ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
OSTEOMİYELİT TEDAVİSİNDE KULLANILMAK ÜZERE GÖZENEKLİ KİTOSAN DOKU İSKELELERİNİN HAZIRLANMASI VE
KARAKTERİZASYONU
Ali Mert ERDEK
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2019
Her hakkı saklıdır
ii ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
OSTEOMİYELİT TEDAVİSİNDE KULLANILMAK ÜZERE GÖZENEKLİ KİTOSAN DOKU İSKELELERİNİN HAZIRLANMASI VE
KARAKTERİZASYONU
Ali Mert ERDEK
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Ayşe KARAKEÇİLİ
Osteomiyelit gibi ciddi bir kemik enfeksyonunun tedavisinde potansiyel olarak kemiğin yerini alabilecek bir yapı ve ilaç taşıyıcı bir sistem kullanılmıştır. pH duyarlı bir antibiyotik olan vankomisin (VAN), kontrollü ilaç salımını sağlamak amacıyla ZIF – 8 nanokristallerine yüklenmiştir. Vankomisin yüklenmiş ZIF – 8 nanokristalleri ile 3 boyutlu biyouyumlu doku iskeleleri elde etmek için ıslak eğirme yöntemi kullanılmıştır.
Islak eğirme işleminde iğne çapı 0.8 mm, akış hızı 7 ml/saat ve toplama banyosu olarak da oda sıcaklığında izopropanol kullanılmıştır. Doku iskelesinin polimer malzemesi olarak kitosan seçilmiş ve kitosan doku iskelelerinde morfoloji, su tutma yüzdesi ve kontrollü vankomisin salımını belirlemek amacıyla karakterizasyonlar yapılmıştır.
Taşıyıcı sistemin Staphylococcus aureus'a karşı etkinliğini araştırmak için antibakteriyel aktivite çalışmaları yapılmıştır. Nanoboyuttaki ZIF – 8 kristalleri için vankomisin molekülünün enkapsülasyonu % 99.3 olarak hesaplanmıştır. Sonuçlar ZIF – 8 nanokristallerine yüklenen vankomisinin, kitosan doku iskelelerinden kontrollü bir şekilde salındığını göstermektedir. Vankomisinin yaklaşık %70’i 8 saat boyunca pH = 5.4’de salınmış, bu değer pH = 7.4’de %55 olarak hesaplanmıştır. Asidik koşullarda daha fazla vankomisin salımı, ZIF – 8’in asidik koşullarda daha yüksek çözünmesiyle açıklanabilmektedir. pH = 5.4 koşullarında kitosan doku iskelelerinden vankomisin salımı 48 saat sonunda plato değeri olan yaklaşık ~% 77'ye ulaşmıştır. Vankomisin yüklü ZIF – 8 nanokristallerini içeren kitosan doku iskeleler, ZIF – 8 içeren kitosan doku iskelelerine göre S.aureus aktivitesinin azaltılmasında çok daha güçlü bir etki göstermiştir. Bu etki en fazla iltihaplı bir dokunun çevresini taklit edebilen pH = 5.4 koşullarında gözlemlenmiştir.
Eylül 2019, 71 sayfa
Anahtar Kelimeler: Osteomiyelit, Kitosan, ZIF – 8, Doku İskelesi, Vankomisin
iii ABSTRACT
Master Thesis
PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF POROUS CHITOSAN TISSUE SCAFFOLD FOR TREATMENT OF OSTEOMYELITIS
Ali Mert ERDEK
Ankara University
Graduated School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering
Supervisor: Doç. Dr. Ayşe KARAKEÇİLİ
In the treatment of bone infection, such as osteomyelitis, a structure that can potentially replace bone and a drug delivery system have been used. Vancomycin (VAN), a pH sensitive antibiotic, was loaded to ZIF - 8 nanocrystals to provide controlled drug release. Wet spinning method was used to obtain 3D biocompatible tissue scaffolds with vancomycin loaded ZIF - 8 nanocrystals. In wet spinning, the needle diameter was 0.8 mm, the flow rate was 7 ml / h, and isopropanol at room temperature was used as the collecting bath. Chitosan was selected as the polymer material of the tissue scaffold and characterizations were made to determine morphology, water retention and controlled vancomycin release in chitosan tissue scaffolds. Antibacterial activity studies were conducted to investigate the efficacy of the carrier system against Staphylococcus aureus. The encapsulation of vancomycin molecule was calculated as 99.3% for ZIF - 8 crystals in nanoscale. The results showed that vancomycin loaded ZIF - 8 nanocrystals were controlled released from chitosan tissue scaffolds. Approximately 70% of vancomycin was released at pH = 5.4 for 8 hours and 55% at pH = 7.4. Further release of vancomycin under acidic conditions can be explained by the higher dissolution of ZIF – 8 under acidic conditions. At pH = 5.4, vancomycin release from chitosan tissue scaffolds reached a plateau value of ~ 77% after 48 hours. Chitosan tissue scaffolds containing vancomycin loaded ZIF – 8 nanocrystals showed a more potent effect on the reduction of S.aureus activity than chitosan tissue scaffolds containing ZIF – 8. his effect was most observed at pH = 5.4, which could mimic the surroundings of an inflamed tissue.
September 2019, 71 pages
Key Words: Osteomyelitis, Chitosan, ZIF – 8, Tissue Scaffold, Vancomycin
iv
ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR
Çalışmam süresince her zaman ilgisini, bilgisini ve tecrübesini benden esirgemeyen, her zorlandığım ve ihtiyacım olan anlarda bana yardımcı olan, gerektiğinde bir arkadaş bir abla olan çok değerli hocam Doç. Dr. Ayşe KARAKEÇİLİ’ye (Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Öğretim Üyesi) teşekkürü bir borç bilirim.
Çalışmam sırasınca laboratuarında gerçekleştirdiğim deneylerinde bana büyük sabır ve anlayış gösteren, her koşulda bana destek ve motivasyon kaynağı olan değerli hocam Doç. Dr. Berna Topuz’a (Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Öğretim Üyesi) çok teşekkür ederim.
Her zaman yardımlarını, maddi ve manevi imkanlarını esirgemeyen büyük bir sabır ile beni destekleyen çok sevgili aileme sonsuz teşekkür ederim.
Sadece çalışma sırasında değil okul ortamında bir aile bütünlüğünde bana destek ve yardımcı olan çok değerli çalışma arkadaşlarım Serdar KORPAYEV, Özge TOPRAK, Simge YILDIRIM, Ali Semih YURTTAŞ ve Tuğçe KURT’a bana gösterdikleri destek ve anlayış için çok teşekkür ederim.
Ali Mert ERDEK Ankara, Şubat 2019
v
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAY SAYFASI
ETİK ... i
ÖZET ... ii
ABSTRACT ... iii
ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR ... iv
SİMGELER DİZİNİ ... viii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... x
ÇİZELGELER DİZİNİ ... xi
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ VE KURAMSAL TEMELLER ... 3
2.1 Osteomiyelit ... 3
2.1.1 Osteomiyelit tedavisinde uygulanan tıbbi tedavi yöntemleri ... 7
2.1.2 Osteomiyelit tedavisinde doku mühendisliği yaklaşımı ... 9
2.2 Lokal ve Kontrollü Antibiyotik Salımında Kullanılan Sistemler ve Biyomalzemeler ... 9
2.3 Lokal ve Kontrollü İlaç Taşıyıcı Sistemlerde Doku İskeleleri ... 14
2.3.1 Doku iskelesi hazırlama yöntemleri ... 15
2.3.2 Islak eğirme yöntemi ... 16
2.4 Metal Organik Kafes Yapıları (MOF) ... 17
2.4.1 MOFların biyomedikal uygulamaları ... 19
2.5 Zeolitik İmidazol Kafes (ZIF) ... 21
2.5.1 ZIF – 8 ... 23
2.5.2 ZIF – 8’in biyomedikal uygulamaları ... 25
3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 27
3.1 Materyaller ... 27
3.2 Zeolitik İmidazol Kafes (ZIF – 8) Sentezi ... 27
3.3 Vankomisin Yüklü ZIF – 8 (ZIF8@VAN) Sentezi ... 28
3.3.1 Vankomisin yükleme veriminin bulunması ... 28
3.4 ZIF – 8 Nanokristallerinin Karakterizasyonu ... 29
vi
3.4.1 Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi ... 29
3.4.2 Fouirer Transform Infrared Spektrofotometresi (FTIR – ATR) analizleri ... 29
3.4.3 X Işını Kırınımı (XRD) analizi ... 29
3.5 Kitosan Doku İskelelerinin Hazırlanması ... 29
3.5.1 ZIF – 8 veVAN@ZIF-8 yüklü kitosan doku iskelelerinin hazırlanması ... 30
3.6 Doku İskelesi Karakterizasyonu ... 32
3.6.1 Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi ... 32
3.6.2 Fouirer Transform Infrared Spektrofotometresi (FTIR – ATR) analizleri ... 33
3.6.3 Şişme deneyleri ... 33
3.6.4 In vitro vankomisin salım çalışmaları ... 33
3.6.5 Antimikrobiyal yapışma ve antimikrobiyal aktivite deneyleri ... 34
