T.C.
NĠĞDE ÖMER HALĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
TARIMSAL GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
PATATESTE KURAKLIK VE YÜKSEK SICAKLIK STRESLERĠNE TEPKĠDE ROL OYNAYAN miRNA’LARIN YENĠ NESĠL DĠZĠLEME YÖNTEMĠ ĠLE
BELĠRLENMESĠ
ESRA KAPLAN
Temmuz 2017 E ÖMER HALĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ E. KAPLAN, 20 YÜKSEK LĠSANS TEZĠ
T.C.
NĠĞDE ÖMER HALĠSDEMĠR ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
TARIMSAL GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
PATATESTE KURAKLIK VE YÜKSEK SICAKLIK STRESLERĠNE TEPKĠDE ROL OYNAYAN miRNA’LARIN YENĠ NESĠL DĠZĠLEME YÖNTEMĠ ĠLE
BELĠRLENMESĠ
ESRA KAPLAN
Yüksek Lisans Tezi
DanıĢman
Doç. Dr. Z. Neslihan ÖZTÜRK GÖKÇE
Temmuz 2017
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin bilimsel ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalıĢmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
Esra KAPLAN
ÖZET
PATATESTE KURAKLIK VE YÜKSEK SICAKLIK STRESLERĠNE TEPKĠDE ROL OYNAYAN MĠRNA’LARIN YENĠ NESĠL DĠZĠLEME YÖNTEMĠ ĠLE
BELĠRLENMESĠ
KAPLAN, Esra
Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Tarımsal Genetik Mühendisliği Anabilim Dalı
DanıĢman : Doç. Dr. Z. Neslihan ÖZTÜRK GÖKÇE
Temmuz 2017, 105 sayfa
Patates kuraklık ve yüksek sıcaklık gibi abiyotik streslere hassas bir bitkidir. Bitkiler abiyotik stres cevabında miRNA’ları kullanarak stres ile ilgili genlerin transkipsiyon sonrası düzenlemesini sağlayarak strese karĢı tolerans gösterdikleri bilinmektedir. Bu nedenle tez kapsamında, kuraklık, yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık stresleri Unica ve Russset Burbank patates çeĢitlerine uygulanarak stres durumunda ve çeĢitler arasında meydana gelen miRNA transkriptomları incelenmiĢtir. Tez çalıĢması sonucunda, 210 tane bilinen ve 104 tane ise yeni bulunan toplam 314 tane miRNA elde edilmiĢtir ve 24 adet miRNA’dan ve onların hedef genlerinden, qRT-PCR yapılmıĢtır.
Bunun yanında stu-miR162-3p sadece kuraklık streslerinde artmıĢ ve hedef geni Endonükleaz homolog1 geninin ekspresyonu düĢüĢ yaĢamıĢtır yine aynı Ģekilde novel_9 sadece Russet Burbank çeĢidinde artmıĢ ve hedef geni NBS-LRR direnç geninin ekspresyonu düĢüĢ yaĢamıĢtır. Bundan dolayı novel_9 ve miR162-3p’nin patateste abiyotik stres cevabının anlaĢılmasında önemli olacağı ve dayanıklı patates geliĢtirmesine yardımcı oacağı düĢünülmektedir.
Anahtar Sözcükler: Solanum tuberosum, kuraklık, yüksek sıcaklık, abiyotik stres, miRNA
SUMMARY
IDENTIFICATION OF miRNAs IN RESPONSE TO DROUGHT AND HEAT STRESSES IN POTATO USING NEW GENERATION SEQUENCING
KAPLAN, Esra
Niğder Ömer Halisdemir University Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Agricultural Genetic Engineering
Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Z. Neslihan ÖZTÜRK GÖKÇE
July 2017, 105 pages
Potato is sensitive to abiotic stresses such as drought and high temperature.The plants are known to express tolerance to stress by using miRNAs in response to abiotic stress and stress-associated genes to regulate post-translation. For this reason, miRNA transcriptomics in the case of stress and among the varieties have been investigated by applying drought, high temperature and high temperature + drought stresses to Unica and Russset Burbank potato varieties. As a result of the thesis study, a total of 314 miRNA of 210 known and 104 novel were obtained. qRT-PCR was performed on 24 selected miRNAs and their target genes. In addition, stu-miR162-3p increased only in drought stresses, and the expression of the target gene Endonuclease homolog1 gene did not decrease, whereas the novel_9 increased only in the Russet Burbank variants and decreased the expression of the target gene NBS-LRR resistance gene.
Keywords: Solanum tuberosum, drought and high temparature, abiotic stress and miRNA
ÖN SÖZ
Yükseköğrenimim sırasında ve bu tez çalıĢmasının konusunun belirlenmesinde, çalıĢmalarımın yürütülmesi ve değerlendirilmesinde yardım ve desteğini esirgemeyen danıĢman hocam Sayın Doç. Dr. Z. Neslihan ÖZTÜRK GÖKÇE’ye, tez çalıĢmama maddi kaynak sağlayan danıĢman hocanım yürütücülüğünü yapmıĢ olduğu 115-O-405 nolu proje desteğinden dolayı TÜBĠTAK’a, patates tohumlarının temininde yardımlarından ve desteğinden dolayı sayın Prof. Dr. Mehmet Emin ÇALIġKAN’a, laboratuvar çalıĢmalarında yardımını esirgemeyen Sayın Yrd. Doç. Dr. Ufuk DEMĠREL’e, bitkilerin yetiĢtirilme ve laboratuvar çalıĢmalarında yardımlarını esirgemeyen ArĢ Gör. Ġlknur TINDAġ, ArĢ Gör. Caner YAVUZ, ArĢ Gör. Ayten Kübra TÜRKMEN ve yükseköğrenim arkadaĢlarım ve tez çalıĢmam esnasında yardım eden Mohammad Hussein AZĠMĠ, Begimay TAALAYBEK KĠZĠ, Arslan ASĠM, Sidra JAMEL’e tez çalıĢma ve yazım esnasında manevi destek olan değerli arkadaĢım BüĢra ERKEN’e kardeĢlerim Tuğba KAPLAN’a ve Halit KAPLAN’a tüm hayatım boyunca yanımda olan ve desteğini hiç esirgemeyen annem Kadriye KAPLAN ve babam Bayram KAPLAN’a, sonsuz teĢekkürlerimi sunarım…
İÇİNDEKİLER
SUMMARY ... v
ÖN SÖZ ... vi
ĠÇĠNDEKĠLER ... vii
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ... x
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... xii
SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ ... xv
BÖLÜM I GĠRĠġ ... 1
BÖLÜM II GENEL BĠLGĠLER ... 4
2.1 Mikro RNA’lar ... 4
2.1.1 Mikro RNA (miRNA) nedir? ... 4
2.1.2 miRNA’ların biyogenezi ... 4
2.2.3 miRNA’ların görevleri ... 5
2.2 Abiyotik stres ... 7
2.2.1 Kuraklık stresi ... 8
2.2.2 Yüksek sıcaklık stresi ... 9
2.3 Bitkilerin abiyotik stres cevabı ... 9
2.4 Abiyotik streste miRNA’lar ... 11
2.5 Patates (Solanum tuberosum L.) ... 14
2.6 Patateste miRNA ÇalıĢmaları ... 15
2.7 Patatesde abiyotik stres ile ilgili mirna çalıĢmaları ... 17
BÖLÜM III MATERYAL VE METOD ... 21
3.1 Bitkilerin büyütülmesi ve stres uygulaması ... 21
3.1.1 Bitkilerin büyütülmesi ... 21
3.1.2 Stres Uygulaması ... 21
3.1.2.1 Kontrol uygulaması ... 21
3.1.2.3 Yüksek sıcaklık uygulaması ... 22
3.1.2.4 Yüksek sıcaklık+kuraklık uygulaması ... 23
3.2 Fizyolojik ölçümler ... 24
3.2.1 Fotosentez hızı ... 24
3.2.2 Yaprak oransal su içeriği ... 24
3.2.3 SPAD değeri (yaprak klorofil indeksi) ... 24
3.2.4 Yaprak sıcaklığı (°C) ... 25
3.2.5 Prolin miktar tayini ... 25
3.2.6 Malondialdehit (MDA) ölçümü ... 26
3.3 Toplam RNA izolasyonu, yeni nesil dizileme ve biyoinformatik analizler ... 26
3.3.1 Toplam RNA izolasyonu ... 26
3.3.2 Yeni nesil dizileme ve biyoinformatik analizler ... 27
3.4 Gen ifadesi doğrulama çalıĢması (qRT-PCR) ... 28
3.4.1 cDNA sentezi ... 28
3.4.1.1 miRNA’dan cDNA yapımı ... 28
3.4.1.2 Toplam RNA’dan cDNA yapımı ... 30
3.4.2 RT-PCR ile cDNA doğrulama çalıĢması ... 31
3.4.2.1 PCR Yapımı ... 31
3.4.2.2 PCR örneklerinin jel elektroforezi ile görüntülenmesi ... 32
