Şişme deneyleri

Doku iskelelerinde su tutma kapasitelerinin belirlenmesi için şişme deneyleri yapılmıştır. Şişme deneyleri iki farklı pH değerinde, dört farklı doku iskelesi grubu ile (CHI, CHI-%1ZIF8, CHI-%5ZIF8 ve CHI-%5ZIF8-CL) gerçekleştirilmiştir.

Şişme deneyleri sonucunda hesaplanan denge şişme değerleri Çizelge 4.3 ve Şekil 4.6’da sunulmuştur:

Çizelge 4.3 Denge Şişme Değerleri (Q %)

pH = 5,4 pH= 7,4

Kitosan 398,24±13,21 270,14±15,21

CHI-1%ZIF8 265,60±20,82 213,44±11,44

CHI-5%ZIF8 184,23±9,44 144,85±5,49

CHI-5%ZIF8_CL 83,44±6,05 72,04±6,74

Şekil 4.6 Denge Şişme Değerleri

49

Kitosan doku iskelelerinin şişme davranışı pH ortamına, ZIF – 8 içeriğine ve glioksal ile çapraz bağlanmasına göre farklılık göstermiştir. Asidik koşullarda (pH 5,4), tüm kitosan doku iskeleleri için daha yüksek bir denge şişme değeri gözlemlenmiştir. pH duyarlı şişme davranışı, kitosan zincirleri üzerindeki protonlanmış amino grupları arasındaki elektrostatik itme ile kontrol edilir. Düşük pH değerlerinde, artan protonasyon, daha güçlü bir itme ve polimer ağının genişlemesine neden olmuştur. Yapıdaki ZIF – 8 oranı arttıkça, kitosanın denge şişme değeri azalmıştır. ZIF – 8 nanokristalleri fiziksel bir çapraz bağlayıcı olarak hareket edebilir ve daha düşük bir şişme oranıyla daha kararlı bir yapı elde edilir. Glioksal çapraz bağlanması, hem pH =5,4 hem de pH = 7,4 tampon çözeltilerinde CHI-%5ZIF8-CL doku iskelelerinde polimer zincirlerinin bağlanması ve şişme oranının azalmasıyla daha kompakt bir yapıya neden olmuştur.

Literatürdeki çalışmalar incelendiğinde, yapının içerisine eklenen maddelerin, moleküller arasındaki boşluğu azaltarak, kitosan doku iskelelerinin su tutuma kapasitesini yani denge şişme değerini azalttığı gözlemlenmiştir. Ek olarak glioksal gibi çapraz bağlayıcı kimyasalların kullanıldığı çalışmalarda yapının kararlılığının artmasından dolayı denge şişme değerlerinin oldukça düştüğü gözlemlenmiştir. Elde edilen deney sonuçları literatürdeki çalışmalarların sonuçlarıyla örtüşmektedir. ((Ma, 2013), (Peter, 2010), Wang, 2016))

4.3.4 Kitosan Doku İskelelerinden Vankomisin Salımı

İlaç salım deneyleri iki farklı pH değerinde (pH = 5,4 ve pH= 7,4) ve dört farklı doku iskelesi grubu (CHI-%1ZIF8/VAN, CHI-%5ZIF8/VAN, CHI-%5ZIF8/VAN-CL ve CHI/VAN) ile gerçekleştirilmiştir.

CHI-%1ZIF8/VAN doku iskelesinden vankomisin salımı spektroskopik bir yöntem ulan UV – VIS analiz yöntemi ile belirlenmiş, kitosan doku iskelesinden zamana karşı salınan vankomisin miktarı kümülatif olarak hesaplanmış ve Şekil 4.7’de sunulmuştur.

50

Şekil 4.7 CHI-%1ZIF8/VAN Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği

CHI-%1ZIF8/VAN doku iskelesinden vankomisin salımında 2 saat içinde ani bir salım gözlenmiştir ve erken aşamada vankomisinin yaklaşık % 80’i salınmıştır. Ardından 48 saat boyunca salım devam etmiştir.

Şekil 4.8 CHI-%5ZIF8/VAN Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği

CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinden vankomisin salımı incelendiğinde; ZIF – 8 oranı %1’den %5’e arttırıldığında, ani vankomisin salımı bastırılmış ve pH’a bağlı salım profili daha belirgin hale gelmiştir. 8. saatin sonunda pH = 5,4’de yaklaşık % 70 vankomisin pH = 7,4’de ise % 55 vankomisin salımı görülmüştür. Vankomisin salımı,

51

asidik koşullarda daha yüksek ZIF – 8 çözünmesi ile arttırılmış ve 48 saat sonunda pH = 5,4’de ~% 77’lik bir plato değerine ulaşmıştır.