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 37
4.1 ZIF – 8 ve ZIF8@VAN Nanokristallerinin Sentezi ve Karakterizasyonu ... 37
4.1.1 Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizi ... 38
4.1.2 Vankomisin yükleme veriminin bulunması ... 38
4.1.3 Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre (FTIR – ATR) Analizi ... 39
4.1.4 X Işını Kırımımı (XRD) analizi ... 41
4.2 ZIF – 8 Yüklü ve Yüklü Olmayan Kitosan Doku İskelelerinin Üretimi ve Karakterizasyonu ... 42
4.2.1 Islak eğirme yötemi ile doku iskelesi hazırlanması ... 42
4.2.1.1 Islak eğirme parametrelerinin belirlenmesi ... 42
4.3 Kitosan Doku İskelesi Karakterizasyonu ... 45
4.3.1 Doku iskelesinin morfolojik yapısı ... 45
4.3.2 FTIR – ATR analizi ... 46
4.3.3 Şişme deneyleri ... 48
4.3.4 Kitosan doku iskelelerinden vankomisin salımı ... 49
4.3.5 Antimikrobiyal aktivitenin incelenmesi ... 52
5. TARTIŞMA ve YORUMLAR ... 59
KAYNAKLAR ... 62
EKLER ... 65
vii
EK 1 Kalibrasyon Grafiği ... 66 EK 2 Kümülatif Salım Yüzdesinin Hesaplaması ... 67 EK 3 pH = 5.4 için 2 saatlik bakteri yapışma deneyi mikroorganizma
derişimi (cfu/ml) ... 68 EK 4 pH = 7.4 için 2 saatlik bakteri yapışma deneyi mikroorganizma
derişimi (cfu/ml) ... 69 EK 5 Yapışma Deneyi Koloni Sayımı Yapılan Agar Fotoğrafları ... 70 ÖZGEÇMİŞ ... 71
viii
SİMGELER DİZİNİ
rpm Dakikada Devir
kHz kilohertz
Kısaltmalar
MOF Metal Organik Kafes
ZIF Zeolitik İmidazol Kafes
VAN Vankomisin
OM Osteomiyelit
ECM Hücre Dışı Matriks
PIA Polisakkarit Hücreler Arası Adezinin
MIC Minimum İnhibasyon Konsantrasyonu
PMMA Polimetil Metakrilat
PVC Poli Vinil Klorür
HA Hidroksi Apatit
nm Nanometre
XRD X Işını Kırılımı
UV-VIS Ultraviyole – Görünür Bölge
NO Nitrik Oksit
MIL Lavosier Enstitüsü Materyalleri
ImI İmidazol
BET Yüzey Alanı Ölçüm Analizi
DMF Dimetilformamid
DEF Dietilformamid
BSA Sığır Serumu Albümini
DOX Doksorubisin
CIP Siprofloksasin
FTIR Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre
ix
MRSA Metisilin Dirençli S.aureus
SEM Taramalı Elektron Mikroskobu
Au-Pd Altın – paladyum
FTIR – ATR Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre – Azaltıl- mış Toplam Yansıma
DD Deasetilasyon Derecesi
mIm Metil İmidazol
TSB Tryiptic Soy Broth
TSA Tryptic Soy Agar
MHB Mueller – Hinton Broth
PBS Fosfat Tampon Çözeltisi
HFIP 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol
PXRD Toz X Işını Kırılımı
mM Milimolar
µL Mikrolitre
mL Mililitre
Chi Kitosan
DPBS Dulbecco’s Fofat Tampon Çözeltisi
UV Ultraviyole
5-FU Floroürasil
IR Infrared
mm Milimetre
TPP Tripolifosfat
PCL Polikapralakton
Q Denge Şişme Değeri
CFU Koloni Oluşturan Birimler
x
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Osteomiyelite Neden Olan S.aureus bakterileri ... 5
Şekil 2.2 Biyofilm Oluşumun Şematik Gösterimi ... 7
Şekil 2.3 Kitin ve Kitosanın Yapısı ... 11
Şekil 2.4 Islak Eğirme Düzeneği ... 16
Şekil 2.5 MOF Yapısı ... 17
Şekil 2.6 MOFların Biyomedikal Uygulamaları ... 19
Şekil 2.7 Bazı Farklı ZIFlerin Atomik Yapısı ... 21
Şekil 2.8 Bazı ZIFlerin Yüzey Alanları ... 23
Şekil 2.9 ZIF - 8 Oluşum Tepkinmesi ... 24
Şekil 3.1 Islak Eğirme Yöntemi ile Doku İskelesi Sentezi ... 32
Şekil 4.1 a) ZIF - 8 Nanokristalleri SEM Görüntüsü b) ZIF8@VAN Nanokristalleri SEM Görüntüsü ... 38
Şekil 4.2 ZIF - 8, Vankomisin ve ZIF8@VAN FTIR-ATR Spektrumu ... 40
Şekil 4.3 a) ZIF - 8 ve b) ZIF8@VAN İçin XRD Spektrumu ... 41
Şekil 4.4 Doku İskelesinin SEM Görüntüleri a) Kitosan Doku İskelesi ve Fiber Yapısı (500 büyütme), b) Kitosan CHI-5%ZIF8 Doku İskelesi ve Fiber Yüzeyi (40000 Büyütme), c) Kitosan CHI-5ZIF8_CL Doku İskelesi ve FiberYüzeyi (40000 büyütme)... 45
Şekil 4.5 Doku İskelelerinin FTIR Sonuçları: a) Kitosan Doku İskelesi, b) ZIF - 8 Yüklü Kitosan Doku İskelesi ... 47
Şekil 4.6 Denge Şişme Değerleri ... 48
Şekil 4.7 CHI-%1ZIF8/VAN Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği ... 50
Şekil 4.8 CHI-%5ZIF8/VAN Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği ... 50
Şekil 4.9 CHI-%5ZIF8/VAN-CL Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği ... 51
Şekil 4.10 2 Saat Sonundaki CFU Sayısı ... 53
Şekil 4.11 24 Saat Sonundaki CFU Sayısı ... 53
Şekil 4.12 Bakteri Yapışması SEM Fotoğrafları... 54
Şekil 4.13 Antibakteriyel Aktivite SEM Fotoğrafları ... 57
xi
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Osteomiyelite Neden Olan Mikroorganizmalar ... 4
Çizelge 2.2 Biyobozunur ve Biyobozunmaz Sistemlerde Kullanılan Biyomalzemeler ... 10
Çizelge 2.3 Biyobozunur ve Biyobozunmaz Sistemlerin Karşılaştırılması ... 14
Çizelge 2.4 Zeolit ve ZIFlerin Karşılaştırılması ... 22
Çizelge 3.1 Optimum Islak Eğirme Parametrelerinin Belirlenmesi İçin Yapılan Denemeler ... 30
Çizelge 3.2 Tez Çalışmasında Kullanılan Kitosan Doku İskelesi Grupları ... 34
Çizelge 4.1 Toplama Banyosu ve Çözücü Etkileşimi Denemeleri ... 44
Çizelge 4.2 Kitosan Doku İskelelerinin FTIR Spektrumlarının Değerlendirilmesi ... 47
Çizelge 4.3 Denge Şişme Değerleri (Q %) ... 48
Çizelge 4.4 96 Saat Sonunda Okunan Absorbans Değerleri ... 57
1 1. GİRİŞ
Organik bağlayıcılarla bağlanmış metallerden (tek metal iyonları veya metal kümeleri gibi) oluşan metal-organik kafesler (MOFlar), yüksek gözeneklilik, geniş kimyasal bileşim yelpazesi ve yüksek termal / kimyasal stabilite ve yüksek olmayan toksisite gibi üstün özellikleri sayesinde biyomedikal uygulamalarda birçok avantaja sahiptir. Bu uygulamaların çoğunda MOFlar yüksek absorbsiyon kapasitesi ve antikanser ilaçları gibi terapötik ajanları taşıyan ilaç taşıyıcıları olarak kullanılmıştır. Bu yapılar arasında, Zeolitik İmidazol Kafes – 8 (ZIF – 8), ilacın etkinliğini arttırması, yan etkilerini azaltması, tümör dokusunun asidik ortamına cevap veren antikanser ajanları kapsülleme ve salım kabiliyeti bakımından önemli bir yer tutmaktadır.
Osteomiyelit gibi kemik hastalıklarında, tedavi için yüksek doz antibiyotik gerekmektedir. Yüksek doz antibiyotik, büyük enfeksiyonlarda yetersiz kalma, hedef bölgeye etkin bir şekilde ulaşamama, toksik yan etkiler ve bakteriyel direnç gelişimi nedeniyle tam bir tedavi sunamamaktadır. Bu dezavantajları önlemek amacıyla, enfekte olmuş kemik bölgesinde yüksek lokal terapötik konsantrasyon elde etmek için doğal veya sentetik polimerik malzemelere dayalı gelişmiş ilaç salım sistemleri geliştirilmiştir. Patojenik bakteriler tarafından yüksek miktarda asit üretimi, enfekte bölgedeki yerel pH’ı düşürür ve bu da antibiyotikler için pH duyarlı salım sistemlerinin kullanımının önemini arttırmaktadır. Ayrıca, herhangi bir nekrotik kemik dokusunun yerini alması için yabancı implantlara kıyasla, biyo-uyumlu doku iskeleleri kemik kusurlarını iyileştirmek için çok daha fazla avantaj sunmaktadırlar.
Kitosan, kemik doku mühendisliğinde doku iskelesi olarak tek başına, farklı polimerlerle veya seramiklerle birlikte yaygın olarak kullanılan doğal bir polisakarittir.
Kitosanın hücre yapışması, proliferasyonu, osteoblastik farklılaşması ve mineralizasyonunu arttırmadaki rolü ile ilgili çeşitli çalışmalar mevcuttur. Fiber olarak hazırlanan kitosan doku iskeleleri, hücre tutunması ve dokunun yenilenmesi için geniş bir yüzey alanı sağlayabilir.
2
Vankomisin (VAN), Staphylococcus aureus (S.aureus) dahil olmak üzere Gram pozitif patojenlere karşı etkinliği ile tanınan bir trisiklik glikopeptittir. Doza bağlı bir toksisiteye sahiptir ve kök hücrelerin osteoblastik farklılaşması üzerinde hiçbir olumsuz etkisi bildirilmemiştir. Vankomisinin çeşitli ilaç salım sistemlerine dahil edilmesi, Gram pozitif bakteriyel büyüme ve biyofilm oluşumuna karşı antimikrobiyal etki göstermiştir.