3.4.3 qRT-PCR yapımı ... 33
BÖLÜM IV BULGULAR VE TARTIġMA ... 34
4.1 Fizyolojik Karakterler ... 34
4.1.1 Fotosentez ölçümü ... 37
4.1.2 Yaprak sıcaklık ölçümü ... 39
4.1.3 Yaprak oransal su içeriği ... 42
4.1.4 SPAD (klorofil indeksi) ... 44
4.1.6 MDA ölçümü ... 48
4.2 Toplam RNA izolasyonu, yeni nesil dizileme ve biyoinformatik analizler ... 50
4.2.1 Toplam RNA izolasyonu ... 50
4.2.2 Yeni nesil dizileme ve biyoinformatik analizler ... 51
4.3 Gen ifadesi doğrulama çalıĢması (qRT-PCR) ... 82
4.3.1 RT-PCR ile cDNA Doğrulama ÇalıĢması ... 84
4.3.2 qRT-PCR yapımı ... 87
BÖLÜM V SONUÇ ... 95
KAYNAKLAR ... 97
ÖZ GEÇMĠġ ... 104
TEZ ÇALIġMASINDAN ÜRETĠLEN ESERLER (MAKALE, BĠLDĠRĠ, POSTER VB.) ... 105
Çizelge 2.1. miRNA’ların görevleri (Basel Krahiwesh, 2011)...……6
Çizelge 2.2. Abiyotik stres etmenleri ... 8
Çizelge 2.3. miRNA’lar ve bitki çeĢitlerindeki stres cevabı (Ramanjulu Sunkar, 2012) 12 Çizelge 2.4. Li ve diğerlerinin buldukları miRNA’lar ve hedefleri (Li vd., 2016) ... 14
Çizelge 3.1. Günlük sıcaklık artıĢ miktarı ... 23
Çizelge 3.2. miRNA’dan cDNA yapımı için kullanılan primer listesi ... 29
Çizelge 3.3. miRNA’dan cDNA sentezinde kullanılan kimyasallar (Bir cDNA sentezi için kullanılan değerler verilmiĢtir) (Qiagen cDNA kiti) ... 30
Çizelge 3.4. mRNA’dan cDNA sentezinde kullanılan kimyasallar (Bir cDNA sentezi için kullanılan değerler verilmiĢtir) (Qiagen cDNA kiti) ... 30
Çizelge 3.5. PCR içeriği (Thermo Scientific) (Dream Taq) ... 31
Çizelge 3.6. PCR koĢulları ... 31
Çizelge 3.7. qRT-PCR ve PCR doğrulama çalıĢmasında kullanılan miRNA primer listesi ... 32
Çizelge 3.8. qRT-PCR içeriği (Applied Biosystem) ... 33
Çizelge 3.9. qRT-PCR sıcaklık döngüsü ... 33
Çizelge 4.1. ÇeĢitler stres uygulamaları ve Ģekil ve çizelgelerde kullanılan kısaltılmıĢ isimleri ... 50
Çizelge 4.2. Ġzole edilen toplam RNA’ların Nonodrop ölçüm sonuçları ... 51
Çizelge 4.3. Ham veriler açısından kütüphanelerin değerlendirme sonuçları ... 52
Çizelge 4.4.Veri filtreleme özeti ... 53
Çizelge 4.5. Yeni nesil dizileme sonuçlarına göre sRNA kütüphanelerindeki toplam ve özgün okuma sayılarının dağılımı ... 54
Çizelge 4.6. Bilinen miRNA’ların tam listesi ... 69
Çizelge 4.7. Stres uygulamasına özgün veya ortak değiĢen miRNA’lar ... 74
Çizelge 4.8. qRT-PCR için seçilen miRNA’lar olgun dizileri ve hedef genleri ... 82
Çizelge 4.9. Jellerin çeĢitler ve primerlere göre değerlendirilmesi ... 87
Çizelge 4.11. Hedef genlerin qRT-PCR sonucuları ... 92
ŞEKİLLER DİZİNİ
ġekil 2.1. miRNA biyogenezi ve etki mekanizması (Yang vd., 2012) ... 5
ġekil 2.2. Abiyotik stres genel cevap Ģematiği (Gökçe, 2015) ... 10
ġekil 2.3. Stres durumundaki miRNA’lar ve etki ettiği gen aileleri (Basel vd., 2011) .. 13
ġekil 2.4. Zhang ve arkadaĢlarının bulduğu miRNA gen aileleri (Zhang vd., 2013) ... 16
ġekil 2.5. Açık havada kurutma ve %15 PEG ile kurutma uygulamasının sonuçları (Hwang vd., 2011b) ... 18
ġekil 2.6. Açık havada kurutma ve %15 PEG ile kurutma uygulamasının sonuçları (Hwang vd., 2011c) ... 19
ġekil 2.7. Seçilen miRNA’lardan artıĢ gösterenler (Zhang vd., 2014) ... 20
ġekil 2.8. Bulunan bazı miRNA’ların hedef genleri verilmiĢtir (Zhang vd., 2014) ... 20
ġekil 3.1. cDNA yapım aĢamaları (Li-hong Yang, 2014) ... 29
ġekil 4.1. Unica çeĢidinin 14 günlük stres uygulamasının sonunda morfolojik görünümü (Sırası ile kontrol, kuraklık, yüksek sıcaklık, yüksek sıcaklık+kuraklık) ... 35
ġekil 4.2. Russet Burbank çeĢidinin 14 günlük stres uygulamasının sonunda morfolojik görünümü (Sırası ile kontrol, kuraklık, yüksek sıcaklık, yüksek sıcaklık+kuraklık) ... 35
ġekil 4.3. Unica ve Russet Burbank yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık uygulaması morfolojik görünümü (Sırası ile Unica yüksek sıcaklık, Unica yüksek sıcaklık+kuraklık, Russet Burbak yüksek sıcaklık, Russet Burbank yüksek sıcaklık+kuraklık) ... 36
ġekil 4.4. 23 günlük kuraklık uygulaması sonunda Unica ve Russet Burbank çeĢitlerinin morfolojik görünümü ... 36
ġekil 4.5. Unica’nın kontrol ve kuraklık koĢullarındaki fotosentez hızı (µmolm-2s-1) ölçüm grafiği ... 37
ġekil 4.6. Russet Burbank’in kontrol ve kuraklık koĢullarındaki fotosentez hızı (µmolm-2s-1) ölçüm grafiği... 38
fotosentez hızı (µmolm-2s-1) ölçüm grafiği ... 39 ġekil 4.8. Russet Burbank’in yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık
koĢullarındaki fotosentez hızı (µmolm-2s-1) ölçüm grafiği ... 39 ġekil 4.9. Unica çeĢidinin kuraklık uygulamasında yaprak sıcaklığı (oC) ölçüm grafiği ...
... 40 ġekil 4.10. Russet Burbank çeĢidinin kuraklık uygulamasında yaprak sıcaklığı (oC)
ölçüm grafiği ... 41 ġekil 4.11. Unica çeĢidinin yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık uygulamasında
yaprak sıcaklığı (oC) ölçüm grafiği ... 42 ġekil 4.12. Russet Burbank çeĢidinin yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık
uygulamasında yaprak sıcaklığı (oC) ölçüm grafiği... 42 ġekil 4.13. Unica ve Russet Burbank çeĢitlerinin kuraklık uygulamasındaki yaprak
oransal su içeriği (%) ölçüm grafiği ... 43 ġekil 4.14. Unica ve Russet Burbank çeĢitlerinin yüksek sıcaklık ve yüksek
sıcaklık+kuraklık uygulamasında ki yaprak oransal su içeriği (%) ölçüm grafiği ... 44 ġekil 4.15. Unica çeĢidinin kuraklık koĢullarındaki SPAD ölçüm grafiği ... 45 ġekil 4.16. Russet Burbank çeĢidinin kuraklık koĢullarındaki SPAD ölçüm grafiği ... 45 ġekil 4.17. Unica çeĢidinin yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+ kuraklık koĢullarındaki
SPAD ölçüm grafiği ... 46 ġekil 4.18. Russet Burbank çeĢidinin yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+ kuraklık
koĢullarındaki SPAD ölçüm grafiği ... 46 ġekil 4.19. Prolin standart eğrisi ... 47 ġekil 4.20. Unica ve Russet Burbank çeĢidinin kuraklık koĢullarındaki prolin birikimi
(µg)... 47 ġekil 4.21. Unica ve Russet Burbank çeĢidinin yüksek sıcaklık ve yüksek
sıcaklık+kuraklık koĢullarındaki prolin birikimi (µg) ... 48 ġekil 4.22. Unica ve Russet Burbak için kuraklık koĢullarındaki MDA değiĢimi grafiği
... 49
koĢullarındaki MDA değiĢimi grafiği (μmol/g FW) ... 50
ġekil 4.24. Ġzole edilen toplam RNA’ların agaroz jel görüntüsü (100 bç’lik Thermo Scientfic firmasının markırı kullanılmıĢtır) ... 51
ġekil 4.25 Dizileme sonucu oluĢan kütüphanedeki sRNA uzunlukları dağılımı ... 54
ġekil 4.26. Özgün okumaların sınıflandırma sonuçları ... 56
ġekil 4.27. Yeni nesil dizileme sonucunda özgün miRNA dizilerinin TPM dağılımı .... 62
ġekil 4.28. ÇeĢide özgün miRNA kütüphanelerinin Pearson analiz sonuçları ... 62
ġekil 4.29. Stres uygulamalarına ait miRNA’ların kendi kontrol verileri ile karĢılaĢtırıldığı Volcano diagramları ... 64
ġekil 4.30. miRNA’ların çoklu karĢılaĢtırma ile oluĢturulan Venn diagramları ... 68
ġekil 4.31. Yeni bulunan miRNA’ların ikincil yapı analiz örneği ... 70
