T.C.
KIRIKKALEÜNİVERSİTESİ FENBİLİMLERİENSTİTÜSÜ
BİYOMÜHENDİSLİKANABILIM DALI YÜKSEKLİSANSTEZİ
KANSERHÜCREHATTINDAALTINNANOPARTİKÜLLERİLEsiRNATAŞINIMI
MelisÇOLAK
BiyomühendislikAnabilimDalındaMelisÇOLAKtarafındanhazırlananKANSERHÜCRE HATTINDAALTINNANOPARTİKÜLLERİİLEsiRNATAŞINIMIadlıYüksekLisans TezininAnabilimDalıstandartlarınauygunolduğunuonaylarım.
Prof.Dr.MustafaYİĞİTOĞLU AnabilimDalıBaşkanı
ButeziokuduğumuvetezinYüksekLisansTeziolarakbütüngereklilikleriyerinegetirdiğini onaylarım.
Prof.Dr.MustafaTÜRK Danışman
JüriÜyeleri
Başkan(Danışman) :Prof.Dr.MustafaTÜRK _______________
Üye :Prof.Dr.SiyamiKARAHAN _______________
Üye :Prof.Dr.NecdetSAĞLAM _______________
……/…../…….
ButezileKırıkkaleÜniversitesiFenBilimleriEnstitüsüYönetimKuruluYüksekLisans derecesinionaylamıştır.
Prof.Dr.MustafaYİĞİTOĞLU FenBilimleriEnstitüsüMüdürü
CANIMAİLEME
ÖZET
KanserHücreHattındaAltınNanopartikülleriİlesiRNATaşınımı
ÇOLAK,Melis KırıkkaleÜniversitesi FenBilimleriEnstitüsü
BiyomühendislikAnabilimDalı,YüksekLisanstezi Danışman:Prof.Dr.MustafaTÜRK
KASIM 2017,sayfa106
Kolonkanserikadınveerkeklerbireylerarasındagörülmesıklığıpekbirfarklılık göstermemektevekanserleringörülmesıklığındaüçüncüsıradabulunmaktaolupBcl2gen ifadesinin kolon kanserinde normal dokulara göre aktivasyonunda artış gösterdiği belirlenmiştir.RNA interferansgenifadesinidüzenleyenbirmekanizmaolupsiRNA’lar aracılığıylamRNA’nınyıkımınınuyarılmasınısağlamaktadır.Kansertedavisindesonyıllarda yapılançalışmalargöstermiştirkibiyouyumlutaşıyıcıaltınnanopartiküllerilesiRNA’yı taşıyarakkansertedavisiiçinumutvadedengelişmelergerçekleştirilmiştir.Sunulanbutez kapsamındafarklıdozlardakisiRNA+altınnanopartikülkomplekslerininDLDkolonkanseri hücrelerineuygulanarakBcl-2genifadesininbaskılanmasıhedeflenmiş.BununiçinpHve sıcaklılığaduyarlıaltınnanopartiküllerisentezlenmişvekarakterizeedilmiştir.siRNA’nın altınnanopartikülileetkileşimlerihemkarakterizeedilmişhemdeagarozjelelektroforezinde incelenmiş ve bir kompleks oluşturdukları saptanmıştır. Hücre poliferasyon testi xCELLigenceRTCA analizyöntemiyleyapılmışveapoptoz/nekrozetkisiikiliboyamaile belirlenmiştir.
AnahtarKelimeler:DLD,Bcl-2,AltınNanopartikül,siRNAuygulama
i
ABSTRACT
SI-RNADELIVERYWITHGOLDNANOPARTICLESINACANCERCELLLINE
ÇOLAK,Melis KırıkkaleÜniversitesi FenBilimleriEnstitüsü
BiyomühendislikAnabilimDalı,YüksekLisanstezi Danışman:Prof.Dr.MustafaTÜRK
KASIM 2017,sayfa106
Theincidenceofcoloncancerisnotsignificantlydifferentbetweenwomenand men,anditisfoundthatBcl2geneexpressionisincreasedincoloncancercomparedto normaltissues.RNAinterferenceisamechanismforregulatinggeneexpression,which stimulatesthedegradationofmRNAthroughsiRNAs.Recentstudiesincancertreatment haveshownthatbiosyntheticcarriernanoparticlesandsiRNAhavebeencarriedforwardto improvecancercare.Inthisthesis,itwasaimedtosuppresstheexpressionofBcl-2geneby applyingsiRNA+nanoparticlecomplexesofdifferentdosestoDLDcoloncancercells.For this,pHandtemperaturesensitivegoldnanoparticlesweresynthesizedandcharacterized.The interactionofsiRNAwithnanoparticlewascharacterizedbothbycharacterizationandby agarosegelelectrophoresisandfoundtoformacomplex.Cellularproliferationassaywas performedbyxCELLIGENCERTCAanalysismethodandapoptosis/necrosiseffectwas determinedbydoublestaining.
Keywords:DLD,Bcl-2,GoldNanoparticle,siRNAapplication
ii
TEŞEKKÜRLER
BiyomühendislikAnabilimDalıiletanışmamısağlayantezçalışmalarımiçinhertürlüdesteği sağlayan,tecrübesiylebanayolgösterensevgilidanışmanhocamProf.Dr.MustafaTÜRK’e
Altınnanopartikülsentezaşamasındabanabilgideneyimleriniaçıpsentezlememeyardımcı olanHakanÇİFTÇİhocama,
Tezçalışmam içinhertürlüdesteğiveolanağısaylayanKÜBTUAM MüdürümüzProf.Dr. SiyamiKARAHANhocamıza,
Laboratuvarçalışmalarım boyuncabanaherşekildeyardımcıolanarkadaşlarım Özlem ÖZDEMİR,Gizem İMRAK ,AytunaÇERÇİ,AslıAGAR,DamlaOKATAN,Murat PARLAK,CananÇAKIR,RümeysaAKÇAPINAR,SemaTUNCER’e;KÜBTUAM AİLESİ olarakbendendestekleriniesirgemeyenarkadaşlarımaveAzizeBUDAK,SeldaÖZ,Gökben BAŞARANhocalarıma,
Anlamadığım,çıkaryolbulamadığımveheraradığımdauzaktandaolsayardımcıolmakiçin uğraşanSevalBİRDANEveAtakanTEVLEKarkadaşıma,
Özelliklebizebirbabagibiyakınlıkgösteren,herzamanmotiveeden,desteğiniüzerimizden hiçeksiketmeyenvebütünbilgideneyiminibizimlepaylaşan PROF.DR.OğuzKUL hocama,
HerşekildeyanımdaolanTuğbaGAYAKERveAilesine,
Ençoktabenibuyaşagetiren,herümitsizliğekapıldığımdabanagüçvererektekrarkendimi iyihissetmemisağlayan,herşekildevekoşuldayanımdaolanhakkınıneyaparsamyapayım ödeyemeyeceğimCANIM AİLEM kahramanlarım,
Sonsuzteşekkürlerimisunuyorum.
