İzmir Orta Körfezi’nden İzole Edilen Biyolüminesen Vibrio İzolatının Poli-Β-Hidroksi
Bütirat (PHB) Üretim Verimliliğinin Belirlenmesi
Esra ERSOY ÖMEROĞLU* İsmail KARABOZ
Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,35100 Bornova-İzmir
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : 06.01.2010
e-posta: esra.ersoy@ege.edu.tr Kabul Tarihi : 08.02.2010 Özet
Bu çalışmada, İzmir Orta Körfezi’nden temin edilen sediment örneğinden biyolüminesens özellik gösteren bir bakteri izole edilmesi ve poli-β-hidroksi bütirat (PHB) üretim verimliliğinin belirlenmesi gerçekleştirilmiştir. Lüminoz izolatın Vibrio selektif tiyosülfat sitrat bile sükroz agar (TCBS) ortamındaki üreme özelliği ve koloni çapı, antibiyotik direnç profili değerlendirilmiş ve Vibrio sp. olarak tanılanmıştır. PHB verimliliğinin belirlenmesi aşamasında, Sudan Black B ve fluoresen boyama ile PHB’nin hücre içinde belirlenmesi, fluoresen mikroskopta PHB’nin belirlenmesi, PHB standardının çıkarılması, kuru hücre ağırlığının saptanması, PHB % veriminin hesaplanması gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda biyolüminesen Vibrio sp.’nin en yüksek PHB verimini 42. saatte verdiği ve %24 oranında verim olduğu tespit edilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Biyolüminesens, Vibrio sp., poli-β-hidroksi bütirat (PHB), İzmir Körfezi
Determination of Poly-Β-Hydroxybutyrate (PHB) Productive Efficiency of Bioluminescent
Vibrio sp. Isolated From Middle Bay of Izmir
AbstractIn this study, it was performed that isolation of bioluminescent bacterium from sediment sample obtained from middle bay of Izmir and determination of its poly-β-hydroxybutyrate (PHB) productive efficiency. It was evaluated that growth characteristic and diameter of colony on thiosulfate citrate bile sucrose agar (TCBS) medium and it is identified as Vibrio sp. During determination of PHB efficiency, it was implemented that determination of PHB in cell with sudan black B and fluorescent staining, formation of PHB standard graphic, detection of dry cell weight, calculation of PHB % efficiency. As a result of the study, it is achieved that bioluminescent Vibrio sp. has the highest efficiency of PHB at 42. hour and yield of PHB is %24.
Keywords: Bioluminescence; Vibrio sp.; Poly-β-hydroxybutyrate (PHB); Izmir Bay
GİRİŞ
Polihidroksialkanatlar (PHAs), değişik bakteriler tarafından karbon kaynağının azot, sülfür, fosfor ya da oksijen gibi diğer besinlerden daha fazla içerildiği dengeli olmayan büyüme koşullarında akümüle edilen poyesterlerdir [1]. Bakteriyal PHA, karbon ve enerji kaynağı için depo materyali olarak intrasellüler olarak üretilmektedir. PHA petrokimya bazlı plastiklerle benzer özelliklere sahiptir [2]. Bu polyesterler biyolojik olarak parçalanabilirler ve biyouyumludurlar. Bu nedenle petrol bazlı olmayan biyolojik olarak parçalanabilir plastiklerin gelişimi için faydalıdırlar [1].
Polihidroksibütirat (PHB), sentetik polimerlerle potansiyel olarak yarışabilme özelliğiyle PHAs ailesinin en önemli üyesidir. PHB, Alcaligenes, Bacillus, Pseudomonas ve Rhizobium genusları gibi değişik bakteriler tarafından akümüle edilmektedir [3]. Fakat şimdiye kadar yalnızca birkaç tane denizel PHA üreten mikroorganizma rapor edilmiştir [1].
Bu mikroorganizmalar arasında Vibrio sp. türleri de bulunmaktadır. Bu genus denizel olmanın yanı sıra aynı zamanda organizmaların hücre içerisinde kimyasal bir reaksiyon ile biyolojik ışık oluşturması olan biyolüminesens olayını gerçekleştirmektedir. Lüminoz V.harveyi türünde potansiyel morfolojik özelliklerin incelenmesiyle, hücre içerisinde lipid benzeri granüller tespit edilmiştir ve bu da PHB’nin varlığını göstermiştir [4]. Son zamanlarda, oldukça fazla hücre yoğunluğuna sahip V.harveyi kültürlerinde PHB içeren belirgin granüller keşfedilmiştir [5].