ġekil 4.32. Hedef genlerin KEGG sonuçlarına göre metabolik yolak sonuçları ... 71
ġekil 4.33. PCR doğrulama çalıĢması jel sonuçları (% 1,2’lik agaroz jel, Biolab 50 bç’lik markır kullanılmıĢtır) ... 84
ġekil 4.34. qRT-PCR erime eğrisi grafikleri ... 90
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ
Simgeler Açıklama
α Alfa
CO2 Karbondioksit
dH2O Distile su
H2O2 Hidrojenperoksit
μg Mikrogram
μl Mikrolitre
ml Mililitre
μM Mikromolar
nm Nanometre
O2- Süperoksit
rpm Santrifuj iĢleminde dakikadaki devir sayısı
Kısaltmalar Açıklama
ABA Absisik Asit
cDNA Tamamlayıcı DNA
CIP International Potato Center
DEPC Dietilpirokarbonat
DNA Deoksiribonükleikasit
dNTP Dinükleotidtrifosfat
dsDNA Çift Ġplikli DNA
EtBr Etidyum Bromür
EtOH Etanol
HSP Isı ġoku Proteini
MDA Malondialdehit
miRNA mikroRNA
ng Nanogram
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
pre-miRNA Ön-mikroRNA
qRT-PCR Kantitatif EĢ Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu RISC RNA Tarafından Uyarılan SessizleĢtirme TümleĢiğ
RWC Yaprak Oransal Su Ġçeriği
RNA Ribonükleikasit
rRNA Ribozomal RNA
SPAD Klorofil Ġndeksi
sRNA Küçük RNA
TE Tris-EDTA
TPM Transkript Per Kilobase Million
BÖLÜM I
GİRİŞ
Patates (Solanum tuberosum L.) yumruları zengin içeriğe sahip ve yüksek besin değeri olan önemli bir gıda maddesidir. Patates, su kıtlığı, yüksek sıcaklık gibi olumsuz çevre koĢullarına yüzlek kök yapısından dolayı hassas bir bitkidir. YetiĢtirme için optimum sıcaklığı 17-21oC’dir. Dünya genelinde sıcaklıklar artmakta ve sulama amacıyla kullanılabilecek tatlı su kaynakları giderek azalmaktadır. Küresel iklim değiĢikliğine bağlı olarak, üretim sırasında gerçekleĢen yüksek sıcaklık, kurak dönemler ve toprağa düĢen yağıĢ miktarı ve sulama amacıyla kullanılan yeraltı su kaynaklarındaki azalma nedeniyle önümüzdeki 30 sene içerisinde patateste verim kaybının % 18 ila 32 seviyesinde azalacağı öngörülmektedir (Monneveux vd., 2013). Bu da patateste kuraklık stresine dayanıklı çeĢitlerin geliĢtirilmesini zorunlu kılmaktadır. AraĢtırıcılar genomik ve moleküler yaklaĢımlarla elde edilen bilgilere dayanarak gerçekleĢtirilen fenotipleme ve ıslah yaklaĢımlarının, tarımsal anlamda önemli bitkilerde kuraklığa veya yüksek sıcaklığa toleransı yüksek çeĢitlerin geliĢtirilmesi için gerekli olduğunu vurgulamaktadırlar (Mir vd., 2012). Abiyotik stres bitkide birçok zararlanmaya neden olmaktadır, hatta bitkinin ölmesine bile sebep olabilir. Ġklim değiĢikliğine bağlı etkiler nedeniyle verim kaybı olmadan daha az suyla ve daha sıcak ortamda büyüyebilen yani daha dayanıklı türlere ihtiyaç duyulmaktadır. Abiyotik stres cevabı karmaĢık biyolojik olaylar silsilesidir ve anlaĢılması zordur. Abiyotik strese bitkiler stresten kaçarak ya da tolerans göstererek cevap verirler. Bu stresten kaçıĢ ya da stres toleransının biyolojik yolaklarının tespit edilmesi stres cevabının anlaĢılmasına ve böylece strese dayanıklı türlerin seçimine, hatta ileride strese dayanıklı türler yetiĢtirmeye yardımcı olacaktır.
Daha önce yapılan çalıĢmalar abiyotik stres tepkisinde mikroRNA’lar (miRNA'lar)’ların da önemli bir rolü olduğunu göstermiĢtir.
miRNA'lar ilk olarak 1993 yılında nematodlarda keĢfedilmiĢ olup (Lee vd., 1993), yaklaĢık 20-24 nükleotid uzunluğunda tek zincirli küçük RNA’lardır. miRNA'lar, bitkilerde hedef mRNA'larına kısmen eĢlenerek bağlanırlar. Bu bağlanma sonucunda, mRNA’daki fosfodiester bağları kesilerek mRNA parçalanmakta ve protein sentezi sekteye uğratılarak protein oluĢumu baskılanmaktadır. Böylece, hedef mRNA'nın ifadesi transkripsiyon sonrası (post-transkripsiyonel) düzeyde düzenlenmiĢ olmaktadır.
Benzer eĢlenik dizilere sahip olan her miRNA farklı mRNA'lara bağlanabilmekte, böylece bir miRNA’nın birden fazla hedef geni de olabilmektedir (Selbach vd., 2008).
Bitki miRNA’ları ilk kez 2002 yılında Arabidopsis thaliana’da bulunmuĢtur (Reinhart vd., 2002). Son yıllarda yapılan çalıĢmalar, miRNA’ların genleri susturması vasıtasıyla bitki geliĢiminin kontrolünde güçlü ve beklenmedik rollere sahip olduklarını ortaya koymuĢtur. miRNA’lar yaprak oluĢumu, çiçek farklılaĢması ve geliĢimi, köklenme ve kök geliĢiminin sağlanması, iletim demetlerinin geliĢimi, vejetatif aĢamadan generatif aĢamaya geçiĢin sağlanması gibi bir çok geliĢim olayını düzenlemektedirler (Chuck vd., 2009; Jones-Rhoades vd., 2006). Ayrıca, miRNA’ların hormon sinyal iletiminde (Liu vd., 2010), çevresel strese tepkide ve patojenlere karĢı savunmada (Sunkar vd., 2006) önemli role sahip oldukları keĢfedilmiĢtir. Bitki stres fizyolojisi genel olarak stresin algılanması, sinyal iletimi ve stres cevabı olarak 3 temel baĢlık altında incelenebilir (Öztürk, 2015). Stres algılaması gerçekleĢtikten sonra bitki stresi tolere edebilir ya da strese adaptasyon gösterebilir. Bu olay hasar gören hücre proteinlerinin tamiri ve hücre homeostazının yeniden oluĢturulmasını sağlayan oldukça karmaĢık bir mekanizmadır.
Bu mekanizmalar genellikle multigen aileleri ile kontrol edilirler (Cramer vd., 2011).
miRNA’ların da mRNA’ya etki ederek proteine dönüĢümü engellendiğinden dolayı stres durumunda meydana gelen genlerin ekspresyon değiĢimlerine etki ettiği ve bundan dolayı miRNA’ların keĢfedilmesi stres fizyolojisinin anlaĢılmasına yardımcı olacaktır.
Gen susturmada miRNA’lar kullanılmıĢ ve strese karĢı dayanıklı bitkiler elde edilebilecek çalıĢmaların önü açılmıĢtır.
Son dönemlerde miRBase veritabanında, 73 bitki türünden toplam 7057 bitki miRNA’sı kayıtlı durumdadır ve çok sayıda miRNA’nın hedefleri tahmin edilmiĢ, bunlardan bazıları doğrulanmıĢ ve deneysel olarak teyit edilmiĢtir (miRBase, 2017). Birçok miRNA da tespit edilmeyi ve görevlerinin aydınlatılmasını beklemektedir. Abiyotik stres çalıĢmalarında da birçok miRNA tespit edilmiĢtir. Örneğin kuraklık ve absisik asit stresinde miRNA169a, cNFY A5 (çekirdek faktörü) gen ailesine etki ederek stomal açılmanın kontrolü ve stres cevap genlerinin anlatımını sağlar(Li vd., 2008). Kuraklık ve tuz stresinde miRNA168 görev almakta ve AGO1 (argonat1) gen ailesine etki etmekte ve bitki geliĢiminin düzenlenmesi ve geri besleme mekanizmasının çalıĢmasında rol oynamaktadır (Basel Khraiwesh vd., 2012). miR169’un yüksek düzeyde ekspresyonu domateste kuraklık stresine karĢı toleransı artırırken, Arabidopsis
thaliana'da toleransı azaltmaktadır (Ramanjulu Sunkar vd., 2012). Bu durum da bitki miRNA’larının strese ve bitki türüne göre değiĢmekte olduğunu göstermektedir.
Örneğin, miRNA156’nın kuraklık stresinde Arabidopsis thaliana’da ekpresyonu artarken, Oryza sativa’da ekpresyonu azalır (Ramanjulu Sunkar vd., 2012).
miRNA156’nın anlatım seviyesinin aynı zamanda yüksek sıcaklık stresinde de Triticum aestivum’da arttığı tespit edilmiĢtir (Ramanjulu Sunkar vd., 2012).
