Amino Asitler ve Proteinler Protein Sentezinin ardışık safhaları, Polipeptid katlanması ve sekresyon proteinleri
Daha önce de belirtildiği gibi, çift-zincirli bir DNA molekülünün belirli bir bölgesinde, zincirlerden sadece birisi (anlamlı zincir) proteine ait şifreyi taşıdığı için genetik şifre, baz- çiftleri şeklinde değil de bazların dizisi olarak yazılabilir. Protein sentezinde amino asitlerin çeşidini belirleyen özelliğin, m-RNA’daki ve buradan da geriye doğru giderek DNA’daki nükleotitler olduğu anlaşılmaktadır. Amino asitleri kodlayan nükleotit dizilerinin büyüklükleri ise yalnızca matematiksel bir hesaplamadan hareket edildiğinde bile, her bir amino asit molekülünün DNA zincirindeki birden fazla nükleotit tarafından şifrelendiği, yani bir kodonun birden fazla nükleotidden meydana geldiği sonucuna ulaşılır. Çünkü, DNA molekülünde dolayısı ile m-RNA’daki tek bir nükleotidin bir amino asiti tayin ettiği kabul edilecek olursa, proteinlerin sadece 4 farklı amino asitten ibaret oldukları kabul edilecektir. Aynı şekilde, m- RNA üzerindeki 2 nükleotid 1 amino asiti belirlese idi, o zaman proteinlerin yapısında sadece 42=16 çeşit amino asit bulunacaktı. Oysa ki, proteinlerin yapısında genel olarak sürekli bulunan 20 farklı amino asitin varlığı bilinmektedir. O halde, 4 farklı nükleotidin en azından üçlü gruplar halinde amino asitleri tayin etmeleri gerekmektedir (43 = 64). Buna göre, DNA moleküllerindeki genetik şifre, üçlü nükleotit grupları (triplet) halinde okunmaktadır. Bir amino asiti belirleyen üç nükleotidlik diziye ise kodon adı verilmektedir. Translasyon işleminde, m- RNA molekülünün kullanılmasından dolayı, genetik kodların DNA molekülünden ziyade m- RNA molekülü üzerinde gösterilmesi daha kullanışlı olmaktadır. m-RNA molekülü üzerinde bulunma ihtimali olan 64 kodon (triplet) ise Tablo 6.1’de gösterilmektedir.
Genetik kod ile ilgili bilgilerin elde edilmesine 1958-60 yıllarında da devem edilmiştir.
Bu yıllarda Crick, genetik kod ile ilgili adaptör hipotezine ek olarak, yaptığı çalışmalar sonucunda genetik kodda kodonlar arsında virgülün olmadığını, dolayısı ile genetik kodun okuma çerçeveleri arasında noktalama işaretleri taşımadığı görüşünü de ileri sürmüştür.
Bununla birlikte Crick, 64 tripletten sadece 20 tanesinin spesifik bir amino asiti belirlediğini, geri kalan 44 tripletin ise kodlama görevi yapmadığını da ileri sürmüştür.
Crick’in bu görüşlerini ileri sürdüğü yıllarda, ne genetik kodun tripletten oluştuğunu gösteren ne de m-RNA molekülünün, DNA ile protein sentezi arasında bir aracı molekül olduğunu gösteren deneysel sonuçlar bulunmakta idi. Bu nedenle, o yıllarda ribozomlar hakkında yeterli bilgi bulunduğu için, çekirdekte yer alan DNA moleküllerindeki genetik bilginin sitoplazmadaki ribozomların yapısında yer alan RNA moleküllerine aktarıldığı ve bu
RNA moleküllerinin de protein sentezinde kalıp olarak kullanıldığına inanılmakta idi. Fakat, kısa zamanda yapılan deneysel çalışmalar sonunda elde edilen verilerden, protein sentezinde kullanılan kalıp ara moleküllerin (m-RNA) kararsız moleküller olduğu, buna rağmen ribozomların yapısında yer alan RNA moleküllerinin ise karaklı moleküller olduğu anlaşılmıştır. Bunun üzerine, ribozomal RNA’ların protein sentezinde kalıp olarak kullanıldığına dair olan inanış da geçerliliğini yitirmiştir. 1961 yılında ise François Jacob ve Jacques Monad, m-RNA moleküllerinin varlığı görüşünü ileri sürmüşlerdir. Bunu takip eden yıllarda yapılan çalışmalar ise, genetik kodun triplet olup olmadığını, ara molekül olan m- RNA’ların varlığını ve tripletlerin hangi amino asitleri spesifik olarak kodladıklarını belirlemeye yoğunlaşmıştır. Buna rağmen, genetik kodun triplet olup olmadığının yanı sıra birçok soru da araştırılarak cevaplandırılmayı beklemiştir. Bu soruların başlıcaları ise:
• Genetik kodda, başlama ve sonlandırma kodonları var mı?