Bu çalışmanın amacı, İzmir Orta Körfezi’nden biyolüminesen bakteri izolasyonunu gerçekleştirmek, lüminöz izolatın, Vibrio selektif tiyosülfat sitrat bile sükroz agar (TCBS) ortamındaki üreme özelliğini, koloni çapını ve antibiyotik direnç profilini belirleyerek tanılamak, sudan black B ve fluoresen boyama yöntemleriyle PHB’yi hücre içinde tespit etmek ve kuru hücre ağırlığına bağlı olarak PHB % verimini hesaplanmaktır.
MATERYAL VE METOT
Biyolüminesen bakteri izole etmek amacıyla 06/08/2008 tarihinde İzmir Orta Körfezi’nden sediment örneği alınmıştır (0-10 m). Sediment örnekleri öncelikle steril deniz suyunda 20oC’de bir gece inkübe edilmiştir
ve daha sonra yayma plaka yöntemi uygulanarak izolasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Sedimentle inokule edilen Seawater Complete (SWC) agar (pepton 5 g/l; yeast extract 3 g/l; gliserol 3 g/l; CaCO3 1 g/l; agar 20
g/l) petrileri 20oC’lik etüvde 1 gece inkübe edilmiştir.
Karanlık bir ortamda koloniler incelenmiş ve ışıma özelliğine sahip koloniler seçilerek birkaç aşama çizgi ekimleri yapılmış ve saf olarak elde edilen izolat +4oC’de
stoklanmıştır [6,7].
Elde edilen izolatı tanılamak amacıyla, ilk olarak Vibrio selektif TCBS (pepton (kazein) 5,0 g/l; pepton (meat) 5,0 g/l; yeast extract 5,0 g/l; sodyum sitrat 10,0 g/l; sodyum tiyosülfat 10,0 g/l; Ox bile 5,0 g/l; sodyum cholate 3,0 g/l; sükroz 20,0 g/l; NaCl 10,0 g/l; demir (III) sitrat 1,0 g/l; timol mavisi 0,04 g/l; bromtimol mavisi 0,04 g/l; agar 14,0 g/l) ortamına çizgi ekim yapılmış ve 20oC’lik etüvde 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon
süresi sonunda koloni üreme rengi ve çapı belirlenmiştir [8, 9].
Çizelge 1. Antibiyotik direnç profilinin belirlenmesinde
kullanılan antimikrobiyal ajanlar, kodları ve disk içerikleri.
Antimikrobiyal Ajan Kod
Disk İçeriği (µg) Gentamisin CN 10 Siprofloksasin CIP 5 Sülfametazaksol/Trimetoprim SXT 25 Nalidiksik asit NA 30 Tobramisin TOB 10 Novobiosin NV 5 İmipenem IPM 10 Meropenem MEM 10 Amikasin AK 30 Linezolid LZD 30 Piperasilin/Tazobaktam TZP 110 Eritromisin E 15 Kloramfenikol C 30 Tetrasiklin TE 110
Antibiyotik direnç profilinin belirlenmesi NCCLS (2001) standartlarına uygun olarak agar disk difüzyon metoduyla gerçekleştirilmiştir [10]. Lüminoz izolatın çizelge 1’de görülen 14 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları belirlenmiştir (Çizelge 1). Bu denemede Mueller Hinton Agar ortamı %2 oranında NaCl [11] ilavesiyle modifiye edilerek kullanılmıştır. 0,5 McFarland yoğunluğuna denk gelecek oranda bakteri süspansiyonu hazırlanmış [12, 13], yayma plaka yöntemi uygulanmış ve diskler yerleştirilmiştir. Petriler 20oC’lik etüvde
24-48 saat inkübe edildikten sonra oluşan zonlar milimetrik olarak ölçülmüş ve izolatın direnç profili belirlenmiştir [14].