Ayrıca, hem folik asit hem de vankomisin ile konjuge nanoboyuttaki ZIF – 8, S.aureus’a karşı mükemmel antibakteriyel aktivite göstermiştir. Antibakteriyel mekanizma, konjuge ZIF – 8 nanokristallerinin S. aureus hücrelerine folat reseptörü aracılığıyla endositoz ile penetrasyonunu, DNA ile etkileşimi ve bakteriyel hücre büyümesini inhibe etmesi ile açıklanabilmektedir.
Bu çalışmada, vankomisin enkapsüle edilmiş ZIF – 8 nanokristallerle yüklü kitosan doku iskeleleri, üç boyutlu fiber yapılı doku iskeleleri elde etmek için ıslak eğirme yöntemiyle üretilmiştir. pH’a duyarlı bir salım profili elde etmek ve antibiyotiğin ani salımını önlemek için vankomisin taşıyıcı olarak ZIF – 8 nanokristalleri kullanılmıştır.
Vankomisin yüklü ZIF – 8 nanokristalleri (ZIF8@VAN), antimikrobiyal özellikler ve osteoblast hücre etkileşimi ile potansiyel bir kemik dokusu elde etmek için kitosan fiber doku iskelelerine yüklenmiştir. Burada, ZIF – 8’in pH duyarlı bir ilaç taşıyıcısı olarak performansı ilk kez üç boyutlu bir doku iskelesine yüklendiği zaman değerlendirilmiştir.
Doku iskelelerinin morfolojileri ve şişme davranışları, fizyolojik ve enfekte olmuş doku pH koşullarında analiz edilmiştir (sırasıyla pH 7,4 ve pH 5,4’de). pH duyarlı salım profilini pH 7,4 ve pH 5,4 koşullarında incelemek için vankomisin salım çalışmaları yapılmıştır. Antibakteriyel çalışmalar osteomiyelite neden olan yaygın bir patojenik mikroorganizma olan S.aureus ile yapılmıştır. Bakteri yapışması ve hücre büyümesi, bakteri üreme ortamında, pH 7,4 ve 5,4’de incelenmiştir.
3
2. KAYNAK ÖZETLERİ VE KURAMSAL TEMELLER
Bu bölümde yapılmış olan tez çalışmasıyla ilgili kuramsal bilgiler verilmiştir. İlk olarak osteomyelit hakkında detaylı bilgiler sunulmuştur. Osteomiyelitin tanımı ve osteomiyelite neden olan mikroorganizmalar hakkında detaylı bilgi verilmiştir.
Osteomiyelitin güncel tedavi yöntemleri, osteomiyelit tedavisi için kullanılan biyomateryaller ve osteomiyelit tedavisinde doku mühendisliği yaklaşımları anlatılmıştır.
Ardından Metal Organik Kafes yapıları (MOFlar) hakkında detaylı literatür bilgisi verilmiştir. MOFların kullanım alanları ve biyomedikal uygulamalarının yanı sıra MOFların ilaç salım sistemlerinde kullanımı anlatılmıştır. Bir MOF grubu olan Zeolitik İmidazol Kafes – 8 (ZIF – 8) hakkında bilgiler verilmiştir. Ardından ZIF – 8’in biyomedikal uygulamaları açıklanmış, ilaç salım sistemlerinde kullanımına değinilmiştir. ZIF – 8 içeren biyomalzemeler ile doku etkileşiminin incelendiği çalışmalar hakkında bilgiler sunulmuştur.
2.1 Osteomiyelit
Osteomiyelit (OM), kemiği enfekte eden, genellikle kemiğe zarar veren, osteolize yol açan ve inflamatuar bir etki ile sonuçlanan, patojenik bakterilerin neden olduğu bir kemik rahatsızlığıdır. Kemik enfeksiyonu, direkt kontaminasyonla (örneğin açık kırıklar), kan akımı yoluyla (hematojen olarak), bitişik bir bölgeden ya da implanttan yayılarak gelişebilir. Akut kemik enfeksiyonları bazen kronik enfeksiyonlara ilerler, bu durum kronik osteomiyelit olarak adlandırılır. Osteomiyelit tanısı ve enfekte edici patojenin tanımlanması, birden fazla kemik biyopsisi gerektirebilir ve kemik kolonizasyonunun heterojenliği, yanlış kültürlere neden olabilir. Rutin sistemik antimikrobiyal tedavi akut kemik enfeksiyonunu temizlemek için tipik olarak yeterlidir;
fakat kronik osteomiyelitin tedavisi son derece zordur. Nekrotik ve enfekte olmuş dokuların cerrahi debridmanını ve ardından geniş antibiyotik tedavilerini gerektirir.
4
Osteomiyelit, kemiğin tipik bir enfeksiyondur ve bazı bakteri ve mantar türlerini içeren piyojenik bakterilerden kaynaklanır. Hastalığın yaygın nedenleri olan tipik mikroorganizmalar Çizelge 2.1’de verilmiştir:
Çizelge 2.1 Osteomiyelite Neden Olan Mikroorganizmalar (Nandi 2016)
Durum Neden Olan Mikroorganizma
Kronik Osteomiyelit Staphylococcus aureus, Pseudomonas Diyabetik Osteomiyelit Polimikrobiyal Enfeksiyon
Tıbbi müdahele sırasında oluşan konta- minasyondan kaynaklı osteomiyelit
Staphylococcus epidermidis
Osteomiyelitin oluşmasındaki temel etken, kemik enfeksiyonu vakalarındaki en yaygın etken patojen, tedavisi son derece zor olan, adaptasyonu ve üreme hızı oldukça hızlı bir tür olan Staphylococcus aureus (S.aureus)’dur. S.aureus, ostemomiyelite neden olan ilk gram pozitif bakteri türü olmasa da, osteomiyelitin gözlemlendiği durumlarda en sık karşılaşılan mikroorganizmadır.
Bir tür gram pozitif bakteri olan Staphylococcus aureus (S.aureus) konak dokuya tutunmayı sağlayan ve fagositozdan koruyan yapısal bileşenler, çok sayıda toksin ve hastalık yapıcı özellik içeren bir bakteri türüdür (Şekil 2.1).
5
Şekil 2.1 Osteomiyelite neden olan S.aureus bakterileri
Staphylococcus aureus’un dış membranı bulunmadığından kuru yüzeyde oldukça uzun süre canlı kalabilir. Kişiden kişiye dokunma veya kontamine olmuş eşyalarla temas edildiğinde bulaşabilir. Yabancı cisim (kıymık, dikiş, protez vb.), cerrahi müdahale ve uygunsuz antibiyotik kullanımı bakterinin bulaşmasındaki risk faktörlerini oluşturur.
Staphylococcus aureus’un osteomiyelitin yanı sıra neden olduğu diğer hastalıkılar; gıda zehirlenmeleri, toksik şok sendromu, haşlanmış deri sendromu, piyojenik ve sistematik hastalıklar olarak sıralanabilir.
S.aureus her suşunda farklı büyüme hızları gösterse de diğer mikroorganizmalarla kıyaslandağında çok hızlı üreyebilme özelliğine sahiptir. Farklı S.aureus suşları farklı üreme hızlarına sahiptir. S.aureus suşlarının ikilenme süresi, içerisinde bulunduğu ortama göre değişiklik göstermekle birlikte ortalama 16 – 20 dakika arasındadır.
(Domingue, 1996).
Sporsuz ve hareketsiz kok formundaki S.aureus, gram ve katalaz pozitif özellik gösterir.
Fakültatif aerob gelişim gösterir ve mezofil karakterlidir. S.aureus suşları optimum 30 – 37 0C sıcaklık aralığında çoğalırlar. Gelişme sınırları 6 – 40 0C aralığındadır.
Toksin oluşturmaları için gerekli minimum sıcaklık biraz daha yüksek olup 10 – 48 0C
6
arasındadır. Optimum olarak pH = 7.0 – 7.5 arasında çoğalan S.aureus canlılığını 4 – 9.3 pH değerleri arasında da sürdürebilir.
Patojenik mekanizma ve enfeksiyon kaynağına dayalı olarak, osteomiyelit üç kategoriye ayrılabilir:
i. Travma, cerrahi operasyon veya prostetik eklemin birleşmesinden kaynaklanan mikrobiyal enfeksiyon
ii. Vertebal kemik ve çocuklarda hematojen yayılmış enfeksiyon
iii. Diyabetes Melitus (Şeker hastalığı) ve periferik vasküler hastalıklarda olduğu gibi vasküler yetmezlik ile oluşan enfeksiyon.
Osteomiyelit enflamasyonu, bakteriyel enfeksiyonun yumuşak dokuya yayılması ile ilerler ve kemik kaybına yol açabilir. Osteomiyelite farklı akut enfeksiyonlar neden olabilir: iki hafta veya bir ay içerisinde gelişen alt akut osteomiyelit veya 1 aydan uzun süre devam eden kronik osteomiyelit. Akut osteomiyelit, kanda bakteri varlığından, lokal anoksiden ve pus oluşumundan kaynaklanabilir. Kronik osteomiyelit osteonekrozu, geniş bir alanın devaskülarize oluşumunu gösterir ve genellikle akut fazın tedavi edilmemiş veya yanlış tedavisinden kaynaklanır.