iii
İÇİNDEKİLERDİZİNİ
SAYFA
ÖZET………...........i
ABSTRACT.………...................ii TEŞEKKÜRLER………....................iii İÇİNDEKİLERDİZİNİ………...…...............iv ŞEKİLLERDİZİNİ……….......................vii ÇİZELGELERDİZİNİ……….................xvi
KISALTMALARDİZİNİ……….......…xvii 1.GİRİŞ………...….....1
2.GENELBİLGİLER………..............3
2.1.KANSERBİLGİSİ………..……...…...3
2.1.1.KanserveOluşumMekanizması……….……...….3
2.2KOLONBİYOLOJİSİ……….…............5
2.2.1.KolonKanseriNedir?SebepleriNelerdir?……….……….....6
2.2.2.KolonKanseriÇeşitleri……….…………............7
2.2.3.KolonKanseriSemptomları……….….........................9
2.2.4.Koloraktal Kanser Tanı, Muayene ve Laboratuvar Testleri……….……….…............................10
2.2.5.KolorektalKanserEvreleri………….……….............12
2.2.6.KolorektalKanserTedaviYöntemleriVeYanEtkileri………..13
2.3RNAMekanizması………...………..17 iv
2.3.1.RNAİnterferans(RNAi)………..…..…....17
2.3.1.1.-mikroRNA(miRNA)………...……........................….....18
2.3.1.2.SmallİnterferingRNA(siRNA)……….………….….19
2.4.Nanopartiküller……….……….…….….21
2.4.1.Altın-Nanopartikülleri………….……….………...21
2.4.1.1.AuNPİleİşaretlemeYöntemi……….…..22
2.4.1.2.AuNPIşığıAbsorbansÖzelliği……….………....23
2.4.1.3.AuNPİleKontrollüİlaçSalınım……….…….….23
2.4.1.4.AuNP’nin Kanser Tedavisinde Uygulanma Şekilleri ve BiyosensörYapımındaKullanımı………...….....….24
2.5.TeronastikYöntem………...………...25
3.DENEYSELÇALIŞMALAR………....…....27
3.1.KimyasallarVeCihazlar………..………..….27
3.2.AuNPSenteziveKarakterizasyonu………....28
3.2.1.AuNPSentezi………..….………....28
3.2.2.Karakterizasyon………...………...…..........29
3.2.2.1.ZetaPotansiyelAnalizi………..……….…….…..29
3.2.3.siRNA’ninAuNPİleEtkileşimi………..………...….….29
3.2.4.AgarozJelElektroforezYöntemiİleAuNPvesiRNA ÖrneklerininEtkileşimlerininBelirlenmesi………..……….….…..29
3.4. İn Vitro Nanopartiküllerin Hazırlanışı ve siRNA’nın Hücre İle Etkileşimi………..………..………..………..………..…………30
3.4.1.HücrelerinHazırlanışı………..………...………30
3.4.2.HücreHattınınPasajlanması………..............……….31
3.4.3.siRNA/Nanopartiküllerin Hücre Proliferasyonlarına Antiproliferatif etkilerininxCELLigenceRTCAİleBelirlenmesi………..……….………..31
3.4.4. İkili Boyama Methodu İle Apoptoz-Nekrozun Belirlenmesi………..……….……….……….……….……33
3.4.5.İkiliBoyamaMetodu……….………..……..35
4.DENEYSELBULGULARVETARTIŞMA………..……….…......…..37
4.1.NanopartiküllerinKarakterizasyonu………..………..…..37
4.1.1.Zeta(ζ)potansiyelAnalizYöntemi………..……..37
4.2. siRNA İle Nanopartiküllerin Etkileşimlerinin Agaroz Jel Elektroforezi YöntemiyleBelirlenmesi………..……….…...41
4.3.HücrepoliferasyonununxCELLigenceRTCAİleBelirlenmesi………...............43
4.3.1. Nanopartiküllerin Hücreler Üzerindeki Etkisinin Belirlenmesi…..……….……….……….……….……….….…..43
4.3.2.Nanopartikül+ siRNA kompleksininHücrelerÜzerindekiEtkisinin Belirlenmesi………..……….………...44
4.3.3.Nanopartikül+siRNAkompleksi,SerbestHaldekiAuNPvesiRNAların HücrelerÜzerindekiEtkisininBelirlenmesi…..………..……….….…..49
4.4.İkiliBoyamaİleApoptozveNekrozBelirlenmesi………..………..….…..55
5.SONUÇLARVETARTIŞMALAR…..………..…………...………….……......…...74
KAYNAKLAR…..………...……….………....……....…..77
vi
ŞEKİLLERDİZİNİ
ŞEKİL SAYFA
3.1. GerçekZamanlıHücreAnalizCihazı(xCELLigence)……….33
3.2. İkiliboyamailehücelerincanlılıkoranlarınınsaptanması(Sarırenklerdekideğişim hücrelerdekicanlılıkoranlarınagöreazalmakta.Koyusarıolarakgörünenlercanlılıkları yüksekolankolonkanserihücreleriikenbeyazayakıngörünenlerisecanlılıklarıdahadüşük olanlardakolonkanserihücreleri.)………..35
4.1. ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+1µLAuNP’ninyüzeyyükü dağılımgrafiği ……….37 4.2. ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+2µLAuNP’ninyüzeyyükü dağılımgrafiği ……….38 4.3. ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+4µLAuNP’ninyüzeyyükü dağılımgrafiği ……….38 4.4. ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+8µLAuNP’ninyüzeyyükü dağılımgrafiği ……….39 4.5. ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+16µLAuNP’ninyüzeyyükü
dağılımgrafiği……….39
4.6.ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmiş1µLsiRNA+32µLAuNP’ninyüzeyyükü dağılımgrafiği ……….……40
4.7.ZetaPotansiyelanaliziileeldeedilmişAuNP’ninyüzeyyüküdağılımgrafiği……....41
vii
4.8.AgarozjelelektorforezindeyürütülenyalnızcaAuNP,yalnızcasiRNAveAuNP+siRNA komplaksiningörüntüsü(A=1µLsiRNA+1µLAuNPkonulankuyucuktakiilerme,B=1µL siRNA+2µLAuNPkonulankuyucuktakiilerme,C=1µLsiRNA+4µLAuNPkonulan kuyucuktakiilerme,D=1µLsiRNA+8µLAuNPkonulankuyucuktakiilerme,E=1µLsiRNA +16µLAuNPkonulankuyucuktakiilerme,F=1µLsiRNA+32µLAuNPkonulan
kuyucuktakiilerme,G=Yalnızca1µLAuNPkonulankuyucuktakiilerme,H=Yalnızca1µL siRNAkonulankuyucuktakiilermegözlemlenmiştir.) ………...42
4.9.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarak1µLAuNP’ekarşıDLD veL929 hücrelerindekiproliferasyondeğişiminingösterilmesi ………....43
4.10.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDhücrelerineuygulananfarklı derişimlerdekiAuNP’lerinhücrelerdekiproliferatifetkisiningösterilmesi ………....44
4.11.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µL+AuNP1µLkompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin
gösterilmesi ………..45
4.12.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µL+AuNP2µLkompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin gösterilmesi ……….…...45
4.13.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µL+AuNP4µLkompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin
gösterilmesi ………..46
4.14.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarak DLD veL929hücrehatlarına uygulanan siRNA 1µL +AuNP8µL kompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin gösterilmesi ………..47
viii
4.15.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µL+AuNP16µLkompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin gösterilmesi ………..47
4.16.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µL+AuNP32µLkompleksininhücrelerdekiproliferatiketkisinin gösterilmesi ……….48
4.17.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDveL929hücrehatlarına uygulanansiRNA1µLhücreproliferatiketkisiningösterilmesi ………..49
4.18.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarak DLDHücrehattınasadecesiRNA 1µL,sadeceAuNP 1µL vesiRNA 1µL + AuNP 1µL kompleksiuygulandığındaki proliferasyonetkisiningösterilmesi………...50
4.19.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDHücrehattınasadecesiRNA 1µL,sadeceAuNP2µLvesiRNA1µL+AuNP2µLkompleksiuygulandığındaki
proliferasyonetkisiningösterilmesi……….....51
4.20.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDHücrehattınasadecesiRNA 1µL,sadeceAuNP4µLvesiRNA1µL+AuNP4µLkompleksiuygulandığındaki
proliferasyonetkisiningösterilmesi……….....52
4.21.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDHücrehattınasadecesiRNA 1µL,sadeceAuNP8µLvesiRNA1µL+AuNP8µLkompleksiuygulandığındaki
proliferasyonetkisiningösterilmesi………....53
4.22.GerçekzamanlıxCELLigencecihazıkullanılarakDLDHücrehattınasadecesiRNA 1µL,sadeceAuNP16µLvesiRNA1µL+AuNP16µLkompleksiuygulandığındaki proliferasyonetkisiningösterilmesi………...54
ix
4.23.GerçekzamanlıxCELLigence’deDLDHücrehattınaayrıayrısiRNA1µL,AuNP32µL vesiRNA1µL+AuNP32µLkompleksiuygulandığındakiproliferasyonetkisinin
gösterilmesi ………...........................................54
4.24.siRNA1µL+AuNP1µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide);
BAR=50µmLeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………....58
4.25.siRNA1µL+AuNP2µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….58
4.26.siRNA1µL+AuNP4µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………59
4.27.siRNA1µL+AuNP8µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………59
4.28.siRNA1µL+AuNP16µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………60
x
4.29.siRNA1µL+AuNP32µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir. ………60
4.30DLDhücrelerindehiçbiruygulamayapılmadan24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….61
4.31.AuNP1µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ……….….61
4.32.AuNP2µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….62
4.33.AuNP4µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….62
xi
4.34.AuNP8µLuygulananDLDhücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….63
4.35.AuNP16µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….63
4.36.AuNP32µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….64
4.37.siRNA 1µL uygulanan DLD hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………...….64
4.38.siRNA1µL+AuNP1µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….66
xii
4.39.siRNA1µL+AuNP2µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….66
4.40.siRNA4µL+AuNP1µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….67
4.41.siRNA1µL+AuNP8µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….67
