Ti'irk NorOfiriirji Dergisi 11: 32 - 36, 2001 Banttquog/u: Tiip Gelifimillde Etalloliill Etkisi
Tavuk Embriyonal
Etanoliin
Etkisi
Erken Donem
Tiip Geli§iminde
The
Effects
of
Ethanol
on
Early
Stage
Neural
Tube
Development
Chick
Embryos
In
MUSTAFA BARUTC:::UOGLU, MEHMET SELC:::UKi, SEDA
V
ATANSEVER, AHMET $DKRD UMUR, SEVINC::: iNANCelal Bayar Universitesi TIp Fakultesi, Noro;;irurji Anabilim Dah (MB, MS, A$U), Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dah (SV, si) Manisa
Geli;; Tarihi: 27.10.2000 <:=:> Kabul Tarihi: 10.12.2000
Ozet: Bu ara;;tumada beyaz Leghorin tipi tavuk embriyolannda, noral tlip kapanma defekti geli;;imi lizerine etanollin etkisi 1;;lkmikroskopu altmda histopatolojik olarak ara;;tmldl. C;:ah;;mamlzda 40 adet (n: 40), spesifik patojen i<;ermeyen (SPF), fertil, beyaz Leghorin tipi tavuk yumurtasl iki e;;it gruba aynldl (n: 20). Her iki grup 37, 8°C±O,2°C'da 30 saat inkube edilerek embriyonel geli;;imlerinin 8. basamagl11a ula;;tmldllar. Birinci grup kontrol grubunu olu;;turdu. ikinci grup <;ah;;ma grubu olup, in-ovo 42 mg/ dl tek doz etanol verildi. Her iki gruptaki yumurtalar 48. ve 72. saatler sonunda a<;llarak 1;;lk mikroskopu altmda histopatolojik olarak degerlendirildi. 48. ve 72. saatlerde a<;llan yumurtalarda, kontrol grubunun tamammda normal embriyolojik geli;;imin devam ettigi, plasental damarlanmanm olu;;tugu, kalp aktivitesinin ba;;ladlgl ve noral tlipun kapandlgl gozlendi. Ancak <;ah;;ma grubundaki embriyolann kontrol grubundakilere gore belirgin geli;;me geriligi gosterdikleri, mikrosefalik olduklan ve noral tlip kapanma defekti ~Iu;;tugu gozlendi.
Abstract: In this study, the effects of ethanol on the formation of the neural tube closure defects in White Leghorn chick embryos were investigated under the light microscope. Fertile specific pathogen free (SPF), White Leghorn eggs (n: 40) were divided into two groups (n: 20). Both of them were incubated at37.8QC ±0.2QC and 65-75 % relative humidity during 30 hours and the eighth stage of the embryonic development was reached (Hamburger and Hamilton). The first group was control group (n: 20). The second was the study group and it was given in-ovo a single dose, 42 mgr / 100 cc of ethanol. The eggs in both groups were opened and investigated under the light microscope at the end -of the 48'" and 72nd hours. The embryos in the control group were developed normally according to Hamburger and Hamilton classification. The normal placental vessel development, cardiac activity and closure of the neural tu be were seen. However in the study group, microcephaly, neural tube closure defect and significant developmental retardation were noticed as compared to the control group. Anahtar Kelimeler: Erken donem tavuk embriyosu, etano!,
noral hipdefekti
Key words: Early stage chick embryo, ethanol, neural tube defect,
GiRi$
Hamjleligin ilk aymda, embriyonal geli;;imin kritik doneminde, alkol kullammmm fetal alkol
sendromuna (FAS) ve noral hip kapanma defektlerine neden oldugu bilinmektedir (12). Nora] hip kapanma defektleri, kranio;;izis totalis, anensefali, myelomeningosel ve ansefaloseli i<;eren
Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001
bir grup konjenital malformasyonlardu
(7). Fetal
alkol sendromu,
geli~me geriligi, kraniyofasiyal
malformasyonlar,
kalp anomalileri
ve noral hip
defektleri ile karakterize
olup ve tiim fetal alkol
<;ah~ma modellerinde
en slk elde edilen defekt
embriyonel
geli~me geriligidir
(12, 13). Tavuk
embriyolannda
etanolUn neden oldugu serebral
hipoplazinin elde edildigi <;ah~malarda, inkiibasyon
ba~langlcmda (0. giin) verilen tek doz etanoliin, erken
donemde belirgin geli~me geriligine neden oldugunu
gosterilmi~tir.(1, 13, 14). Ancak etanoliin molekiiler
diizeydeki
bu
teratojenik
etkisi
tarn olarak
tammlanabilmi~ degildir. Kraniyal noral krest hiicre
geli~iminde,
kontrollii
hiicre olUmii normal
ve
beklenen bir siire<;tir. Yapllan <;ah~malar kraniyal
noral krest hiicrelerinin,
etanolUn indiikledigi
apoptozis nedeniyle kontrol dl~l elimine edildigini
dii~iindiirmektedir
(12). Diger yandan, literatiirde
erken donem embriyolarda
radyoaktif timid in ve
losin kullamlarak, DNA ve protein sentezinin etanol
tarafmdan
inhibe edildigi gosteren <;ah~malar da
vardlr (13). Bu sonu<;, geli~im halindeki dokulardaki
yogun
protein
ve
niikleik
asit
ihtiyaClmn
kar~llanamamasl
sonucu ortaya <;lkan hipoplaziyi
a<;lklamaktadu.