İmplant ile ilişkili S.aureus enfeksiyonlarının tedavisinde birincil zorluk genellikle kalıcı materyalde ve kemik içinde biyofilm oluşumu olarak bildirilmektedir. Biyofilm, yoğun hücre dışı matriks (ECM) içine gömülü bir yüzeye bağlı bakteri topluluğudur (Şekil 2.2). S.aureus, fibronektin ve kollajen gibi konak hücre dışı matriks proteinleri ile etkileşerek biyomateryal implantlara ve konak dokulara yapışır. Ek olarak implant materyali ile, otolizin ve teyikoik asit gibi moleküller aracılığıyla elektrostatik etkileşimler yoluyla ya da doğrudan temas yoluyla yapıya yapışabilir. Biyofilmin olgunlaşması, öncelikle biyofilm hücre dışı matriksinin (ECM) ana bir bileşeni olan polisakkarit hücreler arası adezinin (PIA) atılmasıyla elde edilen bakteriyel çoğalma ve hücreler arası yapışma ile ilerler. Bir biyofilm içerisindeki bakteriler, konakçı immünolojik tepkisini ortadan kaldırabilir ve sıklıkla uykuda veya sakin bir duruma geçebilir. Antimikrobiyallerin birçok hareket mekanizmasının, bakteriyel metabolizma veya proliferasyona müdahale ettiği göz önüne alındığında, biyofilm içindeki
7
bakterilerin uyuşmazlığı antibiyotik etkinliğini daha da bozabilir. Aslında, biyofilmde S.aureus’un minimum inhibasyon konsantrasyonu (MIC), planktonik emsallerinden daha yüksek büyüklük derecelerinde olabilir. Buna ek olarak, S.aureus’un üzerine tutunacağı konak doku savunmasından kaçmak için başka bir potansiyel mekanizma sağlayan osteoblastlar gibi hücre türlerinin içinde gizlenebildiği rapor edilmiştir.
Şekil 2.2 Biyofilm Oluşumunun Şematik Gösterimi
S.aureus’un neden olduğu osteomiyelitten etkilenen hastaların yaşadığı düşük iyileşme oranı ve cerrahi tedavilerde karşılaşılan aşırı zorluklar nedeniyle, kapsamlı araştırma çabaları terapötik müdahaleleri iyileştirmeyi amaçlamaktadır. Çalışmaların çoğu, yerleşik bir kemik enfeksiyonunun yok edilmesine yardımcı olacak yeni antimikrobiyal biyomateryal sistemi geliştirmeye odaklanmıştır. Osteomiyelit tedavisindeki en önemli zorluk ise, sadece enfeksiyonu temizlemek için değil, daha sonraki kemik rejenerasyon sürecine de katkıda bulunmak için bir biyomateryal sistemi geliştirmektir.
2.1.1 Osteomiyelit tedavisinde uygulanan tıbbi tedavi yöntemleri
Osteomiyelitin geleneksel tedavisi cerrahi debridman, implant ve nekrotik dokuların çıkarılması, yumuşak doku restorasyonu ve oral/sistemik antibiyotik uygulamasını içerir. Sekestrumun ve enfekte olmuş kemik dokusunun cerrahi olarak çıkarılması, ilave
8
tıbbi maliyetleri ve daha sonra zor iyileşme ile kemik kaybını önleyerek daha fazla enfeksiyon olasılığına yol açabilen ek bir ameliyatı içerir.
Alternatif olarak, antibiyotik tedavisi kronik osteomiyelit tedavisi için geleneksel tedavi yöntemidir. Sistemik antibiyotik tedavisi, bakterileri başarılı bir şekilde ortadan kaldırmak için yüksek dozlara ihtiyaç duyar, bu da sistemik toksisitenin artmasına neden olmaktadır. Vankomisin, daptinomisin ve teikoplanin gibi glikopeptid ilaçların intravenöz uygulaması kemik dokusuna sınırlı penetrasyon göstermektedir.
Kemik dokusunun zayıf vaskülarizasyonu, antibiyotik penetrasyonunu engelleyerek, bakteriyel direncin artmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, geleneksel antibiyotik tedavisi bazen bakteriyel savunma mekanizmalarına bağlı olarak, osteoblastların içinde uyku halindeki bakterilerin hayatta kalması ve biyofilm gelişmesi gibi enfeksiyonları kontrol edememektedir. Ek olarak, planktonik bir fazdaki bakteriler, yüksek metabolik hıza ve hızlı çoğalmaya sahip, susuz bir form haline gelebilir ve antibiyotiklere duyarlılıkları 1000 kat artar.
Osteomiyelitin oral tedavisi florokinolon ilaçları ile gerçekleştirilir. Vankomisin, siprofloksasin, moksifloksasin, levofloksasin, klindamisin, metronidazol, fosfomisin ve trimetoprim-sülfametoksazol bu amaçla kullanılan en yaygın antibiyotiklerdir. Tedavi çok yüksek antibiyotik dozlarında 12–16 hafta devam etmelidir.
Sonuç olarak antibiyotik tedavisinde ihtiyaç duyulan yüksek dozların toksik etki göstermeleri ve kullanılan antibiyotiklerin kemiğin vasküler yapısından ötürü düşük penetrasyona sahip olması, tüm bu tedavi yöntemleri hastalığın tam tedavisi için her zaman yeterli olmamaktadır ve bu nedenle osteomiyelit için alternatif tedavi yöntemi olarak doku mühendisliği yaklaşımı ve lokal ve kontrollü ilaç salım sistemleri geliştirilmiştir.
9
2.1.2 Osteomiyelit tedavisinde doku mühendisliği yaklaşımı
Osteomiyelit tedavisi için tıbbî yöntemlerin yetersiz kalmasından dolayı doku mühendisliği yaklaşımı önem kazanmıştır ve bu yaklaşım ile çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Yapılan çalışmalardaki genel yöntem antibiyotik yüklü bir taşıyıcı içeren doku iskelesinin hedef bölgeye yerleştirilerek kontrollü ilaç salımının gerçekleş tirilmesine dayanmaktadır.
Osteomiyelitin etkin tedavisinde, lokal olarak uygulanan kontrollü antibiyotik salım sistemlerinin parenteral ve oral uygulamaya göre birçok avantajı vardır. Bu avantajlar;
Sistemik antibiyotik derişimi minimum düzeyde kalırken, etki bölgesinde çok daha yüksek derişime ulaşır ve yüksek sistemik dozlarda antibiyotiklerle ortaya çıkan yan etkiler engellenmiş olunur.
Tedavi sürecindeki iyileşme, olumsuz aşırı hassas reaksiyonlarında önemli bir oranda azalma gösterir.
Hastanın hastanede kalış süresi ve maliyet azalır.
Lokal antibiyotik salım sistemleri, biyolojik olarak parçalanabilir (biyo-bozunur) veya biyolojik olarak parçalanamaz (biyo-bozunmaz) olabilir.
2.2 Lokal ve Kontrollü Antibiyotik Salımında Kullanılan Sistemler ve Biyomalzemeler
Lokal ve kontrollü antibiyotik salımında çok çeşitli biyomalzemeler kullanılmaktadır.
Antibiyotik salımında kullanılan sistemler biyobozunur ve biyobozunur olmayan sistemler olarak ikiye ayrılır. Bu sistemlerde kullanılan biyomalzemeler Çizelge 2.2’de özetlenmiştir:
10
Çizelge 2.2 Biyobozunur ve Biyobozunmaz Sistemlerde Kullanılan Biyomalzemeler
Kullanılan Biyomalzemeler
Biyobozunur Sistemler Biyobozunmaz Sistemler
Kitin/Kitosan Polimetil Metakrilat (PMMA)
Kalsiyum Sülfat Polietan
Kollajen / Polikapralakton Polivinil Klorür (PVC) Hidroksi Apatit Polistiren / Teflon
Biyobozunur olmayan sistemlerde, antibiyotik yüklü polimetil metakrilat (PMMA) boncuk zincirleri sıklıkla kullanılmaktadır. PMMA gibi inert taşıyıcılar tarafından antibiyotik salımında antibiyotik direnci riski her zaman yüksektir. Ayrıca PMMA, immün yanıtı ve dolayısıyla bazı sitotoksik etkileri tetikleyebilir, bu yüzden vücut içerisinde kalan PMMA boncuklarını uzaklaştırmak için ikinci bir cerrahi müdahale gerekir.
Biyobozunur olmayan polimerlerin kullanımı bir süre sonra dört ana nedenden dolayı ideal yöntem olmadıklarına karar verilerek alternatif yöntemler aranmaya başlanmıştır.
Bunlar;
Vücuda yerleştirilen biyobozunur olmayan doku iskelesini çıkartmak için ikinci bir cerrahi müdahale gerekmesi
Subterapötik konsantrasyonda uzun süreli antibiyotik kullanımının antibiyotik direncinin gelişmesine yol açması
Ameliyat sonrası hipotansiyona yol açan sistemik toksisite olasılığı
PMMA bazlı materyallerin kullanımı nedeniyle gecikmiş kemik iyileşmesi olarak belirtilmiştir.
11
Bu nedenlerden dolayı biyobozunur olmayan malzemeler yerine biyobozunur malzemeler ile çalışmalar yapılmaya başlanmıştır.
Biyobozunur sistemler biyobozunur olmayan sistemlere göre birçok avantaja sahiptirler. Bunlar;
İkinci bir cerrahi müdaheleye ihtiyaç duyulmaması,
Uzun süreli antibiyotik kullanımı gerektirmediğinden vücut içerisinde antibiyotik direncine neden olamaması
Kemik iyileştirmesini hızlandırmasıdır.
Biyobozunur sistemlerde kullanılan malzemelerin başında kitosan gelmektedir.
Doğal polimer olan kitosan, kitinden elde edilmektedir. Kitinin birçok türevi bulunmakla beraber, bunlar arasında en önemlisi kitosandır. Kitosan, ilk kez 1811 yılında Henri Bracannot tarafından keşfedilmiştir. Bracannot, mantarlarda bulunan kitini sülfürik asitte çözmeye çalışmış ancak başarılı olamamıştır. 1894’de Hoppe-Seyler, kitini potasyum hidroksit içerisinde 180 ℃’de deasetilasyona tabî tutmuş ve asetil içeriği azaltılmış bir ürün olan kitosanı elde etmiştir.