4.42.siRNA1µL+AuNP16µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….68
4.43.siRNA1µL+AuNP32µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikili boyamaneticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkili boyama(Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µm LeicaDM6000ilegörüntülenmiştir.………..….68
4.44.L929hücrelerindehiçbiruygulamayapılmadan24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ……….69
4.45.AuNP 1µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….69
4.46.AuNP 2µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..…….70
4.47.AuNP 4µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………...70
4.48.AuNP 8µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..….71
4.49.AuNP16µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ……….…….71
xiv
4.50.AuNP32µL uygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ………..………….72
4.51.siRNA1µLuygulananL929hücrelerinde24saatsonundayapılanikiliboyama neticesindeeldeedilenapoptotik(A)venekrotik(B)hücreleringörüntüsü.İkiliboyama (Doublestaining=Hoechst33342+RibonükleazA+Propidiumiodide)BAR=50µmLeica DM6000ilegörüntülenmiştir. ……….…….72
xv
ÇİZELGELERDİZİNİ
ÇİZELGE SAYFA
3.1.96Well-PlateEkilenHücrelereAitDeneyGrupları………32
4.2.DLDhücrelerindekiapoptotikhücreyüzdeoranları………57
4.3.DLDhücrelerindekinekrotikhücreyüzdeoranları……….65
xvi
KISALTMALAR
PBS TuzluFosfatTamponu(PhosphateBufferedSaline) FBS FetalBovineSerum
HAuCl4 Hydrogentetrachloroaurate(III) DMSO Dimetilsülfoksit
DLD İnsanKolonKanseriHücreHattı L929 FibroblastHücreHattı
DNA DeoksiribonükleikAsit siRNA SmallİnterferingRNA EDTA EtiendiaminTetraasetikAsit DMSO Dimetilsülfoksit
miRNA mikroRNA
TEM GeçişliElektronMikroskobu CD52 ClusterofDifferentiation52
CD20 ClusterofDifferentiationAntigen20 UV Ultraviyoleışını
VEGF Endotelyalbüyümefaktörü
HER2 İnsanepidermalbüyümefaktörüreseptörü2 mRNA Mitokondrialribonükleikasit
EGFR Epidermalbüyümefaktörüreseptörü
xvii
RNA Ribonükleikasit
SPECT-PET NükleerTıpyöntemleriilegörüntüleme
MIT AlnylamInc.veMassachusettsTeknolojiEnstitüsü AuNP Altınnanopartikül
HGC Humangonadropichomone DYE Bromfenolmavisi
DMEM Dulbecco’sModifiedEagleMedium RISC RNAindüklenmişsusturmakompleksi dsRNA ÇiftsarmalRNA
Dicer-RDE-1 RNAideficient-1 US Ultrasonografi
FIT DışkıNumunesininİmmünokimyasalTesti BT Bilgisayarlıtomografi
MRG Manyetikrezonansgörüntüleme NIR Optiktomografi
6×LoadingDYE Bromfenolmavisi FOBT DışkıdaGizliKanTesti CO₂ Karbondioksit
FITC Fluoresceinİsothiocyanate PI PropidiumIodide
xviii
1.GİRİŞ
Dünyadaölümnedenleriarasındaensıkrastlananrahatsızlıkolarakkanser gelmektedir.Kanserinsanhücrelerininfizyolojikişlevlerinibozanvehastalıklara bağlıölüm nedenlerinde ikincisırada yeralan çözümlenememiş birsağlık problemidir.[1]Ülkemizde1970’liyıllardasebebibilinenölümlerarasındadördüncü sıradayeralmaktaolankanser,sonyıllardakardiyovaskülersistemhastalıklarından hemensonraikincisırayayükselmiştir.Sebebibilinenhastalıklardaikincisırada olmasınarağmengörülmesıklığıkonusundanetbirbilgibulunmamaktadır.Modern çağınenbüyüksorunlarındanbiriolankanser,sonyüzyıldaçevreşartlarının değişmesi, yaşam temposunun değişmesi ve paralelinde gelen yeme-içme alışkanlıklarınındeğişmesikanseriinsanhayatınınenbüyükproblemlerindenbiri halinegetirmiştir.[1-3]Günümüzdebirçok tedaviyönteminin uygulandığıbu rahatsızlıktagenellikletercihedilencerrahiyöntemleriletümörlüolandokuveya organınvücuttanuzaklaştırılmasıyöntemiolsadaneyazıkkikemoterapive radyoterapigibibirçokvücutdirencinidüşürecekuygulamayadahastalarmaruz kalmaktadır.[1-3]Kanserhücreleriçeşitlikemoterapötik ajanlara karşıdirenç kazanabilmektevekemoterapi‘ÇokluİlaçDirençliliği’mekanizmasısebebiile başarısızolabilmektedir.Tedavisırasındailacadirençlihücrepopülasyonunun fazlalığıtedavidekibaşarınınönündekienbüyükengellerdenbirinioluşturmaktadır. Budirenç;tümörlühücreleregönderilenilacınetkisininkaybolmasına,çoğuanti kanserilaçlarının aktivasyonunu sağladığıapoptozun,DNA tamirinin,hücre döngüsündekideğişikliklerinoluşmasınınengelleyerekilacınetkisiniazaltmakta veyaortadankaldırmaktadır. Sonyıllardayapılançalışmalargöstermektedirki kanserdirencinioluşturanbudurumunapoptozönleyicifaktörlerdendolayıortaya çıktığıveapoptozönleyicifaktörlerinortadankaldırılmasıilekansertedavisinin dahakolayverahatbirşekildeyapılabilecekoluşubüyükumutlarvadetmektedir.[54]
Kolon kanserikadın veerkeklerarasındagörülmesıklığındapek bir farklılık göstermemekle birlikte kanserlerin görülme sıklığında üçüncü sırada bulunmakta olup Bcl2 geninin kolon kanserinde normal dokulara göre aktivasyonunda artış gösterdiğibelirlenmiştir.RNA interferaz (RNAi)genin ifadesini düzenlemektedir.Bu düzenleme,siRNA’lar aracılığı ile mRNA’nın
yıkımının uyarılmasıilegerçekleşir.Tümörbiyolojisindeson yıllardayapılan araştırmalar nanopartiküllerin biyouyumluluğu ve biyouyumlu olan taşıyıcı sistemlerin siRNA’yıtaşıyarak kansertedavisiiçin büyük umutvadettiğini göstermektedir.
Yapmış olduğumuz bu çalışmada siRNA+ altınnanopartikül kombinasyonlarının DLD kolon kanserive L929 fibroblasthücreleriüzerine uygulanarakbukombinasyonunkanserüzerindeolanetkisiveBcl-2genifadesinin baskılanmasıileantikansertedavisindekullanmayıhedeflemekteyiz.Bununiçin siRNA’nınpHvesıcaklılığaduyarlıaltınnanopartiküllersentezlendivekarakterize edildi.siRNA’nınaltınnanopartikülileolanetkileşiminigözlemleyebilmekiçin agarozjelelektroforeziyapıldı.HücreproliferasyonlarıxCELLingenceRTCA ile bakılırkenapoptotikvenekrotiketkilerdeikiliboyamatekniğiilebakıldı.
2.GENELBİLGİLER
2.1.KANSERBİYOLOJİSİ
2.1.1.KanserveOluşumMekanizması
KanserYunancayengeçanlamınagelen“karkinos”veya“karkinoma”
sözcüklerindentüremiştir.Yengecinavınıkıstırdıktansonrauzunvedişlikollarıyla tutupyavaşyavaşkemirerekyemesikanserlihücrelerintedavisininyapılmadığı takdirdeinsanınvücutdirencinidüşürerekzayıflaması,halsizdüşmesiveensonunda daöldürerekcanlınınyaşamınıyitirmesiylesonuçlandığıiçinbuisim verilmiştir. Kanser,hücrelerdeDNA’nınhasarısonucuhücrelerinkontrolsüzveyaanormalbir şekildebüyümeveçoğalmasıolaraktanımlanmaktadırvebudurum bellibirhücre DNA’sınımutasyonauğratacakbirsinyalalmasıylaortayaçıkar.Normalvücut hücreleribirhataalgıladığındahücreyisavunmamekanizmasıyardımıylaveyahücre kendisiniimhaederekortadankaldırırkenbazıdurumlardabudurumtespitedilemez (mutasyongibi).Ortadankaldırılamayanhücresürekliçoğalmayagidervetümör oluşumunasebepolur.Kişidenkişiyedeğişkenlikgösterenkarmaşıkbirhastalık olarakbilinentümörün200’denfazlatüresahipolduğubilinmektedir.[1,4–52]
Kanserhücreleri,normalvücuthücrelerindenfarklılıkgöstermektedirve kanserhücrelerininmetabolizmasınormalhücremetabolizmasından8katdaha büyüktür.Eğeryenivücuthücrelerigerekmiyorisenormalhücrelerdekimevcutolan mekanizma hücreye bölünmeyidurdurmasınısöyler.Kanserhücrelerinde bu mekanizmanınbaskılanmasısebebiilekanserhücrelerikontrolsüzbirşekildebüyür, bölünürveçoğalırlar.Budavücudundiğerbölgelerineyayılarak,birikerektümörün oluşmasınısağlar.Oluşantümörleryalnızcabulunduklarıdokuveorganazarar vermeklekalmazdiğervücuthücrevedokularınısıkıştırabilironlarıniçerisine sızabilirveonlarıdatahripedebilirler.Kanserlihücrelerindokudışındadoğrudan veyakanyadalenfyoluylasıçramalarına‘metastaz’adıverilmektedir.Metastaz Yunancabirkelimeolupyerdeğiştirmeanlamınagelmektedir.Kansererkenteşhis edilemezvebaşladığıhücreveyadokudışındabiryeresıçramışisebaşladığıyerdeki
hücretipiyleaynıhücreisminialırlar.Örneğin;akciğerdeoluşantümöreğer bağırsakta yayılım gösteririse bu oluşan tümöre ‘‘bağırsak kanseri’’değil
‘‘metastatikakciğerkanseri’’olarakadlandırılmaktadır.[2,3–4]
Ülkemizde1970’liyıllardasebebibilinenölümlerarasındadördüncüsırada yeralmaktaolankanser,sonyıllardakardiyovaskülersistemhastalıklarındanhemen sonraikincisırayayükselmiştir.Sebebibilinenhastalıklardaikincisıradaolmasına rağmengörülmesıklığıkonusundanetbirbilgibulunmamaktadır.Modernçağınen büyüksorunlarındanbiriolankanser,sonyüzyıldaçevreşartlarınındeğişmesi, yaşam temposunundeğişmesiveparalelindegelenyeme-içmealışkanlıklarının değişmesikanseriinsanhayatınınenbüyükproblemlerindenbirihalinegetirmiştir. Kanserhücrelerininbirbirindenfarklılıkgöstermesinedeniyleonkogenleriaktifhale getiren, tümör supresör genleri sessizleştiren veya fonksiyonunu önleyen mutasyonlarkeşfedilmiştir.Kanserhücrelerininbulunduğudokuveorganabağlı olarakkendineözelmolekülervebiyokimyasalözellikleresahipolduğuortaya çıkmıştır.Onkogenlerkontrolünü kaybetmişprotein kodlayan genlerdir vegen ekspresyonunuhızlandırarakneoplastikhücrebirikiminenedenolmaktadır.Tümör baskılayıcıgenlerhücreninnormalbirşekildebölünme,büyümeveçoğalmasını sağlayaraktümöroluşumunubaskılamaktadırlar.Çoğutümörhücresindeisebu geninhasarıveyaaktivasyonununkaybolmasıhücreninanormalçoğalmasınaneden olmaktadırlar.
