı (Q1=AKT, Q2=p-AKT, Q3=AKT eksprese etmeyen) ... 111 Şekil 3.26. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP prostat kanseri hücrelerinde p-AKT yüzde
değerlerinin 48 saatlik histogramı (Q1=AKT, Q2=p-AKT, Q3=AKT eksprese etmeyen) ... 112 Şekil 3.27. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP prostat kanseri hücrelerinde akridin boyama
sonuçlarının 48 saatlik floresan mikroskop görüntüleri ... 113 Şekil 3.28. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun PC-3 prostat kanseri hücrelerinde akridin boyama
sonuçlarının 48 saatlik floresan mikroskop görüntüleri ... 114 Şekil 3.29. Klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun LNCaP ve PC-3 prostat kanseri hücrelerinde lumineks yöntemi ile CREB (A), p70s6K (B) ve p38 (C) protein seviyeleri ... 116 Şekil 3.30. LNCaP prostat kanseri hücrelerinde, klorokin (5 µM) ile ön tedavi
sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun 24 ve 48 saat sonrasında Atg5, p62, Beclin1 (BECN1), LC3-I ve LC3-II protein ekspresyonlarının Western blot yöntemiyle alınan sonuçları ... 117 Şekil 3.31. LNCaP prostat kanseri hücrelerinde, klorokin (5 µM) ile ön tedavi
sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun 24 ve 48 saat sonrasında RIP, P-JNK, P-c-JUN, Pro-kaspaz 8, Fas, Pro-kaspaz 3, PARP ve kırılmış PARP protein ekspresyonlarının Western blot yöntemiyle alınan sonuçları ... 118 Şekil 3.32. PC-3 prostat kanseri hücrelerinde, klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun 24 ve 48 saat sonrasında Atg5, p62, Beclin1 (BECN1), LC3-I ve LC3-II protein ekspresyonlarının Western blot
yöntemiyle alınan sonuçları ... 119 Şekil 3.33. PC-3 prostat kanseri hücrelerinde, klorokin (5 µM) ile ön tedavi sonrasında Pd (II) bileşiği (12,5 µM) ve klorokin kombinasyonunun 24 ve 48 saat sonrasında RIP, P-JNK, P-c-JUN, Pro-kaspaz 8, Fas, Pro-kaspaz 3, PARP ve kırılmış PARP protein ekspresyonlarının Western blot yöntemiyle alınan sonuçları ... 120
xii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 3.1. Pd (II) bileşiği uygulanan hücre soylarında MTT canlılık testi sonuçlarına göre 48 saat tedavi süresindeki IC50 ve IC 90 değerleri…………77
1 GİRİŞ
Günümüzde, mevcut ilaçlar ile kanser kemoterapisi yetersiz kalmakta ve birçok kanser türünde tam bir tedavi sağlanamamaktadır. Bu nedenle kanseri önleyici yeni ilaç geliştirme çalışmaları heyecan ve umut vaad eden bir alan olarak karşımıza çıkmaktadır.
Bu yeni yaklaşımlar, kanser tedavisinin gelişmesi, yeni hedeflerin ve yaklaşımların çoğalması için yeni bir kapı açmıştır.
Prostat kanseri tedavilerindeki temel amaç sağ kalımı uzatmak ve hastaların sağlığı için yüksek yan etki oranlarını en aza indirgemektir. Bu durum nedeniyle yeni kemoterapötik ajanlar ve hedefe yönelik tedaviler büyük bir merak ve araştırma konusu haline gelmektedir. Çeşitli kemoterapi tedavilerinin hormon dirençli prostat kanserinde sağ kalıma etkisinin gösterilmesiyle bir çok yeni kemoterapotik ajanın tek başlarına veya kombine olarak kullanımları araştırılmaya başlanmıştır.
Son yıllarda kanser tedavisinde kullanılan metal bileşiklerin çeşitli kanser türlerine karşı umut verici etkilerinden dolayı ilaç olarak kullanımı yaygınlaşmıştır (Abu-Surrah ve ark. 2008, Ferraz ve ark. 2009, Garoufis ve ark. 2009, Ulukaya ve ark. 2011b). Platin (Pt) ve palladyum (Pd) gibi metal bileşiği içeren antikanser ajanların DNA’da iplikler arası çapraz bağların, DNA adductlarının oluşumuna yol açarak sitotoksik ve apoptotik aktiviteyi modüle ettiği bildirilmektedir (Zhu ve ark. 2009). Bu metal bileşiklerden olan Pd; antifungal, antiviral, antitümör ve antibakteriyal etkilere sahiptir. Bu yapıdaki kimyasalların suda kolay çözünebilmeleri, membranlardan kolayca geçip ve hücre içerisine DNA’ya bağlanabilmeleri, ayrıca yan etkilerinin daha az olması tercih edilmelerine neden olmaktadır (Abu-Suurah ve ark. 2008). Yapılan çalışmalarda Pd (II) bileşiklerinin kanser hücrelerinde hücre ölümünü arttırarak apoptozise neden oldukları gösterilmiştir (Keter ve ark. 2008, Miklasova ve ark. 2009, Guney ve ark. 2011b, Ferraz ve ark. 2011). Pd (II) bileşiklerinin bu sitotoksik etkiyi DNA’da yüksek düzeyde hasarlar oluşturarak yaptıkları da belirtilmiştir (Miklasova ve ark. 2009).
Otofajinin genellikle hücrenin hayatta kalımı ile ilgili bir mekanizma olduğu düşünülse de son yıllardaki çalışmalar otofajinin, hücre hayatta kalımı ve ölümü arasındaki karmaşık dengede önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Prostat kanseri hücreleri üzerinde yapılan araştırmalar otofajinin genellikle bir hayatta kalma mekanizması olarak rol aldığını göstermektedir (Hallgren ve ark. 2008). Otofaji tetikleyici veya inhibitörlerinin kemoterapötik ajanlarla birlikte kombine edildiği durumlarda kanser
2
tedavisinde daha etkili bir yaklaşımın gerçekleştiği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Bauvy ve ark. 2001, Cao ve ark. 2006, Herman- Antosiewicz ve ark. 2006, Li ve ark.