Şekil 2.3 Kitin ve kitosanın yapısı
Kitosan günümüzde tıptan gıdaya, ziraatten kozmetiğe, eczacılıktan atık su arıtımına ve tekstil sektörüne kadar sayısız alanda kullanılabilmektedir. Kitosanın en önemli kullanım alanlarından birisi olan ilaç salım sistemlerinde kullanılması; kitosanın
12
biyomedikal alandaki birçok avantajı sayesindedir. Kitosanın insan vücuduna herhangi bir yan etkisi yoktur. Kitosan, tablet olarak kullanılması halinde tükürük veya midede bulunan lipaz enzimi tarafından parçalanabilmektedir. Parçalanma sonucunda amin şekerleri gibi toksik özellikte olmayan ürünler açığa çıkmaktadır. Kitosan diğer yandan kolestrol düşürücü etkiye de sahiptir. Polikatyonik yapısı nedeniyle negatif yüklü lipidler ile etkileşime girerek kolestrolü düşürmektedir. Ayrıca kanıtlar kitosanın antibakteriyel etkilerinin polikasyon niteliği ile ilişkili olduğunu ve teikoik asitler gibi negatif yüklü bakteriyel yüzey molekülleriyle etkileşime girmesini sağladığını göstermektedir ve kitosanın antibakteriyel özelliğini ön plana çıkarmaktadır.
Kalsiyum sülfat, lokal antibiyotik salımı için klinik olarak kullanılan birincil biyobozunur materyaldir. Tobramisin yüklü kalsiyum sülfat ticari preparatları, birçok ülkede klinik kullanım için onaylanmıştır. Kanada ve Avrupa’da, osteomiyelitli hastaları çoklu çalışmalarda tedavi etmek için antibiyotik yüklü kalsiyum sülfat kullanılmıştır. McKee ve arkadaşları (2015), 30 hasta üzerinde gerçekleştirdikleri bir çalışmada kalsiyum sülfat pelletlerinden salınan lokal tobramisinin etkinliğinin, kronik osteomiyelit tedavisi için PMMA boncuklarıyla benzer bir etki gösterdiğini bildirmiştir.
Klinik olarak, 24 aylık takipte tedavi grubundaki hastaların % 86’sında enfeksiyon yok edilmiştir. Bununla birlikte, kalsiyum sülfat grubunda PMMA grubuna göre daha sonraki cerrahi işlemlerin toplam sayısı anlamlı derecede azalmıştır. Ferguson ve arkadaşları, lokal tobramisin yüklü kalsiyum sülfat pelletlerinin sistemik antibiyotik tedavisi ile birleştirildiğinde osteomiyelitin tedavisi için benzer bir başarı olduğunu bildirmiştir. Hastaların % 90.8’i ortalama 3,7 yıllık bir takip süresinde tekrarlayan bir enfeksiyon sergilememiştir.
Kollajen, ortopedik uygulamalarda biyolojik uyumu, hücre dışı bir matriks proteini olarak önemi, doku rejenerasyonu için etkileri ve kollajen ürünlerinin geniş ticari kullanılabilirliği nedeniyle en yaygın olarak kullanılan doğal polimerlerden biridir.
Aslında, tip I kollajen insan vücudunda en çok bulunan yapısal proteindir ve kemiğin hücre dışı matriksinin kritik bir bileşenidir. Antibiyotikler, materyali antibiyotik çözeltisine batırarak ve hidrofilik matriks tarafından absorpsiyon sağlayarak kollajen ürünlerine en yaygın şekilde dâhil edilir.
13
Fibrin, kanın pıhtılaşmasında yer alan ve proteaz trombininin parçalanmasından sonra fibrinojenin polimerizasyonundan elde edilen bir biyopolimerdir. İyileşme sürecinde fibrinlerin doğal varlığı göz önüne alındığında, fibrin, cerrahlar tarafından genel yara hemostazı için sızdırmazlık maddesi olarak kullanılır. Fibrin sızdırmazlık maddeleri, yara kapanma bölgesindeki polimerize edici fibrin jeline toz antibiyotik ilave edilerek enfeksiyon profilaksisinde de kullanılmaktadır.
Hidroksiapatit (HA) ve biyoaktif cam gibi seramikler, mükemmel biyouyumlulukları ve osteokondüktif özellikleri nedeniyle yaygın olarak kemik grefti yerine kullanılır. Bu malzemeler, biyolojik olarak parçalanabilir veya osteoklastlar tarafından emilebilir yani yeni oluşacak kemiğe dahil edilebilir. Antibiyotik salım uygulamaları için, en sık kullanılan enjekte edilebilir kalsiyum fosfat çimentoları olmuştur. Bu çimentolar tipik olarak, HA veya kalsiyum eksikliğinde bir apatit içinde yeniden çökelecek bir macun oluşturmak üzere çözünür bir kalsiyum fosfatın (örneğin, trikalsiyum fosfat) suyla veya başka bir sulu çözeltiyle birleştirilmesiyle oluşturulur. Antibiyotik salımı difüzyon kontrollüdür ve önemli ölçüde matriksin bozulmasına dayanmaz. Bu materyallerden antibiyotik salımının süresi, seramiklerin kimyasal yapılarına bağlı olarak genellikle günlerden haftalara kadardır.
Tüm kullanılan biyobozunur olan ve biyobozunmaz biyomalzemeler karşılaştırıldığında; iki sistem arasındaki avantaj/dezavantajlar Çizelge 2.3’de özetlenmiştir:
14
Çizelge 2.3 Biyobozunur ve Biyobozunmaz Sistemlerin Karşılaştırılması
Durum
Biyobozunur Sistem Avantaj/Dezavantaj
Biyobozunmaz Sistem Avantaj/Dezavantaj Tek cerrahi müdahele yeterli İkinci bir cerrahi müdahele
gerekliliği Daha düşük miktarda antibiyotik
gerekliliği
Yüksek miktarda antibiyotik gerekliliği
Düşük sistemik toksisite olasılığı Daha yüksek sistemik toksisite olasılığı
Hızlı kemik iyileşimi Gecikmiş kemik iyileşimi
2.3 Lokal ve Kontrollü İlaç Taşıyıcı Sistemlerde Doku İskeleleri
Polimer matriks veya doku iskelesi, hücre desteğinin, büyüme faktörleri veya ilaç taşınmasına olanak sağlayan üç boyutlu yapılardır. Doku iskelesi için en önemli faktörlerden biri gözenekliliktir ve hücre penetrasyonu ve doku iç büyümesi için temel etkendir. Doku iskelesi mikro gözenekli (< 2 mikrometre), mezo gözenekli ( >2 mikrometre, <50 mikrometre) ve makro gözenekli (>50 mikrometre, < 300 mikrometre) gibi farklı gözenek boyutlarına sahip olabilir. Doku iskeleleri besinlerin taşınmasına yardımcı olarak hücrelerin iskele üzerinde büyümesini sağlar. İlaç yüklü gözenekli doku iskelelerinde ise, mikro ve mezo gözenekler ilaç difüzyonu ile salıma katkı sağlarlar.
Eğer doku iskelesi biyobozunur bir malzemeden üretilmiş ise, vücut içerisinde bozunmaya uğrayan polimer ilaç salımını sağlayabilir. Doku iskelesinin degredasyon oranı, kontrollü ilaç salımının gerçekleşebilmesi için en önemli faktörlerdendir. Ayrıca, doku iskelesi degredasyonu, doku büyümesi oranı ile senkronize edilmelidir.
15
Kullanılan biyomalzemenin özelliklerine ve hücre ekim yöntemine göre ilaç salım hızı değişkenlik gösterebilir. Malzemeye göre difüzyon, polimer bozunması ve polimerin şişme derecesi kontrollü ilaç salımını etkileyen parametrelerdir. İlaçlar kovalent immobilizasyon ile hareketsizleştirildiğinde salım mekanizması kimyasal ve enzimatik olur. İlaçların salım profili; doku iskelesinin polimer özelliği, gözeneklilik, gözenek boyutu, polimer çapraz bağlanma derecesi ve polimerin bozunma oranı gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerini değiştirerek ayarlanabilir.
Doku iskelelerinin lokal ve kontrollü ilaç salım sistemlerinde bazı avantajları vardır.
Bunlar;
Degredasyon oranına bağlı olarak ilaç salımının daha kontrollü gerçekleşmesini sağlar.
İçerisindeki antibiyotiği hedef dokuya ulaşıncaya kadar korur.
Tedavi sonrası vücuttaki sağlıklı hücrelerin, üzerinde büyümesini sağlar.
Salım hızı minimuma indirilerek, hedef dokuya maksimum destek sağlar.
İlaçların yanı sıra bir veya birden fazla büyüme faktörü taşıyabilir.
2.3.1 Doku iskelesi hazırlama yöntemleri
Doku mühendisliği çalışmalarında hücrelerin organize olarak işlevsel bir dokuya dönüşmesinde kullanılan, hücreler için uygun tutunma yüzeyi oluşturan, mekanik dayanım sağlayan, fizyolojik ve biyolojik değişikliklere cevap vermek için çevre doku ile etkileşimin kurulmasına yardımcı olan ve gerçek hücre dışı matriksin yeniden oluşumuna katkıda bulunan destek yapısına doku iskelesi denir. Doku iskelesi hazırlamak için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemler; faz ayrımı, çözücü döküm–parçacık uzaklaştırma, gazla köpüklendirme, katı serbest form teknikleri, dondurarak kurutma, elektroeğirme ve ıslak eğirme yöntemlerini içermektedir. Tez çalışması kapsamında hazırlanan doku iskelelerinde ıslak eğirme yöntemi tercih edilmiştir.
16 2.3.2 Islak eğirme yöntemi
Islak eğirme yöntemi, bir polimer çözeltisinin, çözücüsünün toplama banyosu içerisinde çözündüğü fakat polimerin toplama banyosu içerisinde çözünmediği koşullarda kullanılabilen bir yöntemdir. Polimer çözeltisi toplama banyosuna temas ettiği anda, polimer çözeltisinin çözücüsü toplama banyosu içerisinde çözünür, çözücüsü uzaklaşan polimer ise banyo içerisinde fiber halinde birikmeye başlar. Toplama banyosunda oluşan fiber yapı, banyo içerisinden çıkartılarak uygun koşullarda kurutulduktan sonra doku iskelesi hâline gelir (Şekil 2.4).
