DNA Dizileme Yöntemleri
Dizi analizleri; homolog dizileri, dizi farklılıklarını, dizinin moleküler yapısını, evrimi ve organizmaların genetik çeşitliliğini tanımlamamızda yardımcı olur. Genom, bir organizmanın yaşamı için gerekli olan tüm proteinlerin genetik kodunu taşır. Biyolojik sekanslar, birbirine benzer modeller gösterir. Bu modeller, sekanslar arasında benzerlik aranarak belirlenebilir. Bunun için, bir organizmanın tüm genomik dizisini bilmemiz gerekmektedir. Biyoinformatik araçlarla birlikte dizileme teknolojilerinin icadı, bir organizma genomunun analiz edilmesinde büyük rol oynamıştır. Genomun dizilenmesi, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) ve kopya sayısı varyasyonları (CNV'ler) gibi mutasyonları saptamanın bir yöntemidir. Nükleotitlerin sırası, RNA'nın oluşumu ve genetik bilginin yapısal proteinlere dönüştürülmesi için oldukça önemlidir.
Frederick Sanger tarafından geliştirilen Sanger dizileme, yaklaşık 5375 nükleotitten oluşan Bakteriyofaj phi X 174'ün sekanslanmasını sağlamıştır. Bu faj, 1977 yılında dizilenen ilk genom oldu. 2005 yılında Roche'un 454 tarafından çok yüksek verimlilikte ve ilk sekanslama teknolojilerinden çok daha düşük maliyetle “yeni nesil sekanslama (NGS) teknolojileri” olarak tanımlanan yeni sekanslama yöntemi dönemi başlatıldı.
NGS'nin temel özelliği, aynı anda birkaç bin diziyi sekanslayabilmesidir. Bu yüksek verimli sekanslayıcılar, DNA dizileme maliyetini büyük ölçüde azaltmıştır.
Maxam-Gilbert Dizileme
Maxam-Gilbert sekanslama, en eski DNA sekanslama yöntemlerinden biridir. Bu sekanslama yöntemi kimyasal bölünme (yıkılma) yöntemi olarak da bilinir. Yöntem;
1977 yılında Harvard Üniversitesi'nde öğrenci olan Walter Gilbert'ın , DNA'da nükleotite özgü kısmi kimyasal modifikasyonlara ve DNA'nın omurgasında modifiye edilmiş nükleotitlerin yakınındaki yıkılmalara dayanır. Maxam-Gilbert sekanslamanın ilkesi, dimetil sülfat ile pürin (A ve G) ve hidrazin ile pirimidin (C ve T) reaksiyonlarının sonucunda bazların yer değiştirmesine dayanmaktadır. Yer değiştirme, azotlu baz ile deoksiriboz şeker arasındaki glikozidik bağın kırılmasıyla oluşur. Baz yer değiştirme bölgelerindeki piperidin, fosfodiester bağının yıkılmasını katalizler. Yöntemin temel amacı, bir dizi reaksiyon yoluyla 5' ucunda radyoaktif bir etikete sahip tek iplikli bir DNA oluşturmaktır. DNA'nın iki ipliği, tek ipliğe ayrılır ve ardından ipliğin 5’ ucuna gama-32P ile radyoaktif işaretleme yapılır ve daha sonra kimyasal olarak yıkılır. Pürinidin ve iki kimyasal (dimetil sülfat ve hidrazin içeren), pürin ve pirimidinlere seçici olarak saldıran
spesifik koşullarda iki aşamalı bir biyokatalitik prosedür içerir. Hem dimetil sülfat hem de piperidin, guanin nükleotitlerini spesifik olarak ayırmasına rağmen formik asit içindeki dimetil sülfat ve piperidin, hem guanin hem de adenini ayırır. Hidrazin ve piperidin hem timini hem de sitozin nükleotitlerini ayırır. Bu sayede 3’ ucunda spesifik nükleotidlere sahip bir dizi etiketli DNA fragmanı üretilir. Reaksiyon ürünleri, büyüklüğe dayanan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile bölünür. En küçük parça en hızlı gider. Jeldeki etiketli fragmanlar otoradyografi ile görselleştirilir.