Yapllan
<;ah~malar,
geli~me
geriliginin kan etanol seviyesi ile yakmdan ili~kili
oldugunu
ve
beyin
dokusunda
cAMP
ve
prostoglandin E2 (PGE2) seviyelerinin yiikseldigini
gas termi~tir.
Bu
<;ah~mamlzda
erken
donem
tavuk
embriyolarma in-ovo verdigimiz tek doz etanol ile,
48 ve 72 saat sonunda elde ettigimiz histopatolojik
sonu<;larliteratiir sonu<;lanyla uyumludur. Gebelikte
erken donemde
kullamlan
alkoliin fetiis iizerine
geli~imsel gerilik ve noral tiip kapanma
defekti
olu~turma
risksi oldugu
deneysel
olarak tavuk
embriyolannda gosterilmi~tir.
GERE<; VE YONTEM
Manisa Tavuk Hastahklan
Ara~tlrma ve A~l
Uygulama Enstitiisii' nden, fertil, spesifik patojen
i<;ermeyen (SPF), slfmncl giin beyaz Leghorin tipi
yumurtalar
almdl (n: 180 tUrn <;ah~ma i<;in). Bu
yumurtalarm
aguhklan
ol<;iiliip verilecek olan 42
mg/ dl alkol dozu mg/kg <;evirilip, yumurta ba~ma
dii~ecek miktan hesaplandl
(»0,5 g/kg/
yumurta)
(2,12, 13, 14). Daha soma bu yumurtalar 37,8 QC
±
0,2 QC' ta
%65-75 bagll nemlilikte 30 saat enkiibe
edilerek, Hamburger ve Hamilton slmflamasma gore
embriyonel geli~imin sekizinci basamagma ula~tmldl
(6). Bu a~amada yumurtalar
iki e~it gruba aymldl.
Kontrol grubundaki yumurtalar tekrar iki e~it klsma
Barutquoglu: Tup Geli~imil1de Etanoliin Elkisi
aynhp
(grup a,b) grup a'ya herhangi
bir madde
verilmeden inkiibasyona devam edildi. Grup b'deki
yumurtalara,
iizerlerinde
kii<;iik bir delik a<;llarak,
G27 igne ile embriyo diskinin altma, <;ah~magrubuna
verilen etanol ile e~it hacimde steril serum fizyolojik
verildi. C::ah~magrubu olan ikinci gruba yine G27
igne kullamlarak
embriyo diski altma 42 mg/ dl
konsantrasyondaki
etanolden 0.05 cc verildi.
Her iki gruptaki yumurtalar
48. ve 72. saatler
sonunda a<;lldlve
%10 formolin ile 24 saat siireyle
tespit edildi. Daha soma l~lk mikroskopu
aItmda,
embriyolar
biitiin olarak degerlendirildi.
Se<;ilen
embriyolann,
hemotoksilen
ile boyamp
alkol ile
tespit
edildikten
sonra,
biitiinsel
preparatlan
hazulandl.
Diger embriyolardan
parafin
bloklar
hazlrlandl.