PHB granüllerinin hücre içinde belirlenmesi amacıyla Sudan Black B boyama ve fluoresen Nile Red (Sigma, N3013-100 mg) boyasıyla fluoresen boyama gerçekleştirilmiştir. Fluoresen boyamada %1 oranında nile red boyası kullanılmıştır [15]. Sudan black B ile yapılan boyama sonucunda preparatlar ışık mikroskobunda, nile red ile yapılan boyama sonucunda da preparatlar Leica fluoresen mikroskobunda (DM4000B) FITC filtresi kullanılarak incelenmiştir. PHB üretiminin en yoğun olduğu saati belirlemek amacıyla belirli zamanlarda bu boyamalar gerçekleştirilmiş ve yine aynı zamanlarda 1 µg/ml nile red içeren [1] Basal Medium Agar’a (BMA) (Tris-HCL pH:7,5 100 mM; NH4Cl 19 mM; K2HPO4.3H2O 0.33 mM; FeSO4.7H2O 0,1 mM; su 500 ml; suni deniz suyu 500 ml: NaCl 23,38 g; MgSO4.7H2O 24,65 g; KCl 1,49 g; CaCl2.2H2O 2.94 g; su 1l) çizgi ekimleri gerçekleştirilmiş [16] ( bu ortama pepton 2,5 g/l, yeast ekstrakt 1 g/l ve gliserol %3 ilave edilmiştir) ve 254 nm UV altında petriler fluoresen özelliklerine göre incelenmiştir.
PHB standardı çıkarmak amacıyla 0,05 g PHB (Aldrich, poly(3-hydroxybutyric acid, natural origin) 100 ml kloroform içinde çözdürülmüş ve gerekli miktarlar alınarak 1 µg/ml-10 µg/ml arasında konsantrasyonlar hazırlanmıştır. Tüplerdeki kloroform tamamen uçurulduktan sonra sülfürik asit ilave edilerek kaynayan sıcak su banyosunda 10 dakika tutularak krotonik asite dönüşmesi sağlanmıştır. Örnekler 235 nm dalga boyunda sülfirik asit körüne karşı okunmuş ve standart grafik çıkarılmıştır [17].
Biyolüminesen izolat tarafından üretilen PHB miktarını belirlemek amacıyla 250 ml’lik erlenlere 100 ml Basal Medium Broth (BMB; pepton 2,5 g/l, yeast esktrakt 1 g/l ve gliserol %3 ilaveli) hazırlanmış ve 20oC’de
150 rpm’de organizma aktive edilmiştir. Organizma yoğunluğu 600 nm’de [18] 1 olacak şekilde ayarlanmış ve steril ortamlara %2 oranında aşılama yapılmıştır. 150 rpm’de 20oC’de inkübe edilen kültürün inkübasyon
süresinin 36. ve 42. saatlerinde inkübasyon durdurulmuş ve tüm örnekler alınarak 6000 rpm’de [19] 15 dakika santrifüj edilerek elde edilen pellet liyofilizatörde 1 gece kurutulmuştur. Biyomas tayin edildikten sonra pellet üzerine 5 ml steril distile su ilave edilmiş ve 2 dakika ultrasonifikasyona maruz bırakılmıştır [20]. Daha sonra örnekler 9000xg’de 15 dakika santrifüj edilerek süpernatant atılmış ve üzerine 5 ml kloroform ilave edilerek 65oC’de 25 saniye bekletilmiştir [5]. Örneklerde
bulunan tüm kloroform uçurulmuş ve üzerlerine 5 ml sülfürik asit ilave edilmiştir [20]. Kaynayan sıcak su banyosunda 10 dakika tutularak krotonik asite dönüşmesi sağlanmış [17] ve 235 nm’de sülfürik asit körüne karşı absorbans değerleri belirlenmiştir (tüm ölçümler paralelli yapılmıştır). Standart grafikten elde edilen formülasyon
kullanılarak üretilen PHB miktarları belirlenmiştir. Biyomas ile üretilen PHB miktarı ilişkilendirilerek organizmanın % PHB verimi saptanmıştır.
BULGULAR
İzmir Orta Körfezi’nden alınan sediment örneğinden SWC agar ortamı kullanılarak biyolüminesen izolat elde edilmiştir (Şekil 1). Bu izolatın Vibrio selektif ortam olan TCBS’de üremesi sonucunda sarı renkli ve 0,5-1 mm çapında koloniler oluşturduğu tespit edilmiştir (Şekil 2).