Apoptozisgenetikolarakdüzenlenenvehücreninkontrollübirşekilde ölümüne yolaçan biyolojik bir olaydır ve anormalhücrelerin apoptozise uğrayamamasıhücreninkontrolsüzbirşekildeçoğalmasınabunedenledetümör oluşumunasebepolmaktadır.ApoptozisidüzenleyengenlerinbaşındaBCL-2ailesi gelmektedir.Kanserhücresivetümöroluşumununmolekülertemelindegenotipini yansıttığıkabuledilennormalhücrepoliferasyonundakibozulmalarabağlıolarak kontrolsüzhücrebüyümeveçoğalmasınınyanısırauyarıiletimindededeğişikliklere bağlıolarak çoğalmayıinhibe eden sinyallere duyarsızlık,apoptotik hücre ölümündenkaçabilme,apoptozungörülmemesi,büyümesinyallerineonkogenik uyarıiletimigibiözelliklergörülmektedir.Bunungibihücreölümünüriskeeden sebeplerdendolayıhücreninbüyümeveçoğalmakontrolüortadankalkar.Çeşitli kansertürlerindehücreyapılarıvebunabağlıolarakmekanizmalarıfarklıolsada karakteristiközelliklerinintemelişleyişleriaynıdır.Bunabağlıolarakkanserin
molekülertemelininbilinmesibüyükbiravantajsağlarkenerkentanıvetedavidebir okadarönemteşkiletmektedir.[4,41-57]
2012senesiverilerinegöredünyada14.1milyonyenikanserolgusu,8.2 milyonkanserkaynaklıölüm teşhisedilmiştir.Teşhistensonraki5seneiçerisinde kanserileyaşayan32.6milyoninsanmevcuttur.Yenikanserolgularınınyüzde
%57’si(8milyon),kanserkaynaklıölümlerin%65’i(5,3milyon)ve5yılboyunca süregelen kanserolgularının %48’i(15,6 milyon)göreceliolarak azgelişmiş bölgelerdesaptanmaktadır.[36]
Teşhis,tedaviveönlemeseçeneklerindekiilerlemeyerağmenkanserdesağ kalım oranlarıhalendüşüktür.Bunedenleyenitedaviseçeneklerininbulunmasına gereksinimduyulmaktadır.[37]
2.2.KOLONBİYOLOJİSİ
‘Kolon’ sindirim sistemimizinbirparçasıolan‘kalınbağırsak’teriminin latincegeneladıdır.Çekumdanbaşlarverektumakadaruzananbağırsakkısmıdır. Asılgörevidışkıdansuyuayırmakolanbağırsakmemelilerdeçekum,çıkankolon, transverskolon,inenkolon,sigmoidkolonverektumdanoluşmaktadır.Çekumdan transverskolonunortasınakadarolankısma‘sağkolon’kalankısmaise‘solkolon’
adıverilmektedir.Çekum kısmıincebağırsağınsonlanıpkalınbağırsağınbaşladığı bölümolarakbilinmektedir.Çekumbirkapakçıkvazifesigörereksindirilengıdaların tekyönlüakışınısağlamaktadır.[21]Rektum isememelilerdekalınbağırsağınson bölümüolupanüseaçılankısmıdır.Dışkınınatılmadanhemenöncekitutulduğuyer olacaktabilinir.İnsanlardarektum uzunluğu12cm dirverektumunsonbirkaç santimetrelikkısmıderiyebenzerbirdokuilekaplıdır.[22]
Kalınbağırsakduvarı3tabakadanoluşur;
1.Kalınbağırsağıniçinikaplayanörtütabakasıdırvebunamukozadenir.Bu tabakabesinmaddelerininsindirimdengörevliolupkanaemilmesinisağlamaktadır.
2.Orta kısımda bulunan ise kas tabakasıbulunur.Bu tabaka besin maddelerininileridoğruhareketetmesinisağlamaktadır.
3.Bağırsakduvarınınendışkısmındaiseserozatabakasıbulunmaktadır. Serozatabakasınınyüzeyidüzgünolupbağırsağınkarınboşluğuiçerisindebirbirine
yapışmasınıengellemektedir.
Sindirim sistemi anatomisinde kalın bağırsak, ince bağırsak ile anüs arasındakikısım olarakbilinirve1,5-2metrearasındauzunluğasahipolup sindirim sistemininbeştebirinioluşturmaktadır.Kalınbağırsağıincebağırsaktan ayıranşeylerçapınınbüyüklüğü,nispetensabitkonumu,keseligörünümüvedışında yeralanperitonlaörtülü‘yağparçacıkları’dır(appendicesepiploicae). Kolonve rektum vücudumuzunsindirim sistemininparçalarıolupözofagustanmideyeinen besinlersindirilerekincebağırsağagönderilir.Buradavücutgıdalardabulunanbesin öğeleriniabsorbanedervebesinmaddelerinigıdalardanayırarakvücuttanatılacak olanatıklarındepolanmasıiçinkalınbağırsağageçer.Dışkıvücuttanuzaklaştırılana kadarrektumdadepolanır.Kalınbağırsakverektum ‘büyükbağırsak’adındauzun kaslıbirtüpoluşturmaktadır.[13]Kalınbağırsağın150-180cm’likkısmına‘kolon’, 15-18cm’likkısmınada‘rektum’denilmektedir.
2.2.1.KolonKanserinedir?SebepleriNelerdir?
ABD'deheryıl150.000'denfazlakişikalınbağırsakkanseriolduğunu öğreniyor.Türkiye'deiseçok sağlıklıkanserkayıtlarının olmamasınarağmen orantısalolarakyaklaşık30.000kişininkolorektalkansereyakalandığıtahmin edilmektedir.[1]Kolonkanserierişkinbireylerdeençoküçüncüsıklıklagörülen kansertürüoluperkekvekadınbireylerdeisekanserebağlıölüm nedenlerinin arasındaikincisıradayeralmaktadır.Kolorektalkanserin%80’iseyrekolarak oluşurkengeriyekalan%20likkısmıisekalıtsaldır.
Kolonkanserininikitipivardır. 1.Polipzeminindegelişenler(Adenoma) 2.Kalıtsalkolorektalkanserler
Familyaladenomatözpolipozis(FAP)zeminindegelişenler ZayıfFAP(AttenuatedFAP)zeminindegelişenler
Familialkolorektalkanser(LynchISendromu)
Herediternonpolipoziskolorektalkanser(LynchIISendromu)
Kolonkanseriolgusununçoğubağırsakiçerisinebirelinparmaklarına benzeroluşumlaroluşarakiyihuylupolipgelişmesiilebaşlar.Elliyaşveüzeri
kişilerdeiyihuylupolipleroldukçasıklıkilegörülmektedirvevakaların%90‘ı50 yaşveüzeridir.Normalriskesahiphastalardadataramayaşınınelliolmasebebi budur.Erkenteşhisvetedaviile(Örneğin;ameliyatilepolip‘inalınımı)iyihuylu poliplerebirmüdahaleedilmelidir.Poliplerinkanserleşmevenormalolankolonveya vücut hücrelerine metastaz yapma kabiliyeti kazanabilmeleri göz önünde bulundurulmalıdır.Metastazkanserhücrelerininkökenaldığıdokuveyaorgandan, lenfveyakandolaşımıilevücuttakidiğerdokuveorganlarayayılmasıdır.Kanyolu ileyayılmadakanserhücreleriyakındabulunanoluşmaktaolanveyayenioluşmuş kandamarlarınagirerekdolaşımsistemiilevücudundiğerbölgelerinetaşınır.Diğer birtaşınmasistemiolanlenfatikyayılmadaisekanserhücrelerilenfatiksistemegirer vebusistem ilefarklılenfnodlarınataşınmasısağlanır.Lenfyoluylakanser hücrelerininbuşekildetaşınmasısonucuikinciltümörlermeydanagelmektedir.[62]
Tümör(halkdilinde‘ur’)bağırsağıtıkayarakdışkıatımınıengelleyebilir.Bukanser tipinintamolaraknedenleribilinmemekleberaberrisktaşıyanhastalarınyaşamtarzı, beslenmeveyagenetikgibifaktörlerleilişkiliolduğugörülmektedir.Ailesindekalın bağırsakkanserihikayesi,kişibağırsağındapolipolması,bazıiltihabikbağırsak hastalıkları(Örneğin;ülseratifkolit,Crohnvb.)veyabağışıklığıdüşükolanlardaha yüksekrisktaşımaktadırlar.Riskyaşilevevücudunherhangibiryerindebulunan kanseroluşumuylabirlikteartmaktadır.Fazlasıylabağırsağıyoranyanilifli,yağlı, işlenmişbesinler(Kırmızıet,salam,sosis,mangalvb.),azorandasebzevemeyve tüketimibeslenmeyleilişkilifaktörlerdir.Yaşamtarzıfaktörleriise;hareketsizyaşam tarzı,fazlakiloalımı,sigaravealkolkullanımınıiçermektedir.[14-53]
2.2.2.KolonKanseriÇeşitleri
Bağırsakkanserininçokçeşitlitiplerivardırkibunlarmeydanageldikleri hücrelerinisimleriyleanılırlar.