Bu bloklardan
7 mikron kalmhgmda
kesitler ahmp hematoksilen-eosin
ile boyandl. Daha
soma l~lk mikroskopu
altmda
<;ah~ma grubu ile
kontrol grubu kar~lla~tmlarak incelendi.
SONU<;LAR
Kontrol
grubundaki
embriyolann
normal
geli~imlerine
devam
ettikleri,
Hamburger
ve
Hamilton
slmflamasma
gore olmalan
gereken
embriyonel
basamakta
olduklan
gozlendi.
Bu
embriyolarda
plasental
damarlanma,
kalp kesesi
olu~umu, kalp aktivitesi
ve kapanml~
noral tiip
gozlendi. Geli~imsel gerilige ya da rnalformasyona
rastlanmadl (Resim la, Ib).
48 saatlik, alkol verilen tavuk embriyolannda
makroskopik olarak geli~imsel gerilik, mikrosefali ve
noral
tiipe uyan
bolgede
doku
organizasyon
bozuklugu goriildii (Resim 2a, 2b).
Seri olarak alman parafin kesitler, sistematik
rastgele ornekleme yontemi kullamlarak
se<;ildi ve
Hematoksilen-Eozin
ile
boyandl.
I~lk
mikroskobunda,
Cavalieri
yontemi
kullamlarak
yapllan, geli~en beyin vezikiillerinin hacim ol<;iimleri
sonucunda
alkol uygulanml~
olgularda
hacmin
(0.070
mm3)normal gruba
(0.165
mm3)gore yan
yanya azalml~ oldugu ve sonu<;lann istatiksel olarak
anlamh oldugu gozlendi
(p<0.05). Bu bulgulann
makroskobik
olarak
goriilen
mikrosefaliyi,
mikroskobik olarak destekledigi goriildii.
Seri alman kesitlerin histolojik incelenmeleri
sonucunda,
noral tiibiin ba~ bolgesinden
itibaren
kapanmaya ba~ladlgl fakat makroskobik olarak doku
organizasyon
bozuklugunun
goriildiigii
bolgede
Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001
$ekil 1a: 30 saa tlik normal geli§im gosteren, noral tubu a<;lk embriyonun hematoksilen ile boyanml§, butUn olarak gorunumu. x 40, B: ba§, K: kuyruk, N: noral tUp, b: ba§ klsmmdan, c: govde kIsmmdan, d: kuyruk klsmmdan ge<;en kesitler.
$ekil 1b: 48 saatlik, normal geli§im gosteren, somit saYIsI artml§, noral tUbu kapah, plasental damarlanmasl olu§mu§, kardiyak aktivitesi ba§laml§ embriyonun diseksiyon mikroskopu altmda gorunumu. x 10, B: ba§, K: kuyruk, N: noral tiip, (*)geli§en kalp.
Barutquoglu: Tiip Geli~imillde Etal1oliil1 Etkisi
$ekil 2a : 30. saatte etanol verilip, 48. saatte a<;llan,geli§me geriligi ve noral tup doku organizasyon bozuklugu gosteren embriyonun hematoksilen ile boyah, butun olarak gorunumu. x40, ('tc):
noral tup uzerinde dezorganize klslm. a: ba§ kIsmmdan, b: govde klsmmdan, c,e,g : noral tiip uzerindeki dezorganize kIslmdan, h: kuyruk klsmmdan ge<;enkesitler.
Resim 2b : 30. saatte etanol verilip, 48. saatte a<;llan,geli§me geriligi ve noral tUp doku organizasyon bozuklugu gosteren embriyonun, dezorganize klsmmdan ge<;enkesitin, hematoksilen ile boyah gorunumu. x200, N: noral tup, (.): bazallamina.
hipu olu~turan ektodermal hucrelerin ilk kesitlerde
normal goruldugu ve bazallaminanm
da korundugu
gozlenirken,
bunu takip eden kesitlerde
verilen
etanoli.i.netkisi ile normal geli~imin etkilendigi, noral
ektoderm hucrelerinin
butunli.i.gunun bozuldugu,
bazallamianm
yer yer kayboldugu
ve noral hipun
belirgin olarak a<;lkoldugu goruldu (Resim 3a, 3b).