2009). HT-29 kolon kanser hücre soylarında otofaji inhibitörü olan 3-Metiladenin (3- MA)’nin 5-Florourasil (5-FU)’in tek başına olan etkisini arttırarak hücreleri apoptoza teşvik ettiği gösterilmiştir (Li ve ark. 2009). Başka bir çalışmada kolorektal kanser hücrelerinde otofaji inhibitör kullanımı ya da önemli otofaji proteinlerinin (BECN1, Atg5) susturulması ile oksaliplatinin sitotoksik aktivititesinin arttığı gözlemlenmiştir (Selvakumaran ve ark. 2013). Metastatik prostat kanser hücrelerinde tirozin kinaz inhibitörlerini etkilerinin otofaji inhibitörü kullanılarak ya da genetik olarak önemli otofaji proteinlerin baskılanması ile arttığı bulunmuştur (Wu ve ark. 2010). Enzalutamid dirençli prostat kanser hücrelerinde otofajinin bloke edilmesinin hücre canlılığını azalttığı ve apoptotik hücre ölümüne neden olduğu görülmüştür (Nguyen ve ark. 2014).
Elde edilen bilgiler doğrultusunda bu tez çalışmasında, Uludağ Üniversitesi Fen- Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Anorganik Araştırma Grubu tarafından sentezlenmiş Palladyum (II) bileşiğinin [[Pd(bpma)(barb)]Cl.H2O] otofaji inhibitörleri ile olan kombinasyonunun LNCaP ve PC-3 insan prostat kanseri ve PNT1A sağlıklı prostat hücre soyları üzerindeki olası sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılmıştır.
3 1. KAYNAK ÖZETLERİ
1.1. Prostat Kanseri
Prostat, erkeklerde mesanenin hemen alt kısmında bulunan 18-20 gr ağırlığındaki küçük bir salgı bezidir. Erkek üretrasını saran ve mesane boynu ile devam eden prostat bezi, 2.5 cm uzunluğunda, sıkıştırılmış ve ters yüz edilmiş konik bir yapıdadır (Şekil 1.1) (Anafarta 2007). Prostatın temel işlevi semen üretimine yardımcı olmaktır.
Şekil 1.1. Prostat bezinin şematik görüntüsü (Anonim 2016b).
Prostat kanseri ise, prostat bezindeki hücre proliferasyonu ve hücre ölümü arasındaki dengenin bozularak, organ hacminin malign (kötü huylu) büyümesi olarak tanımlanabilir. Erkeklerin sağlığını önemli derecede etkileyen prostat kanseri dünyada görülen en yaygın altıncı kanser türüdür. Prostat kanseri insidansı yaş ile artabilen ve erkekler arasında akciğer kanserinden sonra kansere bağlı ölümler arasında ikinci sırada yer almaktadır (Şekil 1.2) (Gronberg 2003, Nahleh 2006). Türkiye’de sağlıklı bir istatistik sonucu bulunmamakla birlikte Sağlık Bakanlığı’nın yaptığı araştırmaya göre prostat kanserinin ülkemizde görülme sıklığı 6-7. Sıradadır (Kaygusuz ve ark. 2007).
4
Şekil 1.2. Erkekler arasında yıla bağlı kanser ölüm oranları, Amerika Birleşik Devletleri, 1930-2007 (Desantis ve ark. 2011).
Prostat kanseri pek çok tip göstermektedir. Bunlar; adenokarsinoma, musinöz adenokarsinoma, prostatik duktal adenokarsinoma, saf küçük hücreli adenokarsinoma, skuamoz ve adenoskuamoz kanserler, sarkomatid karsinoma (karsinosarkom), transizyonel hücreli kanserler, malign mezenşimal tümörler, prostatik epitelyal neoplazi (PIN), atipik küçük asiner proliferasyon (ASAP)’dır. Bunlardan en sık görüleni %98 görülme sıklığı ile adenokarsinomlardır (Baltacı 2007).
Epidemiyolojik gözlemlere dayanarak prostat kanserinde en azından 3 etiyolojik faktörden söz edilmektedir. Bunlar;
Hormonal etkiler,
Diyet ve çevresel faktörler,
Genetik faktörler.
Prostat kanserinin neden ortaya çıktığı kesin olarak bilinmemekle beraber erkeklerde ileri yaşlarda görülen bir hastalık olup 40 yaşın altında nadiren görülmektedir. Yaş arttıkça prostat kanseri gelişme riski artmakta, % 85’i 65 yaşın üzerindeki erkeklerde saptanmaktadır. Prostat kanserinin küresel insidansına bakılacak olunursa siyah ırklarda beyaz ırklara göre prostat kanseri görülme olasılığı daha yüksektir (Dirican 2005).
Sigara ve alkol kullanımının prostat kanseri üzerindeki etkisi açısından tam bir görüş birliği bulunmamaktadır. Ancak sigaranın tüm kanserler ile doğrudan %80 oranında
5
ilişkisinin olduğu bilinmektedir. Bu konu ile ilgili pozitif ve negatif etkilerini bildiren prospektif çalışmalar bulunmaktadır (Reiter ve Dekernion 2005).
Fazla alkol tüketiminin testosteron düzeyini azalttığı bilinmektedir. Bu yüzden alkolün prostat kanseri riskini azaltabileceği öne sürülmektedir (Breslow ve ark. 1999).
Prostat kanseri hücrelerinin çoğu hormonlara karşı duyarlıdır ve erkek hormonlarının bulunduğu ortamda hızla çoğalır. 2004 yılında sıçanlarda yapılan bir çalışmada testosteron hormonun kanser oluşumunu teşvik ettiği de gösterilmiştir (Emil ve ark.
2004).
1.1.1. Hormonal Etkiler 1.1.1.1. Androjen
Prostat kanserinin gelişimi ve ilerlemesi androjenler tarafından etkilenmektedir.