Sanger Dizileme
DNA sekanslamasında dideoksi yönteminin geliştirilmesi, moleküler biyolojinin geleceği için atılmış önemli bir adımdır. DNA diziliminin dideoksi yöntemi, Sanger ve meslektaşları tarafından 1977'de geliştirildi. Sanger’in dideoksi yöntemine ayrıca zincir sonlandırma yöntemi de denmektedir. Zincir sonlandırma yöntemi, normal nükleotidin 2,3′-dideoksinükleosid trifosfatların (ddNTP'ler) analoğunun kullanılmasını içerir.
Bunlar 3'-OH uçları olmayan zincir sonlandırıcı nükleotitlerdir. Bu yöntemde tek iplikli DNA kullanılır. Bu yöntem, zincir uzamasını durdurmak için ddNTP'lerin uzanan bir DNA zincirine dahil edilmesine dayanmaktadır. Kimyasal reaksiyon dört ayrı reaksiyon tüpünde gerçekleştirilir, her reaksiyon kalıp DNA primerleri, DNA polimeraz ve radyoaktif etiketli dört dNTP içerir (bantların tespiti için kullanılan radyoaktif etiketli ddATP'ler). Ayrıca her reaksiyon tüpüne spesifik derişimde dört ddNTP'den (ddATP, ddCTP, ddGTP veya ddTTP) sadece biri eklenmiştir. Çift zincirin denatürasyonu ve primerlerin bağlanması (annealing) ile DNA polimeraz enzimi yeni sentezlenen DNA zincirine dNTP'ler eklemeye başlar fakat ddNTP dahil edilirse reaksiyon sona erer. Bu, dört farklı reaksiyon tüpünde farklı boyutlarda DNA ipliklerinin ayrı toplanmasına yol açar. Reaksiyon, daha sonra üre içeren ayrı bir poliakrilamid jel kuyucuklarına yerleştirilir. Üre, DNA bantlarının pozisyonlarını otoradyografi ile tespit edilmesine ve işlem sırasında DNA renatürasyonunun (eski haline gelmek) önlenmesine yardımcı olur. Radyoaktif ışıma, ddNTP'nin spesifik pozisyona dahil olduğu DNA fragmanlarını gösterir. Ayırma jelindeki nükleotit dizisi, aşağıdan yukarıya doğru belirlenir ve farklı terminatör (uç) şeritlerdeki bantların nükleotit sekansı, kalıp nükleotitin sekansını verir.
Dört reaksiyon tamamlandığında, jel elektroforezi SDS-PAGE ile gerçekleştirilir. Tüm reaksiyon karışımları, toplam dört zincir üretmek için bir şeride yüklenir. Elektroforezde elde edilen sonuçlar bir polimer tabakasına aktarılır ve x-ışını otoradyografisine maruz
bırakılır. Bu bize tam olarak radyoaktif olarak etiketlenmiş parçaların pozisyonunu söyler. Parça ne kadar küçükse o kadar uzağa gider. Bu nedenle, en uzak parça 5' ucu DNA bazı olacaktır. Parçanın boyutuna bağlı olarak, tamamlayıcı dizinin DNA dizisi oluşturulabilir ve bu daha sonra orijinal DNA dizisini dizmek için kullanılabilir.
