Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:149-152
149
Koagülaz Negatif Stafilokok Sufllar›nda Biyofilm Oluflumu ve
Siprofloksasinin Biyofilm Üzerine Etkisi (*)
(*) XXXI. Türk Mikrobiyoloji Kongresi’nde (19-23 Eylül 2004, Kufladas›) sunulmufltur (**) Gazi Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Ankara Ifl›l F‹DAN (**), Sevgi YÜKSEL (**), Feryal ÇET‹N GÜREL‹K (**)
ÖZET
Koagülaz negatif stafilokoklar (KNS), t›bbi aletlerle oluflan infeksiyonlarda s›k olarak izole edilen mikroorganizmalard›r. Çal›flmam›zda KNS’larda biyofilm oluflumu ve biyofilm oluflumu ile siprofloksasin aras›ndaki iliflki incelenmifltir. Elde etti¤i-miz sonuçlar siprofloksasinin biyofilm oluflumunu önlemede etkili oldu¤u gösterilmifltir.
Anahtar kelimeler:Koagülaz negatif stafilokok (KNS), biyofilm, siprofloksasin SUMMARY
Biofilm Production of Coagulase-negative Staphylococci and Effects of Ciprofloxacin on Biofilm Production.
Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the most common causative agents of infections associated with medical devi-ces. In this study we investigated biofilm production of CNS and interaction between biofilms and ciprofloxacin. Our results indicated that ciprofloxacin can be used to prevent biofilm formation.
Key words:Coagulase-negative staphylococci, biofilm, ciprofloxacin
G‹R‹fi
Koagülaz negatif stafilokoklar›n (KNS), hastane in-feksiyonu etkeni olarak her geçen gün önemleri art-maktad›r. Kateter, yapay kalp kapaklar› ve plastik malzemelerin yayg›n olarak kullan›m› KNS’a ba¤l› hastane infeksiyonlar›nda önemli bir art›fla neden olmufltur (1). Bu mikroorganizman›n etken oldu¤u infeksiyonlar, genellikle biyomateryaller üzerinde biyofilm tabakas› oluflumuyla birliktedir (2). Biyo-filmler, mikroorganizmalar›n yüzeylere tutunmas› (adhere olmalar›), ço¤almalar› ve hücre d›fl› poli-merler üretmeleriyle oluflmaktad›r (3). KNS’lar›n kateter yüzeylerine adhere olmalar› ve biyofilm oluflturma yetenekleri, konak savunma mekanizma-lar›nda ve antimikrobiyal maddelerin etkilerinde de¤iflikliklere neden olmaktad›r. Biyofilm oluflturan bakteriler antimikrobiyal tedaviye, biyofilm olufl-turmayan bakterilere göre daha fazla direnç göster-mektedirler (4). Bu nedenle biyofilm oluflturan mik-roorganizmalar›n eradikasyonunda problemler ya-flanmaktad›r (5). Bu infeksiyonlar genellikle cihaz›n
ç›kart›lmas›n› gerekli k›lmaktad›r. Biyofilm oluflu-munun engellenmesi veya oluflmufl biyofilmin era-dike edilmesi, antimikrobiyal maddelerin penetras-yonunu artt›rmaktad›r. Baz› antimikrobiyal madde-ler bakterimadde-lerin adherensini azaltmakta ve biyofilm oluflturmas›n› engelleyebilmektedirler (6). Floroki-nolonlar›n Gram negatif bakterilerde, polisakkarit kapsül formasyonunu, biyofilm oluflumunu ve ad-herensi azaltt›¤› gösterilmifltir (7).
Bu çal›flmada, KNS sufllar›nda biyofilm oluflumu-nun belirlenmesi, siprofloksasinin biyofilm oluflu-munu engellemedeki rolü ve daha önceden oluflmufl biyofilmi eradike etmedeki etkinli¤inin in vitro ola-rak belirlenmesi amaçlanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çeflitli klinik örneklerden izole edilmifl 50 adet KNS suflu incelenmifltir. Sufllar tüpte koagülaz yön-temi kullan›larak identifiye edilmifltir. Sufllar›n 20’si kateter ucu, 10’u kan, 15’i yara, 5’i idrar örne¤inden izole edilmifltir. Adezyon testi için Christensen taraf›n-dan tan›mlanan kalitatif tüp metodu ve kantitasyon için spektrofotometrik mikropleyt yöntemi kullan›l-m›flt›r (1).