TARTI$MA
Embriyonel
geli~imin
kritik
periyodunda
Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001
$ekil 3a: 72. saatte a<;llan, etanol verilmi~ embriyo. Makroskopik olarak normal gorUlen klslmdan ge<;en kesitin, hematoksilen ile boyah gorilnilmii. x400, N: noral tilp, (•• ): bazal lamina.
kusurlanna neden olduklan bilinmektedir (1, 2, 3,4, 6,8, 9, 10, 11, 12, 15). Bu kritik periyod, hamileligin ilk aYl olup gastrulasyon olarak bilinen ve insanda embriyonun blastokist haline ge<;ip implantasyonun ger~ekle§mesiyle ba§laYlp (7 - 8. gunler) 2. hafta son una dogru birbirini izleyen iki evredir. Bu donem, u~ germ yapragmm organizasyonu ile dokularm organlan olu§turmak uzere farkhla§tJgl kritik donemdir.
Erken donem tavuk embriyosu modeli, memelilerde embriyonel geli§imin ilk ayma uyan ve kimyasallarm embriyonel geli§im uzerine etkilerinin incelendigi ideal bir modeldir. Erken donem tavuk embriyolannda, diazepam, verapamil, kafein, papaverin ve lokal anesteziklerin noral tup kapanma defektine neden olduklan deneysel <;ah§malarla gosterilmi§tir (5, 8, 9, 10, 11). Bu model, etanolun noral krest hucrelerinin geli§imleri uzerine etkilerinin incelenebildigi, dolaYlslyla hamileligin ilk aymda maternal etanol tuketiminin fetal alkol sendromu
Barut~uoglu: Tfip Geli~imillde Eta11011111 Etkisi
$ekil 3b: 72. saatte a<;llan, etanol verilmi~ embriyo. Makroskobik olarak doku organizasyon bozuklugunun goriildiigil klsmmdan ge<;en kesitin, hematoksilen ile boyalt goriinilmii. x400, N: a<;1knoral tilp, (•• ): bazallamina.
(FAS) olarak bilinen, geli§imsel gerilik, noral tiip kapanma defektleri ve kraniyofasiyal defektlere neden olabilecegini gostermektedir.
EtanolUn uygulandlgl embriyonel geli§im basamagmm onemi vardlr. Noral tupun kapandlgl, ileri eyre embriyolara verilen aym miktar etanolUn embriyo geli§iminde noral tup uzerinde etkisi gozlenmemi§tir. Enhart ve ark. doza baglmh olarak, embriyolarda geli§en defekt insidansmm arttlgml bildirmi§lerdir (3). Pennigton ve ark. ~ah§malannda in-ovo verilen tek doz 1 g/kg etanolun tavuk embriyolanmn geli§imlerinin yedinci gununde total embriyo aglrhgmm ve beyin dokusu aglrhgmm yan yanya azaldlgml bildirmi§lerdir (13). Yapllan ~ab§malar tavuk embriyolanmn inkubasyonlannm dokuzuncu gununden once yani embriyonel karaciger dokusunda klas 1 alkol dehidrogenaz enzim uretimi ve aktivitesi ba§lamadan verilen etanolun metabolize olmadlgml gostermi§tir. in-ova verilen 42 mg/ dl etano180-100 mg/ dl olan artalama
Tiirk Noro§iriirji Dergisi 11: 32 - 36, 2001
intoksikasyon
dozunun
<;ok altmdadu.
Bu da
etanohin, metabolitleri olan asetaldehid ve asetattan
daha fazla teratojen oldugunu
du~undurmektedir
(12). Her ne kadar, geli~memi~ karaciger dokusu
yuzunden metabolize olmaml~ ethanolun etkisi, bu
methodun
insanlar
i<;in ge<;erli olamayacagml
du~undurse de, kronik alkolik anne kamnda benzer
miktarda serbest alkolun surekli olarak bulundugu
hatIrlanmahdu.
Bununla beraber, kritik donemdeki
tek doz etanolun dahi, embriyo uzerine olumsuz
etkisi olabilecegi dikkati <;ekmi~tir.