Otomatik DNA Dizileme
1986'da Leroy Hood ve arkadaşları, radyoaktif etiketler yerine floresan etiketler kullanarak Sanger dizileme yöntemini daha da geliştirdi. Dört floresan boyadan biri, nükleotit primerlerini etiketlemek için kullanılır. Her boya ayrı bir sekans içine yerleştirilir ve dört ddNTP'den biriyle reaksiyon verir. Sekanslama reaksiyonlarının tamamlanması üzerine, dört reaksiyonun hepsi karıştırılır ve bir poliakrilamid jelin bir şeridinde birlikte analiz edilir. Daha sonra James M. Prober ve arkadaşları, floresan etiketli primerlerin yerine ddNTP'leri etiketlediler. Dört farklı floresans etiketli ddNTP kullanımı dört farklı dalga boyu, dört ayrı reaksiyon yerine tek bir tüpte sekanslama reaksiyonuna izin verir. Bu yöntem 1990'ların başında daha da geliştirildi. Harold Swerdlow ve arkadaşları, DNA dizileme yönteminde kılcal damarları kullandılar. Bu kılcal damarlar oldukça küçüktür ve dizileme süresini azaltmak için çok daha yüksek voltajlarla çalışır. Otomatik dizileme Sanger sekanslamasına benzerdir ancak reaksiyon otomatik olarak yapılır. Reaksiyonlar, her biri dört farklı floresan boya ile kaplanmış ve dört ddNTP’nin hepsine sahip tek bir tüp içinde gerçekleştirilir. Floresan boyaların her biri belli bir dalga boyunda ışık yayar. Oluşturulan sekans verileri bilgisayar kullanılarak analiz edilir. Otomatik DNA sekanslayıcılarında, dizileme reaksiyonu, tek bir reaksiyon halinde gerçekleştirilir. Dizileme reaksiyonunda boya, sonlandırıcı reaksiyonundan sonra kılcala yüklenir. Fragmanlar, kılcal damarda uygulanan sabit elektrik akımına bağlı olarak ayrılır. Floresan etiketli ddNTP’ler lazer içinden geçtiğinde ışıma yayar. Floresan dalga boyları, dedektör tarafından toplanır ve sekans verileri yazılım kullanılarak üretilir.
Pirodizileme
Pirodizileme işlemi, enzimatik bir kaskat kullanılarak fosfatlardan ışık üretilmesini içerir.
Bu ışık, bir polimeraz kalıp DNA'yı çoğaltırken ve DNA'nın doğru şekilde dizilişinde salınır. Kalıp DNA reaksiyonda sabitlenir. A, T, G ve C nükleotidleri art arda eklenir ve
çıkarılır. Reaksiyon; DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz, lusiferin ve adenozin 5- fosfosülfat (APS) ve apiraz enzimi gibi kimyasallar kullanılarak katalizlenir. Primer, kalıp DNA'ya bağlandıktan sonra, DNA polimeraz, kalıp iplik üzerine tamamlayıcı nükleotitlerden birini ekler ve pirofosfatı (PPi) salar. Reaksiyonda bulunan ATP sülfürilaz, APS varlığında PPi'yi ATP'ye dönüştürülür. Üretilen ATP, lusiferazı substratlaştırır ve lusiferini kamera tarafından yakalanabilecek ışık üreten oksilusiferine dönüştürür. Nükleotitler ve ATP, apiraz enzimiyle yıkıldıktan sonra reaksiyonlar başka bir nükleotit ile başlar. Her nükleotit sırayla eklenir, böylece dördünden sadece biri bir ışık sinyali üretilir sonunda yakalanır ve kaydedilir.
Pirodizilemenin okunmasına pirogram denir. Bu teknik, mikroorganizmaların ve SNP’lerin (tek nükleotit polimorfizmi) genotiplemesinde oldukça faydalıdır.
Illumina / Solexa Dizileme
Solexa yönteminde, geri dönüşümlü floresan terminatör kimyası kullanılır. İlk Solexa dizileyicisi (Genome Analyzer) 2006 yılında piyasaya sürüldü. Tek bir çalışmada 1 Gb (gigabaz) dizilenebilir. 