Şekil 4.9 CHI-%5ZIF8/VAN-CL Doku İskelesi İçin Vankomisin Salım Grafiği

CHI-%5ZIF8/VAN-CL doku iskelelerinde vankomisin salımı, CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinde olduğu gibi pH’a bağlı salım profiline benzer olup, salım daha uzun bir süre devam etmiştir. Glioksal ile çapraz bağlama sonrası kompakt yapı, ilacın salım süresini ve miktarını değiştirmiştir. Çapraz bağlanmış doku iskelelerindeki kümülatif salım grafiği toplam vankomisin salımının CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerine kıyasla azaldığını göstermiştir. Toplam ilaç salımı, çapraz bağlanmış yapılar için 144 saatin sonunda, pH 7,4 ve 5,4’de sadece % 30 ve % 45’e ulaşmıştır.

Vankomisin ZIF – 8 nanokristallerine yüklenmeden, ıslak eğirme öncesinde kitosan/HFIP çözeltisine eklenip ardından ıslak eğirme ile doku iskelesi elde edilmiştir (CHI-VAN). Bu yolla hazırlanan kitosan doku iskelelerinden vankomisin salımı hızlı olarak gerçekleşmiştir ve 2 saat sonunda yüklenen vankomisinin %100’ü salınmıştır.

Doku iskelelerden vankomisin salımında, farklı pH değerlerinde PBS doku iskelesinin içerisine girerek ZIF – 8’in çözünmesini sağlamış ve bu da kapsüllenmiş vankomisin moleküllerinin ortaya çıkmasını sağlamıştır. Kitosanın PBS’i içine alarak şişmesi,

52

PBS’in kitosan doku iskelelerindeki ZIF – 8’i çözmesi ve çözünen ZIF – 8 içerisinden vankomisin salınması, kitosanın difüzyon özelliği ile açıklanabilir. Kümülatif ilaç salım grafiklerinde, vankomisinin kütlesel aktarımı için belirli bir fraksiyon gözlenmemiştir.

Çapraz bağlı doku iskelelerinde ZIF – 8 nanokistallerini çözmek için doku iskelesine alınan PBS azalmış ve toplam salınan vankomisin miktarında düşüş görülmüştür.

Zheng ve arkadaşlarının (2015) gerçekleştirdiği çalışmada, ZIF – 8 nanokristallerine bir antikanser ilacı olan doksorubrisin yüklemesi gerçekleştirilmiş ve pH duyarlı doksorubrisin salım deneyleri gerçekleştirilmiştir. pH = 7,4 değerinde kümülatif doksubrisin değeri % 20 olarak hesaplanmıştır. pH > 6.5 olduğu durumlarda doksorubrisin salımı hiçbir zaman % 20’nin üzerine çıkmamıştır. Düşüm pH değerlerinde (pH = 5), doksorubrisin salımı % 95’in üzerine yükselmiştir. Çalışmanın sonuçları yapılan tez çalışması ile karşılaştırıldığında, pH duyarlı ilaç salım sistemlerinde ZIF – 8 kullanımı, ZIF – 8’in vücut pH değerinde (pH = 7,4) bozunmadan kalabilmesi ve asidik pH değerlerinde yapısının bozunması nedeniyle büyük avantajlar sağlamaktadır. Tez kapsamında elde edilen deney sonuçları ile elde edilen literatür sonuçları paralellik göstermektedir.

Chen ve arkadaşlarının yaptığı farklı bir çalışmada (2018), Fe3O4@ZIF – 8’e antikanser ilacı doksorubisin yüklemesi yapılmıştır. İlaç salım deneyleri pH = 5,5 ve pH = 7,4’de yapılmıştır. Doksorubisin salımı 48 saatte tamamlanmış ve pH = 5,5’de kümülatif salım %60, pH = 7,4de kümülatif salım %30 olarak hesaplanmıştır. Tez çalışmasına benzer olarak ZIF – 8’in asidik pH değerinde bozunmasının yüksek olmasından dolayı asidik ortamda kümülatif ilaç salımı nötr ortama göre daha yüksek hesaplanmıştır.