A. Adenokarsinomlar:Kolorektalkanserlerin%95‘ibutipkanserlerdir.Bezsel dokularda ortaya çıkmakta ve beze aitolmasıgerekmez,salgılayıcı özelliklere sahip olmaları yeterlidir. Yani, bağırsak zarındaki bez hücrelerinde başlamaktadır(İyicilbirbezseltümör).Alınan örnekler mikroskopaltındaincelenerekmüsinöztümörveyataşlıyüzüktümörüolarak
gözlemlenir.[16]
B. Skuamöz(yassı)HücreliKanserler(SCC):Adenokarsinom hücreleriyle aynışekildetedaviedilenbuhücretipiciltkanserleriiçerisinde‘bazal hücrelikarsinom’dansonragelenikincienyaygınciltkanseritipidir.[16]
Bağırsaktadayassıhücrelibezhücreleriileberaberbağırsak zarını oluşturancilttipininhücreleridir.
C. DiğerBağırsakTümörleri:
c.1Karsinoidler:Butümörilkolarak1888yılındaLubarschtarafından tanımlanmaktafakat;1907yılındaOberndorfer,Malingpotansiyeliolmadığı ve karsinomlara olan benzerliğinden dolayı ‘KARSİNOİD’ terimini kullanmıştır.Sonyıllardasıklıkla‘NöroendokrinTümörü’dedenilenve yavaşgelişennadirbirtümörtipidir.NöroendokrinsisteminEnterokromatin veya Kulchitsky hücrelerinden gelişmektedirler.Nöroendokrin tümörler (NET)yüzbinde1-2sıklıktave50-60yaşaralığındagörülmektedir.[17,18 -20]Butümörlerhormonüretendokulardagelişmekleberaberkolorektal tümörleregöretedavişekillerifarklılıkgöstermektedir.
c.2Sarkomlar:Vücudumuzunherhangibiryerindenkökenalanmezenkimal tümörlerdirvetüm kanserlerinyaklaşıkolarak%1’inioluşturmaktadırlar. Kolonyadarektumdabulunansarkomlarınçoğu‘Leiomyosarkom’durve yumuşak doku kökenlidüzkashücrelerinden gelişebilen saldırgan bir sarkomdur.Dahaçokyetişkinlerdegörülmektedir.Küçükkandamarlarını döşeyendüzkashücrelerindenkökenalanLeiomyosarkomutüm yumuşak dokusarkomlarınınneredeyse%5–10unuoluşturmaktadır.[16]
c.3 Lenfomalar: Bağışıklık sistemi urları olarak bilinirler. Lenf düğümlerindençıkan,lenfositlerdenoluşantümörlerintümüne‘Lenfoma’
denilmektedir.1832yılındaThomasHodgkin‘Lenfoma’nınilktanımını yapmış hatta kendiadınıverdiği‘Hodgkin Lenfoması’ hastalığıda açıklanmıştır.[19]100kolorektalkanserdenyalnızca1tanesibulenfatik sisteminkanserlerindendirvediğerkolorektalkansertiplerinegöretedavi
yöntemiçokfarklıdır.
2.2.3.KolonKanseriSemptomları Bağırsakalışkanlığındadeğişme
İshal(Gaitalarınınfazlamukusluoluşu)
Dahaçokkabızlık(Hattakalemgibiincegaitayapma) Hastahiçgazvegaitaçıkaramayacakdurumagelebilir. Rektalkanama
Aşikârrektalkanama(Hemoroitgibibeninperianalhastalıklarabağlı olmayankanamalardayaniaçıklanamayankanamalardakolonoskopiiletüm kolon değerlendirilir.)
Karınağrısıvekramplar Şişkinlik
Tenesmus(kişigaitayapmaihtiyacıylatuvaletegiderfakatyapamaz.Çünkü rektumkitleyledoludur.)
Demireksikliğianemisibunabağlıolaraksürekliyorgunlukhissi(Anemi araştırmasısırasındagaitadagizlikantestiilebelliolurvepozitifolanhastalarda kolonoskopigereklidir.)
Aşırıkilokaybıveiştahsızlık
Başkabirçokanormallikveyakanserdebubelirtivebulgularıgösterebilir.Bu bulgulardan herhangibirine sahip olan hastaların klinik destek almalarıve kontrolleriniyaptırmalarıiyiolacaktır.Herhastalıktaolduğugibibuhastalıktada erkentanıvetedaviçokbüyükönem taşımaktadır.Kansereyolaçanpoliplerin teşhisiveçıkarılmasıilekolonkanseriengellenebilirken,erkenbelirlemeile%90‘a varanoranlardatedavideedilebilmektedir.[15]
2.2.4.KolorektalKanserTanı,MuayeneveLaboratuvarTestleri
Erişkinbireylerde50yaşveüzeridüzenliolarakkolonkanseritarama testleriyaptırmasıönerilir.Kişininbireyselkolonkanseririskinegöretarama testlerininbelirliaralıklarlayaptırmasıgereklidir.Birincidereceakrabalardakolon kanserigeçmişivariseakrabayakonulankansertanısınınkonulduğuyaştan10yıl öncetaramalarabaşlanmalıdırveyakişideöncekimuayenelerdetespitedilenpolip geçmişivarsadüzenliolaraktaramalaryapılmalıdır.AmericanCancerSociety (AmerikanKanserDerneği),USMulti-SocietyTaskForceonColorectalCancer (ABDDerneklerFederasyonuKolorektalKanserGörevGücü)veAmericanCollege ofRadiology(AmerikanRadyolojiDerneği )2008Martındaortaklaşakanseröncülü poliplervekolonkanserininerkentanıkılavuzlarınıyayınlamıştır.Bukılavuzlara göreikikategoridetaramayapılmaktadır.[14,51-52]
A. Kolonuinceleyen,hem kanseröncülüpoliphem dekansersaptayabilen tamamenveyakısmıincelemeler.
B. Dışkınumunesiüzerindekimevcutolasılıklıkanserinnedenolduğukan izleriveyadışkıylaatılmışkanserhücrelerinibelirlemek için yapılan laboratuvartestleri.
BuTetkiklerKolonuGörüntülemekteVeVarsaMevcutPolipVeyaKanseri Göstermektedir;
1.Kolonoskopi:Muayenenin önerilen sıklığı10 yıldabirolmaktadır. Rektumvekolonuntamamınınışıklıbiraletilemuayenesigerçekleştirilir.[14]
Olumluetkilerikolonutamameninceleyebilmevepoliplerdenpatoloji testleriiçimbiyopsialabilmekteveyapolip‘içıkarabilmekteyiz.
Olumsuzetkileriisebağırsakyaralanması,enfeksiyonveyakanamariski teşkiletmektedir.İşlemleriçinbağırsağınöncedenkapsamlıbirşekildehazırlanması vesonrasındahastanıntoparlanabilmesiiçinbirikigüngeçmektedir.Uygulamaiçin hastayasedasyon(sakinleştirici)gereklidir.Kişibirgeceöncesindenaçkalırve işlem yaklaşık30dakikasürmektedir.Hastadakarınağrısıilebulantıvekusmaya nedenolabilir.[14]
2.Sigmoidoskopi:Muayeneönerilensıklığı5yıldabirolmaktadır.Rektum vekolonunaltkısmınınincelenmesisertveyabükülebilirışıklıbiraletilemuayenesi gerçekleştirilir.
Olumluetkilerigenelliklesedasyona(sakinleştiriciye)gerekduyulmaz.
Oldukçahızlıvegüvenilirbiryöntemdirveöncesindeminimaldüzeydebirhazırlık gerektirir.[14]
Olumsuzetkileriisekolonunyalnızca%30’lukgibibirkısmıincelenebilir. Poliplerin belli bir kısmı çıkartılabilir ve bulgularda anormallik görülürse kolonoskopiyeihtiyaçduyulur.Küçükbirkanama,enfeksiyonveyabağırsaktayırtık olabilir.Birkaçgünöncesindesulugıdalariçerendiyetlerebaşlanırveişlem 15-20 dakikasürer.İçeriverilenhavayüzündenbağırsaktakramptarzındahafifağrılar görülebilir.