Androjenler; testosteron, androstenedion, dihidrotestosteron (DHT), dehidroepiandrosteron (DHEA) gibi erkek cinsiyet hormon topluluğudur (Jonsson ve ark. 2009).
Testosteron (T), testislerden sentezlendikten sonra pasif difüzyon yolu ile hedef doku hücresine girer. Hücre içindeki testosteron, steroid 5α-redüktaz enzimi ile ya DHT’ye dönüşür ya da ekstradiole aromatize olur. Ortamdaki testosteron ve DHT hücre çekirdeğindeki transkripsiyon düzenleyici faktörlerinden steroid-tiroid-retinoid ailesinin üyesi olan reseptöre bağlanmak için bir yarışa girerler ve bunların reseptöre olan ilgisi aynıdır. Bu reseptör hormon kompleksi genin düzenleyici bölgesine bağlanarak transkripsiyonun düzenlenmesini sağlamaktadır. Testosteron ve DHT aynı reseptöre bağlanmasına rağmen bunların fizyolojik etkileri farklıdır (Miyamoto ve ark.1993).
Yapılan bir araştırmada, Afroamerikanlarda prostat kanseri insidansının yüksek olmasının, dolaşımdaki androjen seviyesi ile ilişkili olduğunu ileri sürülmüştür Ayrıca genç Afroamerikalıların Japon erkeklere göre 3α, 17β- androstenoidol glukuronide ve androstenidol glukuronide (A-diol-g) gibi androjen metabolitlerinin serumda daha yüksek düzeyde olduğu gösterilmiştir. Bu metabolitlerin, testosteronun 5α-redüktaz ile dihidrotestosteron (DHT)’a dönüşüm düzeyini yansıttığını inanılır ve total testosterona göre intraprostatik androjen aktivitesini göstermede daha iyi bir markır olabilecekleri düşünülmektedir (Ross ve ark. 1986).
Prostat kanseri riskinin yüksek androjen seviyesi ile ilişkili olup olmadığı hakkında çok sayıda çalışma yapılmıştır. Prostat kanser riski ile androjen seviyeleri üzerine prospektif
6
çalışmalar düzenlemiş ve testosteron, seks hormon bağlayıcı globulin (SHBG) ya da 5α- redüktaz ile prostat kanseri arasında bir ilişki bulunamamıştır (Barrett-Cannor ve ark.
1990, Guess ve ark. 1997). Bunun aksine, Gann ve ark. (1996), çalışmalarında testosteron seviyesindeki artış ile prostat kanserinde anlamlı bir artış gözlemlemişlerdir.
Ayrıca bu araştırmacılar, prostat kanser riski ile SHBG arasında ciddi bir ters ilişki bulmuşlardır. Yine aynı çalışmacılar testosteron/DHT oranı ve androstenodiol glukuronide düzeyleri ile artmış 5α-redüktaz aktivitesine sahip erkeklerde, prostat kanseri riskinde ciddi bir artış eğilimi olduğunu bildirilmişlerdir. Prostat kanserinin hormonal habercileri hakkında önceden yayınlanmış çalışmaların meta-analizi, total testosteron seviyesinin yüksek olduğu erkeklerde prostat kanseri gelişme olasılığının 2.34 misli yüksek olduğu sonucunu ortaya koymaktadır (Reiter ve Dekernion 2005).
Fakat androjen ve androjen metabolitlerinin prostat kanser riskine katkısının derecesi halen tartışmalıdır. Bu çalışmalar, çok sayıda teknik ve teorik sorulardan etkilenmektedir. Birincil olarak, tüm androjen düzeyinin ölçümü, dolaşımda olan testosteron düzeyindeki ciddi değişikliklerle etkilenmektedir. İkincil olarak, prostatın karşı karşıya kaldığı androjen hormonların güvenilir şekilde ölçülmesi güçtür. Üçüncül olarak, bir erkeğin hayatı boyunca androjenlere erken ya da geç maruz kalmasının kritik olup olmadığı ya da konsantrasyonunda zamanla oluşan değişikliklerin önemi bilinmemektedir (Reiter ve Dekernion 2005). Prehn (1999) yaptığı çalışmada prostat kanserinin, düşük androjen seviyesi nedeni ile ya da yaşlanmaya bağlı androjen seviyesinde azalma sonucu ortaya çıkabileceğini ileri sürerken diğer çalışmacılar, androjen östrojen dengesinin prostat karsinogenezi için önemli olduğunu ileri sürmüşlerdir.
1.1.1.2. Prostat Spesifik Antijen (PSA)
PSA, prostat hücreleri tarafından salgılanan 33.000 dalton molekül ağırlığında bir glikoproteindir. Bir serin proteazdır ve semenin sıvılaşmasına yardımcı olmaktadır. PSA prostat kanseri tanısında, evrelemesinde ve hastaların izleminde kullanılan en önemli tümör belirleyicisidir (Gsur ve ark. 2003). Genç yetişkinlerde, PSA’nın normal değerleri 0-4 ng/ml arasındadır. Prostat kanserinde PSA üretimi değişkendir ve farklılaşmanın derecesine bağlıdır. İyi farklılaşmış kanser dokusu daha fazla, farklılaşmamış kanser dokusunda ise daha az miktarlarda PSA üretilmektedir (Emil ve ark. 2004). PSA her ne
7
kadar prostat organına özelleşmiş olsa da tüm prostat epitel hücreleri, normal- hiperplastik veya infekte, PSA salgılayabilir. Bu nedenlerle, prostat kanseri ile ilgili yeni bio-belirteçlerin bulunması ve geçerliliklerinin kanıtlanması gerekmektedir.
1.1.2. Diyet ve Çevresel Faktörler
50 yaş üstü erkeklerde sıklıkla karşılaşılan prostat kanseri nedenleri arasında diyet önemli bir yer tutmaktadır. Örneğin, yüksek oranda yağ alımının prostat kanseri insidansını arttırdığı düşünülmektedir. Yüksek yağ tüketimi hem in vitro hem de in vivo olarak prostat kanseri hücrelerinin proliferasyonunu uyarabilmektedir. Clinton ve ark.
