Girifl
Son y›llarda tan› ve tedavi alan›ndaki geliflmelere pa-ralel olarak mantar infeksiyonlar›n›n insidans›nda art›fl-lar gözlenmektedir. ‹mmün sistemi bask›lanan hastaart›fl-larda konak savunmas›nda oluflan önemli de¤ifliklikler, infek-siyonlara duyarl›¤› art›r›rken, hastal›klar›n tan› ve teda-visine yönelik invazif t›bbi giriflimler nozokomiyal in-feksiyonlar›n geliflmesini kolaylaflt›rmaktad›r (1). ‹nsan-larda görülen f›rsatç› mantar infeksiyonlar›na neden olan mantar türlerinin çeflitlili¤inde art›fl olmas›na karfl›n hâlâ en s›k etken Candida albicans't›r (2). Bu maya türü di¤er baz› Candida türlerine göre antifungallere daha duyarl›-d›r. Ancak son y›llarda bu maya türüne karfl› da direnç geliflebildi¤i bildirilmektedir (3-6).
Çal›flmam›zda çeflitli klinik örneklerden izole edilen 300 C. albicans suflunun amfoterisin B, flusitozin,
fluko-nazol ve mikofluko-nazole duyarl›klar› in vitro olarak NCCLS'in önerdi¤i mikrodilüsyon yöntemiyle araflt›r›l-m›flt›r.
Yöntemler
Çal›flmam›zda antifungal profilaksi uygulanmayan hastalar›n klinik örneklerinden izole edilen ve her hasta-ya ait sadece bir C. albicans suflu çal›flma kapsam›na al›nd›. Antifungal duyarl›¤› araflt›r›lan C. albicans suflla-r›n›n 97'si vagina sürüntüsü, 60'› balgam, 57'si idrar, 42'si bo¤az sürüntüsü, 24'ü deri (piflik) sürüntüsü, 20'si d›flk› örneklerinden izole edildi. C. albicans sufllar›n›n tan›mlanmas› koloni morfolojisi, germ tübü oluflumu, m›s›r unlu Tween 80 agar'da klamidospor oluflumu ve karbonhidratlara etkisine göre (Mycotube, BBL) yap›ld›. Çal›flmam›zda kullan›lan amfoterisin B, flusitozin ve mikonazol Sigma firmas›ndan, flukonazol Pfizer firma-s›ndan temin edildi. Bu maddelerin hepsi dimetilsülfok-sid (DMSO) içerisinde çözündürüldü ve antifungal
mad-116 Klimik Dergisi●Cilt 11, Say›:3 ●1998, s:116-118
Üç Yüz Candida albicans Suflunun Amfoterisin B,
Flusitozin, Flukonazol ve Mikonazole Duyarl›klar›n›n
Araflt›r›lmas›
Nuri Kiraz1, Zayre Erturan2, Meltem Uzun2, Gül Durmaz1, Tercan Us1, Yurdanur Akgün1,
Özdem An¤2
Özet: ‹mmün sistemi bask›lanan hastalarda oluflan mantar infeksiyonlar›n›n en s›k etkeni Candida albi-cans't›r. Bu etkene ba¤l› infeksiyonlar›n önlenmesinde ve tedavisinde uygun antifungal ilaç seçimi son derece önemlidir. Kandidozlar›n tedavisinde antifungal duyarl›k testlerine baflvurulmas› ise uygun antifungal ilaç seçi-mi yap›lmas›n› sa¤layacakt›r. Bu amaçla antifungal profilaksi uygulanmayan hastalar›n klinik örneklerinden izole edilen C. albicans suflu çal›flma kapsam›na al›nd›. Her hastaya ait sadece bir C. albicans suflu kullan›ld›. Antifungal duyarl›¤› araflt›r›lan C. albicans sufllar›n›n 97'si vagina sürüntüsü, 60'› balgam, 42'si bo¤az sürün-tüsü, 24'ü deri (piflik), 20'si d›flk› örneklerinden izole edildi. Bu sufllar›n amfoterisin B, flusitozin, flukonazol ve mikonazole duyarl›klar› NCCLS taraf›ndan önerilen buyyon mikrodilüsyon yöntemi ile araflt›r›ld›. C.albicans sufllar›n›n amfoterisin B, flusitozin, flukonazol ve mikonazole karfl› M‹K50 ve M‹K90de¤erleri, s›ras›yla 0.5 ve 1 µg/ml, 0.25 ve 1 µg/ml, 1 ve 8 µg/ml ile 1 ve 4 µg/ml olarak bulundu.