Şekil 1. Biyolüminesen izolatın SWC agar ortamında
üremesi, A: aydınlıkta, B: karanlıkta.
Şekil 2. Vibrio sp.’nin TCBS ortamında 20oC’de
24 saatlik inkübasyonu sonucunda oluşan sarı renkli koloniler.
NCCLS (2001) standartlarına uygun olarak agar disk difüzyon yöntemiyle izolatın 14 farklı antibiyotiğe karşı direnç profillerinin belirlenmesi sonucunda izolatın amikasin antibiyotiğine karşı dirençli iken, gentamisin ve tobramisine karşı direncinde ara değerde olduğu, diğer antibiyotiklere karşı ise duyarlı olduğu bulunmuştur (Çizelge 2, Şekil 3).
Hücre içindeki PHB granüllerinin yağda çözünen bir boya olan Sudan Black B’ye afinitesinden faydalanarak tespiti sağlanmış ve hücre içinde gri-siyah renkli granüller belirlenmiştir (Şekil 4). Fluoresen nile red boyası kullanılarak fluoresen boyama ve aynı boyanın büyüme ortamına konmasıyla fluoresen özelliği incelenmiştir. Leica fluoresen mikroskopta preparatların incelenmesi sonucunda, FITC filtresi (eksitasyon 494 nm, emisyon 518 nm) kullanıldığı için PHB granülleri kırmızı renkli olarak gözlenmiştir (Şekil 5).
Çizelge 2. Vibrio sp.’nin 14 farklı antimikrobiyal
ajana karşı oluşturduğu zonlar (mm) ve direnç profili.
Antimikrobiyal Ajan Vibrio sp. Zon Çapı (mm) Direnç Profili Gentamisin 14 I Siprofloksasin 41 S Sülfametazaksol/Trimetoprim 46 S Nalidiksik asit 40 S Tobramisin 13 I Novobiosin 27 S İmipenem 35 S Meropenem 35 S Amikasin 11 R Linezolid 36 S Piperasilin/Tazobaktam 29 S Eritromisin 19 S Kloramfenikol 37 S Tetrasiklin 34 S
R:dirençli, I: orta, S: duyarlı.
Şekil 3. Vibrio sp.’nin MHA (%2 NaCl) ortamında 14 farklı antibiyotiğe karşı oluşturduğu zonlar. A: C ve TE; B: E, LZD ve TZP; C: AK, IPM ve MEM; D: TOB, NV ve NA; E: CN, CIP ve SXT.
Şekil 4. Işık mikroskobunda, sudan black B ile
boyama sonucu hücre içinde gri-siyah renkte gözlenen PHB granülleri
Şekil 5. Fluoresen mikroskobunda, fluoresen nile
red ile boyama sonucu kırmızı renkte gözlenen PHB granülleri
Nile red içeren BMA ortamına ekilen izolatın ürediği petriler saatlik olarak 254 nm UV altında incelenmiş ve en yoğun ışımanın 42. saatte olduğu tespit edilmiştir. Kullandığımız boyaya bağlı olarak PHB üreten izolat yoğun bir sarı fluoresens vermiştir. Üretilen PHB miktarı arttıkça yayılan fluoresens miktarı da artmıştır. Buna bağlı olarak da PHB % verim çalışmaları 42. saat baz alınarak yapılmıştır. 1 µg/ml-10 µg/ml oranlarında PHB içeren solüsyonlar hazırlanmış ve bu konsantrasyonlara karşılık gelen absorbans değerleri 235 nm dalga boyu kullanılarak belirlenmiş ve çalışmanın standart grafiği oluşturulmuştur (Şekil 6).
BMB ortamında gelişen lüminoz izolatın inkübasyonun 36., 42. ve 48. saatlerinde kuru hücre ağırlıkları tespit edilmiştir. 242,1 mg kuru hücre ağırlığı ve 58,153 mg PHB üretimiyle en yüksek değerler 42. saatte elde edilmiştir. İnkübasyonun 48. saatinden itibaren PHB veriminde düşüş başlamıştır (Çizelge 3).
PHB STANDARDI y = 0,1754x R2 = 0,9955 0 0,5 1 1,5 2 2,5 23 5 nm a bs or ba ns d eğ er i µg/ml PHB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Şekil 6. PHB standart grafiği.