2007 yılında Illumina, Solexa'yı satın almıştır. Solexa teknolojisindeki ana adımlar şunlardır: (1) DNA sekanslama kütüphanesi hazırlama, (2) örnekleri akış hücresi kanallarına ekleme, (3) köprü amplifikasyonu, (4) küme üretimi ve (5) sentez yoluyla dizileme. DNA sekanslama kütüphanesi hazırlığı için uzun DNA’lar, ultrasonikleştirme ile rastgele parçalanır; fragmanlar küt uçludur ve adaptör her iki uça bağlanmıştır. Adaptörle bağlanmış fragmanlar 250-350 bp'lik bir uzunluk oluşturmak için seçilir ve jel analizi ile doğrulanan verimi arttırmak amacıyla 10-15 döngü PCR'ye tabi tutulur. İstenen fragman büyüklükleri izole edilir ve DNA sekanslama kütüphanesinin kaynağı olarak kullanılır. dsDNA (çift zincirli DNA) fragmanları denatüre edilir ve akış hücresi kanallarına eklenir. Akış hücresi kanalları, adaptörlerle hibritlenir. Tek iplikçikli fragmanları, immobilize edilen yüzeye sabitlenmiş oligonükleotid primerleri içerir. Bir sonraki adım küme üretmektir. İlk olarak, immobilize edilmiş fragmanları standart PCR amplifikasyonuna tabi tutulur böylece orijinal fragmanın birçok kopyası sıkı bir kümede üretilir. Kümedeki çift sarmallı PCR ürünleri denatüre edilir ve orijinal sarmallar (amplifikasyon için şablon sağlayan yüzeye tutturulmuş primerlere hibridize edilir) yüzeye tutturulmuş olan yeni sentezlenmiş sarmallar bırakılarak yıkanır. En yakın yüzeyde sabitlenmiş primerler, köprü benzeri bir görünüm oluşturur. PCR karışımındaki polimeraz, melezleştirilmiş primeri uzatır ve iki
katmanlı bir köprü oluşturur. Bu PCR amplifikasyonu işlemine köprü amplifikasyonu denir. Ardından köprü denatüre edilir her biri yüzey bağlantılı olan iki tek iplikçikli molekül elde edilir. Köprü amplifikasyon PCR döngüleri, çoğaltılan tek iplikçikli ürünlerin yoğun kümelerini elde etmek için tekrarlanır. Bu şekilde, akış hücresinin her kanalında birkaç milyon yoğun küme elde edilir. Bu başlangıç kümeleri hem ileri hem de geri iplikçik kümelerine sahiptir. Daha sonra, ters zincirler yıkılır ve ileri zincir kümeleri bırakarak yıkanır. Zincirler daha sonra sekanslama primerleri kullanılarak dizilenir. İlk sekanslama döngüsü, floresan olarak etiketlenmiş dört ters çevrilebilir terminatör tabanının (her baz farklı bir florofor içerir), sekanslama primerlerinin ve DNA polimerazın akış hücresine eklenmesiyle başlatılır. Polimeraz sadece tek bir baz uzantısı yapabilir; böylece sadece kalıp ipliğe tamamlayıcı baz eklenir ve ilave edilen tabanın bloke edilmiş 3’-OH ucu nedeniyle uzama durdurulur. Daha sonra, birleştirilmemiş bazlar çıkarılır ve eklenen baz lazere maruz bırakılır. Lazer uyarımınından sonra yayılan floresan bir CCD kamera tarafından yakalanır. Böylece, ilk baz görüntülenmiş olur. Her parçanın ilk bazı benzer şekilde kaydedilir ve görüntülenir. Daha sonra, birinci bazın floroforu ve terminal 3’-OH uç bloğu kimyasal olarak çıkarılır böylece ikinci devir gerçekleşir. Benzer şekilde, eklenen ikinci baz tüm fragmanlar için görüntülenir. Her bir parçadaki bazların sırasını, her seferinde bir baz belirlemek için döngü tekrarlanır. Dizi, bir referans genomu (referans düzeneği) kullanılarak bilgisayar yazılımı ile birleştirilir. Referans genom yoksa ve sekans yeni ise, sekans montajı de novo montaj yöntemiyle yapılır.
Ligasyon Yoluyla Dizileme: ABI/SOLID
ABI/SOLID sekanslama teknolojisi, sekanslama için DNA polimeraz yerine DNA ligazı uygular. Genom rastgele parçalanmaya uğrar ve daha sonra adaptör molekülüne bağlanır. Ardından klonal çoğaltma için ortama manyetik boncuklar eklenir, böylece manyetik boncuk yüzeyinde sadece bir DNA parçası bulundurur. Emülsiyon PCR, boncukta yakalanan DNA moleküllerinin çoğaltılmasında kullanılır. Çoğalan bu yakalanmış DNA, bir cama tutturulur ve floresan etiketli oligonükleotitlerle taşınır.
Oligonükleotid kalıbı tamamlayıcı bağlanır ve daha sonra bir seferde iki baz tespit edilir.
