F.\BAD Farın. Bil. Der.
9, 5 -14, 1984
FABAD J. Pharm. Sel.
9, 5 -14, 1984
İnsülin, Safralaştınlması ve Sentetik İnsülinler
Sinan BOYLUOCLU
c•J
İNSÜLİN, SAFLAŞTIRILMASI VE SENTETİK İNSÜLİNLER Özet : İnsülin, A zincirinde 21, B zincirinde 30 aminoasid ihtiva eden iki peptid zincirinden meydana gelmiş bir polipeptiddir. A ve B zincirleri birbirine iki _disülfid köprüsüyle bağlanmıştır .. Bu yazıda do- muz insülininin safla.ştınlması, klinik avantajları, sentetik insülinler ve saf domuz insülini ile eşdeğer oldukları hakkında bilgiler derlen-
miştir.
INSULİN, PURIFICATION AND SYNTHETIC INSULINS Summary : lnsulin is a polypeptide consisting of two peptide chains containing 21 aminoacids in the A chain and 30 aminoacids in the B chain. The chains are connected with two disulphide bridges.
In this article information about purification of pork insulin, clinical advantages. synthetic insulins and their identity to highly purified pork insulin have been reviewed.
İNSÜLİNİN KİMYASAL YAPISI VE SAFLAŞTIRILMASI
A. zinciri B. zinciri
Türler 8. Aminoasid ıo. Aminoasid 30. Aminoasid İnsan Threonine Isıleucine Threonine
Domuz Threonine Isıleucine Alanine
Sığır Al anine Valine Alanine
C*l Müderrisoğlu İlaç Sanayü ve Ticaret A.Ş., İstanbul.
8 ve 10 no.lu aminoasidler in- sülinin esas biolojik aktivitesinin
görüldLiğü bölge içinde olduğun
dan sığır insülinindeki farklılık bu insülinin antijenik olmasına, anti-
ınsülin antikoru gelişmesine ve re- zistans teşekkülüne neden olmak-
tadır. Bu aminoasidlerin kimyasal olar ak değiştirilmesine imkan yok- tur. Domuz insülininde ise 30 no.lu aminoasid kimyasal olarak değişti
rilebilmektedir. Normal haliyle bile domuz insülini immün reaksiyonla-
rı önemli ölçüde harekete geçirme- mektedir. İnsülinin molekül ağır
lığı 6000 civarındadır. İnsülin, do- muz pankreasından elde edilip çin- ko iyonuyla laistallendirildiğinde
sabit biolojik aktiviteli bir bileşim
elde edilir. Rekristalizı:ı-syonla kon- vansiyonel Cticaril insülin adı ve- rilen % 90 saflıkta insülin ele ge- çer, % lO'u ise elektroforez ve kro- matografi ile teşhis edilebilen insü- lin benzeri maddelerdir Cl, 2l. Rek- ristalize insülin, jel kromatografisi- ne tabi tutulunca molekül ağırlık
larına göre ayırımla b ve c frak-
siyonlarına ayrılır. b-fraksiyonu in- sülin dimer, proinsülin gibi mole- kül ağırlığı 9000-12000 civarında olan proteinleri ihtiva. eder. c-frak- siyonu ise insülin, deamido-insülin.
etilester-insülin gibi molekül ağır
lığı 6000 civarında olan proteinleri ihtiva eder. Bazı kaba insülin pre- paratlannda molekül ağırlığı 15000 civannda o:an proteinleri ihtiva eden a-fraksiyonu da bulunabil- mektedir. Jel kromatografisiyle izo- le edilen c-fraksiyonuna 'kroma-
tografiye insülin' veya 'tek pik in- sülin' adı verilir ve % 99 saflıkta
insülin ihtiva eder, bu insülinin %
s-ıo'u deamido insülin halindedir.
