3
KROMATOGRAFİ
Bir karışımdaki bileşenlerin birbirlerinden ayrılarak tanımlanması işlemine kimyasal analiz denir.
Kimyasal analizler; çeşitli kimyasal, spektroskopik ve kromatografik analiz yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Herhangi bir karışımda birden fazla bileşen olabilmektedir. Bu bileşenlerin her birinin kendi fiziksel ve kimyasal özelliklerinden kaynaklanan farklı davranışları vardır. Bir Kromatografi; iki fazlı bir sistemde, bir karışımı oluşturan bileşenlerin kendilerine özgü fiziksel ve kimyasal özelliklerinden faydalanarak ayrılıp, tanımlanması olarak bilinir. Kromatografide, bir kolon içerisine veya düz bir yüzeye tutturulmuş faza, sabit faz (hareketsiz faz; durgun faz; stasyoner faz), sabit fazın üzerinden veya arasından geçen faza ise hareketli faz (sürükleyici faz; mobil faz) adı verilir.
Kromatografik analiz yöntemleriyle, bir karışımın niteliği (karışımı oluşturan türlerin ayrı ayrı saptanması) ve niceliği (karışımı oluşturan bileşenlerin miktarları) hakkında bilgi edinilmesine yardımcı olan sırasıyla nitel (kalitatif) ve nicel (kantitatif) analizler yapılabilir.
Günümüzde endüstride ve araştırma laboratuarlarında çeşitli analizler için birçok kromatografik yöntem uygulanmaktadır. Bu uygulama alanlarına birkaç örnek verecek olursak; tarım endüstrisinde ürünler üzerindeki pestisit (tarım zararlılarının öldürülmesinde kullanılan kimyasallar) türlerinin ve miktarlarının belirlenmesinde, ilaç endüstrisinde ilaç bileşenlerinin analizinde, çeşitli araştırma laboratuarlarında üretilen malzemenin içeriğinin ve etkinliğinin belirlenmesinde, kriminal laboratuarlarında vücut sıvılarından uyuşturucu analizinde ve parmak izi analizinde kromatografik yöntemlerden sıklıkla yararlanılmaktadır.
Analizde etkin olan mekanizmalara göre çeşitli kromatografik yöntemler geliştirilmiştir. Birbirlerinden farklı yöntemler olsalar da kromatografik yöntemlerde genellikle ayrımı yapılacak karışım; bir hareketli ve bir de sabit faz ile etkileştirilerek bileşenlerine ayrılır. Bu nedenle kromatografi kısaca, sabit ve hareketli fazların yarışı olarak özetlenebilir. Bu yarışta, sabit faza konulan karışım; üzerinden hareketli faz geçirilirken, bu iki faz ile farklı şekil ve miktarlarda fiziksel ve kimyasal etkileşimlere girer.
Bu etkileşimler sonucunda karışımdaki bileşenler, hareketli faz tarafından sürüklenirken sabit faz tarafından tutulmaya çalışılır, böylece karışımdaki bileşenler sabit fazı farklı sürelerde terk ederler ve böylece karışımdaki bileşenler birbirinden ayrılmış olur.
Kromatografide Etkin Olan Mekanizmalar
Kromatografik analizlerde incelenecek karışım ile, hareketli ve sabit fazın etkileşimlerinde etkin olan çeşitli mekanizmalar vardır. Bunlar;
1. Adsorpsiyon mekanizması, 2. Partisyon (dağılma) mekanizması, 3. İyon değişim mekanizması, 4. Jel geçirgenliği mekanizmasıdır.
1. Adsorpsiyon Mekanizması: Adsorpsiyonun sözcük anlamı “yüzeyde tutunma” dır. Bu kromatografi mekanizmasında sabit faz aktif yüzeyli bir katıdır. Katılar yüzey enerjilerini azaltmak amacıyla
çevrelerindeki maddeleri kendilerine doğru çekerler ve bunları yüzeylerinde tutarlar. Bu tür kromatografide karışımın bileşenlerine ayrılması, sabit katı fazın tutucu kuvvetiyle, hareketli fazın itici kuvveti arasındaki yarışa bağlıdır. Sabit faz yüzeyine az tutunan bileşen, hareketli fazla daha çok etkileşeceğinden kolonu daha önce terk edecektir. Diğer yandan sabit faz ile çok etkileşen bir bileşen ise katı yüzeyine daha kuvvetlice tutunarak hareketli faz tarafından daha az sürüklenecek ve kolonu daha geç terk edecektir. şeker, nişasta, selüloz, kalsiyum karbonat, magnezyum sülfat, silikajel ve kil gibi birçok madde adsorban katı faz olarak kullanılabilmektedir.
2. Partisyon (Dağılma) Mekanizması: Her madde, fiziksel ve kimyasal özelliklerine, yapısında bulundurduğu fonksiyonel gruplara göre farklı çözünürlüğe sahiptir. Partisyon mekanizmasında; bir karışımdaki bileşenler, birden fazla çözücüdeki çözünürlük farklarına göre ayrılırlar. İki fazlı bir çözücü sistemine enjekte edilen karışımdaki bileşenler, çözünürlüklerine göre bu iki fazda dağılırlar ve ayrımları gerçekleştirilir. Bu mekanizmanın etkin olduğu kromatografik yöntemlerde; sabit faz genellikle hidrofilik (suyu seven), hareketli faz ise hidrofobik (suyu sevmeyen) dir.
