Doç. Dr. Hilâl Özdağ SANTRİFUGASYON 111-546

(1)

SANTRİFUGASYON

Doç. Dr. Hilâl Özdağ

GÜVENLİ VE ETKİN

LABORATUVAR UYGULAMALARI

111-546

(2)

Santrifugasyon

• Diferansiyel santrifugasyon (peletleme):

– Örnekler belirli bir hızda (g force veya revolution per minute) çevrilerek süpernatan ve pellet olarak ayrışır.

– Sabit veya sallanan rotor kullanılabilir.

• Dansite gradient santrifugasyon:

– Aynı yoğunluğa sahip olan tanecikleri şekil veya boyut olarak farklılaşabilir. Örnek sukroz veya benzeri viskoz bir ortamın gradienti üzerine yerleştirilir. Taneciklerin yoğunluğunun sıvının yoğunluğundan fazla olması nedeni ile tanecikler santrifügasyona bağlı olarak çöker. Ancak santrifugasyonun bütün tanecikler çökmeden durdurulması gerekmektedir.

– Sallanan veya zonal rotor kullanılabilir.

(3)

Santrifugasyon

• Masaüstü Santrifüj: 17000 g/14000 rpm

• Klinik Santrifüj: 4600 g/6000 rpm

• Mikrofüj: 16000 g/13000 rpm

• Yüksek Devirli Santrifüj: 75000 g

• Ultrasantrifüj: 800.000 g/100.000 rpm

• Masaüstü Ultrasantrifüj: 625.000 g/120.000 rpm

(4)

Rotor

• Sabit açılı: Örneği konsantre etmekte (pellet etmekte) kullanılır. En hızlı çalışandır. Pellet tüpün yan duvarına yapışıp sonradan aşağı doğru kaydığı için bir miktar yan duvara sıvaşır.

• Sallanan (horizontal): Genellikle klinik çalışmalarda hücreleri ayırmak için kullanılır.

• Zonal: Büyük ölçekli dansite gradienti hazırlanmasında

kullanılır. Litrelerce solüsyon veya kilolarca hücre veya doku

ayrılmasında kullanılabilir.

(5)

Çalışma Kuralları

• Santrifüj içinde radyoaktif, biyozararlı veya enfeksiyöz malzeme çalışacaksanız kullanacağınız santrifüjün bu işler için kullanılıp kullanılmadığını, bu işler için özel olarak ayrılmış bir cihaz olup olmadığını sorun, öğrenin.

• Tüplerinizi santrifüje dengeli olarak yerleştirin.

• Eğer cihaz yanında bir kullanım listesi varsa bu listeye adınızı yazmadan cihazı kullanmayın. Birçok yüksek devirli ve ultra santrifüj belli bir kullanım saati sonrasında güçten/kapasiteden düşecektir. Cihazın ne kadar kullanıldığının bilinmesi gereklidir.

• Uygun tüpleri kullanın

• Tüplerin ağzını sıkıca kapayın.

• Rotor kapaklarını kapatmayı ihmal etmeyin.

(6)

Çalışma Kuralları

• Tüpleri tepelerinde 1-2 cm boşluk kalacak şekilde doldurun.

• Kırık veya çatlak tüp kullanmayın.

• Soğutmalı santrifüjlerin kapaklarını kondensasyonu ve dolayısıyla uzun süre sonra korozyonu engellemek için kullanım sonrası açık bırakın.

• Örneklerinizi işiniz biter bitmez santrifüjden alın.

(7)

Tüpleri Dengelemek İçin

• Mikrofüj tüpleri: Ağırlığı değil hacmi dengeleyin.

• Ultrasantrifüj tüpleri: Bir beherin darasını alıp tüpleri teker teker tartın.

• Masaüstü veya yüksek devirli santrifüj: Tüpleri karşılıklı

olarak bir terazide dengeleyin.

(8)

Süpernatanı uzaklaştırmak

• Dökmek

– Hızlı

– Aerosol oluşturabilir. Pellet yerinden oynayabilir.