% 99'un üstünde saf insülinler, yüksek derecede saflaştırılmış do- muz insülini: HPPI Chighly purifi- ed pork insulinl ise total net şarja göre ayırım yapan iyon değiştirici
kromatografiye tabi tutulmasıyla
elde edilir. Jel kromatografisi ve iyon deği~tirici .kromatografi uygu- lanarak elde edilen insulin, yüksek derecede saflaştırılmış insülindir.
Bu insülinin saflığı, disk elektro- forezi, jel veya iyon değiştirici kro- matografiyle değerlendirilebilir. Bu tekniklerin ölçüm limiti % 0.2 (2000 ppml 'ye kadardır. % 0.2'nin altı öl-
çülemediği için radyoimmün test- ierlo daha iyi karakterize edilebi- lir. Son birkaç sene içinde pankre- r.stan ekstre edilen insüllnle vazo- aktif intestinal polipeptid CVIPJ, pankreatik polipeptid CPPl, soma- tostatin ve glukagon gibi antijeni- teye sebep olan pankreatik hor-
monların ortama karıştığı görüldü.
Bloom ve arkadaşları bu hormon-
ların konvansiyonel insülinlerde
varolduğunu, HPPI'de ise ölçüleme-
diğini bildirdiler (3).
İnsülin preparatları ile tedavi- de çeşitli tipte antikorlara raslana- bilmektedir. En çok üzerinde duru-
lanı antiinsülin antikorlarıdır. An- tikorlar direkt olarak insüline, in- sülin türevi maddelere veya hor·
monal kontaminasyonlara karşı ol-
maktadır. Amaç, ınsülinin antije-
nikliğini düşürmek olduğu için üç
önemli faktör ortaya çıkmaktadır : tür, fannasötik şekil ve saflık.
Tür
Ben,on ve Yalow (1) konvansi- yonel sığır insülininin domuz in- sülininden çok fazla antijenik oldu-
ğunu, Deckert ve Andersen Cs> de HPPI'nin minimal derecede antije·
nik olduğunu veya bazı vakalarda hiç antijenik olmadığını gösterdi·
ler. Bu bulgular insülin üreticileri- ni HPPI üretmeye yöneltti. Altı ay-
lık bir klinik çalışmanın sonuçları şöyledir: Sığır/domuz karışımı kon- vansiyonel insl.ılin verilen diyabet- lilerde antikor teşekkülü % 98, konvansiyonel domuz insülini veri- lenlerde % 74 iken, HPPI verilen- lerde % 5 olarak bulunmuştur.
Farmasötik Şekil
Farmasötik şeklin önemli oldu-
ğu da beklenebilir, immünoloji bii- gilerine göre bir maddenin enjek- siyon alanında uzun b'.r zaman ka- lacak şekildeki enjeksiyonu o mad- denin anLijenikliğini arttırmaktadır.
Bu durum insülin için de geçerli- dir ve birçok deneyle gösterilmiş
tir. Andersen (6} domuz, Chance (7} ise sığır insülini kullanmıştır.
Uzun tesirli insülin preparatı kul- lanarak günlük enjeksiyon sayısı
azaltılabilmektedir. Bunun yanında
amaç, suspansiyonun antijenikliği
ni minimuma indirmektir.
Saflık
b-fraks!yonundaki insülin ben- zeri kontaminasyonlar immünolojik
açıdan büyük önem taşımaktadır.
a-fraksiyonundakiler ise muhteme- len insülinin haptan olarak bağ
landığı proteinler veya antijenik gruplar taşıyan proteinlerdir. b·
fraksiyonunda.ki proinsülin büyük önem taşımaktadır. Konvansiyonel veya yetersiz saflıkta insülinle te- davi yalnız antiinsülin antikorları
nın değil, proin<ıüline ve a-fraksi- yonuna karşı özel antikorların te- şekkülüne de yol açar. İnsülin benzeri olmayan pankreatik hor- monlara karşı antıkor teşekkl.lünü
0nlemenin tek yolu saflaştırmadır.