‹letiflim:Ifl›l Fidan
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:149-152
Tüp yönteminde, 5 ml triptikaz soy buyyon (TSB) içe-risine 1x105 cfu/ml bakteri inokülasyonu yap›ld›ktan
sonra 37°C’de 18-20 saat bekletilmifltir. Tüp içeri¤i boflalt›lm›fl ve 1’er ml %25’lik safranin eklenip tüp içeri¤i uzaklaflt›r›lm›fl ve kurutma ka¤›d› üzerine ters çevrilip bekletilmifltir. Tüp yüzeyinde bir film tabaka-s› oluflmatabaka-s› pozitif reaksiyon olarak de¤erlendirilmifl-tir. Hava ile temas eden k›s›mda halka fleklinde tabaka oluflumu negatif sonuç olarak belirlenmifltir. Spektro-fotometrik mikropleyt yönteminde, 1x105cfu/ml
bak-teri süspansiyonundan 200’er ml düz tabanl› pleytlere da¤›t›lm›flt›r. Negatif kontrol olarak kuyucuklara TSB içeren besiyeri konulmufltur. 37°C’de 18-20 saat bek-letildikten sonra kuyucuklar›n içeri¤i boflalt›lm›fl, 4 kez PBS ile y›kanm›fl, %99’luk metanol ile fikse edil-mifl ve kristal viole ile boyanm›flt›r. %33’lük glisial asetik asit eklenip, 570 nm’de spektrofotometride okunmufltur.
Deneyin ikinci k›sm›nda, biyofilm oluflturan sufllar›n siprofloksasine (Biofarma) duyarl›l›¤› buyyonda mik-rodilüsyon metodu ile belirlenmifltir. Siprofloksasinin biyofilm oluflturan sufllarda, biyofilm tabakas› oluflma-dan önce etkinli¤ini belirlemek için, bakteri süspansi-yonlar› mikropleyte kuyucuklar›na konulmufl ve 2 M‹K (minimal inhibitör konsantrasyon), M‹K, 1/2 M‹K, 1/4 M‹K konsantrasyonlarda siprofloksasin ku-yucuklara eklenmifltir. 37°C’de 18-20 saat bekletilmifl, pleytler aspire edilmifl, y›kanm›fl, fikse edilip boyan-m›fl ve optik dansiteleri spektrofotometride okunmufl-tur.
Deneyin son k›sm›nda, daha önceden oluflturulmufl bi-yofilm tabakas› üzerine siprofloksasinin etkisini belir-lemek için, 1 gece önceden kuyucuklarda biyofilm ta-bakas› oluflturulmufltur. Ertesi gün bu kuyucuklar›n üzerine siprofloksasinin farkl› konsantrasyonlar› (12.5 μmg-400 μmg/ml) eklenmifl, 37°C’de 18-20 saat bek-letilmifl, pleytler aspire edilmifl, y›kanm›fl ve fikse edilmifl, boyanarak spektrofotometride okunmufltur. BULGULAR
‹ncelenen 50 KNS suflunun 30’unda (%60) tüp meto-du ile biyofilm oluflumu belirlenmifltir. Tüp yöntemiy-le biyofilm oluflturdu¤u beliryöntemiy-lenen sufllar›n mikropyöntemiy-leyt yöntemi ile belirlenen optik dansiteleri 0.095-1.2 ara-s›nda iken, tüp yöntemiyle biyofilm oluflturmad›¤› be-lirlenen sufllar›n optik dansiteleri 0.05-0.08 aras›nda tespit edilmifltir.
Deneyin ikinci aflamas›nda, siprofloksasinin inhibitör ve subinhibitör konsantrasyonlar›n›n biyofilm oluflu-mu üzerine etkisi incelenmifltir. Biyofilm oluflturan 30
suflun tamam›nda siprofloksasinin 2 M‹K ve M‹K de-¤erlerinde spektrofotometrik olarak belirlenen optik dansite de¤erleri 0.08 de¤erinin alt›nda bulunmufl ve biyofilm tabakas› oluflumu tespit edilmemifltir. Siprof-loksasinin subinhibitör konsantrasyonlar›nda (1/2 M‹K, 1/4 M‹K, 1/8 M‹K de¤erlerinde) ise, biyofilm tabakas›n›n optik dansitesinde siprofloksasin uygulan-madan önce tespit edilen optik dansite de¤eriyle k›-yasland›¤›nda anlaml› azalma tespit edilmifltir (p<0.01). Subinhibitör konsantrasyonlarda optik dan-sitede en belirgin azalma 1/2 M‹K de¤erinde belirlen-mifltir.