4.3.5 Antimikrobiyal Aktivitenin İncelenmesi

Bakteriyel yapışma, polimerik doku iskelelerinde biyofilm oluşumunun kritik bir aşaması olarak kabul edilmektedir. Doku iskelesinin yapısına antibiyotiklerin veya antibakteriyel malzemelerin dahil edilmesi, bakteriyel kolonizasyonu ve biyofilm oluşumunu önlenmesini sağlamaktadır. Bunu yanı sıra vankomisin gibi antibiyotikler

53

veya antibakteriyel malzemeler, intravenöz uygulamalardaki toksik yan etkileri mikrobiyal ilaç direncini azaltır ve kontrollü lokal ilaç salımına olanak sağlar. Tez çalışmasında, farklı miktarlarda vankomisin yüklü ZIF – 8 nanokristalleri yüklü kitosan doku iskelelerindeki S.aureus aktivitesi araştırılmıştır. S.aureus süspansiyonlarında (pH = 5,4 ve 7,4’de) 2 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra kitosan doku iskelelerindeki bakteri yapışma miktarları, Şekil 4.10 ve Şekil 4.11’de gösterilmiştir. Kitosan doku iskelelerine 2 saat sonrasındaki bakteri yapışması SEM görüntüleri Şekil 4.12’de verilmiştir. Koloni sayımı gerçekleştirilen agarların fotoğrafları ise EK 5’de sunulmuştur.

Şekil 4.10 2 saat sonundaki CFU sayısı

Şekil 4.11 24 saat sonundaki CFU sayısı

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

CFU x 10^5

Doku İskelesi

pH =7.4 pH = 5.4

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

CHI-5%ZIF CHI-5%ZIF/VAN CHI-5%ZIF_CL

CFU x 10^4

Doku İskelesi

54

Şekil 4.12 Bakteri Yapışması SEM Fotoğrafları

CHI

CHI CHI-1%ZIF8

CHI-1%ZIF8

CHI-1%ZIF8/VAN

CHI-1%ZIF8/VAN CHI-5%ZIF8 CHI-5%ZIF8/VAN CHI-ZIF8_CL/VAN

CHI-5%ZIF8 CHI-5%ZIF8/VAN CHI-ZIF8_CL/VAN

pH= 7.4pH= 5.4

55

ZIF – 8 ve vankomisin içermeyen kitosan doku iskelelerindeki agarlardan sayılan bakterilerin toplam sayısı, sayılamayacak kadar çoktur. ZIF – 8 nanokristallerin varlığında bakteriyel yapışmada gözle görülür bir azalma gözlenmiştir. pH = 7,4’de, CHI-%1ZIF8 doku iskelelerine kıyasla CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerine daha az bakteri yapışmıştır. ZIF – 8 içeriğindeki artışın etkisi, pH = 5,4’de daha belirgindir.

Canlı kolonilerin sayısındaki keskin düşüş, bakteriyel yapışmanın pH = 5,4’deki

CHI-%5ZIF8 doku iskelelerinde engellendiğini gösterir. ZIF – 8 kristallerine yüklenen vankomisin, pH = 5,4’de CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerine bakteri yapışmasını azaltmıştır. Koloni sayısı (CFU), CHI%/1ZIF8 doku iskelelerine kıyasla

CHI-%1ZIF8/VAN doku iskelelerinde azaltılmıştır. Bununla birlikte, pH = 7,4’de, yapışan bakterilerde vankomisin salımı nedeniyle istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlenmemiştir. Bu sonuç, pH = 7,4’de vankomisin salımındaki azalmaya bağlanabilir.

ZIF – 8 miktarının arttırılmasından sonra, CHI-%5ZIF8 ve CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinde, pH = 5,4 değerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır, sadece ZIF – 8’in pH = 5,4’de kısa sürede bakteriyel yapışmayı azaltmak için yeterli olduğunu görülmektedir. Bununla birlikte, pH = 7,4’de, CHI-%5ZIF8 doku iskelelerine kıyasla CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinde koloni sayısında büyük bir düşüş gözlemlenmiştir. Bu sonuç, pH 7,4’de ZIF – 8’in yavaş çözünmesi ve dolaylı olarak daha az vankomisin salımı, bakteriyel yapışmanın azalmasını yüksek oranda engelleyememiştir. Glioksal ile çapraz bağlı doku iskelelerinde CHI-%5ZIF8/VAN-CL) S.aureus yapışması önemli ölçüde azalmıştır.

Kısa vadede yapışma önleyici özelliklerin yanı sıra, ZIF – 8 ve ZIF8@VAN yüklü kitosan doku iskelelerinin antibakteriyel özellikleri ve bakterisidal etkisi, S.aureus büyüme ortamlarında, uzun kültür süreleri boyunca pH 5,4 ve 7,4 koşullarında

incelenmiştir. 24 saatlik inkübasyonun sonunda, CHI, CHI-%1ZIF8 ve CHI-%1ZIF8/VAN doku iskelelerinden elde edilen canlı kolonilerin sayısı sayılabilir

miktarlardan çok daha fazla miktardadır. S.aureus büyümesini azaltmak için ne % 1 ZIF – 8 ne de % 1 ZIF8@VAN miktarı etkili olmamıştır. ZIF – 8 miktarı % 5’e yükseltildiğinde antibakteriyel etki ortaya çıkmıştır. Canlı kolonilerin sayısı hem CHI-%5ZIF8 hem de CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinde azalmıştır. 96 saat 600 nm