(1988) prostat kanserinde, yağsız diyetin androjene bağımlı tümör hücrelerinin büyümesini azaltabileceğini göstermiştir. Yapılan başka bir çalışmada ise yüksek yağ içeren diyetin prostat kanser hücrelerinin büyümesine neden olduğunu ortaya koymuştur. Fakat tüm bu çalışmalara karşın yağın kansere yol açan asıl ajan olduğu kesin değildir. Bazı çalışmalarda yüksek kalsiyum tüketiminin prostat kanseri riskinde artışla ilişkili olduğu bulunmuştur. Fakat kalsiyumun prostat kanserine nasıl yol açtığı bilinmemekle beraber, yüksek kalsiyumun, vitamin-D üretimini azaltabileceği ve böylece hücre proliferasyonunu uyarabileceği hipotezi ortaya atılmıştır (Chan ve ark.
1998). Likopen, selenyum ve E vitamininin antioksidan etkileriyle kanserde potansiyel bir negatif faktör olduklarına dair çeşitli çalışmalar yapılmıştır (Schaid 2004; Gann 2002). İn vitro çalışmalarda, vitamin E’nin, prostat kanseri hücreleri üzerinde apoptotik ve antiproliferatif etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Finlandiya’da yapılan ve vitamin E’nin, sigara içenlerdeki kanser insidansına olan etkisini inceleyen bir çalışmada, plasebo (yalancı ilaç) ile karşılaştırıldığında, prostat kanseri insidansında %32 ve mortalitesinde ise %41’lik bir azalma gösterilmiştir (Heinonen ve ark. 1998).
1.1.3. Genetik Faktörler
Prostat kanseri görülme sıklığını etkileyen önemli faktörlerden biri de genetik yatkınlıktır. Prostat kanserinin ailevi yatkınlığı olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Babalarında ya da erkek kardeşlerinde prostat kanseri olan erkeklerin bu kansere yakalanma risklerinin oldukça fazla olduğu, meme ya da kolon kanserine
8
yakalanmış olan kişilerin aile yakınlarında da prostat kanseri riskinin yine daha fazla olduğu belirlenmiştir (Gsur ve ark. 2003).
Yapılan bazı çalışmalarda, bazı ailelerde prostat kanseri vakalarının daha fazla görüldüğü bilinmektedir. Prostat kanserine neden olan kuvvetli aday gen ya da genlerin (PTEN, AKT, P53, Bcl-2, E-Kaderin) hastalığın görülmesini %63-89 oranında artırdığı tespit edilmiştir (Gsur ve ark. 2003).
1.2. Prostat Kanseri Tedavi Yöntemleri
Erken evre prostat kanseri tedavisinde; cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi tedaviye yanıt veren önemli tedavi yöntemleridir. Hasta için uygun olan tedavinin seçiminde;
hastanın yaşam beklentisi, başka bir hastalığa sahip olup olmadığı, tümörün karakteristiği ve hastanın yaşam kalitesi gibi etmenler başlıca önemli rol oynamaktadır.
Prostat dışına invazyonu gerçekleşmiş olan kanserler de ise en öncelikli olan lokal tedavi yöntemi radyoterapidir. Tüm bunların dışında prostat kanseri tedavisinde hormonal tedavilerin önemli bir rolü bulunmaktadır. Buradaki amaç, prostat kanserini tetikleyen hormonları baskılayarak, kanser hücrelerinin çoğalmasını önlemektir. Ancak bu tedavi yönteminin bir takım dezavantajları bulunmaktadır. Bu tedaviler tek başlarına kullanıldıklarında, kanser hücreleri bunlara karşı zaman içinde direnç geliştirerek yeniden çoğalmaya başlayabilmektedir. Bu nedenle, bu tedavi yöntemi, genellikle radyoterapi öncesi ve sırasında, tümörün küçültülmesini sağlamak amacıyla, metastaz gibi durumlarda tercih edilmektedir. Hormona dirençli metastatik hastalarda kemoterapi ve hedefe yönelik tedaviler önem arz etmektedir (De Bono ve ark. 2010). Yapılan bir faz III çalışmasında dosetaksel içeren kemoterapi rejiminin sağ kalımı uzatabileceği gösterilmiştir (Tannock ve ark. 2004). Bir diğer faz II çalışmasında kapasitabin ve dosetaksel kombinasyonunun hastalarda sağ kalımı önemli ölçüde uzattığı görülmüştür (Vaishampayan ve ark. 2009). Etki mekanizması tam anlaşılmamış olsa da DNA ile interkalasyona girerek DNA’nın biyosentezini engellediği düşünülen doksorubisin ile bir alkile edici ajan olan siklofosfamid ile kombinasyonunda başarılı sonuçlar verdiği belirtilmektedir (Fornari ve ark. 1994). Etoposid, pirarubisin ve sisplatin kombinasyonlarının da PSA yanıtını %70’lere çektiği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Hudes ve ark. 1995, Small ve ark. 1996). Özellikle hormon dirençli prostat kanseri
9
vakalarında kemoterapötik ilaçlarla yeni kombinasyonları içeren tedavi rejimleri günümüzde gittikçe önem kazanmaktadır.
1.3. Prostat Kanseri Moleküler Biyolojisi
Prostat kanserli hastaların yaklaşık %10’unun genetik geçişli, %90’ından fazlasının sporadik olduğuna inanılmaktadır. Yüksek riskli bazı genlerin varlığı ile çevresel faktörler kombine edildiğinde prostat kanserine olan yatkınlık değişmektedir.
Prostat karsinogenezini ile ilişkili genetik değişiklikler, normal hücre büyümesi kontrolünü sağlayan mekanizmalardan, tümör baskılayıcı ve apoptozisi sağlayan mekanizmalara kadar geniş bir alanda etki göstermektedir.
Normal hücresel yaşlanma süreci kromozomların uçlarındaki telomer bölgelerinden progresif genetik materyal kaybıyla karakterizedir. Kök hücreler telomer kısalmasını bir revers transkriptaz olan telomeraz enzimi ile önler ve kayıp telomerik ünitin yerini alır.