3.SanalKolonoskopi(BilgisayarlıTomografikKolonoskopi):Muayene içinönerilensıklık5yıldabirolmaktadır.XIşınlarıkullanılarakbilgisayaryardımı ilerektum,kolonuntümüincebağırsağakadarincelenebilir.Bağırsakiçerisine sokulanbirtüpyardımıilebağırsaktamamenhavaylaşişirilerekbakılır.[14]
Olumlu etkileri kolonun tamamını inceleyebiliriz ve sedasyona (sakinleştiriciye)gerekduyulmaz.Görecelibirgüvenliğesahipolanbuyöntemde minimaldüzeydekolonyırtığıolabilir.[14]
Olumsuz etkileri ise polip temizlenemez ve bulgularda anormallik gözlemlenirisekolonoskopiyeihtiyaçduyulur.Tambirbağırsakhazırlığıyapılması gerekmektedir.
4.ÇiftKontrastlıBaryumLavmanı:muayeneiçinönerilensıklık5yıldabir olmaktadır.Kolonverektumuntamamınınbirdizigörüntüsüalınır.Hastayabeyaz tebeşirimsibirlavmançözeltisiverilerekröntgenfilmlerindekolonverektumaait anahatlarbelliedilir.Rektumdansokulanbirtüpyardımıilebağırsaktamamen havaylaşişirilir.[14]
Olumlu etkileri kolonun tamamını inceleyebiliriz ve sedasyona (sakinleştiriciye)gerekduyulmaz.Görecelibirgüvenliğesahipolanbuyöntemde minimaldüzeydekolonyırtığıolabilir.[14]
Olumsuz etkileri ise polip temizlenemez ve bulgularda anormallik gözlemlenirisekolonoskopiyeihtiyaçduyulur.Tambirbağırsakhazırlığıyapılması gerekmektedir.
VarOlanKanseriSaptayabilmekİçinGerekenTestler;
1.DışkıdaGizliKanTesti(FOBT):Muayenesıklığıyıldabirkezdirve dışkıdabulunangizlikanısaptamakiçinkullanılır.Hazırkithalindedir.[14]
Olumluetkileribağırsakhazırlığınaihtiyaçduyulmazveevdebilenumune toplanabilir.Bağırsaktadoğrudanhiçbirriskteşkiletmez.[14]
Olumsuzetkileriisekanseröncülüdeğişikliklerisaptayamaz.Sadecekolon içerisindekansereözgükanamayıdeğilbesinlervedişselgirişimlerdenkaynaklanan hertürlükanamagözlemlenir.Testöncesindehastayadiyetkısıtlamasıgerektirir. (Testten3günönceC vitamini,narenciye,meyve,meyvesuyuvekırmızıet bırakılır.)Testüçkezfarklızamanlardayapılangaitalariletekrarlanır.[14]
2.DışkıNumunesininİmmünokimyasalTesti(FIT):Muayenesıklığıyılda birkezdir.Dışkıdagizlikanagörefarklıbirnumunetoplamatekniğiylegizlikanı saptamakiçinkullanılmaktadır.Eritrositlerdebulunanhemoglobintespitinedayanan biryöntemdir.[14]
Olumluetkileridiyet,ilaçvb.kısıtlamalaragerekduyulmaksızınbağırsak hazırlığıyapılmaz.Evdenumunealınabilirvebağırsaktadoğrudanriskteşkiletmez.
Olumsuzetkileriisekanseröncülüdeğişiklerisaptayamazvebazıkanser tipleriniatlayabilir.Testfarklızamanaralıklarıilebirkaçkezyapılmalıdır.[14]
3.DNATesti:Halentamolaraktanımlanamamışbutestiçinçokdahafazla bilimselkanıtlaraihtiyaçduyulmaktadır.Butestdışkınumunesindenizoleedilen DNA ‘dabulunankolonkanseriyleveyapolipileilişkilispesifikbirgendeki mutasyonlarısaptamadayardımcıolur.[14]
Olumluetkileridiyet,ilaçvb.kısıtlamalaragerekduyulmaksızınbağırsak hazırlığıyapılmaz.Evdenumunealınabilirveherhangibirbağırsakyırtılmasıriski teşkiletmez.[14]
Olumsuzetkileriisekanseröncülüdeğişiklerisaptayamaz.Yeterlimiktarda dışkınumunesieldeedilmelidirveözelişlemlergerektirir.[14]
2.2.5.KolorektalKanserEvreleri
Testlersonucundatanıkanserisetedaviplanıyapabilmekiçinhastalığın kaçıncı evrede olduğu saptanmalıdır. Kalın bağırsak kanserlerinde 3 ayrı sınıflandırmakullanılmaktadır.
1.DukesSınıflandırması 2.Astler-CollerSınıflandırması
3.TnmSınıflandırması Tümörevreleri;
a.Karsinomainsitu:Butümörünilkevresidirvetümörrektum veyakolonun kanalsınırlarıiçerisindedir.
b.DukesA EvresiI:Submukozayainvazeetmişhaldedir.Buevredetümör hücrelerikolonveyarektumundahaiçduvarlarındagelişmegösterirkendaha dışduvarlaraulaşamazvekolondışınayayılmagösteremez.
c.DukesBEvresi:Tümörmuskularispropriayainvazeetmişhaldedir.Yani tümörhücrelerikolonverektumundahaderinduvarınayayılmışhaldedir. Ancakhücrelerilenfnodlarınayayılımgöstermemiştir.
d.DukesC Evresi:Tümörperitonlakaplıkısımlardasubserozayaulaşmış haldedir.Peritonlakaplıolmayankolonverektumkısımlarındaiseperikolik veperiretraldokudadır.Vücudundiğerbölgelerineyayılmagöstermemiştir. e.DukesDEvresi:Tümördirekolarakdiğerorganları(AkciğerveKaraciğer
gibi)invazeetmiştirveyaperitonudelmiştir. LenfNodu(N)Evreleri;
a.N0Evresi:Lenfnodumetastazıyaniyayılmasıyoktur.
b.N1Evresi:1-3Periraktalyadaperikoliklenfnodunayayılmıştır. c.N2Evresi:4vefazlaperirektalyadaperikoliklenfnodunayayılmıştır. d.N3Evresi:Anavasküleryapılarınçevresindekilenfnodullarınayayılmıştır. UzakMetastaz(M)Evreleri;
a.M0Evresi:Uzakbölgelereyayılmamıştır. b.M1Evresi:Uzakbölgelereyayılmıştır.
2.2.6.KolorektalKanserTedaviYöntemleriVeYanEtkileri
Kalınbağırsakkanseritedaviyöntemlerindecerrahimüdahele,radyasyon vekemoterapibaşlıcayöntemlerdir.Tedavikanserinyerleşim yeri(lokalizasyonu), hastanın yaşı,genelsağlık durumu,eşlik eden başka birhastalık bulunup bulunmaması,bireyseltercihlerveevresinegöredeğişiklikgöstermektedir.Tedavi öncesindehastalartedaviyöntemleri,maliyeti,hastalığınevresi,tedavininyan etkilerive yaşam standartlarına etkisiniayrıca kendilerine tedaviyönteminin
bulunduğu aşamadauygun olup olmayacağınısorgulayabilirler.Cerrahitedavi kanserintedavisindeanabasamağıoluştururkenkanserinorganlarayayılımıda büyükönem taşımaktadır.Kanserpolipaşamasındaiselenfnodlarınasıçrama olmamışisetekbaşınatümörünçıkarılmasıyeterliolurkenhastanınbeşyıllık sağkalımı %80-90dır. Kanser birinci evrede ise kemoterapi kullanılamaz.