• Genetik kod değişken mi? Tek bir triplet birden fazla amino asiti mi kodlamakta?
• Crick, 64 tripletten 44 tanesinin anlamsız olduğunu ileri sürmekte haklı mı?
• Her bir amino asit için birden fazla triplet var ise genetik kodun dejenere olduğu doğru mu?
• Genetik kod evrensel mi?
Bu ve buna benzer soruların cevapları ise bu bölümde verilmeye çalışılacaktır.
Bir amino asitin üçlü baz dizisi (kodon) tarafından tayin edildiğini kesinleştiren ve hangi kodonların hangi amino asitleri tayin ettiğinin belirlenmesini sağlayan ilk deneysel çalışmalar 1960’lı yılların başında başlamıştır. Bu araştırmalarda, RNA moleküllerinin nükleotid dizilerine bir anlam verilmeye çalışılmıştır. RNA, DNA’nın bir zincirine komplementer olduğu için RNA şifresinin çözülmesi ile DNA şifresinin de çözüleceği belirtilmiştir. Genetik şifrenin çözümünde amaç, hangi tripletin hangi amino asitleri protein sentezi sırasında uygun yerlerine koyduğunun saptanmasıdır.
Başlama ve Sonlandırma Kodonları
Tablo 6.1’den de görüldüğü gibi 64 tripletden (kodondan) 61 tanesinin amino asit karşılığı olduğu bilinmektedir. Amino asitleri kodlayan kodonlara anlamlı kodon denmektedir.
Tablo 6.1’de yer alan 64 kodondan birkaç tanesi ise hiçbir amino asite karşılık gelmemektedir.
Bu tripletler (UAA, UAG, UGA) sonlandırma (terminasyon, stop) ya da anlamsız kodonlar
olarak adlandırılmakta olup, spesifik bir proteini kodlayan genin translasyonunun sona erdirilmesini sağlamaktadırlar. Sonlandırma kodonlarından ilk keşfedilmiş olanı ise UAG kodonu olup, 1965 yılında Brenner’in T4 fajının çeşitli mutantları ile yaptığı çalışmalar sırasında ortaya çıkarılmıştır. Bunlardan UAG kodonuna amber, UAA kodonuna ochre, UGA kodonuna ise opal özel adları da verilmiştir. Bu kodonların sonlandırıcı görevleri bakterilerde kesin olarak belirlenmiştir. UAA ile UAG kodonlarının ve büyük bir olasılıkla UGA kodonunun ökaryotlarda da aynı görevi yaptığına dair kanıtlar elde edilmiştir.
Translasyonun başlama noktasının tam olarak bulunmasını sağlayan mekanizma nedir?
Mesajın okunması, m-RNA’nın amino asit sentezleten bölgesinin başında bulunan ve N- formilmetionin (Ökaryotlarda ve Arkelerde metionin) amino asitinin kodlanmasından sorumlu olan başlama (AUG) kodonunun okunması ile başlar. Şayet translasyonun doğru lokasyondan başlaması için, başlangıç kodonunun olmadığını var sayarsak, m-RNA üzerinde yer alan kodonların okuma çerçevesi her defasında başka bir noktadan başlayacak ve bunun sonucu olarak da tamamı ile amaçlanan proteinden faklı bir protein sentezlenecek ya da hiçbir protein sentezlenmeyecektir. Bu nedenle, translasyonun doğru lokasyondan başlaması çin bir başlangıç kodonunun bulunma zorunluluğu vardır.