Son dönemde yapılan çalıĢmalarda miRNA’ların bitki büyüme geliĢiminin yanı sıra biyotik ve abiyotik streslerde de görev aldığı ve stres cevabında önemli olduğu anlaĢılmıĢtır. Bu tez çalıĢması kapsamında kuraklığa dayanıklı Unica (Ramirez vd., 2015) ve hassas Russet Burbank (Stark vd., 2013) patates çeĢitlerinde kuraklık, yüksek sıcaklık, yüksek sıcaklık+kuraklık stresi uygulanarak yeni nesil dizileme yöntemiyle karĢılaĢtırmalı miRNA transkriptomlarının belirlenmesi hedeflenmektedir. Bulunan miRNA’lardan bazılarının ekspresyon seviyeleri qRT-PCR ile kontrol edilerek doğrulanacaktır. ÇalıĢma miRNA’ların olası hedef genlerinin tespit edilerek patates çeĢitlerinin stres cevabının anlaĢılabilmesi ve abiyotik strese dayanıklı patates geliĢtirmek için bir ön çalıĢma niteliği taĢımaktadır.
BÖLÜM II
GENEL BİLGİLER
2.1 Mikro RNA’lar
2.1.1 Mikro RNA (miRNA) nedir?
MikroRNA’lar (miRNA'lar) ilk olarak 1993 yılında nematodlarda keĢfedilmiĢ olup (Lee vd., 1993), yaklaĢık 22 nükleotid uzunluğunda tek zincirli küçük RNA’lardır.
miRNA’lar, mRNA’ya bağlanarak mRNA’nın tamamen ya da kısmen parçalanmasına neden olarak genin baskılanmasını ya da ekspresyonunun azaltılmasına neden olurlar (Jung vd., 2007). Bitki miRNA’ları ise ilk kez 2002 yılında Arabidopsis thaliana’da bulunmuĢtur (Reinhart, 2002). Mevcut durumda, miRBase veritabanında, 73 bitki türünden toplam 7057 bitki miRNA’sı kayıtlı durumdadır (miRBase, 2017). Çok sayıda miRNA’nın hedefleri tahmin edilmiĢ, bunlardan bazıları doğrulanmıĢ ve deneysel olarak teyit edilmiĢtir. Bitki miRNA araĢtırması, 2002’den beri hız kazanmıĢtır ve buna miRNA sentezine katılan bitkisel proteinlerin keĢfi de eĢlik etmiĢtir.
2.1.2 miRNA’ların biyogenezi
miRNA’ların biyogenezi miRNA genlerinden RNA polimeraz II (Pol II) enziminin transktripsiyonu baĢlatması ile baĢlayan ve 20-24 nükleotitlik olgun miRNA oluĢması ile sonlanan bir dizi biyolojik iĢlemler silsilesidir (ġekil 2.1.). Ġlk olarak miRNA geni Pol II enzimi tarafından transkribe olur pre-miRNA oluĢur ve pre-miRNA sap-ilmek halini alır. Sonraki aĢamada DCL1 (Dicer enzimi) enzimi tarafından pre-miRNA, miRNA: miRNA* çift sarmal yapısını oluĢturur. Bu aĢamalar nukleusta gerçekleĢir ve miRNA:miRNA*, HST1 (eksportin 5 ortoloğu) tarafından sitoplazmaya taĢınır. Helikaz enzimi miRNA:miRNA* çift sarmal yapısını ayırarak olgun miRNA’nın oluĢmasını sağlar. HYL1 proteini ise çift iplikli RNA’nın bağlanmasını sağlar bunun yanı sıra HEN1 enzimi ise miRNA’nın 3’ ucuna metil grupları ekleyerek miRNA’nın RNA polimerazlarca parçalanmasını engeller (Bartel, 2004; Lu vd., 2008a; Yang vd., 2012;
Zhang vd., 2006).
Şekil 2.1. miRNA biyogenezi ve etki mekanizması (Yang vd., 2012)
OluĢan olgun miRNA çift sarmal yapısı RISC adında ribonukleoprotein kompleksi ile birleĢir. Kompleksten miRNA* ayrılarak degrede olur. Kompleskin AGO1 (Argonaute- 1) adında temel bileĢeni vardır bu bileĢen RISC’in fonksiyonel olmasını sağlar (Khraiwesh vd., 2012; Kumar, 2014). RISC kompleksindeki miRNA’lar hedefledikleri mRNA’ya 3’ bölgesinden bağlanılar ve bu sayede post-transkripsiyonel kontrol sağlayarak mRNA’nın parçalanmasını sağlar (Zhang vd., 2006; Yang vd., 2012).
2.2.3 miRNA’ların görevleri
miRNA’lar post-transkripsiyonel olarak genlerin baskılanmasında görev aldığı gibi aynı zamanda da bitki büyümesi, bitki çiçeklenmesi, oksin sinyalizasyonu, yaprak ve kök geliĢimi, biyotik stres ve abiyotik streste görev almaktadırlar. Daha önce yapılan çalıĢmalarda bulunan miRNA’lar ve bu miRNA’ların görevleri Çizelge 2.1.’de gösterilmiĢtir.
Çizelge 2.1. miRNA’ların görevleri (Basel Krahiwesh, 2011) Rolü miRNA Aileleri Etki Ettiği Gen Aileleri
Oksin
sinyalizasyonu
miRNA160 miRNA164 miRNA167 miRNA390 miRNA393
ARF10 (oksin cevap faktörü 10)
NAC1 (NAC domain transkripsiyon faktör 1) ARF8 (oksin cevap faktörü 8)
ARF (oksin cevap faktörü) TIR1 (taĢıma inhibitör cevap TF 1) Yaprak gelişimi miRNA159
miRNA164 miRNA166 miRNA172 miRNA319
MYB (mapkinaz transkripsiyon faktör) NAC1 (NAC domain transkripsiyon faktör 1) HD-ZIPIII (homedomain lusin zinciri TF) AP2 (apatela 2 DNA bağlanma proteini) TCP (TF)
Yaprak polaritesi miRNA166 miRNA168 miRNA390
HD-ZIPIII (homedomain lusin zinciri TF) AGO1 (argonaute 1)
ARF (GAP domain 1) Çiçek organları
tanımlanması
miRNA160 miRNA164 miRNA172 miRNA319 miRNA156 miRNA159 miRNA172 miRNA319
ARF10 (oksin cevap faktörü 10)
NAC1 (NAC domain transkripsiyon faktör 1) AP2 (apatela 2 DNA bağlanma proteini) TCP (TF)
SBP (sulfat taĢıyıcı)
MYB (mapkinaz transkripsiyon faktör) AP2 (apatela 2 DNA bağlanma proteini) TCP (TF)
Çizelge 2.1. (Devam) miRNA’ların görevleri (Basel Krahiwesh, 2011)
Stres cevabı miRNA156 miRNA159 miRNA160 miRNA167 miRNA168 miRNA169 miRNA171 miRNA319 miRNA393 miRNA395 miRNA396 miRNA397 miRNA398 miRNA399 miRNA408
SBP (sulfat taĢıyıcı)
MYB (mapkinaz transkripsiyon faktör) ARF10 (oksin cevap faktörü 10) ARF8 (oksin cevap faktörü 8) AGO1 (argonaute 1)
NFY (çekirdek TF) SLC (nitrat redüktaz) TPC (TF)
TIR1 (taĢıma inhibitör cevap TF 1) APS (adenozin fostat kinaz) GRF (nükleer resöptör) Laktaz
CSD (büyüme faktörü)
UBC24 (ubiqutin konjugasyon enzimi) Plastosiyanin
miRNA’ların kontrolü
miRNA162 miRNA168 miRNA403
DLC1 (Dicer enzimi) AGO1 (argonaute 1) AGO2 (argonaute 2)
Diğer miRNA158
miRNA161 miRNA163 miRNA173
At1g64100 (Arabidopsis thaliana TF) PPR (DNA motifi)
At1g66700 (Arabidopsis thaliana TF) At3g28460 (Arabidopsis thaliana TF)
2.2 Abiyotik stres
Bitkide metabolizmayı, büyümeyi, geliĢmeyi ve ürün verimini etkileyen veya engelleyen, yani bitki için uygun olmayan herhangi bir uyarıcının etkisine stres denir.
Cansız stres etmenlerine ise abiyotik stres denir. Abiyotik stres etmenleri Çizelge 2.2’de gösterilmiĢtir.
Çizelge 2.2. Abiyotik stres etmenleri
1. Kuraklık 2. Yüksek Sıcaklık
3. DüĢük Sıcaklık 4. Radyasyon
5. Tuzluluk 6. Mekanik
7. Pestisit 8. IĢık
9. Hava Kirliliği 10. Su Baskını
11. Toksinler 12. Besin Kıtlığı
2.2.1 Kuraklık stresi
Tarımsal anlamda kuraklık, yağmur ve sulama ile sağlanan su miktarının terleme (transpirasyon) ile kaybedilen su miktarından az olması nedeniyle bitkinin maksimum büyüme ve verim potansiyeline ulaĢamaması durumunu anlatmaktadır (Deikman vd., 2012; Tuberosa, 2012). Bitkiler kuraklık koĢullarında sakınarak veya tolerans göstererek yaĢamlarını sürdürmeyi baĢarabilirler. Sakınma bitkinin derin kök sistemi, erken çiçeklenme ve ozmotik düzenleme gibi morfolojik ve fizyolojik değiĢiklikler ile dayanıklılık gösterdiği bir durumdur. Tolerans ise sentezlenen karbonhidratların yeniden yerleĢtirilmesi ve moleküler koruyucuların birikimi gibi metabolik seviyede gerçekleĢen değiĢiklikler aracılığıyla bitkinin su kaybı olan koĢullarda metabolik iĢlevlerini yerine getirebilmesi temeline dayalıdır (Lawlor, 2013; Tuberosa, 2012).