Deneyin son aflamas›nda, bir gece önce mikropleyt ku-yucuklar›n›n taban›nda oluflturulmufl biyofilm tabaka-s› üzerine siprofloksasinin farkl› konsantrasyonlardaki (12.5-400 μmg/ml) etkisi incelenmifltir. Biofilm olufl-turan 30 suflun 25’inde siprofloksasin uygulanmadan önce belirlenen optik dansitesiyle k›yasland›¤›nda, bi-yofilm tabakas›n›n optik dansitesinde anlaml› bir azal-ma saptanm›flt›r (p<0.01). 30 suflun 5’inde ise biyo-film tabakas›n›n optik dansitesinde bir azalma belir-lenmifl ama bu azalman›n anlaml› olmad›¤› tespit edilmifltir (p>0.01).
TARTIfiMA
KNS’lar, kateter, kalp kapak盤› gibi t›bbi cihazlar›n bulundu¤u hastalarda s›k olarak infeksiyona neden olan etkenlerdir (2). Bu mikroorganizmalar yüzeye tutunduktan sonra, biyofilm oluflumuna neden olan hücred›fl› slime oluflturarak, antimikrobiyal maddele-rin penetre olmas›n› engelleyerek, biyosid ve dezen-fektanlara da direnç oluflturarak bu infeksiyonlar›n güçlükle tedavi edilmelerine neden olurlar (8). Bu ne-denle, çal›flmalar kateter yüzeyine mikroorganizman›n yap›flmas›n› önlemek amac›yla, kateterlerin gümüfl, antiseptikler gibi maddelerle kaplanmas› üzerinde yo-¤unlaflmaktad›r (3). Ancak kateterle iliflkili infeksi-yonlar›n önlenmesinde, biyofilm oluflumunu önleye-cek veya uygulanan antimikrobiyal maddenin etkinli-¤ini artt›rmak için , oluflmufl biyofilm tabakas›n›n çö-zülmesini sa¤layacak uygun antimikrobiyal maddenin belirlenmesi de önem tafl›maktad›r.
Çal›flmam›zda KNS sufllarda biyofilm oluflumu %60 olarak tespit edilmifltir. Daha önce yapt›¤›m›z bir ça-l›flmada bu oran %43 olarak belirlenmifltir (9). Yassien ve ark. (5) ise bu oran› %50 olarak bildirmifllerdir. Çal›flmam›zda özellikle yüksek konsantrasyonlardaki siprofloksasinin biyofilm tabakas›n›n oluflumunu inhi-be etti¤i inhi-belirlenmifltir. Siprofloksasinin subinhibitör konsantrasyonlar›nda, mikropleyt taban›nda KNS’un
I. Fidan ve ark, Koagülaz Negatif Stafilokok Sufllar›nda Biyofilm Oluflumu ve Siprofloksasinin Biyofilm Üzerine Etkisi
2. Vogel L, Sloos JH, Spaargaren J, Suiker I, Dijk-shoorn: Biofilm production by Staphylococcus epidermi-dis isolates associated with catheter related bacteremia. Di-agn Microbiol Infect Dis 36: 139 (2000).
3. Be¤endik F:‹nfeksiyon hastal›klar› ve klinik mikrobi-yolojide biyofilm. Flora 8 : 271 (2003).
4. Yasuha H, Ajiki Y, Koga T, Yokota T:Interaction between Clarithrmycin and biofilms formed by Staphylo-coccus epidermidis. Antimic Sgents Chemother 38: 138 (1994).
5. Yassien M, Khardori N:Interaction between biofilms formed by Staphylococcus epidermidis and quinolones. Diag Microbiol Infect Dis 40: 79 (2001).
6. Rupp M, Hamer KE:Effect of subinhibitory concen-trations of vancomycin, cefazolin, ofloxacin, L-ofloxacin and D-ofloxacin on adherence to intravascular catheters and biofilm formation by Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 41: 155 (1998).