Sonu<; olarak
gastrulasyon
donemindeki
embriyoya etanohin major etkisi noral krest hucre
populasyonunun
geli~imini duraksatmasl
ve hucre
toplulugunun
kaybldlr. Bu etkinin mekanizmasl net
olarak a<;lklanabilmi~ degildir. Noral doku geli~imi
i<;inkritik olan hucreler araSI sinyalin kaybma neden
olabilecegi gibi, etanolun
indukledigi
kontrolsuz
apoptozisin noral tup kapanma defekti geli~iminden
sorumlu olabilecegi du~unUlmektedir.
C::ah~mamlz
du~uk
doz
alkol
konsantrasyonlarmda
bile embriyonun
geli~imsel
olarak kontrol grubuna gore belirgin ~ekilde geri
kaldlgml
ve
noral
tup
kapanma
defekti
olu~turdugtinu gostermi~tir.
Bu <;ah~ma 2-6 Ekim 2000 tarihleri arasmda
istanbulda
yapIlan, 28. InternatIOnal
Society for
Pediatric Neurosurgery Kongresi' nde poster bildirisi
olarak sunulmu~tur.
YaZl~ma Adresi: Prof. Dr.Mehmet Selc;uki 1403 sokak No: 5 / 8 35220Alsancak / izmir Tel: (232) 422 0302
E-mail: mselcuki@yahoo.com
KAYNAKLAR
1. Bupp Becker SR,Shibley lA Jr: Teratogenicity of ethanol in differtent chicken strains. Alcohol Alcholism V0133 No 5; 457-464, 1998
2. Cartwright MM, Smith SM: Stage dependent effects of ethanol on cranial neural crest cell development: partial basis for the phenotypic variations observed in fetal
Barutquoglu: Tiip Geli§iminde Etanoliin Etkisi
alcohol syndrome. Alcholism: Clinical and Experimental Research Vol19 No 6; 1454-62, December 1995
3. Ernhart CB, Jokol RI, Martier S, Moron P, Nadler
0,
Ager JW, Wolf A: Alcohol teratogenicity in the human; A detailed assessment of specificity, critical period and threshold. Am J Obstet Gynecol156; 33-39, 1987 4. Gilani S, Persaud TV: Embryonic development in the
chick following exposure to ethanol, acetaldehyde and cyanamide. Annals of Anatomy 174 (4); 305-308,1992 5. Giiney
0,
Selc;ukiM, Unlii A, Bagdatoglu C: The effect of diazepam on the development of neural tube defects in the chick embryos. Turkish Neurosurgery 9 (1-2); 44-48, 19996. Hamburger V, Hamilton HL: A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morph 88; 49 - 92, 1951.
7. Dirks PB and Rutka JT: The Genetic Basis of Neurosurgical Disorders. Youmans JR Neurological Surgery, Fourth Edition CD-ROM In. Volume Il, Part VI, Chapter 31, 1994: Record: 9814-9832
8. Lee H, Bush KT, Nagele RG: Time-lapse photographic study of neural tube closure defects caused by xylocaine in the chick. Teratology 37; 203-209, 1988 9. Lee H, Nagele RG: Neural tube closure defects caused
by papaverine on explanted early chick embryos. Teratology 20; 321-331, 1979
10. Lee H, Nagele RG: Toxic and teratologic effects of verapamil on early chick embryos. Evidence for the involvement of calcium in neural tube closure. Teratology 33; 203-211, 1986
11. Lee H, Nagele RG, Pietrolungo JF: Toxic and teratologic effects of caffeine on explanted early chick embryos. Teratology 25; 19-25, 1982
12. Martina M.Cartwright, Susan M. Smith: Increased cell death and reduced neural crest cell numbers in ethanol-exposed embryos; partial basis for the fetal alcohol syndrome phenotype. Alcholism: Clinical and Experimental Research V0119 No 2; 378-386, April 1995 13. Pennigton S, Kalmus G: Brain growth during ethanol
induced hypoplasia. Drug and Alcohol Dependence 20; 279-286, 1987
14. Pennington SN: Alcohol metabolism and fetal hypoplasia in chick brain. Alcohol Mar-Apr; 5 (2): 91-94, 1988
15. Susan E. Maier, ]ennifer A. Miller, Jennifer M. Blackwell, James R. West: Fetal alcohol exposure and temporal vulnerability; regional differences in cell loss as a function of the timing of binge-like alcohol exposure during brain development. Alcholism: Clinical and Experimental Research 1999: Vo123 No 4; 726-734