Prostat kanserlerinin çoğunun telomerazı aşırı eksprese ettiği rapor edilmiştir (Sommerfeld ve ark. 1996).
Normal metabolizma sırasında, çevresel ya da diğer etkenler sonucu oluşan reaktif oksijen türleri (örn, serbest radikaller) oldukça mutajenik ve karsinojenik olabilirler.
Reaktif oksijen türleri, glutatyon-S-transferaz (GST), glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz gibi koruyucu enzimler tarafından inaktive edilirler. Bu enzimlerden biri olan GST-pi’nin ekspresyonunun, hemen hemen tüm prostat kanseri olguların kaybolduğu bildirilmiştir. Bu kayıp yeni mutasyonların gelişmesine neden olmakta ve bu durumun kanser gelişimine neden olabilmektedir. Bu genomik değişiklik prostat kanserinde en sık görülen ve hastalığı başlatıcı olaylardan biri olarak bildirilmiştir (Reiter ve Dekernion 2005).
Fosfataz ve tensin homolog proteini (PTEN)’deki değişiklikler hem lokalize hem de metastatik prostat kanserinde saptanmıştır. İleri evre tümörlerin yaklaşık yarısında PTEN allellerinde kayıp ya da mutasyon bulunmaktadır. Bazı çalışmalar, PTEN’in, Fosfatidilinositol 3 kinaz/ Protein Kinaz B (PI3 kinaz/AKT) sinyal yolunda negatif bir düzenleyici olduğunu göstermiştir (Stambolic ve ark. 1998). PI3 kinaz, epidermal büyüme faktörü düzenleyicisi (EGFR), İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) reseptörü ve her-2/neu gibi prostat kanserinin gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayan bazı büyüme faktörlerinin “downstream” hedefidir. PTEN’in normal fonksiyonu PI3 kinazı
10
defosforile ve inaktive etmektir. Prostat kanserinde, PTEN’in kaybı, PI3 kinaz ve sonrasında Akt ve onun “downstream” sinyallerinin aktivasyonuna bu durumda prostat kanserinin gelişimine yol açmaktadır (Reiter ve Dekernion 2005).
MYC onkogeni kromozom 8q24’de bulunur ve prostat kanserinin ilerlemesinde yer alan genlerden biridir. Bir çok metastatik prostat kanseri tümörlerinde fazla eksprese edildiği görülmüştür (Linja ve ark. 2001).
Bcl-2 apoptozisi önleyen bir onkogendir. Bcl-2 normal prostatda kök hücreler tarafından eksprese edilir. Aynı zamanda, özellikle androjen bağımsız tümörlerde oldukça fazla eksprese edildikleri gözlemlenmiştir (Raffo ve ark 1995). Bcl-2’nin inhibisyonunun prostat kanserinin potansiyel bir tedavi şekli olması açısından da araştırılmıştır (Reiter ve Dekernion 2005).
Önemli tümör süpresör genlerden biri olan p53 kaybı veya mutasyonu lokal ileri ve metastatik tümörlerde gösterilmiştir. Prostat kanserinde p53 protein ekspresyonu ile tanımlanan p53 mutasyonu, radyoterapi gören hastalarda kötü prognoz ile ilişkili bulunmuştur (Reiter ve Dekernion 2005). Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF), kanserler tarafından salınan en aktif proangiogenik gendir. VEGF prostat kanserlerinin çoğunda eksprese edilmektedir ve ekspresyonunda artış, tümörün klinik yaygınlığı ile korelasyon gösterir. VEGF, androjen tarafından düzenlenmektedir; bu da androjenlerin prostat kanserinin etkilemeleri açısından potansiyel bir yol olduğu belirtilmektedir (Latil ve ark. 2001). Metalloproteinazlar, prostat kanserinin invaziv bir duruma dönüşüm sürecinde hücresel matriksin parçalanmasında ve anjiogenezin uyarılmasında rol oynamaktadırlar. Reiter ve Dekernion (2005) çalışmalarında insan prostat kanseri örneklerinde birçok metalloproteinaz tipinin aşırı eksprese edildiğini saptamışlardır. Adhezyon moleküllerinden biri olan E-kaderin ekspresyonu, özellikle kötü diferansiye tümörlerde olmak üzere prostat kanserlerinin ciddi bir bölümünde azalmıştır. Metastatik prostat kanserinde E-kaderin ekspresyonunun düzeltilmesi, tümör oluşumunun engellenmesi ile ilişkili bulunmuştur (Reiter ve Dekernion 2005)
1.4. Apoptozis
Ökaryotik organizma hücreleri doğarlar, belirli bir süre yaşamlarına devam ederler ve daha sonra ölürler (Bowen 1988). Bu yaşam süresi hücre tipine göre değişim göstermektedir. Örneğin, bağırsak hücreleri 3-5 günlük bir yaşam süresinden sonra
11
ölürlerken, deri hücreleri 20-25 günlük bir süreden sonra ölmektedirler. Bunun aksine, miyokard kası hücreleri veya nöronlar ömür boyunca yaşarlar. Nöronların ölmesi ancak sinapsların tam olarak oluşmadığı dönemden önce olur ve doğumda aşırı sayıda görülen nöronların sayısı uygun sinaptik ağın sağlanabilmesi için azalır. Bahsedilen bu hücre ölümleri apoptozisle gerçekleşir. Apoptozis terimi ilk olarak 1972’de nekrozdan farklı olarak gerçekleşen diğer bir ölüm şekli için tanımlanmıştır ve fizyolojik hücre ölümünü ifade etmektedir. Aynı zamanda zamanı gelince ölen hücreler daha önceden proglamlanmış bir şekilde öldüklerinden dolayı, apoptozis programlı hücre ölümü olarak da adlandırılır. Eski bir yunan terimi olan apoptozis, kelime anlamı olarak da yaprakların ağaçtan, petallerin çiçekten doğal olarak düşmesi anlamına gelmektedir (Kerr ve ark. 1972).