Kemoterapidahaçokmetastazyapanvelenfnodutulumubulunanhastalarda kullanılmaktadır.İlerisafha da bulunan yanidördüncü evredekitümörlerde kemoterapisadecehastanınyaşam süresiniuzatmak,tümörüküçülterekbelirtileri azaltmak için geçiciolarak kullanılır.Fakatnüksetmiştümörlerdekemoterapi kullanılmaktadır.Cerrahimüdahaledekanserlikısım çevresindekisağlam dokularla beraberçıkartılırkenbağırsağıbağlayanmezenterdokuvelenfbezleridealınır. Rektum kanserindetümörünevresinegörecerrahimüdahaleöncesiradyoterapive kemoterapikullanılır.Yoksaradyoterapikolonkanserlerindeçoktercihedilenbir tedaviyöntemideğildir.Rektum kanserlerindetümöranüseçokyakınveyaanüsün içerisindeisekalınbağırsağınsoltarafınınbirkısmıileberaberalınmasıveikiucun birbirinebağlanmasıgerekir.[23,24-25]
Anastomozlukolonkansericerrahisindekolonunbirbölümüileetrafındaki birbölümsağlıklıbölgeçıkarılırvegeriyekalansağlıklıparçalarbirleştirilerekkolon birarayagetirilir.[26]
Birleşmeninmümkünolmadığıdurumlarisesağlam olanbağırsağınuç kısmıkarınduvarınadoğruağızlaştırılarakdiğerucukapatılır(kolostomi).Bu işlemdensonraözelkolostomitorbasıiledışkıdışarıatılır.Çoğuhastadabudurum geçiciolarakrektumvekolonuniyileşmesinebağlıolarakçıkarılırkenrektumunalt bölgesineyakınkısımdabulunantümörlühastalardabudurum kalıcıolabilir.Son yıllardadaakciğerveyakaraciğereyayılantümörlerdeçıkarılmaktavecerrahitedavi uygulanmaktadır.[24,25-26]
Kolonun kanserliolan bölümü veetrafındakisağlıklıbölüm çıkarılır, bağırsağınüstucukarınönduvarınaağızlaştırılırvekolostomitorbasıyerleştirilir. [26]
Kemoterapikyöntemlerdetümörüyokedebilmekiçinantikanserilaçları kullanılmaktadır.Sistemiktedaviolarakadlandırılanbuyöntemdeverilenilaçkan yoluylabütünvücududolaşmaktavekanserliolanvücuthücreleriniöldürmektedir. Kolonkanserininbazıevrelerivebaşkaorganlarasıçradığıdurumlardakanserli
hücreleriyoketmekiçinkullanılır.Antikanserilaçlarıağızyadadamaryoluile verilirvehastanadirendeolsabuilaçlarıyatarakalır.Hastalarcerrahiişlemöncesi (Neoadjuvant) veyacerrahiişlem sonrası(Adjuvant)buişlemigörmelerininyanı sıraradyoterapiilebirliktedealabilirler.Cerrahiişlem öncesiyapılankemoterapi tümörünküçülmesineyönelikikencerrahiişlem sonrasıkemoterapidahaçok kalabilecekolankanserlihücreleriortadankaldırmakveyakanserintekrarlamasını engellemekiçinuygulanır.[24]
Radyoterapikolonkanserindeçokfazlatercihedilmesedebazıevrelerinde kullanılmaktadır.İyonizeradyasyonilekanserhücresinintahribatınısağlayanlokal biryöntemdir.Alandabulunantümörhücrelerininyüksekenerjiliışınlarileortadan kaldırmayıhedefler.Ameliyatöncesitümörünküçülmesinihedeflerkenameliyat sonrası tümörlü hücrelerin nüksetmelerini engellemek için kemoterapi ile verilebilir.[24]
Buişlemlerkanserintedavisiniyaparkenbağışıklıksisteminiçökertme,ağrı verahatsızlıkhissi,halsizlikveyorgunluk,kabızlıkyadaishal,kanamariski, infeksiyongibiacilmüdahalegerektirendurumlar,kolostomisonrasıciltteirritasyon veenönemliyanetkisiolansağlıklıhücretahribigibihastaüzerindebirçokyanetki göstermektedir.[49]
Kemoterapininyanetkileriuygulanacakdozaveilacagöredeğişiklik göstermektedir.Kemoterapiiçinçeşitliilaçlarkullanılmaktaikenbuilaçlarınbir kısmıdoğrudan tümöre etkieden kemoterapik ilaçlarbiyolojik ajanlarveya hormonlardır.Kemoterapibüyüyenvebölünenhücrelerinortadankaldırılmasıiçin kullanılırkenilaçlarsağlıklıhücreleredezararvermektedir.Genellikleantikanser ilaçlarıhızlaçoğalanhücrelereetkiederkenençoketkilenenhücrelerbunların vücuttataşınmasınayardımcıolankanhücreleridir.Kanhücreleripıhtılaşma,doku veorganlaraoksijentaşıma,enfeksiyonlasavaşmagibibirçokişleviyaparken ilaçlarınhücrelerietkilemesiüzerinehastadayorgunlukhalsizlikhissi,kanamave enfeksiyoneğilimleriartar.Kemoterapidenençoketkilenenhücrelermide-bağırsak sistemi,kemikiliği,saçkökühücrelerigibihızlıçoğalmagösterenhücrelerdir.Saç köküetkilendiğiiçinsaçlardatedavisürecindedökülmegörülmektedir.Kolostomi sonrasıgörülenağızvedudakyaralarıgibiyanetkilerideolmaktadır.Kemoterapiye herhastanınbağışıklıksistemivevücutlokasyonufarklıolduğuiçinhastalardafarklı zamanaralıklarındafarklıyanetkileriolmaktadır.Birkemoterapidehastanıngörmüş
olduğuyanetkiyihastadiğerseferlerdegörmeyebiliryadabirkaçkemoterapi sırasındayanetkigözlenmezkensonrakikemoterapilerdeyanetkigörülebilmektedir. Kemoterapininyanetkilerinindedeğerlendirilebilmesiiçinfarklıtetkikvetestler vardır.Bunlarkansayımıvebiyokimyasaltestlerdir.Butestlerkemoterapialan hastalarabelliaralıklarlayapılarakhastalarınhemoglobin,trombosit,lökositsayıları, karaciğerveböbrekfonksiyonlarıkontroledilir.[28-29]
Kemoterapideençokgörülenyanetkilerbulantı,kusma,saçlardadökülme, iştahsızlık,ağızvedişetiproblemleri,ciltproblemleri(kurumagibi),kaslardave eklemlerdeağrı,cinselproblemler,kanama,enfeksiyonakarşıduyarlılıkartışı, yorgunluk,halsizlik,kansızlıkveishalyadakusmagibi.Buyanetkilerkemoterapi alımınınbitmesiylebirliktevücudunkendinitoparlamasürecindeortadankaybolur. Tabiyanetkilerinkaybolmasıkişininyaşıyla,hastalıkgeçmişiylevevücutdirenciyle doğruorantılıolarakdeğişiklikgöstermektedir.[28-29]
Radyoterapininyanetkileriniazaltmakvesağlıklıhücrelerinkendilerini toparlayabilmeleriiçinhaftasonu2günaraverilir.Ayrıcayanetkilerienaza indirmekiçinuygulanacakbölgeninçevresindekalandokuveorganlarıkorumak amacıileışınınetkietmesiniengellemekamacıilekurşunkorumabloklarkonulur. Yan etkileri ilk günlerde değil genellikle doz arttıkça ilerleyen günlerde görülmektedir.Yanetkivedozhastayaşına,hastalıkgeçmişinevehastanındirencine bağlıolarakdoğruorantılıbirşekildedeğişmektedir.Günlükvetoplamdoznekadar yüksekisehastadakiyanetkideokadaryüksekolmaktadır.Herdokuveorganın radyasyonakarşıdirencifarklılıkgösterir.Özellikleradyasyonakarşıtoleransıdüşük olandokuveorganların(karaciğer,böbrekgibi)bulunduğubölgelerdeçokdaha dikkatliyapılmalıdırkikolorektalkanserlerindefazlatercihedilmemesebeplerinden birisidebudur.Bazenkanyapıcıhücrelerideetkileyebilir.Mideyeyakınbölgelerde uygulananradyoterapilerdehastadaishal,kusmavebulantı,idraryaparkenağrı, iştahazalmasıbunabağlıolarakkilokaybı,cilttekızarmavekuruma,halsizlik yorgunluk hatta dışkı kaçırma gibi genel yaşamını etkileyen yan etkiler görülmektedir.[27-49]
Budurumlarhastanıngenelyaşam standartlarınıetkilediğiiçinhastanın psikolojikolaraksakendinikötühissetmesihastanındüzelmesüreciniuzatabilir.
2.3.RNAMekanizması
Son yıllarda yapılan araştırmalar, DNA’daki kontrol sisteminin düşünüldüğündençokdahakompleksyapıdaolduğudur.
2.3.1.RNAİnterferans(RNAi)
RNA interferans, gen fonksiyonu araştırmalarında üzerinde yoğun araştırmalaryapılmaktaolanyenibiralandır.RNAi,Sciencedergisitarafından2001 de‘YılınMolekülü’ve‘2002YılınınEnÖnemliBilimselHamlesi’olarakseçilmiştir. M.I.T.’denNobelödüllüProf.Dr.PhillipSharp,‘RNAinterferans,son10yılınen heyecanvericikeşfidir.’demiştir.RNA interferansgenetikçalışmalaresnasında ortayaçıkanönemlibirbuluştur.RNAimekanizmasımayalardanmemelilerekadar olantüm ökaryotlarda,benzerhücrebileşenlerininkatılımıylaoluşmuştur.RNAi canlıhücreleriçindeyeralan,hangigenlerinnasılaktivitegöstereceğinibelirleyen vekontroledensistemdir.Transkripsiyonsonrasısessizleşme,bastırılmaveyabir genindiğerineüstüngelmesigibibirçokolayRNAinterferansilegerçekleşmektedir. İkitipküçükRNA vardır.BunlargenifadesininsusturulmasınısağlayanRNA interferansyolakları,smallinterferingRNA(siRNA)vemikroRNA(miRNA)adı verilenküçükRNA parçacıklarıdır.BuküçükRNA parçalarıproteinkodlayamaz.