• Aspire etmek

– Pelleti yerinden oynatmaz, aerosol oluşturmaz.

– Büyük hacimler için yavaş bir tekniktir.

(9)

Laboratuarda sağlık ve

güvenlik

(10)

Lab çalışanlarının sağlık ve güvenliklerinin sağlanması

– Gerekenler

• Eğitim

• Gerekli güvenlik ekipmanları

• MSDS

(11)

Genel Kurallar

• Laboratuarlarda yemek, içmek kesinlikle yasaktır. Bu kişinin sağlığı için esastır.

• Açık ayakkabı giyilmez.

• Laboratuarlarda bulunan sürelerde önlük (özellikle bilfiil deney kurarken) giymek esastır. Laboratuar önlüğü yalnızca laboratuar dahilinde giyilebilir.

Ofisler, mutfak, seminer ve toplantı odalarında laboratuar önlüğünün giyilmemesi gerekmektedir.

• Deney yaparken deney eldiveni takılması şarttır.

• Sıcak (mikrodalga çıkışlı) veya soğuk (-80/Nitrojen tank çıkışlı) materyel tutarken izolasyonlu eldiven takılması taviz verilmemesi gereken bir noktadır.

• Deneyler yapılırken bir dökülme sırasında problem yaratabilecek takıların

veya yine aynı durumda ayakları korumasız bırakacak olan üst ve/veya

yanları açık olan terlik/sandalet tipi ayakkabıların giyilmemesi

gerekmektedir.

(12)

Temel hayatta kalma kuralları

• Önceki labımda bunu böyle yapmazdık demeyin.

• Telefon ve fotokopiyi “şahsi amaçlarla” gereğinden fazla kullanmayın.

• Rica edin emretmeyin.

• Dünyanın merkezi değilsiniz. Herkesin deneyi kendisi için öncelikli ve en zorudur. Sizin için kimse işini yarıda bırakmak ve size yardım etmek zorunda değildir.

• Arkadaş veya hocalarınıza birşeyler sormak istediğinizde müsait zamanlarını sorun.

• Laboratuvar sonuçlarınızı ve laboratuvarda yaşananları 3. kişilerle asla

tartışmayın.

(13)

Temel hayatta kalma kuralları

• İzin almadan kimsenin reaktif ve tampon çözeltilerini kullanmayın.

• Eğer ortak kullanılan bir reaktif/çözelti azaldı veya bittiyse sipariş edin veya yeniden hazırlayın.

• Bir cihazın bozulduğunu veya alarm verdiğini farkedersiniz asla gözardı etmeyin.

• Ortak kullanım alanlarında bulunan üzerinde kime ait olduğu belli olan tüplere dokunmayın, sahiplerine haber verin.

• Ortak alanda bıraktığınız ve üzerine ismini/isminizi yazmadığınız çözelti, tüp, reaktif vs’nin akıbetini sorma hakkınız bulunmamaktadır.

• Eğer bir hata yaparsanız bunu telafi etmeye başlamanın en iyi yolu

İTİRAF ETMEKTİR.

(14)

Temel hayatta kalma kuralları

• İşiniz bittikten sonra arkanızı temizleyin. Laboratuvarda peşinizden ANNENİZ koşmaz.

• Arkadaşlarınızdan minimum düzeyde KIYAK istemeye gayret edin.

• Bir cihazın bozulduğunu veya alarm verdiğini farkedersiniz asla gözardı etmeyin.

• Ortak kullanım alanlarında bulunan üzerinde kime ait olduğu belli olan tüplere dokunmayın, sahiplerine haber verin.

• Ortak alanda bıraktığınız ve üzerine ismini/isminizi yazmadığınız çözelti, tüp, reaktif vs’nin akıbetini sorma hakkınız bulunmamaktadır.

• Eğer bir hata yaparsanız bunu telafi etmeye başlamanın en iyi yolu

İTİRAF ETMEKTİR.