Bloom (3} 93 diyabetlide konvan- siyonel insülin kullanarak % 47 PP antikoru, % 7 V1P antikoru, % 6 glıtkagon antikoru buldu. HFPI kullanan diyabetlilerde ise antikor
bulunamadı. Antiinsülin antikoru- nun oluşması problemi HPPI'lerin takdimiyle büyük ölçüde çözülmüş
tür. Saflaştırılmış sığır, sığır/d'J
muz insülinleriyle yapılan çaitş
malar ise iyi netice vermemiştir.
Chance (7) yüksek derecede saf-
laştırılmış sığır zinc-insülin sus- pansiyonunun, konvansiyonel sı~r zinc-insülin suspansiyonuna göre hiçbir üstün tarafını bulamamışt.r.
Crraber ve Fankhauser (8) sığır :ıinc-insülin suspansiyonunun ba7- ka bir kromatografiyle saflaştırıl
mış şeklinin. konvansiyonel sığıx zinc-insüim suspansiyonuna göre çok az farklı olduğunu bulmuş, ay-
nı saflıktaki domuz zinc-insülm suspansiyonunun ise çok diişük ss- viyede antijeniklik gösterdiğini bu.·
muşlardır. Hansen (9) bu :wrlukl~
rı yenebilmek için değişik bir yo:
la sığır NPH insülini üretti. İnsi.i
lini dissosiasyon ortamında dira".{t olarak protaminle reaksiyona sok .... - rak izole etti, normal ara çöktür- me ve kristalizasyon işlemlerinden
uzak tuttu. Diğer sığır insülini prıJ.
paratlanna göre antijenik açıda'1
bi.raz daha iyi sonuç aldı. Bu dı1.
rum, insülinin moleküler durumu·
nun önem taşıyabileceğini göst'l•· · mektedir.
Antikor teşekkülünde has :,.ı,
faktörünün de rolü vardır. HPPr- nin bazı hastalarda düşük mikta:·
da antikor teşekkül ettirmesi ba7L hasta faktörlerine bağlıdır. Bu fak-
t&ı lerin en önemlisi HLA antijenl::-
ridir. HLA antijenlerinden B-15 v~
ya Dw-4 antijenle.-ini taşıyan diy;ı.
betliler, taşımayanlara göre ek.;;ıl · jen lnsüline karşı antikor teşekkul
ettirme eğilimindedirler. Eksojen i.n- süline antikor teşekkül eğilimi bü . yük bir çoğunlukla erken yaşta di · }'abat olmuş kişilerde görülmekte- dir. Bu nedenle de jüvenil diyabet- liler erişkin diyabetlilere göre ek·
sojen insüline daha fazla immün re ..
aksiyon göstermektedir (10}.
Yüksek Saflıktaki Domuz İnsü
Jininin Klinik Avantajları
- Minimal seviyede antikor te-
şekkülü veya hiç antikor teşekküt
etmemesi : İnsülinin saflaştınlına·
sı, hormona! kontaminasyonlara ve·
insülin benzeri proteinlere karş.,
domuz türünün seçimi de insüllı'rı karşı antikor teşekkülünü önle- mekte ve minimuma indirmekte-
dir. Genetik yapı değişikliği Cbazı
HLA tiplerD onlarda insüline karşı
immün reaksiyonlar hala beklen- mektedir. Birçok diyabetlinin HPPI ile tedavisi immünolojik açıdan ba-
zı belirli avantajlar ve kronik im- munolojik dıırı1mlarda da bazı muhtemeı avc-.ntajlar göstermiştir.
- İnsülin dozunda azalma : Yüksek insülin dozuna ihtiyaç du-
yulması, düzensız diyet sonucu ol-
duğu gibi enjekte edilen insülinin antikorlara bağlanıp inaktif hale geçmesi sonucu da olmaktadır.
