ELEKTROFOREZ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
Elektroforez
• Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek ayrıştırılması tekniğine elektroforez denir.
• DNA, RNA ve Protein molekülleri ile yapılan çalışmaların
öncelikle basamakları arasında yer alır.
Temel Kurallar
• Jel tankında işlem yapmadan önce güç kaynağını kapattığınızdan emin olun.
• Yükleme ve yürütme yapmadan önce jelinizin iyice polimerleştiğinden emin olun.
• Neyi hangi sırayla yüklediğinizi hemen kaydedin: Bunun için yüklediğiniz örneklerin tüplerini tüplüğün üzerinde yükleme sırasıyla deney bitip siz bunların sırasını kaydedinceye dek muhafaza edin.
• EtBr veya toz akrilamid kalıntılarına karşı muhakkak eldiven
giyin.
Temel Kurallar
• Jelinizi erittikten sonra EtBr ekleyin. EtBr eklenmiş jel solüsyonunu eritip kaynatmayın.
• Kullanılmış jelinizi jel tankının içinde bırakmayın.
• Kullanılmış jelleri jel atık çöpüne atın.
• Jel tankının içindeki tampon çözelti defalarca kullanılabilir. Ancak bu tamponun kullanım sıklığına bağlı olarak birkaç günde bir boşaltılıp karıştırılması ve buharlaşan kısmı kadarının taze tamponla doldurulması gerekir.
• Jel tankının en az haftada bir boşaltılıp yıkanması ve distile sudan geçirilmesi tankın platin tellerinin uzun ömürlü olması açısından gereklidir.
Zira yıkanmadığı takdirde zaman içinde tamponun için tuz platin teller
üzerinde birikecektir.
Temel Kurallar
• Jelinizi yürütmeye başlamadan önce kutupların doğru bağlandığından emin olun.
• En doğrusu jeli yürütmeye başladıktan sonra 0.5-1
dak bekleyip yürümenin doğru yönde olduğundan, akımın
geçtiğinden emin olmaktır.
Örnek hazırlama
• Örnekler yükleme solüsyonu ile jele yüklenirler.
• Yükleme solüsyonunun içinde örneğin kuyulara oturmasını sağlayan ağır bir molekül (sukroz, ficoll, gliserol) ile yürümeyi takip etmeyi mümkün kılan indikatör bir boya (BFB, XC) bulunur.
• Yükleme solüsyonu uzun dönem için -20
oC’de bölünerek saklanmalıdır.
• Kullanımdaki yükleme solüsyonu oda ısısında kararlılığını uzun süre
muhafaza edecektir.
Standartlar/Belirteçler
• Moleküler ağırlık belirteçleri muhakkak jele dahil edilmelidir.
• Bunların jele yüklenmesi hem jelin ve elektroforezin kalitesini standardize edecek hem de örneklerin yorumlanmasını mümkün kılacaktır.
• Yüklenecek belirteç analiz edilecek örneklere uygun olarak seçilmelidir.
• Moleküler ağırlık belirtecinin yürüme profili belirtecin kullanım kılavuzundan alınarak lab defterine, jel dokümantasyon sisteminin yanına konmalı, gerektiğinde kolayca kontrol edilebilmelidir.
• Gerektiğinde ve mümkün olduğunda jele pozitif ve negatif
kontroller yüklenmelidir.
Elektroforez Tipleri
• Agaroz jeller genellikle yatay iken akrilamid jeller dikey olarak yürütülür.
• Jeller farklı ebatta olabilir. Dizileme jelleri büyük olmak zorundadır ancak tarama ve transfer için kullanılan jeller mini veya midi boyutta tercih edilir.
• Kapiller elektroforezde ince kapillerler için DNA, RNA,
proteinleri otomatik olarak yüksek verimde ayrıştırılırlar. Ayrışma
kromatografide olduğu gibi tespit ve analizle beraber gerçekleşir.
Jel Tipleri
• Agaroz ve akrilamid her ikisi de porlu yapıdadır. Yüzdeleri ne kadar yüksekse por çapı o kadar küçülür. Gerekli ayarlamalar yapıldığında her ikisinde de DNA, RNA ve Protein incelenebilir.
• Düşük konsantrasyondaki akrilamid jelleri manipüle etmek zordur.
Düşük konsantrasyondaki agaroz jellerin manipülasyonu daha kolaydır.
• Jel konsantrasyonunun ilgilenilen fragmentin boyutuna uygun olması gerekir.
• Önceden dökülmüş hazır akrilamid jeller birçok firma tarafından
üretilmektedir. Bu jeller buzdolabında aylarca bozulmadan
kalabilir.
Yürütme Tamponları
• Yürütme tamponları konsantre olarak (5X veya 10X) hazırlanır.
0.5X veya 1X konsantrasyonda kullanılır.
• Her tamponun belirli bir amperde belirli bir voltajı vardır.
Kullandığınız tamponun özelliklerini farkedin, öğrenin ki problem
oluştuğunda teşhis edin.
Güç Kaynağı
• Güç kaynağının çıkışı sabit voltaj (mV), sabit akım (amps) veya sabit güç (W) şeklinde olabilir. Birçok güç kaynağı modelinde bu modlar arasında otomatik değişimler mümkündür.
• Her güç kaynağı sizin için uygun olmayabilir. Deneyiniz için gerekli olan amper veya voltu öğrenin ve buna uygun güç kaynağını seçin.
• Dizileme jelleri yüksek wattlı, elektroforetik transferler yüksek akımlı ve agaroz veya akrilamid jel elektroforezleri geniş voltaj aralıklı güç kaynaklarına ihtiyaç duyar.
• DNA, RNA ve protein jellerinde örnekler eksiden artıya yürürler.
Eksi (katod) siyaha, artı (anod) kırmızıya bağlanmalıdır.
Güç Kaynağı
• Güç kaynağının zaman ayarı varsa mutlaka kullanın yoksa jelinizi yürütmeye başladıktan sonra kronometrenizi ayarlayın. Özellikle küçük fragmentleri unutup fazla yürütüp jelden kaybetmeniz mümkündür.
• Güç kaynağını kapatmadan jel tankına müdahale etmeyin!
Fiksasyon
• Boyanacak jellerin boyamadan önce fikse edilmesi gerekmekdir.
• Fiksasyon jellerin şişmesini engellediği gibi örneklerin
denatürasyonunda da etkindir.
Kurutma
• Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
• Otoradyografide daha keskin bant verir.
• Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
Kurutma
• Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
• Otoradyografide daha keskin bant verir.
• Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
Boyama
• Agaroz jel içine EtBr eklenerek DNA ve RNA jellerinin boyanması sağlanır.
• DNA yürütülen poliakrilamid jelleri yürütme sonrasında jelin ebadına göre EtBR veya gümüş nitrat ile boyanır.
• Protein jelleri de elektroforez sonrası gümüş nitrat veya coomasie
mavisi ile boyanır.
Belgeleme
• Poloroid fotoğraf
• Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir.
• Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine
alınabilir.
Belgeleme
• Poloroid fotoğraf
• Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir.
• Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine
alınabilir.
DNA Jelleri
http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/gelel.GIF