56

dalga boyunda okunan S.aureus kültüründeki absorbans değerleri Çizelge 4.4’de verilmiştir:

Çizelge 4.4 96 Saat Sonunda Okunan Absorbans Değerleri

pH = 7,4 pH= 5,4

Örnek Seyreltme Absorbans Seyreltme Absorbans

CHI 4 kat 0,719 4 kat 0,934

CHI-1%ZIF8 4 kat 0,622 4 kat 0,708

CHI-1%ZIF8/VAN 4 kat 0,469 4 kat 0,487

CHI-5%ZIF8 4 kat 0,019 4 kat 0,028

CHI-5%ZIF8/VAN 4 kat 0,013 4 kat 0,026

CHI-5% ZIF8-CL 4 kat 0,014 4 kat 0,019

CHI-VAN 4 kat 0,134 4 kat 0,288

Kontrol 4 kat 0,706 4 kat 1,080

Hem pH 5,4 hem de 7,4 koşullarında,% 5 ZIF – 8 ve % ZIF8@VAN varlığı kültür koşullarında S.aureus’un büyümesini büyük ölçüde azaltmış ve bakterisit etki göstermiştir. SEM görüntüleri, Şekil 4.13’de kitosan doku iskelelerinde S.aureus’un morfolojisini göstermektedir.

57

Şekil 4.13 Antibakteriyel Aktivite SEM Fotoğrafları

CHI

CHI CHI-1%ZIF8

CHI-1%ZIF8

CHI-1%ZIF8/VAN

CHI-1%ZIF8/VAN CHI-5%ZIF8 CHI-5%ZIF8/VAN CHI-ZIF8_CL/VAN

CHI-5%ZIF8 CHI-5%ZIF8/VAN CHI-ZIF8_CL/VAN

pH= 7.4pH= 5.4

58

ZIF – 8 içermeyen kitosan doku iskeleleri, küresel morfolojili yüksek bir S.aureus popülasyonuyla kaplıdır. % 1 ZIF – 8 varlığında, liflerin yüzeyinde daha az sayıda bakteri görülmesine rağmen, agarlarda çok sayıda canlı koloniler büyümüştür. ZIF – 8 miktarı % 5’e çıkarıldığında, liflerin yüzeyinde daha az bakteri gözlenmiştir. ZIF – 8’e vankomisin yüklenmesi yüzeydeki bakterilerin morfolojisini etkilemiş ve hem CHI-%1ZIF8/VAN hem de CHI-%5ZIF8/VAN doku iskelelerinde küresel bütünlük kaybı gözlenmiştir. Benzer şekilde, CHI-%5ZIF8/VAN-CL doku iskelelerinde de S.aureus morfolojisinde bütünlük kaybı görülmüştür.

ZIF – 8 ve ZIF8@VAN yüklü kitosan doku iskeleleri, S.aureus aktivitesinin azaltılmasında tek başına kitosan doku iskelelerine kıyasla güçlü bir etki göstermiştir.

Bu etki en iyi, iltihaplı bir dokuyu taklit edebilen pH = 5,4’de belirgindir. Doku iskelelerinin asidik koşullarda daha yüksek şişme oranı, yüklenen ZIF – 8 nanokristallerin çözünmesini hızlandırmıştır. Ayrıca, ZIF – 8, asidik ortamda ZIF – 8 ve ZIF8@VAN kristallerinin çözünmesinin bir sonucu olarak Zn⁺² iyonlarını ortama salabilir. Zn⁺² iyonlarının antimikrobiyal aktivitesi, bakteri yüzeyindeki anyonik glikopolimerler gibi negatif yüklü alanların ve pozitif yüklü Zn⁺² atomlarının elektrostatik etkileşimi nedeniyle yüksektir. Bunun dışında, ZIF – 8’in çözünmesinden sonra da salınan metilimidazol ligandlarının, antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu literatürde belirtilmiştir. Kohsari ve arkadaşlarının (2016) gerçekleştirdiği çalışmada kitosan/polietilen oksit matlarına yüklenmiş ZIF – 8 nanopartiküllerinin antibakteriyel aktivitesi, gıda kaplama/paketleme uygulamaları için kullanılmıştır. Ayrıca folik asit ile modifiye edilmiş vankomisin yüklü ZIF – 8 nanopartiküllerinin antibakteriyel aktiviteyi arttırdığı bildirilmiştir.