Islak eğirmeyi etkileyen bazı parametreler vardır. Islak eğirmenin gerçekleşebilmesi için polimer çözücüsü ile toplama banyosu arasındaki ilişki çok fazla önem arz etmektedir.
Aynı zamanda oluşan fiberin fiziksel özelliklerini de değiştirmek için, polimer çözeltisinin içerisinde bulunduğu enjektörden çözeltinin çıkışını sağlayan şırınga pompasının hızı ve ıslak eğirmede kullanılan iğnenin çapı değiştirilebilir.
Şekil 2.4 Islak Eğirme Düzeneği
17 2.4 Metal Organik Kafes Yapıları (MOF)
Yapıtaşları metal iyonları ve organik köprü ligandları olan, özgün bir uzaysal mimariye sahip makro moleküler malzemelere, “gözenekli koordinasyon polimerleri” veya
“metal-organik kafes (MOF) adı verilir.
MOFlar Şekil 2.5’de görülebileceği gibi metal iyonlarını organik bağlayıcılarla birleştiren bir yapı-blok yaklaşımı ile oluşturulmaktadır (Keskin 2011). Bir materyalin MOF grubuna dahil olup olmadığını belirlemek için 3 doğal öznitelik gerekmektedir:
Sağlamlık sağlayan güçlü birleşme, birleştirme birimleri ve geometrik olarak iyi tanımlanmış yapı, bu materyallerin yüksek derecede kristal olması gerektiğini ifade eder. (Rosswell 2004).
Şekil 2.5 MOF Yapısı
MOFlar tipik olarak düşük yoğunluk değeri (0,2 – 1 g/cm3), çok yüksek yüzey alanı (500 – 4500 m2/g), yüksek gözeneklilik ve yüksek termal/mekanik stabiliteye sahiptirler. MOFların bir diğer çok önemli avantajı ise nanogözenekli malzemelerin, sentez sırasında (in-situ) kolayca yapıya katılabilmeleridir. Bu özellik MOF gruplarını geleneksel zeolitlere göre oldukça avantajlı bir konuma getirmektedir.
18
Birçok MOF düşük maliyetlerde hızlı ve kolayca sentezlenebilmektedir. MOFlar genellikle, hidrotermal veya solvotermal tekniklerle sentezlenir. Önemli bir konu da sentezden sonra MOFların aktivasyanodur. Sentez sırasında kullanılan çözücüler genellikle malzemelerin gözeneklerinde kalır ve genellikle bu çözücü moleküllerini uzaklaştırmak için ısıtma ile aktivasyon gereklidir. Çalışmalar, yüksek sıcaklıklarda aktivasyonun numune ayrışmasına neden olabildiğini gösterirken, düşük sıcaklıklarda aktivasyonun metal iyonlarının ayrışma tehlikesini büyük ölçüde azalttığı görülmüştür (Liu 2017).
Nano gözenekli malzemeler, hem araştırma hem de endüstriyel sektörde çeşitli uygulamalarda, gaz ayrıştırma, şekil/boyut seçici kataliz, ilaç depolama ve salımı, görüntüleme ve algılama konularında çalışılan temel malzeme gruplarından biri olmuştur. Metal organik kafes yapıları (MOFlar), binlerce farklı yapı içeren yeni bir kristal nano gözenekli malzeme ailesi olarak kabul edilebilir. MOFlar, koordinasyon merkezleri gibi davranan metal iyonlarının ve metal merkezleri arasında bağlayıcı görevi gören organik ligandların bir araya gelmiş hâlidir. Nano gözenekli malzeme bilimindeki en yeni malzeme sınıflarından biri olan MOFlar, literatürde, koordinasyon polimerleri, hibridorganik inorganik maddeler, metalorganik polimerler veya gözenekli koordinasyon ağları olarak da adlandırılmıştır. Yüksek gözenekliliği, çok geniş yüzey alanları, geniş gözenek boyutları ve topolojileri ve çok sayıda olası yapıların benzersiz kombinasyonu, MOFları birçok bilim dalında ve endüstriyel alanda geleneksel nano gözenekli malzemelere çekici alternatifler hâline getirmiştir.
MOFlar kristal ve gözenekli yapılarından dolayı genellikle X ışını kırınımı (XRD) ile analiz edilir. Yüzey alanları azot adsorpsiyon deneyleri ile hesaplanır. Geçirgenlik deneyleri sonrası, MOFların gözeneklerindeki materyallerin karakterizasyonu genellikle kızıl ötesi, Raman Spektroskopisi ve UV-VIS spektrofotometresi ile yapılmaktadır.
19 2.4.1 MOFların biyomedikal uygulamaları
MOFlar biyomedikal alanda genel olarak ilaç depolama ve salım sistemlerinde, nitrik oksit (NO) depolanmasında, potansiyel görüntüleme ajanı olarak ve biyomedikal algılama süreçlerinde kullanılmaktadır (Şekil 2.6).
Şekil 2.6 MOFların Biyomedikal Uygulamaları
MOFların ilaç salım sisteminde kullanılması organik sistemlerin ilaç salımını kontrollü bir şekilde gerçekleştirememesinden dolayı büyük önem taşımaktadır. Organik sistemler biyouyumlu ve birçok ilacı depolama kabiliyetine sahip olma avantajına sahip olsa da bu özellikleri yeterli olmamaktadır. İnorganik salım malzemeleri, gözenekli ve sıralı ağları sayesinde, yüklenmiş ilaçların daha kontrollü bir şekilde salımını sağlayabilir.
Ancak, daha az ilaç yükleme kapasitesine sahiptirler.
Potansiyel ilaç salım sistemleri olarak kabul edilen ilk MOF grubu, Ferey ve arkadaşları tarafından geliştirilen MIL (Lavosier Enstitüsü Materyalleri) ailesidir. Üç değerlikli
20
metal merkezlerinden ve karboksilik asit köprü ligandlarından sentezlenen MIL ailesi, geniş gözenek boyutları (25-34 Å), olağanüstü yüzey alanları (3100-5900 m2/g) sayesinde ilaç salımında çok umut verici bir MOF ailesidir ve daha fazla işlevselleştirme imkânı da mevcuttur. Horcajada ve arkadaşları, ayrıca, ısındıktan sonra yapısını genişletme kabiliyetine sahip olduğu için “nefes alabilen” esnek bir MOF olan, MIL – 53’den ilaç salımı üzerinde çalışmıştır.
MOFlar son derece yüksek yüzey alanları ve gözenekli yapıları sayesinde gaz depolama uygulamalarında büyük potansiyele sahiptir. Tıptaki önemli gaz depolama uygulamalarından biri, nitrik oksidin (NO) saklanmasıdır. Nitrik asit, nöronal, bağışıklık ve vasküler sistemde çözünmeyen yapısı dolayısıyla pek çok in vitro ve in vivo antibakteriyel uygulamalara sahiptir. Bu nedenle, MOFlar önemli miktarda nitrik oksit depolayabilen vücutta önemli miktarda saklayabilen ve sunabilen materyaller olarak kullanılabilmektedir. Gerekmediğinde nitrik asitin MOFlardan salınmasını önlemek için, depolama malzemesi ve gaz arasındaki etkileşim yüksek olmalıdır.
Depolama malzemeleri için hızlı kinetik ve iyi termal/mekanik özellikler de gereklidir, böylece salım belirli bir uygulama için istenen zamanda ve oranda meydana gelebilir.
Biyomedikal görüntüleme alanında, nanomalzemeler aktif olarak yeni moleküler problar olarak çalışılmıştır. Tipik nano boyutlu görüntüleme probları, kuantum noktaları, süper paramanyetik metaloksitleri ve altın nanoparçacıkları gibi tamamen inorganik materyallere dayanmaktadır. Hibrit organik-inorganik malzemeler olarak MOFlar hâli hazırda kataliz, gaz depolama, ilaç dağıtımı ve non-linearoptik alanında umut vaat etmektedirler. Li ve grubu tarafından (2008) yapılan bir çalışmada bir floresan MOF’un nano tabakalarını sentezlenmiş ve bu MOFun flüoresans özelliğinin etilamine karşı oldukça duyarlı olduğu bildirilmiştir.
MOFların biyomedikal görüntüleyici olarak kullanılması, şekil/boyut seçici ile birlikte parlaklık özelliklerine sahip olan MOFların emme özelliğine sahip olmalarıyla açıklanabilmektedir. İyon izleme için birkaç ışıldayan MOF grubu ile çalışmalar yapılmıştır. MOFlar çeşitli gaz türlerini algılamak için çalışılmış olsa da, oksijen,
21
glukoz veya biyomolekülleri algılayabilen MOFların geliştirilmesi biyomedikal uygulamalarda özellikle önemlidir.
2.5 Zeolitik İmidazol Kafes (ZIF)
ZIF (Zeolitic Imidazolate Framework), MOF malzemeler sınıfının son yıllarda en fazla çalışılan ısıl, hidrotermal ve kimyasal kararlılığı yüksek olan sınıfıdır. ZIFler tetrahedral koordineli geçiş metalleri iyolarının karışımından meydana gelen yapılardır.
ZIFler ısısal ve kimyasal kararlılıkları yüksek olan, geleneksel gözenekli malzemelere kıyasla çok yüksek yüzey alanına sahip yapılardır. Bir ZIF molekülünün ortalama yüzey alanı 1500 m2/g’dır.