Anahtar Sözcükler: Candida albicans, antifungal duyarl›k testleri.
Summary: Susceptibility of 300 Candida albicans strains to amphotericin B, flucytosine, fluconazole and mi-conazole. C. albicans is the most frequently isolated fungus from immunosupressed patients. To prevent and treat this infection, it is very important to choose the correct antifungal agent. Antifungal drug susceptibility testing is an obligation to choose the right drug to treat candidosis. For this purpose, 300 C. albicans strains isolated from pa-tients not taking antifungal prophylaxis have been included in this study, and only one strain was taken from each patient. From these C. albicans strains, 97 were isolated from vagina, 60 from sputum, 57 from urine, 24 from skin, 20 from stool specimens and 42 from throat swabs. Susceptibility testing for amphotericin B, flucytosine, flucona-zole and miconaflucona-zole was performed by broth microdilution method according to the NCCLS guidelines. MIC50and
MIC90values to amphotericin B, flucytosine, fluconazole and miconazole were found as follows: 0.5-1 µg/ml,
0.25-1 µg/ml and 0.25-1-4 µg/ml, respectively.
Key Words: Candida albicans, antifungal susceptibility testing.
(1) Osmangazi Üniversitesi, T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Eskiflehir
(2) ‹stanbul T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Çapa-‹stanbul
delerin stok solüsyonlar› haz›rland› (en yüksek dilüsyon x 10). Antifungal duyarl›k deneyinde 0.165 M 3-(N-morfo-lino)-propan-sulfonik asid (MOPS) (Sigma) ile tampon-lanm›fl, pH'si 7, L-glutaminli, bikarbonats›z RPMI 1640 (Sigma) besiyeri kullan›ld› ve antifungal maddelerin stok solüsyonlar› da bu besiyerinde haz›rland›.
Duyarl›k Deneyinin Uygulan›fl› (7-9): Sabouraud dekstroz agarda üretilen ve en az 1 mm çap›nda olan C. albicans kolonilerinden befl tane seçildi. Bu koloniler, içinde serum fizyolojik bulunan tüplere aktar›ld› ve 15 saniye vorteksle kar›flt›r›ld›. Süspansiyonun haz›rlanma-s›nda NCCLS'in önerdi¤i spektrofotometrik yöntem kul-lan›ld› ve bu süspansiyon RPMI 1640 besiyeri kullan›la-rak önce 1/50, daha sonra 1/20 oran›nda dilüe edildi. Di-bi yuvarlak, steril, 96 çukurlu mikroplaklar kullan›larak iki kat azalan dilüsyonlar fleklinde antifungal maddelerin en yüksek dilüsyonundan bafllayarak 100'er mikrolitre olarak ilk 11 çukura inokülasyon yap›ld›. 12. çukura ise antifungal madde içermeyen besiyerinden 100 mikrolitre konuldu. Çal›flmam›zda amfoterisin B için 4-0.03, miko-nazol için 16-0.03, flusitozin için 2-0.06 ve flukomiko-nazol için de 8-0.06 µg/ml aras›nda iki kat azalan dilüsyonlar kullan›ld›. Tüm çukurlara 100'er µl maya süspansiyonu konuldu. Üzerlerine steril cam kapat›larak 35°C'de 48 saat inkübe edildi. Amfoterisin B ve flusitozin için bula-n›kl›¤›n görülmedi¤i en son çukur; flukonazol ve miko-nazol için ise üremenin %80 azald›¤› çukur, M‹K de¤eri olarak belirlendi.