Bitkilerin kuraklık stresine en erken tepkilerinden biri stomalarını kapatmasıdır.
Stomaların kapatılmasının bitkilerde su kaybını azaltırken aynı zamanda CO2 giriĢinide azaltığı görülmüĢtür (Mullet vd., 1996). ABA (absisik asit) kökte sentezlenir ve ksilem ile taĢınarak stomaların kapanmasına neden olur (Sauter vd., 2002). Bitkilerin stres cevabı sadece fizyolojik değil aynı zamanda molekülerdir; bu da stres sırasında bazı genlerin anlatımının artması bazı genlerin anlatımının azalması ile gerçekleĢir. Kuraklık
stresi sırasında anlatımı artan genler genel olarak ozmokoruyucular, taĢıyıcı proteinler, transkripsiyon faktörleri ve protein kinaz ve fosfotaz gibi direkt olarak stresten korunma mekanizmalarında görevli proteinleri kodlamaktadırlar (Krasensky vd., 2012).
2.2.2 Yüksek sıcaklık stresi
Yüksek sıcaklık stresi bitkilerin yaĢadığı optimum sıcaklık değerinin üzerine çıkıldığında ortaya çıkar. Küresel ısınmanın etkisinden dolayı hava sıcaklığının 2100 yılına kadar ortalama 1.4-4.5oC artacağı öngörülmektedir (Bahuguna vd., 2014). Bu sıcaklık artıĢının Ģu an bile sorun olan yüksek sıcaklık stresini, ilerde daha büyük bir problem haline getirmesi kaçınılmaz bir durumdur. Kuraklık stresinde olduğu gibi yüksek sıcaklık stresinde de moleküler zararlanmalar ortaya çıkar. Sıcaklığın artmasından dolayı bitki içindeki moleküllerin kinetik enerjisi artar, moleküller arasındaki bağlar gevĢer ve bu durum hücre zarının yapısının bozulmasına neden olur (Yasuda vd., 2008). Aynı zamanda yüksek sıcaklık proteinlerin denatüre olmasına sebep olur ki bu da bütün hücre metabolizmasını etkiler. Kuraklık stresinde olduğu gibi fotosentez hızı da etkilenir ve yaprakçık sıcaklığının artamasına da sebep olur (Redondo-Gomez, 2013).
2.3 Bitkilerin abiyotik stres cevabı
Bitkilerin abiyotik stres cevabı 3 aĢamada gerçekleĢir. Ġlk aĢama stresin algılanması, algılamadan sonra sinyal iletimi ve son olarak stres cevabı gerçekleĢir. Bu olaylar ġekil 2.2.’de anlatılmıĢtır.
Şekil 2.2. Abiyotik stres genel cevap Ģematiği (Gökçe, 2015)
Stres algılaması gerçekleĢtikten sonra bitki stresi tolere edebilir ya da strese adaptasyon gösterebilir. Bu olay hasar gören hücre proteinlerinin tamiri ve hücre homeostazının yeniden oluĢturulmasını sağlayan oldukça karmaĢık bir mekanizmadır. Bu tür mekanizmalar genellikle multigen aileleri ile kontrol edilirler (Cramer vd., 2011).
Her multigen ailesini belirli bir transkripsiyon faktörü kontrol eder. Transkripsiyon faktörleri (TF) genin eksperyonunun artırılması ya da azaltılmasında büyük bir role sahiptirler. Stres durumunda bu özelliklerinden dolayı genellikle bitkiler TF’leri kullanarak multigen ailelerine etki ederler. Arabidopsis thaliana’da stres durumunda bulunan TF’lerin çoğu MYB, MYC, AP2/EREBP, bZIP, WRYK gibi multigen ailelerine aittir (Hirayama, 2010). Transkripsiyonel düzenleme gerçekleĢtikten sonra hücre içindeki metabolit ürünleri değiĢir. Bu düzenlemenin en önemli ürünlerinden biri ozmolit sentezidir.
Ozmolitler düĢük molekül ağırlığına sahip, hücre içinde fazla çözünebilen toksik olmayan metabolitlerdir. Ozmolitler bitkilerde ozmotik basıncın ayarlanmasını sağlarlar. Ozmolitler amino asitler (prolin), kuarterler aminler (glisin betain, poliaminler) ve Ģeker alkollerdir (monnitol,sorbitol) (Bhatnagar-Mathur vd., 2008).
Prolinin hücre içindeki temel görevi lipit oksidasyonunu engelleyerek hücre membran yapılarının korunmasıdır. Prolin kuraklık koĢullarında ilk biriken ozmolittir ve bu da stres seviyesini tespit etmede ölçüm olarak kullanılır. Aynı zamanda son yılllarda hücre
içi sinyal iletiminde de görev aldığı ortaya konululmuĢtur (Kishor vd., 2014). Glisin betainin kuraklık ve tuzluluk stresi ile arttığı gözlenmiĢ fakat çeltik, domates ve patates bitkilerinde ise birikimin olmadığı ortaya çıkmıĢtır. Bundan dolayı bu bitkilerin strese karĢı daha hassas olduğu varsayılmaktadır (Bhatnagar vd., 2008).
Kuraklık veya yüksek sıcaklık meydana geldikten sonra ortamda reaktif O2 türleri birikmeye baĢlar ve bu da bitkinin oksidatif strese (ROS) girmesine sebep olur. ROS seviyesinin yüksek olması bitkinin ölümüne sebep olabilir ve bitkiler bu durumu gidermek için antioksidan mekanizmaları geliĢtirmiĢlerdir. Bu antioksidanlar; katalaz, süperoksit dismutaz (SOD), askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon redüktaz enzimleridir. Bu enzimler ortaya çıkan hidrojen peroksit (H2O2), süperoksit (O2-) türevlerini zararsız hale getirirler (Cramer vd., 2011).
Bitki stres cevabının en önemlilerinden biri de stres ile iliĢkili proteinlerdir. Bunlar ısı Ģoku proteinleri (HSP) ve geç embriyogenez proteinleri (LEA)’dir (Bhatnagar vd., 2008). HSP proteinleri daha çok yüksek sıcaklık stresinde orta çıkarlar. Stres durumunda genel hücre proteinleri aktivitelerinin yitirirler ya da denatüre olurlar;
HSP’ler bu denatüre olmuĢ proteinlerin düzeltilmesini sağlarlar yani bir moleküler Ģaperon olarak görev yaparlar (Bhatnagar vd., 2008). Bitkilerde HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 ve küçük HSP’ler olmak üzere 5 tane korunmuĢ HSP ailesi mevcuttur (Bhatnagar vd., 2008). Embriyogenezin geç evresinde sentezlenen LEA proteinleri stres durumunda ortaya çıkarlar ve görevi tam olarak bilinmemektedir. Membran stabilizasyonunu sağladıkları düĢünülmektedir (Bhatnagar vd., 2008).
2.4 Abiyotik streste miRNA’lar
Stres cevabında miRNA’lar seviyelerini artırarak ya da azaltarak gen ailelerine etki eder ve bitkinin strese hassasiyet ya da tolerans göstermesine neden olurlar. Bazı miRNA’lar aynı bitkide farklı streslere farklı Ģekilde cevap verirler birinde artıĢ gösterirken diğerinde azalıĢ gösterebilirler. Yine aynı Ģekilde farklı bitkilerde de farklı anlatım miktarı gösterebilirler. Bu konuda yapılan bir çalıĢma 2012 yılında Ramanjulu Sunkar ve arkadaĢları tarafından yapılmıĢ ve Çizelge 2.3.’de kuraklık ve yüksek sıcaklık
streslerinde artıĢ ya da azalıĢ gösteren miRNA’lar ve faklı bitkilerdeki durumları verilmiĢtir.