HPPI kullanılması, önceden kon- vansiyonel insülin kullananlarda önemli bir doz azalması sağlamak
ta ve yeni teşhis edilmiş diyabetli- lerin de düşük dozlarla tedavisini mümkün kılmakt::ıdır (5, 11, 12, 131.
Konuyla ilgili :;::.lışn;alar. sonuçta
% 25'lik bir doz azalmasının ger-
çekleştiğini ortaya koymaktadır.
- Azalan lokal reaksiyonlar : HPPI kullanılması, enjeksiyon sat-
hındaki kızarıklık ve kaşınma gibi lokal allerjik reaksiyonları ve im- mün reaksiyonların sonucu ortaya
çıkan lipoatrofiyi önlemektedir.
l.ipohipertrofi ise daha ziyade dar bir alana yapılan sık enjeksiyon so- nucu olmaktadır.
- Diğer muhtemel avantajlar : Remisyon süresinin uzaması bazı
diyabetlilerde önemli ölçüde doz
azalmasına ve antikor teşekkül et- memesine bağlı olarak görülmüş
tür. Antijenik insülin kullanan ve antikor teşekkül edenlPrde bu sü·
re çok kısa olmaktadır. Teşekkül
Hasta
İnsülin Sayısı
Rekristalize domuz 31
HPPI 33
eden antikorlarm remisyon süre- sinde biraz artmış olan endojen in- r,ü!Lrü kısmen nöt:ralize ettiği tah.
min edilmektedir r 131.
Uzun süreli veya geç diyabetik komplikasyonlar (retinopati, nöro- pati, nefropatil diyabete sekonder
olduğu için bunların azaltılma ve- ra önlenme imkanı doğmaktadır.
Bu teori, kan glikoz kontrolunun iyi temin edildiği, komplikasyonla-
rın sıklığını vey:ı ciddiliğini azal- tan birçok deneyle doğrulanmıştır
(16, 17l. Sonuç olarak diğer faktör- . ler, başta immwıolojik faktörler rol
oynamaktadır, antikor ile kompli·
kasyon arasında bir ilişki mevcut- tur.
Wehner, insülinin antiienik a ve b komponenti ile immünize
edilmiş tavşanların glomeı üler
membranlarında nodüler değişiklik gözlemiş, HPPI ile ise bu değişik
likleri görmemiş Lir (18). Andersen, komplikasyonlu grupta · komplikas- yonsuz gruba göre yüksek antikor seviyesi ve bazal membran kalınlı
ğı ile antikor seviyesi arasında bir korelasyon olduğunu bulmuştur
Cl3l. Tavşanlarda yüksek antikor
teşekkül ettiren im,ülin uygulama-
sı büyük miktarda insülit sıklığı göstermiş, HPPI uygulamasında ise insülit görülmemiştir (19). İnsülin/
antikor komplekslerinin plasenta!
Tedavi Günlük
Süresi İhtiyaç
13.4 ay 32.5+2.4 UI
18.7 ay 24.6+2.o uı
transferi insülin uygulanan diya- betli kadınların bebeklerinde gös-
terilmiştir (20, 21). Doğumdan kı
sa bir süre sonra bebeklerde insü- lin salgılamaya karşı anormal bir tepki görülmüştür C22ı. Diyabetik komplikasyonlar 10-15 sene sonra
ı~eliştiği için HPPI'nin komplikas.
yonlar açısından avantajı tam bir kesinlik kazanmamışsa da yukarıda
bahsedilen bulgular ve hemen gö.
rülen diğer avantajları şu endikas-
yonları ortaya koymaktadır:
- Bütün yeni teşhis edilmiş
insüline bağımlı diyabetliler.
- Fasılalı insülin uygulaması gerektiğinde Chamilelik, cerrahil.
- Diğer tip insülinleri kulla- nan bütün jüvenil diyabetliler.
- Kişisel muhakeme ile fakat her halikarda lipoatrofi veya yük- sek insülin ihtiyacı görülenler.