Sonra oligonükleotid ayrılır. Örnekten bir DNA kütüphanesi hazırlanır ve bir klonal boncuk popülasyonunun hazırlanmasında kullanılır. Tek tek manyetik boncukların yüzeyinde sadece bir DNA parçası tutulur. P1 adaptörü her parçanın başlangıç dizisine
bağlanır. PCR için tüm gerekli reaktifi içeren bir mikro reaktörde, bir emülsiyon PCR gerçekleşir. PCR'den kaynaklanan taneye tutturulmuş ürünler daha sonra bir cam lama bağlanır. Primerler, kütüphane kalıbı içindeki P1 adaptör dizisini hibridize eder. Dört floresan etiketli di-baz prob seti, sekanslama primerine ligasyon için rekabet eder. Her ligasyon reaksiyonunda her birinci ve ikinci bazın sorgulanması, di-baz probunu belirler. Birden fazla ligasyon, saptama ve yıkılma döngüsü, nihai okuma uzunluğunu belirleyen döngü sayısı ile gerçekleştirilir. Birden fazla ligasyon döngüsü turundan sonra genişletilmiş ürün çıkarılır ve bu kalıp, ligasyon döngüsünün ikinci turu için n -1 pozisyonuna karşılık gelen primerler ile tekrar ayarlanır. Dizi etiketi için yaklaşık beş tur primer sıfırlama deneyi yapılır. Bu primer sıfırlama işlemi sırasında her nükleotit bazı, iki farklı primer seti ile iki farklı bağımsız ligasyon reaksiyonunda incelenir.
İyon Torrent Dizileme
Bu dizileme teknolojisi, Şubat 2010'da Ion Torrent Systems Inc. tarafından geliştirilip ticarileştirilmiştir. İyon Torren dizileme yöntemi, polimerizasyon sırasında kalıp ipliğinde nükleotit ilavelerinin yan ürünleri olan H2 iyonlarının saptanmasına dayanmaktadır. Zenginleştirilmiş DNA içeren boncuklar çipteki bir mikro kuyucuğa kalıp olarak eklenir. Mikro kuyucuk, tek seferde tek tip nükleotid ekler. Tamamlayıcı nükleotitler, büyüyen DNA zin cirine dahil edilir. DNA'nın dizilenmesi, kimyasal bilgileri yakalayabilen ve bunları dijital bilgiye çevirebilen milyonlarca kuyucuğa sahip bir yarı iletken çip kullanılarak yapılır. DNA örneği parçalanır. Ardından her bir parça, bir boncuğa tutturulur ve boncuğu klonal amplifikasyon ile çoğaltılır. Bu otomatik işlem, milyonlarca farklı parçaya sahip milyonlarca boncuğu kapsar. Boncuklar daha sonra her biri bir kuyudaki çip boyunca akar. Yarı iletken çip üzerindeki her mikrokuyu sıralı ssDNA moleküllerine sayısız kopya barındırır. Çip daha sonra değiştirilmemiş dNTP’yi su altında bırakır. Tamamlayıcı nükleotitler, DNA polimerazı tarafından büyüyen şerit içine dahil edilir. Bununla birlikte, tamamlayıcı olmayan iplik bulunduğunda nükleotid birleşimi olmayacaktır. Bir dNTP, tek bir DNA şeridine dahil edildiğinde, bir hidrojen iyonu salınır. H2 iyonunun salımı, her oyuktaki çözeltinin pH'ında değişikliklere neden olur. Bir nükleotidin dahil edilmesinde voltajdaki karakteristik değişiklikler kaydedilir.
Polonator Dizileme
Ligasyon temelli bu dizileme yöntemi, Dover tarafından geliştirilmiştir. Yüksek performansa ek olarak; DNA dizilemesi için ucuz, uygun fiyatlı bir araç olarak popüler hale gelmiştir. Sistem ücretsiz olarak indirilebilen açık kaynaklı yazılım ve protokoller kullanmaktadır. Polonator, ligasyon algılama sekansına dayanarak çift bazlı bir prob kullanan SOLiD'den farklı olarak azotlu bazı tek bir baz probu ile tanımlar.