Çizelge 2.3. miRNA’lar ve bitki çeĢitlerindeki stres cevabı (Ramanjulu Sunkar, 2012)
miRNA’lar Kuraklık Yüksek sıcaklık
miR156 Ath+, Ttu+, Hvu+, Osa-, Peu+ Tae+
miR159 Ath+, Peu+ Tae+
miR160 Mes!, Peu+ Tae+
miR162 Peu+ tanımlanmamıĢ
miR165/166 Hvu+yaprak, Hvu-kök, Mes!, Gma^, Peu+&- Tae+
miR167 Ath+, Mes!, Peu+ tanımlanmamıĢ
miR168 Ath+, Osa-, Peu- Tae+
miR169 Ath-, Osa+, Mth-, Peu+ Tae+ miR170/171 Ath+, Hvu+yaprak, Ttu-, Osa+&-, Peu+&- Ptc-
miR172 Osa-, Peu+&- Tae-
miR390 Peu- tanımlanmamıĢ
miR319 Ath+, Osa+&-,Peu+&- tanımlanmamıĢ miR393 Ath+, Osa+, Mtr+, Pvu+, Peu+&- Tae+
miR395 Peu+&-,Osa+ tanımlanmamıĢ
miR396 Ath+, Osa-, Ttu-, Peu+&- tanımlanmamıĢ miR397 Ath+, Osa-, Gma^, Peu+ tanımlanmamıĢ
miR398 Mtr+, Ttu+, Peu+ tanımlanmamıĢ
miR408 Ath+, Mtr+, Hvu+, Osa- tanımlanmamıĢ
Ath, Arabidopsis thaliana; Ttu, Tritucum turgidum; Hvu, Hordeum vulgare; Osa, Oryza sativa; Peu, Populus euphratica; Mes, Manihotasculenta nd; Gma, Glycine max; Mtr, Medicago truncatula; Pvu, Phaseolus vulgaris; Tae, Triticum aestivum
+, gen ekspesyonunun arttığı; -, gen ekspresyonunun azaldığı; +&-, hem artıĢ hem azalıĢ olduğu; !, farklı bitkilerinde farklı tepki verme durumu; ^, hassas ve dayanıklı genotiplerinde farklı tepki verme durumu.
miRNA’ların strese göre değiĢiklik gösterdiği bilinmektedir bu durumdan yola çıkarak 2011 yılında Basel Khraiwesh stres durumunda etkili olan miRNA’ları ve bu miRNA’ların hedef genlerini analiz etmiĢtir (ġekil 2.3.). ġekil 2.3.’e göre miR169a,c’nin kuraklık stresinde etkili olduğu ve hedef geni olan NFY A5 transkripsiyon faktör genini etkilediği gösterilmiĢtir. Bunun yanı sıra bu gen stomaların açılmasını ve stres genlerinin düzenlenmesi kontrol etmektedir. Yüksek sıcaklık stresi ile ilgili ġekil 2.3.’da bir bilgi olmamasına rağmen yüksek sıcaklık stresine bağlı olarak geliĢen oksidatif stresle ilgili bilgi yer almaktadır. miR398 oksidatif stresde görev almakta ve hedef geni CSD1,2’yi etkilemektedir ve Ģeker metabolizmasının ve fotosentez aktivitesinin düzenlemesinde katkı sağlamaktadır. Kuraklık stresi ile ilgili olan miR168 ise AGO 1 transkripsiyon faktörünü etkilemekte ve bu da miRNA’ların geri-besleme ile düzenlemesimi sağlamaktadır. Oksin ve kök sinyalizasyonun kuraklık stresinde düzenlenmesinde görev alan miR393 hedef geni TIR1 transkripsiyon faktörüne etki ederek bu düzenlemeyi gerçekleĢtirmektedir. miR156 ve miR390’da diğer miRNA’lar gibi kuraklık stresinde görev almaktadırlar ve tohum çimlenmesi, yaprak geliĢimi ve çiçeklenme zamanının düzenlenmesini sağlamaktadırlar.
Şekil 2.3. Stres durumundaki miRNA’lar ve etki ettiği gen aileleri (Basel vd., 2011)
miRNA’lar ile ilgili bir baĢka yapılan çalıĢmada Li ve diğerleri 2016 yılında salatalık üzerinde çalıĢmıĢlardır. ÇalıĢmada salatalık ve kabağa aĢılanan salatalık kullanılarak
%600’lük PEG ile kurutma yapılmıĢtır. Kuraklık stresi dayanıklıklıklarını
Stomal açılmanın düzenlenmesi ve stres genlerinin düzenlenmesi
• Abiyotik stres genlerinin ekspirosyo nlarının düzenlenm
esi
• Abiyotik stres genlerinin ekspirosyo nlarının düzenlenm
esi
ġeker cevabı Fotosentez aktivitesi
miRNA’ların feedback düzenlemesei
Enerjinin kontorolü
Çiçeklenme zamanı Yaprak geliĢimi
Yaprak geliĢimi Yaprak polaritesi
Tohum çimlenmesi Yaprak geliĢimi
Tohum çimlenmesi Oksin sinyalizasyonu
Oksin sinyalizasyonu Kök geliĢimi
karĢılaĢtırabilmek için 17 miRNA ve onların olası hedef genleri seçilmiĢ ve qRT-PCR yapılmıĢtır. qRT-PCR 3 saatlik, 8 saatlik ve 24 saatlik kuraklık stresi uygulamasından sonra alınan yaprak ve kök örneklerinde yapılmıĢtır. ÇalıĢma sonunda tüm miRNA’ların indüklendiği gözlemlenmiĢtir (Li vd., 2016)
Çizelge 2.4. Li ve diğerlerinin buldukları miRNA’lar ve hedefleri (Li vd., 2016)
Düzenleyici rolleri miRNA Hedef
geni Görevi
Bitki büyümesi
miR159 T159 MYB protein 306-like miR167 T167 Auxin response factor 8-like miR170 T170 GRAS transcription factor
miR172 T172 Floral homeotic protein APETALA 2-like miR319 T319 Transcription factor MYB75-like b-miR-n-07 TB7 ATPase
Stress cevabı
miR169 T169 Nuclear transcription factor Y subunit A- 1-like
miR395 T395 ATP sulfurylase 1 miR398 T398 Superoxide dismutase
miRNA’ların düzenlenmesi
miR168 T168 Protein Argonaute 1A-like
miR396 T396 Endoribonuclease Dicer homolog 1-like b-miR-n02 TB2 Pre-mRNA-processing factor 17-like b-miR-n20 TB20 Dicer-like protein 4-like
2.5 Patates (Solanum tuberosum L.)
Solanaceae ailesine üye olan Solanum tuberosum L. yüksek besin içeriğine sahip yumruları yenen tek yıllık bir bitkidir. Boyu 60-80 cm olabilen ılıman-serin iklim bitkisi olup bitki geliĢimi ve verimi açısından optimum sıcaklık isteği 17-21°C arasındadır.
Genel olarak, yüksek ve düĢük hava sıcaklıkları ile tuzluluk gibi çevre faktörlerine hassas bir bitki olduğundan abiyotik stres faktörleri yumru verimi ve kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir ve su kullanım etkinliği yüksek ancak yüzlek kök sistemi nedeniyle kuraklık stresine dayanıklılığı az olan bir bitkidir (Lahlou vd., 2005; Liu vd., 2005; Hassanpanah, 2010; Monneveux vd., 2013). CIP (International Potato Center) verilerine göre dünyada en çok tüketilen 3. bitkidir; bundan dolayı da patatesin verimde ki kayıplar önemli hale gelmektedir. Küresel iklim değiĢikliğine bağlı olarak üretim sırasında gerçekleĢen yüksek sıcaklık, kurak dönemler ve toprağa düĢen yağıĢ miktarı ve sulama amacıyla kullanılan yeraltı su kaynaklarındaki azalma nedeniyle, önümüzdeki 30 sene içerisinde patateste verim kaybının % 18 ila 32 seviyesinde azalacağı öngörülmektedir (Monneveux vd., 2013). Bu da patateste kuraklık stresine dayanıklı çeĢitlerin geliĢtirilmesini zorunlu kılmaktadır. AraĢtırıcılar genomik ve
moleküler yaklaĢımlarla elde edilen bilgilere dayanarak gerçekleĢtirilen fenotipleme ve ıslah yaklaĢımlarının, tarımsal anlamda önemli bitkilerde kuraklığa toleransı yüksek çeĢitlerin geliĢtirilmesi için gerekli olduğunu vurgulamaktadırlar (Mir vd., 2012). Bu anlamda patateste yapılan dayanıklıklık çalıĢmalarında 2013 yılında Stark ve arkadaĢları GemStar Russet, Alturas, Ranger Russet, Russet Burbank, Russet Norkotah ve Summit Russet çeĢitlerini kullanarak kuraklık stres çalıĢması yapmıĢlar ve Russet Burbank çeĢidinin kuraklığa diğerlerinden daha hassas olduğunu göstermiĢlerdir (Stark vd., 2013). 2015 yılında Ramirez ve arkadaĢlarının yapmıĢ olduğu farklı bir kuraklık çalıĢmasında da Desire, Unica ve Sarbav çeĢitlerine kuraklık stresi uygulanmıĢ ve Unica’nın diğer iki çeĢide göre daha dayanıklı olduğu gösterilmiĢtir (Ramirez vd., 2015).
2.6 Patateste miRNA çalışmaları
Bitki miRNA’ları 2002 yılında keĢfedilmiĢtir fakat patateste miRNA çalıĢmaları 2009 yılında baĢlamıĢtır. Zhang ve diğerleri (2009), in siliko yaklaĢımla bilinen miRNA’ları kullanarak patatesin nükleotit dizilerini karĢılaĢtırmıĢlar ve potansiyel 48 tane miRNA tespit etmiĢlerdir. Bu miRNA’ların 186 adet hedef geni düzenleyebileceğini bildirmiĢlerdir. Bulunan 48 miRNA’dan miR157a, miR166a, miR390, miR396, miR403, miR414a, miR395a, miR395b, miR395c, miR395d, miR395e ve miR395f olmak üzere 12 tanesi için qRT-RCR yapmıĢlardır. qRT-PCR’da referans gen olarak GAPDH geni kullanmıĢlar ve tomurcuk, yaprak, gövde ve kök için yapmıĢlardır. Sonuç olarak bazı miRNA’ların patates bitkisinin her bölgesinde aktif olmadığını göstermiĢlerdir (Zhang vd., 2009).