ZIF metal düğümlerinin (genellikle çinko) imidazol (ImI) gruplarına (bağlayıcı) bağlandığı ve zeolit benzeri yapıyı Metal Bağlayıcı - Metal açısının 145o olmasıyla sağlamaktadır. Zeolitlerle eş yapılı olmalarına rağmen ZIFlerin zeolitlere oranla birçok farklılığı bulunmaktadır. Bu farklılıklar Çizelge 2.4’de verilmiştir.
Şekil 2.7 Bazı Farklı ZIFlerin Atomik Yapısı
22
Çizelge 2.4 Zeolit ile ZIFlerin Karşılaştırılması (Chen 2014)
Yapı Zeolit ZIF
Tür İnorganik İnorganik – Organik
Bileşim Si;Al;O Zn;Co;C;N;H
İkincil Bileşen SiO4 ve AlO4 M(Im)2
Topoloji 200 civarı 100 ve artması bekleniyor
Stabilite Si/Al oranına bağlı genel olarak termal ve mekanik
stabilite yüksek
500 0C’ye kadar termal stabil, organik ve sulu ortamda
kimyasal stabil Uyumluluk Polimerlerle zayıf etkileşim Organik, polimerlerle iyi
etkileşim
Fonksiyonellik Düşük Zengin kimyasal fonksiyonlar
ZIFler farklı atomik yapılara sahip olabilirler. Dünya üzerinde keşfedilmiş 100 civarı ZIF yapısı bulunmaktadır. Bu sayının artacağı tahmin edilmektedir. ZIFlerin uygulama alanlarına göre alanı çapı ve yüzey alanları oldukça fazla önem taşımaktadır. Farklı ZIF türleri farklı gözenek çapı ve yüzey alanına sahiptirler. En yüksek yüzey alanına sahip olan ZIF türü ZIF 70 (= 3000 m2/g), en düşük yüzey alanına sahip olan ZIF türü ise ZIF– 78 ( =500 m2/g) olarak bilinmektedir.
23
Şekil 2.8 Bazı ZIFlerin Yüzey Alanları
ZIFler birçok kullanım alanına sahiptirler. ZIF molekülleri doğrudan kullanılabildikleri gibi membran halinde de kullanılabilirler. ZIF bazlı membranlar ile toz olarak kullanılan ZIFlerin kullanım alanlarında bazı farklılıklar vardır. ZIF tozlarının saf olarak kullanımında hidrojen, karbondioksit, küçük organik moleküllerin ayrılması amaçlanmıştır. ZIF bazlı karışık matriksli membranlarda ise; toz haldeki ZIF tozlarının kullanım alanlarına ek olarak özellikle petrokimyasal sanayide oksijen uzaklaştırılması bulunmaktadır.
2.5.1 ZIF – 8
ZIF – 8; 0.34 nm gözeneklerin 2-metilimidazol bağlantı gruplarının oluşturduğu 1.16 nm açıklıklarla bağlandığı, hibrid organik-inorganik yapıya sahiptir. ZIF – 8 ‘in BET yüzey alanı ise 1300 – 1600 m2/g arasındadır (Venna 2010). ZIF – 8 membran olarak ayırma proseslerinde ve adsorpsiyon işleminde kullanılma potansiyeline sahiptir.
24
En yaygın olarak kullanılan ZIF türü ZIF – 8’dir. ZIF – 8 sentezi için farklı metodlar uygulanmaktadır. Bunlar hidrotermal, solvotermal ve oda koşullarında olmak üzere üç çeşittir. Solvotermal metodda organik bir çözücü ile hazırlanan sentez solüsyonu kullanılmaktadır. Bu çözücüler DMF (Dimetilformamid), DEF (Dietilformamid) veya metanol olabilir. Kullanılan organik bileşiklerin fazla miktarda atık meydana getirmesi ve maliyetinin yüksekliği farklı yöntemler üzerinde çalışılmasına sebep olmuştur.
Organik çözücü yerine su denenmiş ve sentez sırasında harcanan imidazol oranının yükseldiği görülmüştür. İmidazol kullanımı maliyetin artmasına neden olsa da hidrotermal olarak sentezlenen ZIF – 8, solvotermal sentezle hazırlanan nanokristallere göre doku mühendisliği uygulamalarında daha etkili bir kullanıma sahiptir. Solvotermal yöntem ile hazırlanan antibiyotik yüklü ZIF – 8’in yapısındaki antibiyotiğin yapısında bozunmalar olabilmektedir. Bunun nedeninin antibiyotik ile organik çözücünün etkileşiminden kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Ancak, hidrotermal olarak sentezlenen antibiyotik yüklü ZIF – 8’in ilaç taşıyıcı olarak kullanıldığı sistemlerde, antibiyotiğin sentez sırasında bozunmasını önlediği görülmüştür.
Şekil 2.9 ZIF – 8 Oluşum Tepkimesi
ZIF – 8’in membran olarak kullanılmasında gözenek boyutu (0.34 nm) ve hidrofobik yapısının büyük önemi vardır. Gözenek boyutu ve hidrofobitesi ile hidrojen iyonunun diğer büyük gaz moleküllerinden kolayca ayrımını sağlamaktadır. Literatürde yapılan bir çalışmada ZIF – 8 membranın H2/CH4 ayırma işleminde 11.2 gibi yüksek bir ayırma oranına ulaştığı gözlemlenmiştir (Bux, 2011). Bu değer 2.8 olan Knudsen ayırma faktöründen oldukça yüksektir.
25 2.5.2 ZIF – 8’in biyomedikal uygulamaları
ZIF – 8’in biyomedikal uygulamalarının en önemlisi ilaç salım sistemlerinde ilaç taşıyıcı olarak kullanılmasıdır. Yapılan çalışmalar büyük oranda anti kanser ilaçlarıyla gerçekleştirilmiştir ve ZIF – 8’in mikroorganizma temelli hastalıklarda kullanımı daha yeni bir çalışma alanı olarak ortaya çıkmaktadır. ZIF – 8’in antibiyotik taşımasıyla ilgili çalışmalar ilerledikçe daha başarılı tedavi sonuçlarının elde edileceği düşünülmektedir.
ZIF – 8’in ilaç taşıma sistemlerinde kullanılmasının avantajları şu şekilde sıralanmak tadır;
Yüksek depolama kapasitesinden faydalanılarak ZIF – 8’e ilaç yüklemesi ve daha büyük moleküller Sığır Serumu Albümini (BSA) proteini yüklenmesi gerçekleştirilebilir.
ZIF – 8’in pH duyarlı bir çözünürlüğe sahip olması da biyomedikal uygulamalarda büyük avantaj sağlamaktadır.
ZIF – 8 vücut içerisinde toksik bir etki oluşturmamaktadır.
Zheng ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği bir çalışmada ZIF – 8 içerisine bir anti-kanser ilacı olan doksorubisin (DOX) yüklenerek pH duyarlı bir sistem elde edilmesi hedeflenmiştir. Çalışma sonrasında özellikle düşük pH değerlerinde ZIF – 8 içerisinde doksorubisin salımının başarılı bir şekilde gerçekleştiği görülmüştür. Meme ve yumurtalık kanseri tedavisinde kulllanılan doksorubisin yüklü ZIF – 8 nanokristal lerinin yapılan denemler ardından kanser hücrelerini öldürme konusunda serbest doksorubisinden daha etkin olduğu gözlemlenmiştir. Aynı zamanda vücut pH değerinde yapının stabil kaldığı ve hedef pH değerlerinde (pH=5,5–6) salımın arttığı gözlemlenmiştir.
Shearier ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği bir diğer çalışmada ZIF – 8 nanokristallerinin içerisine rahim ağzı kanseri tedavisinde kullanılan hidroksiüre yüklemesi gerçekleştirilmiştir. Hidroksiürenin yükleme verimi oldukça yüksek bir değer olan %90
26
oranlarına ulaşırken, yüklenen hidroksiürenin salım değeri 48 saatte % 99 olarak hesaplanmıştır.
ZIF – 8’in antibiyotik taşıyıcı olarak kullanıldığı Nabipour ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği çalışmada metal-organik kafesler (MOFlar) antibiyotik yüklemesi araştırılmıştır. Gözenekli ZIFler konsantre sulu çözelti altında sentezlenmiş ve nano çökeltme yöntemi ile bir antibiyotik olan siprofloksasin (CIP), ZIF – 8 nanokristallerine yüklenmiştir. ZIF – 8 ve CIP@ZIF – 8, FTIR spektroskopisi, X ışını toz kırınımı, taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon sonucunda antibiyotiğin yapıya yüklendiği görülmüştür ve yükleme verimi %21 olarak bulunmuştur. pH = 5.0’da asetat tampon çözeltisi içerisinde yüzde % 97 oranında salım gözlenmiştir ve bu değer fosfat tampon çözeltideki (pH = 7,4) salım değerinden (%83) daha yüksektir. Ayrıca yapılan antibakteriyel aktivite çalışmalarında ayrı ayrı ZIF – 8 ve CIP@ZIF – hem gram pozitif ve hem de gram negatif bakterilere karşı antibakteriyel özellik göstermiştir.
Chowdhuri ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği çalışmada, metisilin dirençli S.aureus’a (MRSA) karşı terapötik etkinliği arttırmak için bir antibiyotik (vankomisin) ve bir hedef ligand (folik asit) taşıyan nano ölçekli metal-organik kafeslerin (nano MOFlar) kullanımı araştırılmıştır. Vankomisini ve folik asidi birlikte tutan küresel morfolojilere sahip olan ZIF – 8 hazırlanmıştır. ZIF – 8’in yüzeyindeki folik asit varlığının, MRSA tarafından endositoz yoluyla yapıya alındığı gözlemlenmiştir. İşlevselleştirilmiş ZIF – 8 ler vankomisini MRSA’ya hücre çeperi boyunca taşımaktadır. Bu çalışma, işlevselleştirilmiş ZIF – 8’in MRSA’ya karşı etkili tedavisi için büyük umut vaat ettiğini göstermektedir.