Türler İnkübasyon Süresi Kuru Hücre Ağırlığı (mg) PHB Ağırlığı(mg) Verim (%)
Vibrio sp.
36 saat 226,0 42,116 18,64
42 saat 242,1 58,153 24,0
48 saat 230,7 52,514 22,76
Çizelge 3. Vibrio sp.’nin farklı inkübasyon sürelerindeki kuru hücre ağırlığı, üretilen PHB
TARTIŞMA VE SONUÇ
Bu çalışmada, İzmir Orta Körfezi’nden alınan sediment örneğinden bakteri izolasyonu gerçekleştirilmiş ve petriler karanlıkta incelendiğinde biyolojik ışıma yapma özelliğine sahip bir bakteri izole edilmiştir (Şekil 1). Bu bakteriyi tanılamak amacıyla TCBS agar ortamına ekim yapılmış ve koloni rengi ve çapı değerlendirilmiştir. Üreme sonucunda izolatımız sarı renkli ve 0,5-1 cm çapında koloniler oluşturmuştur.
TCBS agar oldukça selektif bir ortamdır ve birçok Vibrio straini bu ortamda büyüme yeteneğindedir. Diğer bakteriler ise inhibe olmaktadır [8, 21]. Çünkü ortamda yüksek konsantrasyonda bulunan tiyosülfat ve sitrat yüksek alkaliniteye sahiptir ve inhibisyon etkisi göstermektedir [22]. İzolatımızın bu ortamda üremesi bir Vibrio türü olduğunun göstergesidir. Vibrio sp.’nin TCBS ortamında sükrozu kullanması sonucu asit oluşumu meydana gelmiş ve timol mavisi ve bromtimol mavisi karışık indikatöründen dolayı sarı renkli koloniler oluşmuştur [22]. Vibrio türleri bu ortamda üremektedir fakat strain farkına bağlı olarak koloni renginde ve çapında değişiklikler meydana gelebilmektedir. Musa ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada 30 biyolüminesen Vibrio harveyi türünün TBCS agar ortamında üremesi sonucunda 3 tanesinin sarı, 27 tanesinin ise yeşil renkli koloniler oluşturduğu tespit edilmiştir [23].
Tanılamanın bir diğer aşamasında izolatın 14 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları belirlenmiş ve sadece AK’e karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Amikasin, aminoglikozid grubu antibiyotiklerdendir [24]. Etki mekanizmasına bağlı olarak bu antimikrobiyal aktif transport ile hücre içine alınarak ribozoma dönüşümsüz bağlanmakta ve mRNA’nın yanlış okunmasına yol açarak protein sentezini engellemektedir. Vibrio sp.’nin bu antibiyotiğe karşı dirençli olması hücre içine alınımındaki bir farklılıktan kaynaklanıyor olabilir. TOB ve CN’e karşı duyarlı olması protein sentezlerinin inhibe olması ile açıklanabilir. Çünkü her iki ajan da protein sentezini inhibe ederek etki etmektedir. C’e karşı oldukça duyarlı olması yine aynı nedenlerle açıklanabilir.
Sudan black B ve fluoresen nile red boyası ile yapılan fluoresen boyama sonucunda PHB üretiminin en fazla olduğu inkübasyon saati belirlenmiştir. Chien ve arkadaşları tarafından 2007 yılında yapılan çalışmada denizel çevreden izole edilen Vibrio sp.’nin en yüksek verimi 36. saatte verdiği tespit edilmiş [1]. Bizim çalışmamızda ise en yüksek PHB verimine %24 ile inkübasyonun 42. saatinde ulaşılmıştır ve bu sonuç saatlik olarak yapılan boyama yöntemleri ve nile red içeren BMA ortamındaki yayılan fluoresens sonuçlarını desteklemiştir. Çünkü çalışmamızda boyamalarda en
yoğun PHB granülleri 42. saatte gözlenmiştir. Aynı zamanda, nile red içeren ortamda organizmanın 42. saatte en yoğun fluoresensi gösterdiği, 48. saatte artık bir düşüşün olduğu tespit edilmiştir. Üretilen PHB miktarının spektrofotometrik yöntemlerle belirlenmesi sonucunda da bu veriler doğrulanmıştır.