Yang ve diğerleri de 2010 yılında yine in siliko yöntemle 71 adet potansiyel miRNA tespit etmiĢlerdir. Tespit edilen miRNA’lardan 65 tanesinin ilk kez tespit edildiğini belirtmiĢlerdir. miR159, miR162, miR164, miR165/166, miR167, miR168 ve miR171 olmak üzere toplam 7 adet gen için qRT-PCR ile doğruma çalıĢması yapmıĢlardır. 18S rRNA’yı referans gen olarak kullanmıĢlardır ve yaprak, kök, gövde ve SAM dokularında analiz yapmıĢlardır. miR164’ün diğer miRNA’lara göre daha yüksek bir ekspresyona sahip olduğu sonucuna varmıĢlardır. Aynı zamanda farklı dokularda da miRNA’ların aktif olduğunu kanıtlamıĢlardır (Yang vd., 2010).
Xie ve diğerleri (2011), in siliko olarak 78 aileden oluĢan 202 adet potansiyel miRNA bulmuĢlardır. Bulunan miRNA’lardan 54 tanesinin patateste yeni olduğunu söylemiĢlerdir. Bunlardan 12 adet miRNA’yı genç yaprak, tomurcuk ve olgun çiçek dokularında qRT-RCR yapmıĢlardır. MiR162, miR167 ve miR396 miRNA’larının qRT- PCR yapılan tüm dokularda yüksek seviyede eksprese olduğunu ve miR372’ni ise sadece çiçekte yüksek seviyede eksprese olduğunu göstermiĢlerdir. Sonuç olarak bu miRNA’ların 1.094 adet geni hedeflediği ve bu genlerin stres cevabı, sinyal iletimi ve çeĢitli metabolik yolaklarda görev aldıklarını belirlemiĢlerdir (Xie vd., 2011).
İn siliko yaklaĢımla gerçekleĢtirilen miRNA çalıĢmalarına baĢka bir bakıĢ açısı getiren Zhang ve diğerleri (2013 ve 2014), yeni nesil dizileme yaklaĢımı ile patateste 159 miRNA ailesine ait 259 adet miRNA belirlemiĢlerdir. Ayrıca ġekil 2.4.’de buldukları miRNA gen aileleri verilmektedir. Hedef genlerin stres cevabında, iyon sinyal iletiminde ve bitki geliĢiminde görev aldığı tahmin edilmektedir (Zhang vd., 2013).
Şekil 2.4. Zhang ve arkadaĢlarının bulduğu miRNA gen aileleri (Zhang vd., 2013)
Lakhotia ve diğerleri (2014) deney çeĢitliliğini artırarak 3 farklı doku ve yumru geliĢiminin farklı aĢamasını kullanarak miRNA’ları belirlemeye çalıĢmıĢlardır. 33 adet aileden 89 adet korunmuĢ miRNA ve 147 adet patatese özgü miRNA keĢfetmiĢlerdir.
Bulunan miRNA’lardan bazıları, miR160, miR164, miR172 ve miR171’dir ve hedef genleri ARF16 (Oksin cevabı faktör 16), NAM (apikal meristemi olmayan), RAP1
(apetala2 1 ile iliĢkili) ve HAM (saçak meristem)’dir. Bu çalıĢmada yapılan ifade analizleri sonucunda bazı miRNA’ların dokuya özgü ifade oluĢtururken bir kaçının yumru oluĢumu devresine özgü ifade edildiği ortaya konulmuĢtur (Lakhotia vd., 2014).
Patateste miRNA’ların hedef genlerine yönelik çalıĢma ise Ou ve diğerleri (2014) tarafından yapılmıĢtır. Bu çalıĢmada soğukta depo edilen patatesler incelenerek 53 tane bilinen ve 60 tane ise yeni miRNA bulunmuĢ ve bunların 70 hedef geninin olduğunu tespit etmiĢlerdir. Ayrıca, depolamaya tepkisi farklı olan iki ayrı patates genotipi arasında 11 tane miRNA’nın ve 34 tane hedef genin ifadelerinde farklılık gözlenmiĢtir (Ou vd., 2014).
Diğerlerinden farklı bir yöntemle karĢılaĢtırmalı genomik yaklaĢımı ile kuraklık koĢullarında 120 miRNA bulmuĢlar ve 10 tanesinin qRT-PCR ile ekspesyon seviyelerine bakılmıĢtır. 433 adet potansiyel hedef gen bulmıĢlardır (Din vd., 2014).
Ancak abiyotik stres ile iliĢkili miRNA’larla ilğili bilgiler halen sınırlıdır.
2.7 Patatesde abiyotik stres ile ilgili miRNA çalışmaları
Patateste abiyotik stres çalıĢmaları genelikle kuraklıkla ilgili yapılmıĢtır. Hwang ve diğerleri (2011a; 2011b; 2011c), patateste kuraklık stresi koĢullarında ifadesi değiĢen stu-miR396, stu-miR156a ve stu-miR157a isimli 3 tane miRNA belirlemiĢlerdir.
Kuraklık uygulamasından sonraki birinci saatten altıncı saate kadar stu-miR396’ın ifadesi kademeli olarak artıĢ göstermiĢtir. stu-miR159a ve stu-miR157a’nın ifadesi ise birinci ve üçüncü saatte azalırken altıncı saate artmıĢtır.
Hwang ve diğerleri (2011b) yine kuraklık stresinde miR171 ailesine dahil miRNA’ların ifade değiĢikliğini inceledikleri baĢka bir çalıĢmalarında, miR171a, miR171b ve miR171c’nin ifadelerinin kuraklık stresi koĢullarında değiĢtiğini gözlemlemiĢlerdir.
Kuraklık uygulamasını açık havada kurutma yaparak ve ortama %15 PEG 6000 ekleyerek iki farklı Ģekilde gerçekleĢtirmiĢlerdir. Deneyin miRNA ekspresyonu jel sonuçları ġekil 2.5.’de verilmiĢtir. ġekle göre açık havada kurutma uygulamasında, seçilen miRNA’ların ifadeleri stres uygulamasının birinci saatinde azalmıĢ, ardından altıncı saate kadar artıĢ göstermiĢtir. PEG ile kuraklık uygulamasında; miR171a’nın
ifadesi benzer Ģekilde 1 saat sonra azalmıĢ, ardından 3 saat sonra artıĢ göstermiĢ ve incelenen 48 saat süresince bu düzeyde sabit kalmıĢtır. miR171b’nin ifadesi, açık havada kurutma uygulamasının birinci saatinde azalmıĢ, üçüncü saatte artıĢ göstererek kontrol seviyesine ulaĢmıĢ, altıncı saate ise kontrol seviyesini geçmiĢtir. PEG uygulamasında ise altıncı saate kadar miR171b ifadesinde hafif bir azalıĢ olmuĢ, fakat onikinci saatten itibaren miR171b’nin ifadesi kontrole göre daha yüksek olmuĢtur.
miR171c’nin açık havada kurutma uygulamasındaki ifade modeli, miR171a’nınkiyle aynı olmuĢtur. PEG uygulamasında ise 1 saat sonra ifadesi azalmıĢ ardından ifadesinde hafif yükseliĢ meydana gelerek 48 saat sonra kontrol seviyesine ulaĢmıĢtır.
Şekil 2.5. Açık havada kurutma ve %15 PEG ile kurutma uygulamasının sonuçları (Hwang vd., 2011b)
Hwang ve diğerleri (2011c) benzer baĢka bir çalıĢmalarında, kuraklık stresi koĢullarında stu-miR172c, stu-miR172d, ve stu-miR172e miRNA’larının ifadelerinin değiĢtiğini belirlemiĢlerdir. Kuraklık uygulamasını açık havada kurutma yaparak ve ortama %15 PEG 6000 ekleyerek iki farklı Ģekilde gerçekleĢtirmiĢlerdir. Sıfırıncı saatten 48. Saate kadar aralıklarla örnek alınmıĢ ve RT-PCR yapılmıĢtır. Ekspresyon seviyesinde ki değiĢiklik sonuçları ġekil 2.6.’da mevcuttur. stu-miR172e’in açık havada kurutma uygulamasında ve PEG ile kurutma uygulamasında sıfırıncı saatten itibaren artıĢ gösterdiği gözlenmiĢtir. stu-miR172c ve stu-miR172d PEG ile kurutmada 24. ve 48. saatlerde ve açık hava ile kurutmada ise 6. saatte ekspresyon seviyesinde artıĢ göstermiĢtir (ġekil 2.6.).