27 3. MATERYAL VE YÖNTEM
Bu bölümde, tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen deneysel çalışmalar hakkında detaylı bilgi verilmiştir. İlk bölümde, çalışma kapsamında kullanılan kimyasal malzemeler açıklanmıştır. Sonraki bölümde, ilaç taşıyıcı ZIF – 8 nanokristalinin sentezlenmesi ve bu kristallere ilaç yüklenmesi anlatılmıştır. Üçüncü bölümde kitosan doku iskelelerinin hazırlanması yöntemleri açıklanmıştır. Sonraki bölümde ise örneklerin yapısal karakterizasyonun (Taramalı elektron mikroskobu (SEM), şişme deneyleri, Fouirer Transform Infrared Spektrofotometresi (FTIR-ATR), ve ilaç yüklü ZIF – 8 içeren doku iskelelerinden in-vitro salım çalışmaları açıklanmıştır. Son bölümde ise antimikrobiyal çalışmalar (Mikroorganizma yapışması ve antimikrobiyal aktivite deneyleri) ile ilgili bilgiler sunulmuştur.
3.1 Materyaller
Tez çalışması sırasında kullanılan malzemeler; kitosan (düşük viskozite, DD > %75), vankomisin (Vankomisin Hidroklorür), 2-metilimidazol (C4H6N2, mIm) ve çinko nitrat hekzahidrat (Zn(NO3)2.6H2O) Sigma-Aldrich (Almanya)’dan satın alınmıştır.
Mikroorganizma deneylerinde kullanılan besi ortamları Tryptic Soy Broth (TSB), Tryptic Soy Agar (TSA) ve Muller Hinton Broth (MHB), Merck (Almanya)’dan temin edilmiştir. Glioksal çözeltisi (H2O içinde ağırlıkça % 40) ve fosfat tampon çözeltisi (PBS, pH 7,4) tabletleri Sigma-Aldrich’den (Almanya) alınmıştır. Çözücü olarak kullanılan1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP), stabilizasyonda kullanılan etanol ve toplama banyosu olarak kullanılan 2-propanol Sigma-Aldrich (Almanya) firmasından alınmıştır.
3.2 Zeolitik İmidazol Kafes (ZIF – 8) Sentezi
Tez çalışmasında kullanılan ZIF – 8’in sentezi için sulu sentez yöntemi tercih edilmiştir.
Sulu ZIF – 8 sentez yöntemi kullanılarak molar bileşim çinko nitrat hekza hidrat:2-metil imidazol:su : (Zn2+:Hmim:Su) : 1:70:1243 olacak şekilde oda sıcaklığında 30 dakika
28
süre ile karıştırılarak tam çözünme sağlanmıştır. Elde edilen çözelti 15000 rpm (dakikada devir) hızında 30 dakika santrifüjlenerek katı ZIF – 8 nanokristalleri çöktürülmüştür. Elde edilen ZIF – 8 nanokristalleri saf metanol ile 15000 rpm hızında 15 dakika boyunca 4 kez yıkanmıştır. Elde edilen ZIF – 8 nanokristalleri üzerindeki süpernatant uzaklaştırılarak etüvde 40 0C’de 2 gün kurumaya bırakılmıştır.
3.3 Vankomisin Yüklü ZIF – 8 (ZIF8@VAN) Sentezi
Vankomisin yüklü ZIF – 8 sentezinde, molar bileşim çinko nitrat hekza hidrat:2-metil imidazol:su:vankomisin : (Zn2+:Hmim:Su:Van) : 1:70:1243:34,5 olacak şekilde oda sıcaklığında 30 dakika süre ile karıştırılarak tam çözünme sağlanmıştır. Elde edilen çözelti 21000 rpm hızında 30 dakika santrifüjelenmiştir. Çöken vankomisin yüklü ZIF – 8 nanokristalleri 2000 rpm hızında, saf metanol ile 15 dakika boyunca 4 kez yıkanmıştır. Elde edilen ZIF – 8 nanokristalleri üzerindeki süpernatant uzaklaştırılarak 400C’de 2 gün kurumaya bırakılmıştır.
3.3.1 Vankomisin yükleme veriminin bulunması
Vankomisin yüklü ZIF – 8 sentezinde, sentez sırasında eklenen vankomisinin yükleme verimi spektroskopik yöntemle indirekt olarak belirlenmiştir.
Yükleme veriminin belirlenebilmesi için saf su içerisinde vankomisin stok çözeltisi hazırlanmıştır. Kuartz küvetlere aktarılan vankomisin çözeltisinin maksimum pik verdiği dalga boyu 229 nm olarak bulunmuş, tarama aralığı 180 – 550 nm aralığında tutulmuştur. Yükleme işlemi sonrası, sentez çözeltisinden alınan çözeltinin UV absorbans değeri ölçülerek, yüklenen miktar indirekt olarak hesaplanmıştır. Absorbans değerinin vankomisin miktarı ile orantılı olan değişimini tespit etmek amacıyla bilinen derişimlerde hazırlanan vankomisin çözeltileri kullanılarak kalibrasyon grafiği elde edilmiştir.
𝑌ü𝑘𝑙𝑒𝑚𝑒 𝑉𝑒𝑟𝑖𝑚𝑖 (%) = [(𝑇𝑜𝑝𝑙𝑎𝑚 𝑉𝑎𝑛𝑘𝑜𝑚𝑖𝑠𝑖𝑛−𝑆ü𝑝𝑒𝑟𝑛𝑎𝑡𝑎𝑛𝑡𝑡𝑎𝑘𝑖 𝑉𝑎𝑛𝑘𝑜𝑚𝑖𝑠𝑖𝑛)
𝑇𝑜𝑝𝑙𝑎𝑚 𝑉𝑎𝑛𝑘𝑜𝑚𝑖𝑠𝑖𝑛 ]𝑥 100 (3.1)
29 3.4 ZIF – 8 Nanokristallerinin Karakterizasyonu
3.4.1 Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi
Vankomisin yüklemesinin ZIF – 8 ‘in yapısında herhangi bir değişim oluşturmadığını göstermek amacıyla ZIF – 8 ve ZIF8@VAN taramalı elektron mikroskobu yardımıyla morfolojik olarak gözlemlenmiştir (FEI, Quanta 200 FEG). Nanokristal örnekleri SEM analizi öncesinde önce altın-paladyum (Au-Pd) ile kaplanarak görüntülemeye hazır hale getirilmiştir.
3.4.2 Fouirer Transform Infrared Spektrofotometresi (FTIR – ATR) Analizleri
ZIF – 8 ve ZIF8@VAN, nanokristallerinin kimyasal yapılarının belirlenmesi amacıyla FTIR – ATR spektrofotometresi (Thermo Scintefic Nicolet iS10) ile analizler yapılmıştır. Örnekler, 400 – 4000 cm-1 aralığında taranmıştır.
3.4.3 X Işını Kırınımı (XRD) Analizi
ZIF – 8 ve ZIF8@VAN nanokristallerinin toz X ışını kırınımı (PXRD) örnekleri, Cu-K radyasyon kaynağına sâhip bir RigakuUltima – IV difraktometre kullanılarak kaydedilmiştir. Analizler 2 açıda 5 – 400 aralığında ve 0.2 dakika-1 tarama hızında gerçekleştirilmiştir.
3.5 Kitosan Doku İskelelerinin Hazırlanması
Kitosan doku iskelelerini elde etmek amacıyla ıslak eğirme yöntemi ile çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Doku iskelesi eldesi için ilk olarak ıslak eğirme parametreleri üzerinde çalışmalar yapılmış ve optimum koşullar belirlenmiştir. Optimum koşulların belirlenmesi için yapılan çalışmalar Çizelge 3.1’de gösterilmiştir:
30
Çizelge 3.1 Optimum Islak Eğirme Parametrelerinin Belirlenmesi İçin Yapılan Denemeler
Parametre Denemeler
Akış Hızı (mL / saat) 5 7 15
İğne Çapı (mm) 0,45 0,5 0,8
Toplama Banyosu Metanol, soğuk aseton, soğuk izopropanol, etil laktat, izopropanol ve Na2SO4 karışımı, tripolifosfat (TPP), Na2SO4 – NaOH – su karışımı ve oda sıcaklığındaki izo- propanol
Kitosan çözeltisi %2 (w/v) derişime sahip olacak şekilde 1-1-1-3-3-3 hekzafloro-2- propanol (HFIP) içerisinde hazırlanmıştır. Tam çözünme için çözelti 24 saat karıştırılmıştır. Kitosan çözeltisi şırınga pompası yardımıyla 7mL/saat akış hızında, 0,8mm çapındaki iğne ucu ile izo–propanol banyosunda, ıslak eğirme yötemiyle doku iskeleleri elde edilmiştir. Elde edilen doku iskeleleri 24 gözlü Petri kaplarına alınarak 24 saat saf izo-propanol banyosunda bekletilip ardından metanol:su (1:1) banyosunda 2 saat boyunca yıkanmıştır. Ardından doku iskeleleri 96 gözlü Petri kaplarında sıkıştırılarak etanol ile 2 saat boyunca stabilize edilmiştir. Stabilize edilmiş doku iskeleleri liyofilizatörde -86 0C’da vakum altında 96 saat süresince kurutularak +40C’da saklanmıştır.
3.5.1 ZIF – 8 veVAN@ZIF-8 Yüklü Kitosan Doku İskelelerinin Hazırlanması
Kitosan çözeltisi %2 (w/v) derişime sahip olacak şekilde 1-1-1-3-3-3 hekzafloro-2- propanol (HFIP) içerisinde hazırlanmıştır. Tam çözünme için çözelti 24 saat karıştırılmıştır. Yüklenmek istenen ZIF – 8 miktarı polimer ağırlığının %1’i ve %5’i olacak şekilde ZIF – 8 veya vankomisin yüklü ZIF – 8 tartılarak 10 dakika boyunca 500