Daha sonra bakterilerdeki ribozomlar, m-RNA üzerindeki spesifik başlama kodonunu (AUG), başlama kodonundan önce yer alan Shine-Dalgarno sekansının yardımı ile tanırlar.
Translasyonun başlaması için Shine-Dalgarno sekansı tarafından sağlanan bu ekstra yardım ise, birkaç bakterideki m-RNA’da başlama kodonu olarak AUG yerine neden GUG kodonunun kullanıldığını da açıklamaktadır. Buna rağmen, ender olarak rastlanan bu başlama kodonları da N-formilmetionini kodlamaktadırlar.
Açık Okuma Çerçeveleri
Daha önceki kısımlarda da değinildiği gibi bir proteinin sentezi, DNA molekülünün spesifik bir segmentinin m-RNA’ya transkripsiyonu sonucunda gerçekleştirilir. DNA molekülünün m-RNA’ya transkripsiyonu ise transkripsiyon başlangıç bölgesinin önünde yer alan promotör bölgenin varlığına gereksinim duymaktadır.
Bir araştırmacı, transkribe olan bir RNA’nın protein kodlayıp kodlamayacağını nasıl anlayabilir? Bunu anlamanın bir yolu, RNA’nın baz sekansının belirlenerek bu molekülün başlangıç kısmında AUG gibi bir başlangıç kodonunun bulunup bulunmadığına bakmaktır.
Şayet, bu tipteki bir başlama kodonu aynı okuma çerçevesinde olmak kaydıyla, sonlandırma kodonundan önce uzun baz dizileri ile devam ediyorsa, bu RNA molekülü muhtemelen bir proteini kodlamaktadır. Böyle bir baz sekansı ise başlama ve sonlandırma kodonlarının aynı çerçevede yer alması nedeni ile açık okuma çerçevesi (open reading frame = ORF) olarak adlandırılmaktadır. Çok uzun DNA sekanslarındaki açık okuma çerçevelerinin bulunmasında ise bilgisayar programları kullanılabilmektedir. Açık okuma çerçevelerinin araştırılması ise gen mühendisliğinde oldukça önemlidir. Çünkü, izole edilen ve baz sekansı belirlenen DNA parçalarının bir proteini kodlayıp kodlamadığı, açık okuma çerçevelerinin belirlenmesi ile anlaşılabilir. Şayet bir DNA parçacığı, açık okuma çerçevesi bulundurmuyorsa bu DNA parçacığı, muhtemelen bir protein sentezlememektedir. Özellikle ökaryotik hücrelerde protein kodlamayan çok uzun DNA sekansları bulunmaktadır. Bu nedenle, diğer bir anlamda “açık okuma çerçevesi” gen terimi ile eşit anlamdadır.
Genetik Kodun Evrenselliği ve Diğer Genetik Kodlar
Günümüzde yaşamakta olan bütün organizmalar, çok değişik genetik yapılara sahip olsalar da, yakın geçmişte filogenetik açıdan ortak bir ataya sahip olmasalar da, genetik şifrenin genel biçiminin ve işleme mekanizmasının temel olarak aynı olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, günümüzdeki canlılarda polipeptid sentezleri için tek bir temel şifre bulunmaktadır.
1960’lı yıllarda genetik kod keşfedildiğinde, incelenen bütün prokaryot ve ökaryotların aynı kodu kullandığı belirlenmiştir. Memeli hücrelerinde hemoglobin sentezini sağlayan m-RNA molekülü, E. coli’ye verildiğinde bu hücrenin protein sentez mekanizmasının (r-RNA ve t- RNA’lar gibi) memeli homoglobinini sentezlediği görülmüştür. Bu nedenle, genetik kodun evrensel olduğu ve bütün canlı sistemler tarafından aynı kodonların kullanıldığı düşünülmüştür.