Genifadelerininnegatifdüzenleyiciajanlarıolarakgörevalırlar.BuküçükRNA tipleri,genlerinfaaliyetleriniazaltmadayadaarttırmadaörneğinbir mesajcıRNA 'nınproteinüretmesiniengelleyerekdiğerözelRNA'lar(mRNA)ilebağlanabilirler. Apoptozis,hücreçoğalması,hücrefarklılaşmasıvegelişimgibibirçokbiyolojikrolü üstlenmişlerdir.RNAi’ınküçükparçalarıolanbuikitüraynısentezveolgunlaşma süreçlerinden geçmelerinerağmen aralarındaönemlifarklılıklarbulunmaktadır. [30,31-66]
RNA interferansınmekanizmasıbeştemelişlem halindeözetlenebilir. Bunlar:
1. dsRNAtanımavetaramaprosesi
2. RNAideficient-1 (Dicer-RDE-1)yanibirRNaseIIIfamilyasıenzim eşliğindeçiftzincirlidsRNA’nıntanınmasıvekesilmesi
3. siRNAüretimi:21-23nukleotiduzunluğundaRNAlarınoluşması
4. siRNA-RISCkompleksiikilisininspesifikkomplemantermRNAbölgesiile bileşmesi
5. RISCiçindekiexonukleazlartarafındanhedefmRNA’nıntahripedilmesive RISCkompleksininyenibirişlemiçinbaşadönmesi.[30]
2.3.1.1.–mikroRNA(miRNA)
-mikroRNA yanimiRNA’laryaklaşık21-23nükleotituzunluğundatek iplikli RNA molekülütürüdürvegenifadesinindüzenlenmesinderoloynarlar.- mikroRNA’larkodlanmayanRNA’lardandır.YaniDNA'dantranskripsiyonuyapılan ama çevirisiolmayan,yapılmayangenlertarafındankodlanırlar. Pri-miRNA olarak adlandırılan primertranskriptlerişlenerek,önce pre-miRNA adlıkısa sap-ilmik yapılarına,sonradafonksiyonelmiRNA’yadönüşürler.OlgunmiRNAmoleküller birveya daha çok mesajcıRNA (mRNA)ile kısmitamamlayıcılardır.Başlıca işlevlerigen ifadesiniaşağıayarlamaktır.1993'teLeeveçalışmaarkadaşları tarafındanVictorAmbroslaboratuvarındakeşfedilmişlerdir.Ancak–mikroRNAyani miRNAterimiancak2001yılındakullanılmıştır.[33]Proteinüretimindeveüretimin kontrolündesayısızproteingörevlidir.miRNA’larkökhücreleri,embriyo,beyin, kalp,karaciğerdedâhilolmaküzeretüm hayvandokularınınnormalgelişiminden sorumludur.Bunlarda en ufak bireksiklik veya hata canlının ölümüne yol açmaktadırveyacanlıdahastalıkyapıcıetkendir.ÖrneğinmiRNA’nınazveyaçok üretilmesininfarklıkansertürlerinesebepolduğubulunmuştur.
-mikroRNA’larınesasetkimekanizmasıtranslasyonunbaskılanmasıdır. NormalbirtranslasyonişlemiiçinönceliklebaşlangıçfaktörlerininmRNA’ya bağlanmalarıve buyollamRNA ’nınribozomayerleştirilmesigerekir.RISC kompleksininmRNA ’nın3’translasyonuolmayanbölgeyeyerleşerekmiRNA + mRNA etkileşiminigerçekleştirmesigerekir.Dahasonrabaşlangıçfaktörlerinin mRNA’yabağlanmasınıbozaraktranslasyonubaskılar.Buesasmekanizmayaek olarak,RISC kompleksitranslasyonun başlamasından sonra da mRNA ’ya bağlanabilir.Budurumdadaribozomlarınayrılmasıylatranslasyonerkensonlanır. [32,33-34]
2.3.1.2.SmallİnterferingRNA(siRNA)
1998yılındaNobelÖdülükazananYangveMellotarfındanyayınlanan sentetikuzunçiftsarmallıRNAmoleküllerininnedenolduğusolucanlardakiRNA etkileşiminitanımladı.SentetiksiRNA ilkolarakZamorevediğerleritarafından 2000yılındatanımlanmıştır.GensessizliğiiçinenyaygınolarakkullanılanRNAi şeklidir.SentetikolarakRNAalınarakuygulanacakyereözgüsentezlenebilirler.Bu sayedeuygulanacakbölgedesusturulmakistenengenhedefalınır.
SmallinterferingRNA(siRNA)küçükRNAparçalarıolarakadlandırılırlar. Boylarıyaklaşıkolarak20-25nükleotiddir.Genlerindüzenlenmesindegörevalırlar. Susturulmasıgerekengenlerlebağlanarakbaskılamaişleminiyaparlar.Kontrol molekilüolansiRNA moleküllerimRNA’larabağlanarakonlarıkeserleryada etkisizhalegetirirler.Böylelikleproteinsentezidurdurulur.Ökaryotikcanlılarda bulunurlarvegenellikleyüksekyapılıbitkilerdevardır.ÇiftsarmalRNA (dsRNA) moleküllerinisiRNAdenilenve20 nükleotidden oluşanküçükfragmanparçalarına ayıran DİCERisimlibirenzim tarafındanbaşlatılırlar(RNAindüklenmişsusturma kompleksi (RISC)).[35,65,66-69]
Smallinterfering RNA (siRNA)poliferasyon,invazyon,anjiyogenez, metastaz,inhibisyon,sağkalımveapoptozileilişkiliolanonkogenihedeflemedeve susturma potansiyeliile terapötik uygulamalarda çok fazla ilgigörmektedir. TerapötikuygulamalardasiRNA’yıminimum hedefdışı etkilere,aktifolarakise hedefespesifikbirşekildetasarlamakgerekirkensiRNA’nıninvivoolarakhedef hücrelere etkilibirşekilde verilmesinisağlamak en zoradım olarak kabul edilmektedir.Genelolarakgentaşıyıcılarviralvenon-viraltaşıyıcıolmaküzere ikiyeayrılabilmektedir.[65-69]
Geçmişten beri, siRNA aracılı gen sessizleştirme, klinik öncesi araştırmalarda,genineözgüsessizleştirilmesibakımındanbaşkabirtedaviyöntemi olarakönemlibirgarantivermeyebaşlamıştır. Çokuzunzamanöncelerdeinvivo siRNA verilmesionarıcıbiryöntem olarakkullanılmadaönemlibirengelolarak görülmekteydi.[68]
BirmemelihücresisiRNA gibiçiftsarmallıbirRNA ilekarşıkarşıya kaldığındaonubirviralyanürünolarakalgılayabilirvebirbağışıklıkcevabı başlatabilir.siRNA’nınhücreyegirmesidiğertehditaltındaolmayanproteininde
saldırıyauğramasıveelenmesidurumunuortayaçıkarabilirvehedeflenmemiş hedeflemeyenedenolabilir.VücuttaçokfazlasiRNA’nınbulunmasıdoğalbağışıklık tepkilerininaktivasyonunedeniylespesifikolmayanolaylaranedenolabilir.Ancak herhangibirgeniyenmekabiliyetigözönünealındığındasiRNA'larbirçokterapötik kullanımiçinpotansiyelesahiptir.[35]
MemelilerdekiilkterapötikuygulamasiRNA ileFasaracılıkaraciğer fibrozlubirfaredeFas'ınaşağıdüzenlenmesiilegösterildi. Fas'akarşısiRNA ile tedaviedilenfarelerin% 82'sinin,kontrolgrubu4için3günilekarşılaştırıldığında 10günboyuncahayattakalabildiklerigözlendi.Hücretürünespesifiksevkıyatiçin ilkörneklerdenbiri,siRNA'nınprotamin/antikorilekonjugeedildiğizaman gösterildi.[67]
Alnylam Inc.veMassachusettsTeknolojiEnstitüsü(MIT)işbirliğiile binlercefarklılipidbenzerimoleküllerdenoluşanbirkütüphaneyisentezlemekiçin birprojeüzerindeişbirliğiyaptı.DahasonrasındaisesiRNA'yısunmaverimliliği için onlarıtaradı. Solunum hastalığınıtedavietmek için farelerde bu iletim sistemlerinitestettiler.Moleküllerininbirkısmınınmevcutolmayankapsüllenmemiş siRNA vermeilekarşılaştırıldığındasiRNA vermedeonkatdahaetkiliolduğunu buldular.[67]
Yakınzamandakanserlerveenfeksiyonlardâhilolmaküzeregenişbir yelpazedekibozukluklarıntedavisiiçinyeniterapötiksınıflarolarakaraştırılmıştır. GerçektendesiRNA’larınkanserdedâhilolmaküzerebirçokfarklıhastalığınve enfeksiyonuntedavisindeterapötikpotansiyelininolduğugörülmüştür.Örneğin;
enzimatikbirfonksiyoneksikliğinde,ilaçmolekülleriiçinerişiminsağlanamadığı proteinlergibihedefeyöneliketkietmeyimümkünkılmaktadır.[65-66]
siRNA’larıterapötik özelliklerinigeliştirmek üzere kimyasalolarak modifiyeederekkullanabiliriz.[35-65]
Modifiyeederekkullanılmaşekilleri;
Geliştirilmişetkinlik
Artmışserumstabilitesivedahaazhedefdışı
Azalmışimmünolojikaktivasyon[35]