Sonuçlar
Klinik örneklerden izole edilen 300 C. albicans suflu-nun amfoterisin B, flusitozin, flukonazol ve mikonazole in vitro duyarl›klar› Tablo 1'de gösterilmifltir.
300 C. albicans suflunun amfoterisin B, flusitozin, flukonazol ve mikonazole duyarl›klar›n›n çal›fl›lan dilüs-yonlara da¤›l›m› Tablo 2'de gösterilmifltir.
‹rdeleme
Son zamanlarda ciddi mantar infeksiyonla-r›n›n görülme s›kl›¤›nda önemli art›fllar oldu¤u bilinmektedir. Mantar infeksiyonlar›n›n tedavi-sinde tek seçene¤in amfoterisin B oldu¤u za-manlarda duyarl›k testleri düflünülmemifl, an-cak yeni azol grubu ilaçlar›n kullan›ma girme-si ile antifungal duyarl›k testleri de gündeme gelmifltir (10). 1992'de NCCLS (7) taraf›ndan Candida türleri ve Cryptococcus neoformans için standard yöntem tan›mlanm›flt›r. Antifun-gal duyarl›k deneylerinin standardizasyonunda önemli sorunlar oldu¤u, mantar hücresinin stabil olma-mas› baflta olmak üzere deneyi etkileyen birçok etken bulundu¤u belirtilmifltir. Pratik ve güvenilir antifungal duyarl›k deneyleri gelifltirmeye yönelik araflt›rmalar sür-dürülmekte ve sonuçlar› NCCLS'in önerdi¤i yöntemle k›yaslanmaktad›r (9,11-14).
Candida türlerinin antifungal duyarl›klar›n›n belir-lenmesinde NCCLS taraf›ndan önerilen makrodilüsyon yöntemiyle uyumu gösterilen mikrodilüsyon yöntemi s›kl›kla kullan›lmaktad›r (11,12). Duyarl›k deneylerin-den elde edilen in vitro sonuçlarla in vivo sonuçlar ara-s›nda kesin bir korelasyon olmasa bile in vitro sonuçlar birbirleriyle k›yaslanabilecek standarddad›r. Sistemik ilaçlardan amfoterisin B ve büyük ölçüde flusitozin ile al›nan sonuçlar›n yorumlanmas› daha objektif olarak ya-p›labilmektedir. Flukonazolün de içinde yer ald›¤› azol grubu ilaçlar›n M‹K de¤erlerinin belirlenmesinde güç-lüklerle karfl›lafl›lmakta ve sübjektif de¤erlendirmeler olabilmektedir. Ancak amfoterisin B ve flusitozin için üremenin inhibe oldu¤u en son konsantrasyonun, azol grubu için ise üremenin %80 inhibe edildi¤i konsantras-yonun M‹K de¤eri olarak belirlenmesi, olas› hatalar› en aza indirmektedir (10). Çal›flmam›zda daha objektif so-nuçlar vermesi bak›m›ndan spektrofotometrik ölçümler kullan›lm›flt›r.