DNA moleküllerinin sekansının kolayca belirlenmesini sağlayan tekniklerin geliştirilmesi ile çok sayıdaki organizmanın DNA sekansları belirlenmeye başlanmıştır. Buna rağmen, proteinlerin amino asit sekansları ile bu proteinleri kodlayan DNA sekanslarının karşılaştırılması ise beklenmedik birkaç süprizin ortaya çıkmasını da sağlamıştır. Bu süprizlerden birisi ise ökaryotik genlerdeki intron bölgelerin varlığının belirlenmesidir. Fakat yine de genetik kodun evrenselliği hakkındaki düşüncelerimiz değişmemeştir. Ayrıca, bazı hücreler ve organeller evrensel genetik koddan çak az da olsa farklı genetik kodlar kullanmaktadır.
Genetik koddaki alternatif farklılıklar ise orijinal olarak ilk defa mitokondrilerde bulunmuştur. Şimdiye kadar bilinen mitokondriler arasında, sadece biktisel mitokondriler evrensel kodu değiştirmeden kullanmaktadırlar. Bitkilerde bulunan diğer bir organel olan kloroplastlar da yine standart kod olan evrensel kodu kullanmaktadırlar. Diğer bütün ökaryotlardaki mitokondriler ise evrensel kodu bir veya birkaç değişikliğe uğratarak kullanmaktadırlar. Bu değişikliklerden birkaç tanesi ise Tablo 6.2’de gösterilmektedir. Tablo 6.2’den de görülebileceği gibi, evrensel koddaki anlamı sonlandırma olan UGA’nın triptofan kodonu olarak kullanılması gibi birkaç tane genel özellik bulunsa da basit bir mitokondriyal kod bulunmamaktadır.
Mitokondriyal genomlar tarafından kullanılan alternatif kodlar ise evrensel kodlara oldukça benzemektedir ve bunların, evrensel kodonun evrimi sonucunda meydana geldikleri düşünülmektedir. Günümüzde ise kromozomlarında evrensel koddan az da olsa farklı bir kod kullanan birkaç hücre bilinmektedir ve bu hücrelerden birkaç tanesi ise Tablo 6.2’de gösterilmektedir. Tablo 6.2’den de görülebileceği gibi, kromozomal kodunda alternatif kod kullanan organizmaların hepsi de normal sonlandırma kodonundan farklı sonlandırma kodonları kullanmaktadırlar. Bu organizmalar, evrensel koda oranla çok daha az sonlandırma kodonlarına sahiptirler. Çünkü, normal kodondaki anlamsız kodonlardan bir veya ikisi, bu organizmalarda bir amino asiti kodlayan anlamlı kodonlara dönüşmüştür.
Şayet, herbir kodonun bir görevi varsa, bir organizmadaki genetik kodun değiştirilmesinin çok zor olduğunu tahmin etmek hiç de güç olmayacaktır. Örneğin, AUA kodonunu izolösin kodonundan metionin kodonuna çevirmenin anlamı, bu kodonun yer aldığı m-RNA’dan sentezlenecek olan her proteinde, AUA tarafından kodlanan her izolösin amino asitinin yerine artık metionin amino asitinin gelmesi ile sonuçlanacaktır (Tablo 6.2). Böyle bir protein ise normal fonksiyonunu gösteremeyebilir. Bu değişiklik ise, şayet kodon kullanımı rastgele olmuyorsa belki de önemli bir probleme neden olmayabilir.