Nonanükleotidler veya nonamerler olarak bilinen tek baz problarına sahip nükleotitler bir florofor ile etiketlenir. Genomik DNA, çift etiketli shotgun kütüphanesini için birçok parçaya kesilir. Emülsiyon PCR kullanılarak, kalıpların klonal amplifikasyonu, poloniler olarak adlandırılan taneciklere bağlanmış on binlerce kopya oluşturur. Bunu, kendilerine bağlı bu tür yükseltilmiş kalıplara sahip boncukların zenginleştirmesi takip eder. Bu tür taneciklerin akış hücresine yerleştirilmesinden sonra, Polonator, siklik sekanslama dizisi teknolojisi kullanılarak paralel olarak milyonlarca kısa okuma üretmek için kullanılır.
Nanopor Dizileme
Nanopor dizileme yöntemi, bir zar boyunca gözenekli bir kanal oluşturan transmembran proteinlere dayanmaktadır. Nanopor dizileme sistemi, yüksek elektrik direncine sahip bir polimer zar içine yerleştirilmiş biyolojik nanoporlardan (a-hemolizin veya Mycobacterium smegmatis porin A) veya katı hal nanoporlarından (Si3N4 ve Si02 nanoporları) oluşur. İyonik akım geçirilerek membran boyunca voltaj korunur. Bir analit gözenekten geçtiğinde, akım kesilir ve bozulma spesifik molekülü tanımlamak için kullanılır. Analiz edilecek DNA örneği bozulmadan tutulur ve bir enzimle karıştırılır.
DNA enzim kompleksi nanopora yaklaşır, tek iplikçikli DNA açıklıktan girer ve enzim DNA iplikçiklerini her seferinde bir bazla kilitlenir. Nükleotitlerin nanopor yoluyla işlenmesi, elektrik akışında karakteristik bozulmalar yaratır. Bu nedenle üretilen sinyal, bazların sırasını belirlemek için kullanılır.
Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı (SMRT) Dizileme
Tek moleküllü gerçek zamanlı sekanslama, DNA'nın uzun okunan dizileri için kullanılan ve gerçek zamanlı olarak tek molekülün DNA sekansının belirlenmesini sağlayan bir yöntemdir. Dizilemenin prensibi; sentezle sekanslamanın, diğer sekanslama tekniklerinden oldukça farklı olmasıdır. Tespit için tek bir molekül kullanır bu nedenle amplikon kütüphanesini hazırlamak için herhangi bir çoğaltma adımı gerekmez. SMRT
teknolojisi, sıfır modlu dalga kılavuzu (ZMW) olarak adlandırılan teknolojiyi kullanır. Bir ZMW, bir cam substrat üzerinde biriktirilmiş 100 nm metal bir filmde üretilen, onlarca nanometre çapında bir deliktir. Aktif bir polimeraz, her ZMW odasının dibinde hareketsizleştirilir. Çok küçük olan ZMW, görünür lazer ışığının tamamen içinden geçmesini önler ve lazer ZMW'ye girdikçe katlanarak bozulur. Bu özellik nedeniyle, camdan ZMW'ye geçen bir lazer sadece ZMW odasının 30 nm'sini aydınlatır.
Nükleotidlerin ZMW odasına yayılmasına izin verilir; her baz farklı bir floresan boya ile etiketlenir. Eklenen baz, nanoodanın aydınlatılmış bölümünde meydana gelen floresan emisyonuna dayanarak tanınabilir. Tek bir DNA molekülünün sentezi, doğrudan kaydedilir. Bu yöntemde, aynı DNA molekülü dairesel bir DNA kalıbı olarak yaratılarak veya yeni sentezlenen DNA zincirini kalıptan ayırarak yeniden oluşturulabilir. PacBio RS platformunda ortalama okuma uzunluğu yaklaşık 3000 bazdır ve çalışma süresi yaklaşık 20 dakikadır. Doğrudan tekli DNA moleküllerini görüntülemek için transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ve nanopore bazlı tek moleküllü bir sekanslama yaklaşımı gibi diğer çeşitli yaklaşımlarla test edilmektedir.
REFERANSLAR
Shaik, N. Ahmad, Hakeem, K. Rehman, Banaganapalli, B., & Elango, R. 2019.
Essentials of Bioinformatics, Volume I: Understanding Bioinformatics: Genes to Proteins. 1st ed.
Choudhuri, S. (2014). Bioinformatics for Beginners: Genes, genomes, molecular evolution, databases and analytical tools.
Keith, J. M. (2017). Bioinformatics: Volume 1. Totowa, NJ: Humana Press.