SENTETİK İNSAN İNSÜLİNLE·
Ri
İnsan Pankreas İnsülinl İnsan pankreasından insülin, hayvan insülinindeki metodla izole
edilmiştir (24, 25). Kristal insan in- sülini, konvansiyonel sığır ve do- muz insüliniyle saflık açısından
mukayese edilebilir ve poliakrila-
mid jel elektroforeziyle değerlen
dirilebilir. Muhteme:en aynı konta-
minasyonları ihtiva etmektedir.
Konvansiyonel kristal insan insüli·
ninin domuz insülinine göre biolo- jik aktivitesi ve antikor teşekkülü
mukayese edilebilir.
Kimyasal Sentez ile İnsülin
Biolojik aktif insülinin ilk kim- yasal sentezi 1963'te yapıldı (26, 27). Bu metodda önemli problem, a ve b zencirinin doğru sentezin- den ziyade bu iki zinciri doğru şe
kilde birbirine bağlamakta görül- mektedir. Sieber (28) sistein için
değişik koruma grupları kullanarak disülfid bağlarının teşekkülünü sağladı. Bu sentetik materyal, bio- lojik aktivitesini doğrulayan bir- kaç biolojik ve klinik araştırma
larda kullanıldı (29-31). Fakat bu metodla ürün çok düşük olmakta.
brkaç yan ürün vermekte ve ma- liyeti çok yüksek olmaktadır.
Domuz İnsülininden İnsan İnsü
lini (Semisentetikl
İnsan ve domuz insülinlerinin
yapıları B-30 pozisyonundaki ami- noasid ile birbirinden farklılık gös- termektedir. Domuzdaki alanin, threonin ile enzimatik semisentez yoluyla değiştirilebilmektedir. Ter- minal aminoasidin B zincirine doğ
ru parçalanmasının sınırlandırıl
ması ve biolojik aktivite için önem- li olan A zincirindeki terminal aminoasidin korunması oldukça zor olmaktadır. Bu sorun, özel bir tampon içinde karboksipeptidaz A
kullanarak yalnızca terminal uçta enzimatik parçalanma sağlanması şeklinde çözülmüştür (32). Proteo- litik enzimler peptid bağlarının teşekkülünü katalize edebilmekte- dirler (33) ve alanini ayırılmış do- muz insülinine threonin bağlanma
sında kullanılabilirler ve sonuçta insan insüliniyle aynı yapıda bir insülin ortaya çıkar. Parçalama ve
birleştirme işlemleri sırasında bazı
yan ürün çeşitleri ortaya çıkabilir.
Rekombinant DNA Tekniği ile İnsan İnsülini CBiosentetikl :
Bu teknikle insan insülini üret- menin iki stratejisi vardır. İlk yak-
laşım messenger RNA ile başla
makta, zıt transkriptaz kullanarak DNA kopyası yapılmakta ve bu da bir plazmid vektörüne bildirilmek- tedir. Hibrid plazmid, bakteri transformu için kullanılır. Genin
taşıdığı bilgiler tamamen aktif bir
hızlandırıcı unsura bağlıdır, bağlı C>lmadığı taktirde bakteri hücreleri
yabancı DNA'yı çoğaltmazlar. Bir
diğer yaklaşımda A veya B zinciri- ne uyan DNA pBR 322 plazmidi- nin betagalaktozidaz genine ilave edilmesidir (34). Betagalaktozidaz geninin tabii hızlandırıcısı bir hib- rid proteinin parçalanması şeklin
de kimyasal bir metodla izole edi- lir. İki zincir de birbirine bağla
narak insan insülini yapısında in- sülin elde edilir (35l. İzole edilen
bileşiğin insan pankreasından izo- le edilen insüline biolojik ve kim- yasal eşdeğerliği görülmüştür (36, 371. Bakteri toksinleri, insülin rü-
r
revleri, polimerler ve izomerler ta- yin edilmelidir.