Her saniye yaklaşık bir milyon hücre apoptozisle vücuttan uzaklaştırılmaktadır.
Bunların yerine yenileri yapılmaktadır. Yapım (mitozis) ile yıkım (apoptozis) arasında kontrollü bir denge vardır. İşte bu dengenin apoptozisin lehine veya aleyhine bozulması birçok önemli hastalığın patogenezine katkıda bulunmaktadır. Apoptozisin gereksiz yere oluştuğu veya hızlandığı hastalıklara örnek olarak AIDS, nörodejeneratif hastalıklar, insüline bağımlı tip diyabet, hepatit C infeksiyonu, miyokard enfarktüsü, ateroskleroz gibi hastalıklar verilebilirken apoptozisin yavaşladığı hastalıklara örnek olarak ise otoimmün hastalıklar ve kanser verilebilir (Fadeel ve ark. 1999, Evan ve Vousden 2001, Gewis 2003).
1.4.1. Apoptozis-Nekrozis
Apoptozis nekrozisden farklı bir ölüm şekli olup morfolojik olarak özgündür (Şekil 1.3). Nekrozis fizyolojik bir ölüm şekli olmamasına rağmen apoptozis hem fizyolojik hem de patolojik şartlar altında meydana gelmektedir.
12
Şekil 1.3. Apoptotik hücre ile nekrotik hücrenin morfolojik açıdan farkı (Fuchs ve ark.
2007).
Nekrozisde hücre içine aşırı sıvı girmesi sonucu hücre şişerken “cell swelling”, apoptotik hücre tam tersine küçülür “cell shrinkage”. Nekrozisde kromatin patterni hemen hemen normal hücredeki görüntüye benzerdir ama apoptotik hücrenin kromatini nükleus membranının çevresinde toplanır “chromatin aggregation” ve kondanse olur
“chromatin condensation”. Nekrotik hücrenin plazma membranı bütünlüğünü kaybeder ve hücre içinden dışına hücre içi materyallerinin çıkışı gerçekleşir. Oysa apoptotik hücre membranı intaktır ve üzerinde küçük cepcikler “membran blebs” oluşur (Şekil 1.4) (Ulukaya 2003).
13
Şekil 1.4. Apoptozis ve Nekrozun şematik karşılaştırılması (Anonim 2016a)
Nekrotik hücreler lizise uğrarken apoptotik hücreler küçük cisimciklere “apoptotik bodies” parçalanır. Apoptotik cisimcikler membranla kaplıdır değişen miktarlarda nukleus veya diğer hücre içi yapılar içerirler. Nekrozisde hücre içeriği dış ortama salındığından dolayı inflamasyon uyarılır ama apoptozisde apoptotik hücre veya cisimcikler komşu hücreler veya makrofajlar tarafından fagosite edildiklerinden inflamasyon oluşmaz. Apoptozisin en önemli özgün yönü DNA’nın internukleozomal bölgelerden yaklaşık 180-200 baz çifti veya bunun katları boyutunda DNA parçaları oluşturacak şekilde parçalanmasıdır. Bu durum agaroz jel elektroforezinde merdiven görüntüsü imajının “ladder pattern” ortaya çıkmasına neden olur. Ama bu durum hücre tipine bağlı olarak değişebilir ya da sadece yaklaşık 50 kilo baz çifti (kbp) boyutunda bir DNA fragmentasyonu da görülebilir. DNA’yı parçalayan bir Ca/Mg-bağımlı endonükleazdır. Ayrıca, DNase I ve II’de DNA parçalanmasından sorumludur. Hangi parçalayıcı enzimin rol alacağı hücre tipine ya da uyaranın özelliğine göre değişebilir.
Apoptotik hücrede görülen önemli değişikliklerden biri normalde plazma membranının iç yüzünde bulunan fosfatidilserin (PS)’in erken evrede membranın dış yüzüne doğru
14
transloke olmasıdır. Bu mekanizma apoptotik hücrelerin komşu hücreler ve makrofajlar tarafından tanınmasını sağlamaktadır (Ulukaya 2003).
1.4.2. Kaspazların Apoptozis Sürecindeki Rolü
Kaspazlar, hücrede inaktif (zimojen) olarak bulunan sistein proteazlardır ve aspartik asitten sonraki peptid bağını kırarak proteolitik olarak birbirlerini aktifleştirirler.
Memelilerde şu ana kadar en az 14 kaspaz tanımlanmıştır. Filogenetik analiz sonucunda gen ailesinin ICE (Kaspaz-1) ile ilişkili ve Ced-3 benzeri olmak üzere iki alt grubu olduğu görülmektedir. Proenzimlerin kısa (Kaspaz 3, 6, 7) veya uzun prodomain barındırmalarına göre de kaspazları daha alt gruplara ayırmak mümkündür.
Aktivasyonları ise zimojenlerin proteolitik kesimi sonucu büyük ve küçük alt birimlerin ayrılması ve “prodomain”lerin uzaklaştırılması ile olur (Şekil 1.5). Kaspazlar, subtratlarında birbirini takip eden en az dört amino asit (P4–P3–P2–P1) yapısını tanırlar ve C-terminal rezidüsünden (P1) sonra kırarlar. Bu ise genellikle Asp (aspartik asit) rezidüsüdür (Fuentes-Prior ve ark. 2004, Timmer ve Salvasen 2007).
Şekil 1.5. Kaspazların aktifleşme mekanizması (Clarke 2009 değiştirilerek alınmıştır).
Kaspazların birçoğu apoptozis sürecinde önemli roller üstlenmektedir. Bazıları başlatıcı kaspazlar (2, 8, 9, 10) olarak bilinirken, bazıları da ilerletici (efektör) kaspazlar (3, 6, 7) olarak bilinir (Thornberry ve Lazebnik 1998 ).
Başlatıcı kaspazlar, protein-protein etkileşim motiflerini barındıran uzun bir
“prodomain” içerir. Bu motifler, ya ölüm etkileyici alan (DED; “death effector
15
domain”) ya da kaspaz takviye alanıdır (CARD; “caspase recruitment domain”) (Şekil 1.6). Kaspazlar bu motifler sayesinde adaptör moleküllerle etkileşimlerini sağlarlar.