Gün ve arkadafllar› (15) C. albicans sufllar›n›n etki aral›¤›, M‹K50ve M‹K90de¤erlerini amfoterisin B, flu-konazol ve miflu-konazol için s›ras›yla 0.062-0.125, 0.125, 0.125; 0.125-1, 0.5, 1; 0.3-2.5, 0.3, 1.25 µg/ml olarak bulmufllard›r. Molbay ve arkadafllar› (16) flukonazol için etki aral›¤›n› 0.125-8, M‹K50 de¤erini 0.25 ve M‹K90 de¤erini 0.5 µg/ml olarak bildirmifllerdir. Willke ve arka-dafllar› (17) C. albicans sufllar›na amfoterisin B ve fluko-nazolün etki aral›¤›n› s›ras›yla <0.06-2 ve <0.06-4 µg/ml olarak bulmufllard›r. Gülay ve Yulu¤ (18), C. albicans sufllar›na flukonazolün etki aral›¤›n› <0.06-64, M‹K50 de¤erini 0.25 µg/ml olarak saptam›fllard›r. Price ve arka-dafllar› (19), 1987 ve 1992 y›llar› aras›nda kan kültürle-rinden izole ettikleri C. albi-cans sufllar›na flukonazolün etki aral›¤›n› 0.125-1, M‹K50 ve M‹K90de¤erlerini s›ras›y-la 0.125 ve 0.25 µg/ml os›ras›y-larak bildirmifllerdir. NCCLS (8), flukonazol ve flusitozin için duyarl›k s›n›rlar›n› s›ras›yla <8 ve <4 µg/ml olarak
bildir-Klimik Dergisi●Cilt 11, Say›:3 117
Tablo 1. 300 Candida albicans Suflunun Amfoterisin B, Flusitozin, Flukonazol ve Mikonazole In Vitro Duyarl›klar› (µg/ml)
Antifungal Madde M‹K Aral›¤› M‹K50 M‹K90
Amfoterisin B 0.03-4 0.5 1
Flusitozin 0.06-2 0.25 1
Flukonazol 0.06-8 1 4
Mikonazol 0.03-16 1 8
Tablo 2. 300 Candida albicans Suflunun Amfoterisin B, Flusitozin, Flukona-zol ve MikonaFlukona-zole Duyarl›klar›n›n Çal›fl›lan Dilüsyonlara (µg/ml) Da¤›l›m›
Antifungal 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0.06 0.03 Madde Flukonazol * 6 25 81 52 41 34 31 30 * Mikonazol 5 21 30 57 56 37 30 29 20 15 Amfoterisin B * * 8 11 66 74 49 37 33 22 Flusitozin * * * 6 59 82 70 63 20 * *Çal›fl›lmad›
mifl; ancak amfoterisin B ve mikonazol için herhangi bir s›n›r vermemifltir. Bahsedilen antifungaller için dirençli-lik s›n›rlar› s›ras›yla >64 ve >32 µg/ml olarak bildiril-mifltir. Çal›flmam›zda buldu¤umuz etki aral›¤›, M‹K50 ve M‹K90de¤erleri Tablo 1'de verilmifltir. Bulgular›m›z, li-teratür ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda, baz› araflt›rmalarla uyum-lu, baz› araflt›rmalarla da uyumsuz sonuçlar elde edilme-sine karfl›n NCCLS kriterlerine göre, flukonazol ve flu-sitozine direnç gözlenmemifltir.
Antifungal duyarl›k testlerinin Candida türleri ve C.neoformans için standardize edilmifl olmas› ve uygula-nabilirli¤i daha kolay olan mikrodilüsyon yönteminin so-nuçlar›n›n makrodilüsyon yöntemininkilerle korele ol-du¤unun bildirilmesi son derece sevindiricidir. Candida türleri için uygulanan ve NCCLS taraf›ndan önerilen in vitro testler birbiriyle k›yaslanabilecek standarddad›r. In vitro sonuçlar ile in vivo sonuçlar›n da korele oldu¤unu gösteren çal›flmalar olmakla birlikte (20), bu konu henüz netlik kazanmam›flt›r.
Sonuç olarak, in vitro antifungal duyarl›k deneyi so-nuçlar›, ancak klinik yan›tla paralellik gösterdi¤inde, bu sonucun güvenilir ve klinisyene yard›m edecek nitelikte olabilece¤i kan›s›nday›z.
Kaynaklar
1. Anaissie E. Opportunistic mycoses in the immunocompro-mised host: experience at a cancer center and review. Clin Infect Dis 1992; 14(Suppl 1): 43-53
2. Wingard JR. Importance of Candida species other than C. albicans as pathogens in oncology patients. Clin Infect Dis 1995; 20: 115-25
3. Boken DJ, Swindells S, Rinaldi MG. Fluconazole-resistant Candida albicans. Clin Infect Dis 1993; 17: 1018-21 4. Goff DA, Koletar SL, Bueshing WJ, Barnishen J, Fass RJ.