(15)

Kişisel koruyucu ekipmanlar

• 1. Göz ve yüz maskeleri

• 2. Önlük

• 3. Eldiven

(16)

Kimyasallar

• Soluma

• Göze temas

• Deriye temas/emilim

• Yutma

(17)

Kimyasallara maruz kalma süreleri

• Akut (kısa bir süre için)

• Kronik (Ay-Yıl)

(18)

Kimyasalların olası zararları

• Zarar uyarıları

• Yanıcı (Flammable)-aseton, etanol, benzen

• Korozif (Corrosive)-amonyak, sodium

hidroksit, glasiyal asetic asit, mineral asitler

• Sıkıştırılmış gazlar (Compressed gases)-Ar, CO

2

, NH

3

anh, N

2

, LN

2

• Zehir (Poison)-kloroform, siyanür tuzları,

fenol, metil izosyanat, cıva klorür, karbon

tetraklorür

(19)

Kimyasalların olası zararları

• Patlayıcı - perklorat tuzları, barium azit, TNT, pikrik asit/pikrat tuzları

• Su ile reaksiyon veren (Water

reactive)-barium, kalsiyum, lityum, sodyum

• Yanıcı/Parlayıcı (Combustible)-fenol, n-

propanol, anilin, benzaldehid

(20)

Kimyasalların olası zararları

• Kanserojen (Carcinogen)-Akrilonitril, asbestos, benzen, karbon tetraklorür, formaldehid, kurşun, PCBs, styrene, EtBr

• Enfeksiyöz (Infectious Substance)-bakteri, virus, parazit

• Oksitleyici (Oxidizer)-nitrik asit, sodyum nitrat, gümüş nitrat, hidrojen peroksit

• Radyoaktif C-14, Kr-74, P-32, U-230

(21)

Material Safety Data Sheets (MSDS) Materyel Güvenlik

Bilgileri Belgesi

1. Kimyasal ürün ve şirket ismi (Chemical Product and Company ID)

2. Yapısı ve bileşenleri hakkında bilgi

(Composition/Information on Ingredient)

(22)

MSDS (devam)

3. Zararların tanımlanması

A. Materyelin tanımlanması ve zararların belirlenmesi.

B. Olası yan etkileri (alım yolları ve kanserojen özellikleri ile beraber)

4. İlk yardım önerileri

(23)

MSDS (devam)

5. Yanıcı özellikleri

A. Flash point-materyelin buharlaştığı ve yanıcı özellik kazandığı en düşük ısı derecesi

B. Kendi kendine yanma/parlama ısısı

C. Alt patlama sınırı-Lower Explosive Limit (LEL) D. Üst patlama sınırı-Upper Explosive Limit (UEL)

6. Kaza sırasında alınması gerekli

tedbirler/Accidental Release Measures—

Dökülme, akıtma durumunda yapılacaklar

(24)

MSDS (devam)

7. Kullanma ve depolama kuralları.

8. Maruz kalmaya karşı alınması gereken önlemler.

9. Fiziksel ve kimyasal özellikleri.

10. Stabilite ve reaktivite

(25)

MSDS (devam)

11. Toksikolojik bilgiler (Hayvanlar üzerine yapılmış testler)

12. Ekolojik bilgiler—çevreye verdiği etki, zararlar

13. Atıklarının uzaklaştırma yolları 14. Taşınma koşulları

15. Diğer bilgiler

(26)

İlk yardım

• İlk yardım eğitimi almış personel

• İlk yardım çantası

(27)

Bir kaza durumunda……

• 1. Durum değerlendirmesi yapılmalı ve

öncelikle kişi kendi güvenliğini düşünmeli.

• 2. Yardım istenmeli. Kazanın nevi ve

ciddiyeti ile ilgili kesin bilgiler verilmeli.

• 3. Yardım gelinceye kadar kaza mahalli

gözlem altında tutulmalı.

(28)

Dökülme/Akıntı durumunda yapılacaklar

• 1. Hazırlıklı olun, panik olmamaya gayret edin.

• 2. Öncelikle kendinizi korumaya alın.

• 3. Olayın hemen yakın çevresinden uzaklaşın.

• 4. Neyin döküldüğünü tespit edin.