Sentetik İnsülinlerin Klinik ÖzeJlik1eri :
Sentetik insülinlerin kan gli- kozunu düşürücü etkisi HPPI ile
eşdeğer bulunmuştur (24, 29, 41, 42, 44, 46l. Deri reaksiyonları ve antijenik özeliikleri de eşdeğerdir
(45). Sentetik insülinlere karşı ge-
lişen antikorlar HPPI'ne karşı geli-
şen antikorlardan ayırt edileme- mektedir (38, 47>. Sentetik insülin- Jerin inandırıcı immünolojik avan-
tajları henüz tesbit edilememiştir (39, 43). Selüloz absorbsiyon meto- du ile yapılan bağlanma testlerin- de sentetik insülinlerle HPPI'nin antiinsülin antikorlarına eşit ola- rak bağlandığı gözlenmiştir C40l.
Gönüllülerle, diyabetlilerle ve in vitro yapılan kimyasal, fiziksel ve biolojik testlerin sonuçlan incelen-
diğinde sentetik insülinler, insan
pankreasından izole edilen insülin ve HPPI her konuda eşdeğer bir görünüm arzetrnektedir (38, 481.
CGeliş Tarihi : 6.6.19831
KAYNAKLAR
1. Mirsky, I.A., Kawamura, K.,
«Heterogeneity of Crystalline Insulin», Endocrinology, 78, 1115-1119, 1966.
2. Steiner, D.F., Hallund, O., Ru- benstein, A., Cho, S. Bayliss, C., dsolation and Properties of Proinsulin, Intermediate Forms, and Other Minor Components
from Crystalline Bovine Insu- lin •, Diabetes, 17, 725-736, 1968.
3. Bloom, S.R., al., Gut Hormones, Bloom, S.R. Ced l, 318, Churc- hill Livingstone, 1978.
4. Berson, S.A., Yalow, R.S., cln- sulin in Blood and Insulin Antibodies», Am. J. Med. 40, 676-690, 1966.
5. Deckert, T., Ortved Andersen, O., Poulsen, J.E .. «The Clinical Significance of Highly Purified Pig-insulin Preparations•, Dia- betologia, 10, 703-708, 1974.
6. Andersen, O., O., dnsulin An- tibody Formation : 2 : The Influence of Species Differen- ce and Method of Administra- tion•, Acta Endocrinologica, 72, 33-45, 1973.
7. Chance, R.E., Root, M.A., Gal- loway, J.A., «The lmmunogeni- city of Insulin Preparations•.
Acta Endocrinolo,_·ica, suppl.
205, 1976.
8. Graber, D., Fankhauser, S.,
«Die Antigenitaet Einiger Neu- er, Chromatografisch Gereinig.
ter Depot - Insulin - Prepara- te•, Schweiz. Med. Wschr. 108, 46, 1807-1809, 1978.
9. Hansen, B., al., «Studies on the Immunogenicity of Bovine In- sulin•, . Diabetologia, 13, 399, 1977.
10. Rotter, J.I., Rimoin, D.L., «He- terogeneity in Diabetes Melli- tus. Up'date, Hl78•, Diabetes, 27, 599-605, 1978.
tı. Oakley, N.W., «Effect of 'Frac- tionated' lnsulins on Total Plasma Insulin Binding Capa- city and Insulin Requirement in Severe Diabetes», Lancet, May 8, 994-996, 1976.
12. Daggett, P.. Mustaffa, B.E., Nabarro, J.D.N., Reader's let- ter, Lancet, May 22, 1133-1134, 1976.
13. Andersen, O., Egebjerg, J., •The Clinical Significance of Insu- lin Antibodjes», Acta Paediatr, Scand., Suppl. 270, 63-67, 1977.
14. Daggett, P., Mustaffa, B.E., Nabarro, J.D.N., «lmprove- ments in Skin Reactions to In- sulin, Produced by a Highly Purified Preparation», Brit. J.