7. Held TK, Adamczik C, Trautmann M, Cross AS: Ef-fects of MICs and sub-MICs of antibiotics on production of capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae. An-timic Agents Chemother 39 : 1093 (1995).
8. Pitts B, Hamilton MA, Zelver N, Stewart PS:A mic-rotiter-plate screening method for biofilm disinfection and removal. J Microbiol Methods 54: 269 (2003).
9. Akyar I, Fidan I, Rota S, Türet S:Koagülaz negatif stafilokoklarda slime faktör yap›m›n›n üç farkl› yöntemle araflt›r›lmas›, tür tayini ve antibiyotik direnci. Mikrobiyol Bült 32: 15 (1998).
10. Souli M, G›amarellou H:Effects of slime produced by clinical isolated of Coagulase-Negative Staphylococci on activities of various antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 42: 939 (1998).
11. Presterl E, Grisold AJ, Reichmann S, Hirschl AM, Georgopoulos A, Graninger W:Viridans streptococci in endocarditis and neutropenic sepsis: biofilm formation and effects of antibiotics. J Antimicrob Chemother 55: 45 (2005).
yap›flmas›n› ve biyofilm oluflumunu anlaml› olarak azaltt›¤› tespit edilmifltir (p<0.01). Bu azalt›c› etkinin doza ba¤›ml› oldu¤u tespit edilmifltir. Subinhibitör konsantrasyonlarda en belirgin azalma 1/2 M‹K de¤e-rinde belirlenmifltir. Yassien ve ark. da (5) siprofloksa-sinin subinhibitör konsantrasyonlarda biyofilm taba-kas›n›n optik dansitesinde anlaml› azalma sa¤lad›¤›n› göstermifller ve florokinolonlar›n kateter üzerinde oluflmufl biyofilmi eradike edebilece¤ini belirtmifller-dir.
Çal›flmam›z›n ikinci bölümünde yüksek konsantras-yonlarda (12.5-400 μmg/ml) siprofloksasinin daha ön-ceden mikropleyt taban›nda oluflturulan biyofilm taba-kas›n›n optik dansitesinde sufllar›n 25’inde (%83) an-laml› olarak azalmaya neden oldu¤u belirlenmifl-tir(p<0.01). Bu etki ayn› flekilde doza ba¤›ml›yd› ve yüksek konsantrasyonlarda daha belirgin olarak göz-lenmifltir. Yani yüksek konsantrasyonlarda siproflok-sasin biyofilm tabakas›nda düflük optik dansite de¤er-leri oluflturmufltur.
Souli ve ark (10) kinolonlar›n implant, kateter gibi t›b-bi aletlere ba¤l› infeksiyonlar›n tedavisinde komt›b-bine tedavilerde kullan›labilecek güçlü bir antibiyotik ol-du¤unu göstermifltlerdir.
Persterl ve ark (11) moksifloksasinin yüksek konsan-trasyonlarda biyofilm dansitesinde azalma sa¤lad›¤›n› ve patogenezde biyofilm oluflumunun rol oynad›¤› dü-flünülen infeksiyonlar›n tedavisinde kullan›labilece¤i-ni belirtmifllerdir.
Sonuç olarak, çal›flmam›zda da gösterildi¤i gibi , sip-rofloksasin prostetik kapak, katater gibi yüzeylere KNS’lar›n yap›flmas›n› ve biyofilm oluflturmas›n› ön-lemede iyi bir seçenek olabilir. Böylece t›bbi aletlere üzerinde biyofilm oluflturan sufllarla oluflan infeksi-yonlarda kullan›lan antibakteriyel maddenin etkinli¤i-ni artt›rmada siprofloksasietkinli¤i-nin iyi bir alternatif olabile-ce¤i düflünülmektedir. Bakteri kolonizasyonunun en-gellenmesi için konulacak materyalin florokinolon gi-bi gi-bir antimikrogi-biyal madde ile kaplanarak uygulan-mas› biyofilm oluflumunu engelleyebilir. Bu bulgular›n klinik çal›flmalarla da do¤rulanmas› uygun olacakt›r.
KAYNAKLAR
1. Monzon M, Oteiza C, Leiva J, Amorena B:Synergy of different antibiotic combinations in biofilms of Staph-ylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 48: 793 (2001).
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:149-152