• 5. Dökülen maddenin etrafında bulunabilecek hasarı arttıracak maddeleri uzaklaştırın.

• 6. Döküntünün yayılmasını engelleyin.

• 7. Döküntüyü temizleyin.

(29)

Laboratuarda güvenli çalışmayı sağlayacak bazı öneriler

• 1. Deneyinizi planlarken ortaya çıkabilecek tehlikeli durumları

önceden değerlendirin. Bu tehlikeleri en aza indirebilecek şekilde planınızı şekillendirin (Cihazların yerleşimi, çalışma tezgahınızın düzeni).

• 2. Haftasonları ve mesai saatleri sonrası yapacağınız deneylerin böyle riskler taşımamasına özen gösterin. Tercihen yalnız

çalışmayın. Yalnız çalıştığınız durumlarda laboratuarda yalnız

çalıştığınızı ve çalışmaya başladığınız saat ile çalışmayı bitirmeyi planladığınız muhtemel saati bir yakınınıza bildirin.

• 3. Acil durumlarda kullanımı gereken gereçlerin yerlerini ve

kullanımlarını öğrenin. Yangın söndürücüler, göz yıkama istasyonu, duş, telefon ve gerekli telefon numaraları, döküntü temizleme

gereçleri.

• 3. Çalıştığınız maddelerin MSDS’lerini okuyun.

• 4. Güvenlik prosedürlerini öğrenin ve takip edin. (Maske, önlük,

çeker ocak…)

(30)

Laboratuarda güvenli çalışmayı sağlayacak bazı öneriler

• 5. Tehlikeli gördüğünüz faaliyet ve durumları sorumlu kişilere bildirin.

• 6. Zararlı materyelleri kurallara uygun olarak kullanın ve saklayın.

• 7. Eğer bir prosedür veya madde/materyel ile

en küçük bir tereddütünüz bile varsa lütfen

ama lütfen sorun!

(31)

Laboratuarlarımızda özellikle dikkat edilmesi gereken bazı ek

hususlar

• Biyolojik materyel kalıntıları ve kontamine pipet ucu vs sarf malzemeleri sarı atık kutularına atılmalıdır.

• Biyolojik materyel ile kontamine olan cihazlar

(aksi belirtilmedikçe) %10 çamaşır suyu ile

silinmeli, sarf malzemeleri atılmadan önce yine

aynı çözeltide bekletilmelidir.

(32)

Laboratuarlarımızda özellikle dikkat edilmesi gereken bazı ek

hususlar 2

• EtBr’lü jeller ve poliakrilamid jeller laboratuarımızda jel atıkları için ayrılmış çöp kutusu haricindeki bir kutuya kesinlikle atılmamalıdır.

• Bütün cihazların kullanım sonrası uygun prosedürle temizlenmesi şarttır.

• Laboratuardaki özellikle ortak kullanım alanlarının

düzenli ve temiz bırakılması hem genel nezaket

kurallarının hem de laboratuar genel akışının

bozulmaması için önemli bir gerekliliktir.

(33)

Mikrodalga fırınlar jel hazırlanmasında büyük kolaylıklar sağlamakla beraber ciddi tehlikeler

yaratabilecek cihazlar olarak değerlendirilmelidir.

• 1. Mikrodalga fırınlar jel hazırlamada kullanılırken “buz çözme” veya düşük ayarda kullanılmalıdır.

• 2. Jel kabının erlen veya Duran şişe ağzı açık veya kapakları hiçbir

şekilde sıkıştırılmamış olmalıdır. Sheffield üniversitesine 2003 yılında 0.5L’lik bir Duran şişesi içinde agaroz ile başında beklenmeden

bırakılmış fırın içindeki şişenin patlaması ile bütünüyle parçalanmış üzerinde bulunduğu tezgah ve çevresi kullanılmaz hale gelmiştir.

• 3. Metal parçası olan herhangi bir eşya kati suretle mikrodalga fırın içine konulmamalıdır.

• 4. Mikrodalga fırınlar su kaynatmak için kesinlikle kullanılmamalıdır.