İlerletici kaspazlar, kısa bir “prodomain” içerirler ve apoptozisin ilerlemesini sağlamak için çok çeşitli hücresel substratları kırarlar (Lamkanfi 2011).
Şekil 1.6. Başlatıcı ve efektör kaspazlar (Forro 2012 değiştirilerek alınmıştır).
Kaspazlar birbirlerini aktifleştirerek proteolitik bir şelaleyi oluştururlar. Başlatıcı kaspazlar, ölüm sinyalini ilerletici kaspazlara iletirler. İlerletici kaspazların bazıları lamin, hücre içi iskelet ve çekirdek zarı proteinlerini parçalar. Kaspaz 3, DNA onarımında görevli olan PARP’ı kırarak inaktive eder ve DNA onarımını engeller.
Bazıları ise bir dizi DNaz’ı aktive ederek DNA’nın parçalanmasına yol açar (Ulukaya 2001, Oliver ve Valette 2005). IAP’lar (apoptozis inhibitörleri) sitozolde bulunur ve kaspazların inaktif veya aktif formlarına bağlanarak fonksiyonlarını baskılar.
Smac/DIABLO ise mitokondrinin iç zarında bulunur ve IAP bağlanma motifi içerir.
Apoptozis sürecinde sitokrom-c ile beraber salınarak IAP’ları baskılar ve böylece kaspaz aktivasyonunu sağlar (Zimmermann ve ark. 2001, Zhang ve ark. 2003).
16
1.4.3. Mitokondrinin Apoptozis Sürecindeki Rolü
Hücre ölümünün düzenlenmesinde mitokondrinin, apoptotik yolların kesiştiği önemli bir kavşak noktası olduğu görülmüştür. Bu yüzden mitokondrinin aktivasyonu (sitokrom c’nin mitokondriden sitoplazmaya salınması) apoptotik süreçte geri dönüşümsüz noktayı gösterir (Kumar ve ark. 2005). Mitokondri, Apoptozis İndükleyici Faktör (AIF), Smac/DIABLO ve sitokrom c gibi birçok pro-apoptotik proteini içermektedir. Sitokrom c, elektron transport zincirine ve oksidatif fosforilasyona katılır.
Sağlıklı hücrelerde sitokrom c, mitokondride membranlar arası boşlukta yer almaktadır (Hu 2003). Sitotoksik ilaçlar, büyüme faktörü eksikliği, reaktif oksijen türleri ve DNA hasarı gibi değişik hücresel stresler sitokrom c’nin salınmasını harekete geçirir.
Sitokrom c’nin salınması, Bcl-2 ailesi üyeleri ile düzenlenir (Chang ve Yang 2000).
1.4.4. Bcl-2 Ailesinin Apoptozisdeki Rolü
Bcl-2 ailesi, antiapoptotik ve proapoptotik üyelerden oluşan ve apoptozu düzenlemede en önemli role sahip olan onkoprotein grubudur (Altunkaynak ve Özbek 2008). Bcl-2 ailesi birbirine zıt etkili iki gruptan oluşur. Bu grupların biri anti-apoptotik (Bcl-2 ve Bcl-XL gibi), diğeri ise pro-apoptotiktir (Bax, Bid gibi) (Şekil 1.7). Anti-apoptotik grup apoptozisi baskılayıcı, pro-apoptotik grup ise apoptozisi indükleyici etkiye sahiptir.
Anti-apoptotik olanlar, sitokrom c’nin salınmasını engeller; pro-apoptotik olanlar ise sitokrom c’nin sitoplazmaya salınmasını indükler (Kumar ve ark. 2005). Hücrelerin apoptotik uyarıya hassaslığı pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 proteinleri arasındaki dengeye bağlıdır (Burlacu 2003). Anti-apoptotik Bcl-2 proteinlerin aşırı ekspresyonu apoptozisi baskılarken, pro-apoptotik üyelerin aşırı ekspresyonu apoptozise neden olur (Kumar ve ark. 2005).
17
Şekil 1.7. Apoptozisin mitokondri yolunda yer alan Bcl-2 ailesi üyeleri (Anvekar ve ark. 2011’den değiştirilerek alınmıştır).
Pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinler arasındaki etkileşim, anti-apoptotik Bcl-2 proteinlerinin normal fonksiyonunu bozar ve mitokondride porların oluşumuna, sitokrom c ve diğer pro-apoptotik moleküllerin zarlar arası bölgeden salınımına neden olur (Şekil 1.8). Bu da apoptozom oluşumu ve kaspaz kaskadı aktivasyonuna yol açmaktadır (Robertson ve Orrenius 2000, Fan ve ark. 2005).
18
Şekil 1.8. Apoptozom oluşumu ve kaspaz aktivasyonu (Anvekar ve ark. 2011’den değiştirilerek alınmıştır).
1.4.5. Apoptozisin Mekanizmaları
Apoptozisin aktivasyonunda üç sinyal yolunun rol aldığı bilinmektedir;
1. Hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanan ölüm aktivatörleri ile tetiklenme/ Ekstrinsik (dışsal) yolak
2. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması/İntrinsik (içsel) yolak 3. Endoplazmik retikulum aracılı apoptozis oluşturulması
1.4.5.1. Ekstrinsik (Dışsal) Yolak
Bu yolak da, ölüm reseptörleri (DR) olarak bilinen ve Tümör Nekroz Faktörü Reseptörü (TNFR) geni ailesinin üyesi olan; TNFR-1, Fas/CD95/APO-1 ve TNF-İlişkili Apoptozis İndükleyici Ligand (TRAIL) reseptörleri olan DR-3 (TRAMP), DR-4 (TRAIL-R1) ve DR-5 (TRAIL-R2)‘in ilgili ligandlarla etkileşime girmesi sonucunda apoptozis indüklenir. TNFR süper ailesi üyeleri, tip I transmembran proteinleri olup hepsi sistein bakımından zengin ekstrasellüler bölgeler (subdomainler) içermektedir ve bu özellik
19
TNFR süper ailesi üyelerinin kendilerine özgü ligandları tarafından tek tek tanınmasını sağlamaktadır. Ölüm reseptörleri ayrıca apoptotik sinyalin transdüksiyonu için gerekli olan 80 aminoasit uzunluğunda intraselüler Ölüm Bölgesi (DD) içerir. Ölüm reseptörlerine bağlanan ligandlar (FasL, TNFα, VE TRAIL) yapısal olarak reseptörler ile ilişkili proteinler olup TNF süper ailesine aittirler. Bu ölüm ligandları tip II transmembran proteinleri gibi eksprese edilirler. Bazı durumlarda, bu proteinler proteolitik kırılabilir ve serbest kalabilirler (Ghobrial ve ark. 2005, Guicciardi ve ark.