Derın., 96, 439-443, 1977.
l5. Wentworth, S.M., Galloway, J.A., Davidson, J.A., Root, M., A., Chance, R.E., Haunz, E.A., «An Update of Results of the Use of 'Single Peak' CSPJ and 'Single Component' CSC>
lnsulin in Patients with Comp- lications of Insulin Therapy», Diabetes, 25, rnppl. l, 326, 1976.
16. Pirart, J., «Diabetes Mellitus and its Degenerative Compli- cations : A prospective Study of 4400 Patients Observed Bet- ween 1947-1973», Diabetes Ca- re, 1, 168-188 CMay-Junel and 252-263 (July-aug.J, 1978.
ı 7. Gundersen, H.J.G., 0sterby, R., Lundbaek, K., «The Basement Membrane Controversy», Dia- betologia, 15, 361-363, 1978.
18. Wehner, H.. Huber, H., Kro- nenberg, K.H., «The Glomeru- lar Basement Membrane of the Rabbit Kidney on Long-Ternı
Treatment with Heterologous Insulin Preparations of Diffe- rent Purity,)> Diabetologia, 9, 255-263, 1973.
10. Klöppel, G., Freytag, G., c<Insu- lin Antibodies and Immune In- sulitis in Rabbits Immunized with Bovine or Porcine Insu- lin Components•, Horm. Metab.
Res., 7, 25-30, 1975.
w. Tamas, Gy., Jr., Bekefi, D., Gaal, O., «Insulin Antibodies in Diabetic Pregnancy», Lancet March 1, 521, 1975.
21. J 13gensen, Kai R., Deckert, T., M13lsted Pedersen, L., Peder- sen, J., ·lnsulin, Insulin Anti- body and Glucose in Plasma of N<'Jwborn Infants of Diabetic Women», Acta Endocrinologi·
ca, 52, 154-167, 1966.
22. Pedersen, J., Meılsted Peder- sen, L., J0rgensen, K.R., «ln- sulin and Glucose in Plasma from Umblical Vem and Heel Blood of Newborn Infants of Diabetic Women», Acta Endoc·
rinlogica, 53, 310-314, 1966.
23. Alberti, K.G.M.M., Nattrass, M., «Highly f'urilied Insulins», Diabetologia, 15. 77-80, 1978.
24. Smith, L.F., «lsolation of Insu- lin from Pancreatic Extracts Using Carboxymethyl and Di- ethylaminoethyl Celluloses•,
Biochim. Biophys, Acta.. 82, 231-236, 1964.
25. Bıımfeldt, K., Deskert. T., Thomsen, J., «Human Crystal- line Insulin from Non-Diabe- tic and Diabetic Patients-, Ac- ta Endocrinologica ICopenha- genl, 60, 543-549, 1969.
26. Katsoyannis, P,G., Tometsko, A., Fukuda, K., «lnsulin Pepti- des. 9. The Synthesis of the A-Chain of Jnsulin and its Combination with Natural B- Chain to Generate Insulin Ac- tivity•, J. Am. Chem. Soc. 85, 2863-2865, 1963.
27. Meinhofer, J., Schnabel, E., Bremer, H., Brinhoff, O., Zabel, R., Sroka, W., Klosterıneyer,
H., Brandenburg, D., Okuda, T ..
Zahn, H., ·Synthese Der Insu- Jinketten Und ihre Kombinati- on zu Insulinaktiven Praepa- raten•, Z. Naturforsch, 18, 1120-1121, 19ö3.
28. Sieber, K., Kamber, B., Hart- mann, A., Jöhl, A., Riniker, B., Rittel, W., «Totalsynthese von Humaninsulin Gezielter bil- dung der Disulfidbindungen•, Helv. Chim. Acta., 57, 2617- 2621, 1974.