Isolation of fluconazole-resistant Candida albicans from human immunodeficiency virus-negative patients never tre-ated with azoles. Clin Infect Dis 1995; 20:77-83
5. Rex CH, Rinaldi MG, Pfaller MA. Resistance of Candida species to fluconazole. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 1-8
6. White a, Goetz M B. Azole-resistance Candida albicans: re-port of two cases of resistance to fluconazole and review. Clin Infect Dis 1994; 19: 687-92
7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Re-ference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Proposed Standard. M27-P. Villanova, Pa: NCCLS, 1992
8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Re-ference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Approved Standard. NCCLS Document M27-A. Villanova, Pa: NCCLS, 1996
9. Espinel-Ingroff A, Kish C W, Kerkering T M, et al. Colla-borative comparison of broth macrodilution and microdilu-tion antifungal susceptibility tests. J Clin Microbiol 1992; 30: 3138-45
10. Rex CH, Pfaller MA, Rinaldi MG, Polak A, Galgiani J. An-tifungal susceptibility testing. Clin Microbiol Rev 1993; 6: 367-81
11. Barchiesi F, Colombo AL, Mc Gough DA, Rinaldi MG. Comparative study of broth macrodilution and microdiluti-on techniques for in vitro antifungal susceptibility testing of yeasts by using the National Committee for Clinical La-boratory Standards Proposed Standard. J Clin Microbiol 1994; 32: 2494-500
12. To WK, Fothergill AW, Rinaldi MG. Comparative evaluati-on of macrodilutievaluati-on and alamar calorimetric microdilutievaluati-on broth methods for antifungal susceptibility testing of yeast isolates. J Clin Microbiol 1995; 33: 2660-4
13. Espinel-Ingroff A, Rodriguez-Tudela JL, Martinez-Suarez JV. Comparison of two laternative microdilution procedu-res with the National Committee for Laboratory Clinical Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro testing of fluconasole-resistant and fluconasole-sus-ceptible isolates of Candida albicans. J Clin Microbiol 1995; 33: 3154-8
14. Pfaller MA, Grant C, Morthand V, Rhine-Chalberg J. Com-parative evaluation of alternative methods for broth diluti-on susceptibility testing of flucdiluti-onazole against Candida al-bicans. J Clin Microbiol 1994; 32: 506-9
15. Gün H, Özyurt M, Haznedaro¤lu T, Baysallar M. Klinik ör-neklerden patojen etken olarak izole edilen Candida suflla-r›n›n sistemik etkili antifungal ajanlara duyarl›klar›. Gazi-antep Üniv T›p Fak Derg 1993; 4: 181-92
16. Molbay D, Ener B, Gülen D, Korten V, Özek E, Bozok-Jo-hannson C. Candida kökenlerinin amfoterisin B ve flukona-zole karfl› in vitro duyarl›klar›n›n makro-dilüsyon ve mikro-dilüsyon yöntemleri ile karfl›laflt›r›lmas›. ‹nfeks Derg 1997; 11: 149-52
17. Willke A, Çeriko¤lu N, ‹nci R, Arslan H, Demirkaz›k A. Kanserli hastalardan izole edilen kandida türlerinin antifun-gallere duyarl›klar›. Türk Mikrobiyol Cemiy Derg 1993; 23:119-22
18. Gülay Z, Yulu¤ M. Antikandidal duyarl›k testlerinde yön-temlerin karfl›laflt›r›lmas›. Mikrobiyol Bül 1995; 29: 179-88 19. Price MF, Larocco MT, Gentry LO. Fluconazole susceptibi-lities of Candida species and distribution of species recove-red from blood cultures over a 5-year period. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 1422-42
20. Quereda C, Polanco M A, Giner C, Sanchez-Sousa A, Pere-ire E, Navas E, Fortun J, Guerrero A, Baquero F. Correlati-on between in vitro resistance of flucCorrelati-onazole and clinical outcome of oropharyngeal candidiasis in HIV-infected pati-ents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996; 15: 30-7