Şekil 2.6. Açık havada kurutma ve %15 PEG ile kurutma uygulamasının sonuçları (Hwang vd., 2011c)
Yang ve diğerleri (2013) ise kuraklık stresinde prolin artıĢındaki miRNA’lar ile ilgili bir çalıĢma yapmıĢlardır. Ġfade ve iĢlev analizleri sonucunda, miR172, miR396a, miR396c ve miR4233’ün prolin sentezinden sorumlu genlerden biri olan P5CS geninin ifadesinin düzenlenmesinde rol alıyor olabileceğine dair bulgular elde edilmiĢtir. Bunun yanında yine prolin sentezinden sorumlu diğer genler olan P5CR (prolin 5 karboksilat) ve ProDH (prolin dehidrogenez)genlerinin sırasıyla miR2673 ve miR6461 tarafından düzenliyor olabileceğine dair sonuçlar elde edilmiĢtir (Yang vd., 2013).
Zhang ve diğerleri (2014) kuraklık toleransı üzerene çalıĢmıĢlar ve kontrole ait 458 adet bilinen, 674 adet ise yeni miRNA, kuraklık uygulanmıĢ örneklerde ise 471 adet bilinen, 566 adet yeni miRNA tespit etmiĢledir. ġekil 2.7.’de seçilen bazı miRNA’ların okuma sayıları ve ġekil 2.8’de miRNA’ların hedef genlerinin ekspresyon seviyeleri verilmiĢtir (Zhang vd., 2014). Buna göre bulunan hefedlerin çoğu transkripsiyon faktörleridir.
miR168 ve miR166’nın kontrole göre ekspresyon seviyelerinin düĢtüğü ve miR156’nın ekspresyon seviyesinin arttığını tespit etmiĢlerdir (ġekil 2.7.). Hedef gen ekspresyon seviyelerine baktıklarında ise MYB transkripsiyon faktörünün ekspresyon seviyesinin azaldığı ve miR811’in ekspresyon seviyesinin arttığını tespit etmiĢlerdir (ġekil 2.8.).
Şekil 2.7. Seçilen miRNA’lardan artıĢ gösterenler (Zhang vd., 2014)
Şekil 2.8. Bulunan bazı miRNA’ların hedef genleri verilmiĢtir (Zhang vd., 2014)
BÖLÜM III
MATERYAL VE METOD
3.1 Bitkilerin büyütülmesi ve stres uygulaması
3.1.1 Bitkilerin büyütülmesi
Bu tez çalıĢmasında kuraklık koĢullarına toleranslı olduğu bilinen Unica (Ramirez vd., 2015) ve hassas olduğu bilinen Russet Burbank (Stark vd., 2013) çeĢitleri kullanılmıĢtır.
2:1 oranında torf ve perlit içeren 5 litrelik saksılar toprak doyma kapasitesine gelene kadar sulanmıĢtır. Sulama iĢleminden sonra yumru iriliği ve sürgün sayısı gibi farklılıkları ortadan kaldırmak için tek göz yumrular her bir çeĢit için 120 adet saksıya dikilmiĢtir. Sera koĢullarında çıkıĢ dönemine kadar saksılara sadece su verilmiĢtir ve ortam sıcaklığı 21oC ve nem oranı %60 olarak ayarlanmıĢtır. ÇıkıĢ sonrasında tek gözlerden birden fazla filizlenme mevcutsa her saksıda bir bitki olacak Ģekilde tekleme yapılmıĢtır. Büyüme sırasında afit gibi zararlılar için insektisit ilacı yapılmıĢtır. Bitki çıkıĢından 30 gün sonra, 4 kg Nutribella 18 litre suda çözdürülerek 5x gübre çözeltisi hazırlanmıĢ ve 1x konsantrasyonda her saksıya 250 ml olacak Ģekilde verilmiĢtir.
3.1.2 Stres uygulaması
Bitki çıkıĢından 45 gün sonra kontrol ve kuraklık stresi için bitkilerden 4 tekerrürden 7 bitki, sıcaklık ve sıcaklık + kuraklık stresi için 3 tekerrürden 4 bitki olacak Ģekilde ayrılmıĢtır.
3.1.2.1 Kontrol uygulaması
Kontrol grubuna hiçbir stres uygulanmamıĢ ve aynı sera koĢullarında yetiĢtirilmiĢtir.
Normal bir patates bitkisinin günlük su ihtiyacı kadar su verilmiĢtir (300 ml). Kontrol uygulaması ve kuraklık stresi, kontrol uygulaması ve yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık stresi olmak üzere iki grup olarak değerlendirilmiĢtir. Bunun nedeni kuraklık, yüksek sıcaklık ve yüksek sıcaklık+kuraklık streslerinin farklı sürelerde uygulanmasıdır. Stres uygulamalarının sonunda stres gruplarıyla birlilikte kontrol
grubundan da yeni nesil dizilemede kulanılmak üzere gerekli yaprak örnekleri öğlen saatlerinde ortalama 7 bitkinin 3. ve 4. tepe yaprakcıklarından toplanmıĢ ve sıvı azotta dondurulduktan sonra -80oC’de saklanmıĢtır.
3.1.2.2 Kuraklık uygulaması
Bitki çıkıĢından 45 gün sonra uygulamaya baĢlanmıĢtır. Bitkilere 23 gün boyunca su verilmeden büyütüldükleri serada stres uygulanmıĢtır. Stres uygulamasının sonunda yeni nesil dizileme için gerekli yaprak örnekleri öğlen saatlerinde ortalama 7 bitkinin 3.
ve 4. tepe yaprakcıklarından toplanmıĢ ve sıvı azotta dondurulduktan sonra -80oC de saklanmıĢtır.
3.1.2.3 Yüksek sıcaklık uygulaması
Bitki çıkıĢından 45 gün sonra uygulanmaya baĢlanmıĢtır. Bitkiler seradan bitki büyütme odalarına taĢınmıĢ ve orada ortama alıĢmaları için bir gün bekletildikden sonra stres uygulamaya baĢlanmıĢtır. Stres uygulaması sırasında kontrol gruplarına verilen su miktarı (300 ml) kadar su verilmiĢtir. Stres uygulaması 14 gün sürmüĢ ve 14 gün boyunca sıcaklık degeri gece ve gündüz farklı olarak artırılmıĢtır. Sıcaklık değerleri 1.gün 23oC gündüz 19oC gece sıcaklığı, 2.gün 24oC gündüz 20oC gece sıcaklığı, 3.gün 25oC gündüz 21oC gece sıcaklığı, 4.gün 26oC gündüz 22oC gece sıcaklığı, 5.gün 27oC gündüz 23oC gece sıcaklığı, 6.gün 29oC gündüz 24oC gece sıcaklığı, 7.gün 31oC gündüz 25oC gece sıcaklığı, 8.gün 33oC gündüz 26oC gece sıcaklığı, 9.gün 35oC gündüz 27oC gece sıcaklığı, 10.gün 37oC gündüz 28oC gece sıcaklığı olarak ayarlanmıĢ ve 10.günden 14.güne kadar gündüz 37oC’de gece 28oC’de olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır (Çizelge 3.1).
Stres uygulamasının sonunda yeni nesil dizileme için gerekli yaprak örnekleri öğlen saatlerinde ortalama 7 bitkinin 3. ve 4. tepe yaprakcıklarından toplanmıĢ ve sıvı azotta dondurulduktan sonra -80oC’de saklanmıĢtır.
Çizelge 3.1. Günlük sıcaklık artıĢ miktarı
Gündüz Sıcaklığı Gece Sıcaklığı
1. gün 23oC 19oC
2. gün 24oC 20oC
3. gün 25oC 21oC
4. gün 26oC 22oC
5. gün 27oC 23oC
6. gün 29oC 24oC
7. gün 31oC 25oC
8. gün 33oC 26oC
9. gün 35oC 27oC
10. gün 37 oC 28oC
11. gün 37 oC 28oC
12. gün 37 oC 28oC
13. gün 37 oC 28oC
14. gün 37 oC 28oC
3.1.2.4 Yüksek sıcaklık+kuraklık uygulaması
Bitki çıkıĢından 45 gün sonra uygulanmaya baĢlanmıĢtır. Bitkiler seradan bitki büyütme odalarına taĢınmıĢ ve ortama alıĢmaları için bir gün bekletildikten sonra stres uygulamaya baĢlanmıĢtır. Stres uygulaması 14 gün sürmüĢtür. 14 gün boyunca bitkilere su verilmemiĢ ve düzenli olarak gece ve gündüz sıcaklıkları artırılmıĢtır. Sıcaklık değerleri 1.gün 23oC gündüz 19oC gece sıcaklığı, 2.gün 24oC gündüz 20oC gece sıcaklığı, 3.gün 25oC gündüz 21oC gece sıcaklığı, 4.gün 26oC gündüz 22oC gece sıcaklığı, 5.gün 27oC gündüz 23oC gece sıcaklığı, 6.gün 29oC gündüz 24oC gece sıcaklığı, 7.gün 31oC gündüz 25oC gece sıcaklığı, 8.gün 33oC gündüz 26oC gece sıcaklığı, 9.gün 35oC gündüz 27oC gece sıcaklığı, 10.gün 37oC gündüz 28oC gece sıcaklığı olarak ayarlanmıĢ ve 10.günden 14.güne kadar gündüz 37oC’de gece 28oC’de olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır (Çizelge 3.1). Stres uygulamasının sonunda yeni nesil dizileme için gerekli yaprak örnekleri öğlen saatlerinde ortalama 7 bitkinin 3. ve 4. tepe yaprakcıklarından toplanmıĢ ve sıvı azotta dondurulduktan sonra -80oC’de saklanmıĢtır.