Chien tarafından yapılan çalışmada izole edilen türün generasyon süresinin oldukça kısa (9.8 dakika) [1] olması bu türün daha kısa inkübasyon sonucunda PHB üretiyor olmasının nedenidir. Bu çalışmada ortamdaki karbon kaynağı gliserol iken %24 ile %42,8 arasında değişen verimler elde edilirken, ortama gliserol yerine sükroz konduğunda %45,5’lik bir verim elde edilmiştir [1]. Bizim çalışmamızda ise gliserol içeren ortamda %24’lük bir verim elde edilmiştir. Büyüme ortamındaki karbon kaynağı değiştirilerek verim arttırılabilir. Bu aşamada farklı karbon kaynaklarının yanı sıra farklı azot kaynakları da denenerek en yüksek verimin olduğu optimum ortam tespit edilebilir. Bunun yanı sıra endüstriyel açıdan maliyeti düşürmek amacıyla ucuz nutrient kaynakları da denenebilir.
Çalışmamızda 48. saatte, üretilen PHB miktarının 58,153’den 52,514’e düştüğü bulunmuştur. Bu durum stres koşullarında karbon ve enerji kaynağı olarak depo edilen PHB’nin hücre tarafından kullanılmaya başlaması ile açıklanabilir. İnkübasyon süresinin uzamasıyla üretilen PHB miktarının azalması Mercan ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada da gösterilmiştir. Bu çalışmada Rhizobium bakterisi inkübasyonun 48. saatinde %74,03’lük bir verime sahipken 72. saatte verim %36,10 ve 96. saatte %21,72’ye kadar düşmüştür [20].
Çok sayıdaki heterotrofik ve ototrofik aerobik bakteri, fotosentetik anaerobik bakteri, kayan bakteri, Actinomycetes spp., cyanobakteri ve son zamanlarda anaerobik yağ asidi oksitleyen gram negatif bir bakterinin de içinde bulunduğu çok değişik prokaryotik organizmalar tarafından PHB’nin akümüle edildiği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir [25]. Fakat şimdiye kadar sadece birkaç tane denizel PHB üreten mikroorganizma rapor edilmiştir.
Çalışmamızdan elde edilen Vibrio sp.’nin denizel kökenli olması, hızlı üremesi, kültüvasyonunun kolay olması ve %24’lük bir PHB verimine sahip olması bu organizmanın endüstriyel biyoplastik eldesinde kullanılabilecek yeni bir kaynak olduğunun bir göstergesidir.
Bu çalışmamız temel alınarak denizel Vibrio sp.’nin moleküler karakterizasyonu yapılarak tür tanısına gidilebilir. Ortam içerikleri modifiye edilerek, karbon ve azot kaynakları değiştirilerek, farklı pH değerleri, NaCl konsantrasyonları, çalkalama koşulları denenerek en yüksek verimin olduğu ortam koşulları belirlenebilir ve laboratuar ölçeğinden endüstriyel ölçeğe geçiş yapılabilir.
KAYNAKLAR
[1] Chien C-C, Chen C-C, Choi M-H, Kung S-S, Wei Y-H, 2007. Production of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) by Vibrio spp. isolated from marine environments. Journal of Biotechnology, 132:259-263.
[2] Alias Z, Tan IKP, 2005. Isolation of palm oil-utilising, polyhydroxyalkanoate (PHA)-producing bacteria by an enrichment technique. Bioresource Technology, 96:1229-1234.
[3] Kaynar P, Beyatlı Y, 2009. Determination of poly-β-hydroxybutyrate production by Bacillus spp. isolated from the intestines of various fishes. Chemistry and Biochemistry, 75:439-443.
[4] Sun W, Cao J-G, Teng K, Meighen EA, 1994. Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate in the luminescent bacterium, Vibrio harveyi, and regulation by the lux autoinducer, N-(3-hydroxybutanoyl) homoserine lactone. The Journal of Biological Chemistry, 269:20785-20790. [5] Miyamoto CM, Sun W, Meighen EA, 1998. The
LuxR regulator protein controls synthesis of polyhydroxybutyrate in Vibrio harveyi. Biochimica et Biophysica Acta, 1384:356-364.
[6] Ersoy Ömeroğlu E, Karaboz İ, Sukatar A, Uzel A, Sayan M, Şanlıdağ T, 2008. Phenotypic and molecular characterization of luminous bacteria isolated from Izmir gulf in turkey: Vibrio harveyi TEMO5 and TEMS1 strains. Fresenius Environmental Bulletin, 17:506-510.