Biyokimyacılar tarafından genetik kodun yeniden çalışılmasından sonra ve bir genin sekansının gerçekten belirlenmesinden önce, bir amino asit için olan farklı kodonların hepsinin de eşit olarak kullanıldığı var sayılmakta idi. DNA sekanslarının belirlenmesi ile bu var sayımın da doğru olmadığı ortaya çıkmıştır. Aynı amino asiti kodlayan kodonların kullanım oranı ise organizmadan organizmaya değişmektedir. Örneğin, E. coli’de her 20 izolösin amino asitinden sadece bir tanesi AUA kodonu tarafından kodlanırken, geriye kalan 19 izolösin ise AUU ve AUC kodonları tarafından kodlanmaktadır. Bu verilerden yola çıkılarak, kodonların görevlerinin değişmesine, aynı amino asiti kodlayan bazı kodonların daha az oranda
kullanılmasının yol açtığı düşünülmektedir. Bu değişikliklerin ise, mitokondriyal genomların büyüklüklerinin diğer organizmaların genomlarına oranla daha küçük olması nedeni ile daha kolay gerçekleşeceği var sayılmaktadır.
Yanlış Translasyon
Genetik kodun translasyonundaki diğer bir problem ise bazen yanlışlıkların olmasıdır.
Bunun anlamı ise, bir kodon belki de doğru olarak okunamamakta ve bu yanlış okumaya bağlı olarak, polipeptid zincirde yanlış amino asit yer almaktadır. Örneğin, fenilalanin (UUU) ve lösin (UUA) sentezinden sorumlu olan kodonların, tek bir baz açısından farklılık göstermesi, bu yanlışlıklara neden olabilmektedir. Daha ender rastlanan durumlarda ise kodon, UUU olmasına rağmen uzamakta olan polipeptid zincirine fenilalanin yerine lösin eklenmektedir.
Normal bir hücrede ise ender olarak rastlanan bu yanlışlıklar, çok sayıdaki protein molekülleri arasında çok az bir oranda meydana gelmektedir ve bu nedenle, önemli bir etki oluşturmazlar.
Örneğin, yapılan denyesel çalışmalar sonunda her 103-104 kodonda bir yanlış okumanın oluştuğu saptanmıştır. Buna rağmen, streptomisin ve neomisin gibi ribozomları inhibe eden antibiyotikler ise hücredeki birçok protein sentezinde yanlış okumalara ve bunun sonucu olarak da anormal proteinlerin sentezlenmesine ve hücrenin fonksiyonlarını tam olarak yerine getirememesine yol açmaktadırlar.
Bazen, ribozomların yanlış okuma çerçevesine neden olacak şekilde kayması veya sonlandırma kodonlarını anlamlı bir kodon olarak okumaları sonucunda da translasyon yanlışlıkları meydana gelmektedir. Şaşırtıcı olan ise, virüsler gibi bazı genetik elementlerin kendi zorunlu proteinlerini sentezletmek için bu şekildeki translasyon yanlışlıklarını kendi avantajlarına kullanacak şekilde evrimsel değişikliğe uğramış gibi görünmeleridir.
Üst Üste Örtüşen (Overlapping) Genler
Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda elde edilen veriler, nükleik asitlerin belirli bir ürünü sentezleten baz sekansının, başka bir ürünü sentezleten baz sekansından farklı ve ayrı olduğunu gösterse de, bazı virüslerde bunun aksi belirlenmiştir. Küçük bir bakteriyel virüs olan φX174, 5386 nükleotidden oluşan ve maksimum 1795 amino asidi kodlayacak büyüklükte, 5-6 farklı proteini kodlayabilecek dairesel bir kromozoma sahiptir (bkz. Şekil 4.18). Fakat, φX174 ile yapılan çalışmalar göstermiştir ki, bu virüsün kendi çoğalması için gerekli olan 11 farklı proteini (2300 amino asit) sentezletecek kadar yeterli büyüklükte bir genoma sahip olmamasına ve genetik materyalin ekonomik olmak zorunda olması nedeni ile, aynı DNA parçacığının
birden fazla farklı ürünü kodladığı belirlenmiştir. Bu ise, aynı DNA sekansının farklı iki başlama noktasından başlanarak iki ayrı okuma çerçevesinde okunması ile sağlanan bir prosestir (Şekil 6.3). Buna ilaveten, çoğunluğu SV40 ve G4 fajı gibi virüslerde olmak üzere, çok sayıda ilginç overlapping gen pattırnlarının olduğu da bilinmektedir (bkz. kısım 4.6).