29. Maerki, F., Albrecht, W., «Bio- Jogical Activity of Synthetic Human Insulin .. , Diabetologia, 13, 293·295, 1977.
30. Teuscher, A., «Die Biologische Wirkung von Vollsynthetisc- hem Humanem Insulin bei Pa-
tienten mit Diabetes Mellitus•, Schweiz. Med. Wochenschr.
109, 743-747, 1979.
?l. Diem, P., Teuscher, A., «Iınmu
nologische Untersuchungen mit Vollsynthetischem Hııma
nem Insulin bei Patienten mit Dü.betes Mellitus•, Schweiz.
MP.d. Wochenschr., 109, 1814- 1816, 1979.
32. Schmitt, E.W., Gattner, H.G.,
«Verbesserte Darstellung von
Desalar~yl B30-lnsulin•, Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Cheın., 359, 799-802, 1978.
33. Morihara, K., Oka, T., Tsuzuki, H., «Semi-Synthesis of Human Insulin by Tripsin-Catalysed Replacement of Ala-B30 by Thr. in Porcine Insulin•, Natu- ra, 2Bll, 412-413, 1979.
::"4. Crea, R., Kraszewski, A., Hiro·
se, T., Itakura, K., «Chemical Synthesis of Genes for Human Insulin•, Proc. Natl. Acad, Sci.
USA., 75, 5765-5769, 1978.
35. Riggs, A.D., Itakura, K., «Synt- hetic DNA and Medicine•., Am.
J. Hum. Genet., 31. 531-538, 1979.
36. Chance, R.E., Kroeff, P.E., Hoff- mann, J.A., «Chemical, Physi- cal and Biological Properties of Recombinant Human Insu- lin•, Gueri.gian, J.L., Miller, H.
I., Schaffenburg, C.A., Grego.
ire, A.T., Sobel, S. (eds), Insu- lins, Growth Hormona and Re- combinant DNA Techonology,
Raven, Press., New York, 71·
86, 1981.
37. Keen, H., Pickup, J.C., Bilous, R.W., Glynne, A., Viberty, G.C., Jarrett, R.J. cHuman Insulin Produced by Recombi- nant DN ~ Technology : Safety and Hypoglycaemic Potency in Healthy Men•, Lane et, 2, 398·
401, 1980.
38. Beischer, W., Maier, V., Jonat- ha, E.M., Hartweg, D., Kratz- sch, G., Diabetes Care, 4, 202- 204, 1981.
39. Diem, P.. Teuscher, A.. Schwe- iz. Med. Wschr .. 109, 1814-1816, 1979.
40. Kerp, L., Steinhilber, S., Kase-
ınir, H., Klin Wschr., 44, 560·
567, 1966.
~1. Massi-Benedetti, M., Burrin, J.M.. Capaldo, B., Alberti, K.G.M.M.. Diabetes Cara, 4, ] 63-16'7, 1981.
42. Raptis, S., Karaiskos, C., Enz·
mann, F .. Hatzidakis, D., Zou- oas Ch., Souvatzoglou, A., Dia- mantopoulos, E., Moulopoulos, Sp., Diabetes Carc, 4, 155-162, 1981.
43. Teuscher, A .. Diem, P., Diabe- tologia, 13, 435-436, 1977.
44. Viberti, G.C., Pickup. J.C., Keen, H., Bilous, R.W., Mat- tock, M .. Jarrett, R.J., Glynne, A., Rogers, R., Diabetes Care, 4, 175-179, 1981.
45. Waldhaeusl, W., Kastner, G., Komjati, M .. Bratusch-Marrain, P. Diabetes Care, 4, 205-208, l981.
46. Weinges, K., Ehrhardt, M., Enzmann, F .. Diabetes Cara, 4, 180-182, 1981.
47. Velcovsky, H.G.. Laube, H., Weil, I., Federlin, K., Tagung der Dtsch. Ges. f. Medizin, Wiesbadan, 26-30.4.1981, Kong-
ressberichtsband 154-159, Berg-
mann-Verlag, München, 1981.