2009). Ölüm reseptörlerinin ligandları yani aktivatörleri reseptörlerin oligomerizasyonuna yol açarak aktifleşmelerine neden olmaktadır. Reseptörlerin aktivasyonu, Ölüm İndükleyici Sinyal Kompleksi (DISC) denilen ve proteinlerden meydana gelen bir kompleks oluşumuna sebep olur. DISC, adaptör protein Fas ilişkili ölüm alanını (FADD) ve TNFR-1 ilişkili ölüm bölgesi proteinini (TRADD) içerir. Bu ölüm bölgeleri prokaspaz-8’i aktifleştirmektedir. DISC yapısında yer alan prokaspaz 8’in aktivasyonunu takiben kaspaz 8 sırasıyla kaspaz 3, 6 ve 7’nin aktive olduğu bir kaspaz kaskatını harekete geçirir. Kaspaz 8’in aktif hale geçmesi ayrıca Bid’in aktive olmasına neden olur. Kırılmış Bid (tBid) sonrasında mitokondriye geçer ve sitokrom c, SMAC (İkinci mitokondri türevli kaspaz aktivatörü) ve kalsiyum salınımını uyarır (Şekil 1.9) (Elmore 2007, Solakoğlu 2009, Dickens ve ark. 2012).
20
Şekil 1.9. Reseptör aracılı kaspaz aktivasyonu (Fulda ve Debatin 2006’dan değiştirilerek alınmıştır).
1.4.5.2. İntrinsik (İçsel) Yolak
İçsel/mitokondriyal yolak, pro-apoptotik ve anti-apoptotik üyeleri olan Bcl-2/Bax gen ailesi ile düzenlenmekte olup uyarıldığında mitokondriden sitokrom-c salınımına ve böylece ölüm sinyaline sebep olur. İki yolak da (dışsal ve içsel), düzenleyici ve yapısal molekülleri kıran ve bunun sonucunda hücrenin ölümüne sebep olan kaspaz denilen proteaz kaskadının aktivasyonunu içeren ortak bir yolda birleşir (Ghobrial ve ark.
2005). Anti-apoptotik üyeler olan Bcl-2 ve Bcl-XL, kaspazların öncü formlarını durdurarak ya da apoptogenik faktörlerin mitokondriden salınımını engelleyerek hücrenin yaşamasını teşvik ederken; Bax, Bad, Bim, Bid gibi pro-apoptotik üyeler hücreyi apoptozise teşvik ederler. Normal durumda Bax ve Bak proteinleri Bcl-2 tarafından inaktif halde tutulur. Apoptotik sinyal oluştuğunda Bcl-2 inaktif hale geçerken aktifleşen Bax ve Bak mitokondri dış membranında porların oluşmasına ve zar potansiyelinde değişime neden olurlar. Mitokondriyal yolun kilit olayı mitokondri dış membran permeabilizasyonudur (MOMP) ve sonucunda; sitokrom c, mitokondri türevli kaspaz aktivatörü/IAP bağlayıcı protein Smac/DIABLO, HtrA2/Omi, AIF ve endonükleaz D (EndoG) gibi mitokondri membran proteinleri sitozole salınır.
Mitokondri iç membran yüzeyinden sitokrom c’nin sitozole salınması ile sitokrom c, sitoplazmik protein olan Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör-1 (Apaf-1)’e bağlanır ve onu aktive eder, dATP/ATP’nin de ortamda bulunması ile Apaf-1/sitokrom c
21
kompleksi heptamerik bir yapıya oligomerize olur. Bu yapının oluşması, prokaspaz 9’un Apaf-1 ile etkileşimini mümkün kılar ve apoptozom kompleksi oluşur (Şekil 1.10).
Apoptozomun görevi, başlatıcı kaspaz olan kaspaz 9’u aktive etmektir ve aktif kaspaz 9, kaspaz-3’ü veya diğer ilerletici kazpazları aktive ederek kaspaz kaskadına aracılık eder.
Şekil 1.10. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması (Zimmermann ve ark. 2001).
Aktif kaspaz 3, kaspazla aktive edilmiş DNaz inhibitörü (ICAD; “inhibitor of caspase- activated DNase”) poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP, DNA tamir enzimi), Rho ilişkili sarmal oluşturan kinaz I (ROCKI; “Rho-associated coiledcoil forming kinase I”), aktin, fodrin ve lamin gibi hücresel substratları kırarak apoptotik morfolojinin oluşumunu sağlar. CAD normal hücrelerde ICAD’üne bağlı ve inaktif halde bulunur ve aktif hale geçtiğinde kromatin yoğunlaşmasına ve DNA’nın nükleozamal fragmentlere kesilmesine neden olur. Ayrıca kaspaz aktivitesini inhibe eden ve aktiviteleri Smac veya Omi/HtrA2 gibi fonksiyonel analoglar ile engellenmiş birçok IAP’lar (apoptozis inhibitörleri) vardır. Ölen hücrelerde Smac ve Omi/HtrA2 (mitokondriyel proteinler, pro-apoptotik proteinler) mitokondriden salındığında IAP’lar inaktive olmakta ve böylece ilerletici kaspazların inhibisyonu engellenip hücrelerin apoptozise gitmeleri