[7] Ozdemir G, Pazarbaşı B, Koçyiğit A, Ersoy Ömeroğlu E, Yaşa İ, Karaboz İ, 2008. Decolorization of acid black 210 by Vibrio harveyi TEMS1, a newly isolated bioluminescent bacterium from Izmir bay, Turkey. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 24:1375-1381.
[8] Farmer III JJ, Hickman-Brenner FW, 2006. The Genera Vibrio and Photobacterium.In: Prokaryotes. Chapter 3.3.18, 6:508-563.
[9] Haris L, Owens L, Smith S, 1996. A selective and differential medium for Vibrio harveyi. Applied and Environmental Microbiology, 62:3548-3550. [10] National Committee for Clinical Laboratory
Standards (2001).Performance standards for the antimicrobial disk susceptibility tests, 11th ed. Approved Standard M’-A7and M7-A5. National Committee for the Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pennsylvania.
[11] Castro D, Pujalte MJ, Lopez-Cortes L, Garay E, Borrego JJ, 2002. Vibrios isolated from the cultured Manila clam (Ruditapes philippinarum): numerical taxonomy and antibacterial activities. Journal of Applied Microbiology, 93:438-447.
[12] Zanetti S, Spanu T, Deriu A, Romano L, Sechi LA, Fadda, G, 2001. In vitro susceptibility of Vibrio spp. isolated from the environment. International
Journal of Antimicrobial Agents, 17:407-409. [13] Ottaviani D, Bacchiocchi I, Masini L, Leoni
F, Carraturo A, Giammarioli M, Sbaraglia G, 2001. Antimicrobial susceptibility of potentially pathogenic halophilic vibrios isolated from seafood. International Journal of Antimicrobial Agents, 18:135-140.
[14] Ersoy Ömeroğlu E, Karaboz İ, Sukatar A, 2009. In vitro susceptibility of antibiotics against bioluminescent Vibrio harveyi TEMO5 and TEMS1 isolated from Holothuria tubulosa and seawater. Fresenius Environmental Bulletin,18:2023-2028. [15] Ostle AG, Holt JG, 1982. Nile blue A as a fluorescent
stain for poly-β-hydroxybutyrate. Applied and Environmental Microbiology, 44:238-241.
[16] Dunlap PV, Kita-Tsukamoto K, 2006. Luminous bacteria. In: The Prokaryotes (ed. Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E. An Evolving Electronic Resource for Microbiological Community. Volume 2, Academic Press, Springer New York, pp. 863-892.
[17] Ateş M, 1997. Batık kültür fermentasyonu yöntemiyle bazı bakterilerden PHB üretimi. Doktora tezi. Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı.
[18] Bramhachari PV, Dubey SK, 2006. Isolation of characterization of exopolysaccharide produced by Vibrio harveyi strain VB23. Letters in Applied Microbiology, 43:571-577.
[19] Boyandin AN, Kalacheva GS, Rodicheva EK, Volova TG, 2008. Synthesis of reserve polyhydroxyalkanoates by luminescent bacteria. Microbiology, 77:318-323.
[20] Mercan N, Aslım B, Yüksekdağ N, Beyatlı Y, 2002. Production of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) by some Rhizobium bacteria.Turkish Journal of Biology, 26:215-219.
[21] Uchiyama H, 2000. Distribution of Vibrio species isolated from aquatic environments with TCBS agar. Environmental Health and Preventive Medicine, 4:199-204.
[22] Anonymous, 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları, (ed. Halkman AK). Başak Matbaacılık Ltd. Şti., Ankara, 358 sayfa.
[23] Musa N, Seong Wei L, Wee W, 2008. Phenotypic and genotypic characteristic of Vibrio harveyi isolated from black tiger shrimp (Peneaus monodon). World Applied Sciences Journal, 3:885-902.
[24] Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Uzmanlar Tus Serisi (yenilenmiş 2. baskı).
[25] Katırcıoğlu H, Aslım B, Yüksekdağ Z, Mercan N, Beyatlı Y, 2003. Production of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation of putative Bacillus mutant strains by SDS-PAGE of total cell protein. African Journal of Biotechnology, 2:147-149.
