Gen Klonlama Basamakları
Klonlama basamakları:
1. Vektörü içeren plazmid DNA ile hedef geni içeren kromozomal DNA hücrelerden saflaştırılır.
2. Kromozomal DNA’daki hedef genin yakınında bulunan RE kesim bölgesine uygun bir RE kesim bölgesi önceden kullanılacak vektörün polilinker
bölgesinde bulunan uygun RE kesim bölgesi ile karşılaştırılır.
3. Her iki DNA^da aynı RE enzimi ile kesilerek yapışkan uçlar oluşturulur.
4. DNA molekülleri aynı tüpün içerisine koyularak DNA ligaz enzimi ile birleştirilir.
5. Plazmit vektöre insert olan DNA’lar ligaz enzimi ile birleştirilerek rekombinant bir vektör elde edilir.
6. Her plazmit mutlaka istenilen geni içermeyebilir ve yeniden geni insert etmeden kapanabilir.
7. Bu aşamada aynı tüpe koyulacak hem hedef DNA hem de vektörün miktarı çok önemlidir ve iyi ayarlanmalıdır.
8. Ortamda bulunan rekombinant plazmitler veya insert almamış plazmitler uygun konağa transformasyonla aktarılır.
9. Konak bakteri hücresi uygun besiyerinde çoğaltılır.
10. İnsert DNA’yı içeren vektörün varlığını belirleyebilmek için doğru klon, antibiyotik direnci veya lacZ geni gibi bir raportör gen yönünden taranır.
11. İşaretleyici gen yönünden pozitif olan doğru klonlar petriden seçilir.
12.İnsert DNA’yı içeren doğru klonun varlığı; dizileme veya probla hibridizasyon gibi yöntemlerle belirlenerek hücre çoğaltılır.
13.Böylece istenilen geni içeren çok sayıda klonla DNA çoğaltılıp konak bakteri içersinde saklanabilir.