3. İyon Değişim Mekanizması: İyon değişimi; sabit fazın yüzeyinde kimyasal bağlarla bağlanmış yüklü grupların, hareketli faz ile sürüklenen karışımda bulunan ve kendileriyle benzer yüke sahip gruplarla yer değiştirmesi üzerine kurulmuş bir mekanizmadır. Şehir kullanım sularının temizlenmesinde ve yumuşatılmasında bu kromatografi mekanizması etkin bir şekilde kullanılmaktadır.
4. Jel Geçirgenliği Mekanizması: Jel geçirgenliği mekanizması ile karışımdaki bileşenler büyüklük farkına dayanılarak ayrılırlar. Herhangi bir karışım gözenekli bir jel içerisine döküldüğünde, karışım içindeki küçük moleküller gözeneklere tutunurken büyük moleküller jelden akarak geçerler. Böylece özellikle kromatografik saşaştırma sırasında bozunabilecek biyolojik bazı karışımlar (protein, enzim, vb.) bu mekanizmanın etkin olduğu jel geçirgenlik kromatografisi ile ayrılabilir.
Kromatografide Çözücü Seçimi
Özellikle kağıt, ince tabaka ve kolon kromatografisinde çözücü hareketli faz olarak kullanıldığından, yürütülecek örneği en iyi şekilde birbirinden ayıracak çözücüler seçilmelidir. Çözücü seçiminde
“benzer benzeri çözer” ilkesi dikkate alınmalıdır. Çözücü seçimi yaparken analiz yapacak kişi, ayrılması planlanan maddelerin ve kullanılabilecek çözücülerin özelliklerine göre, elindeki karışımı en iyi şekilde bileşenlerine ayıracak çözücü sistemini deneme yanılma yöntemiyle belirlemelidir. Bir karışımı ayırmak için bazen saf çözücüler, bazen de çözücü karışımları kullanılmalıdır.
Çözücü sistemi seçilirken;
1. Karışımdaki maddelerin büyük bir kısmını aralarında uzaklık olacak şekilde yürütecek, 2. Mümkünse başlangıç noktasında yürümeyen madde bırakmayacak,
3. Kolayca uzaklaştırılabilecek (buharlaştırma vb.) çözücüler (ideal çözücü) kullanılmasına dikkat edilmelidir. Örneğin; karışımda bulunabilecek polar bileşenlerin, yürütme sonrasında sabit faz üzerinde daha önde olmasını istiyorsak daha polar çözücü veya çözücü karışımları kullanmalıyız.
Polar ve apolar maddeleri içeren bir karışımı ayırmak için çok polar bir çözücü hareketli faz olarak seçilirse, karışımdaki tüm bileşenler hızlı bir şekilde ilerler ve karışım, bileşenlerine ayrılamaz.
Kromatografik analizlerde çok çeşitli çözücüler kullanılmakla birlikte, yaygın olarak kullanılan bazı çözücüler ve karışımlarda sıklıkla karşılaşılan organik gruplar aşağıda artan polaritelerine göre sıralanmıştır.
Şimdi de etkin mekanizması ne olursa olsun bir kromatografik analizde neler olduğunu aşama aşama bir ince tabaka kromatografisi (İTK) örneğinde inceleyelim. Kromatografik analizi bir atletizm yarışmasına benzetirsek, karışımdaki saf bileşenlerin her biri sürüklenme hızına göre aynen bir yarıştaki atletler gibi farklı zamanlarda bitiş noktasına ulaşırlar.
Analiz edilecek örneğin A, B ve C bileşenlerinin bir karışımı olduğunu varsayalı m. Bu bileşenlerden A polar; B düşük polariteli, C ise apolar bir bileşik olsun. Hareketli (yürütücü) faz olarak polar bir çözücü karışımı seçilmiş olsun. Karışımın seyreltik çözeltisinden bir damlayı İTK plakasında başlangıç çizgisinde bir noktaya damlatalım ve içinde az miktarda çözücü olan bir behere koyarak yürütme işlemini başlatalım. Çeşitli zaman aralıklarında meydana gelen değişiklikler şekilde aşamalı olarak gösterilmektedir. Şekil (a-d)’den görüldüğü gibi analiz süresi boyunca karışımdaki A, B ve C bileşenleri sürüklenme hızlarına göre ayrılırlar. Çözücü polar bir çözücü olduğundan, polar A bileşeni en hızlı, orta polaritedeki B bileşeni orta hızda ve apolar C bileşeni ise yavaş sürüklenir. Böylece karışımdaki bileşenler birbirinden ayrılır ve tanımlanır.
İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ
İnce tabaka kromatografisi (İTK) de kağıt kromatografisi gibi düzlemsel bir kromatografi türüdür. Bu yöntemde, öğütülmüş bir malzeme cam veya plastik bir plakaya belirli bir kalınlıkta kaplanır ve böylece üzerinde gözenekler olan aktif yüzeyli bir sabit faz oluşturulur. Bu işlem yapılırken kaplama malzemesinin bir çözücüde süspansiyonu oluşturulur. Bu süspansiyon cam veya plastik üzerine dökülerek yüzey kaplanır. Ardından çözücü buharlaştırılır ve böylece yüzeyde sadece kaplama malzemesi kalır. Kaplama malzemesi, kullanılacak mekanizmaya göre belirlenir.
Kimya laboratuarlarında, ince tabaka kromatografisi için genellikle silikajel kullanılır. Piyasada çeşitli tanecik boyutlarına sahip silikajeller satılmaktadır. İnce tabaka kromatografisi, hem nitel (kalitatif) hem de nicel (kantitatif) analizlerde kullanılmaktadır. Bir karışımın hangi bileşenlerden oluştuğunu belirlemek için kullanıldığı nitel analizde; İTK plakasına incelenecek karışımın çözeltisinden ve karşılaştırılacak standartların çözeltilerinden kapiler ile damlatılır. Daha sonra plaka, uygun bir çözücü veya çözücü karışımıyla yürütülür. Örnekteki lekeler ile standart lekeleri karşılaştırılarak örnekte hangi standartlardan olduğu belirlenir. Böylece incelenen örneğin nitel analizi yapılmış olur. İTK’nın bir diğer nitel analiz uygulaması da bir tepkimenin izlenmesidir. Bir tepkimede amaç, belirli miktarlarda başlangıç maddelerini tepkimeye sokarak ürünler oluşturmaktır. Tepkimenin tamamlandığını görebilmek ve tamamlanma süresini belirlemek üzere, tepkime ortamından belirli zaman aralıklarıyla bir kapiler yardımıyla örnek alınır (O). Bu örnek başlangıç çizgisinde bir noktaya damlatılır. Başlangıç maddelerinden de, başlangıç çizgisinin üzerindeki diğer noktalara damlatılır.
Uygun bir çözücü ile yürütülür. Tepkime karışımından alınan örneğin lekeleri arasında, başlangıç maddelerinin lekeleri var ise tepkime henüz tamamlanmamıştır, yok ise tamamlanmıştır,denir.
İTK’nin nicel (kantitatif) analiz uygulamalarında ise, ayrımı yapılacak karışım İTK plakasının başlangıç çizgisi üzerine damlatılır. Daha sonra plaka, uygun bir çözücü veya çözücü karışımı ile yürütülür.
Birbirinden ayrılan lekelerin etrafı sert bir cisimle çizilerek plakadan sabit faz ile birlikte kazınır ve ayrı ayrı kaplarda toplanır. Uygun bir çözücü ile çözülür, çözelti süzülerek madde sabit fazdan ayrılır.
Çözeltideki çözücü buharlaştırılarak uzaklaştırılır ve kalan madde tartılarak madde miktarı belirlenir.
İncelenen maddeler renkli ise, bir İTK analizi sonucunu gözle izlemek olasıdır. Ancak renksiz maddelerin İTK plakası üzerinde ilerledikleri uzaklıkları belirlemek için bu maddeleri renklendirmek gerekebilir. Bunun için; yürütme işlemi sonunda plaka, içinde birkaç iyot kristali olan bir kavanozda kısa bir süre bekletilir veya plakaya ninhidrin boyası püskürtülür. Böylece lekeler gözle görülür hale gelir. Günümüzde floresans etkili silikajeller bu amaç için üretilmektedir. Bu tür silikajel ile kaplanmış bir plakada yapılan İTK analizi sonucunda renksiz bileşenler mor ötesi (UV) ışığı altında görünür hale gelirler.
İnce Tabaka Kromatografisi ile İndikatörlerin Analizi
Bu deneyde ince tabaka kromatografisi (İTK) ile çeşitli indikatörlerin Rf değerleri belirlenecek ve bilinmeyen indikatör karışımının nitel analizi yapılacaktır.
Deneyin Yapılışı
1. a. Analiz örneği (B) olarak, 10 mL’lik bir beher içine bilinmeyen indikatör karışımı alınır ve B olarak işaretlenir.
b. Karşılaştırma standartı olarak, 10 mL’lik beş behere ayrı ayrı a-Naftalein (a-N), Alizarin Sarısı (AS), Bromkresol Yeşili (BY), Bromtimol Mavisi (BM) ve Metil Kırmızısı (MK) indikatörlerinin 1 g L–1 çözeltilerinden 5’er mL konulur ve beherler sırasıyla a-N, AS, BY, BM ve MK şeklinde etiketlenir.
2. Daha sonra bir erlene 10 mL etil alkol çözeltisi ve 20 mL petrol eteri (40-60°C) konularak hareketli faz hazırlanır. İTK plakasına çizilen başlangıç çizgisini geçmeyecek şekilde bu çözücü karışımından 250 mL’lik bir behere eklenerek beherin ağzı bir saat camı ile kapatılır.
Kromatografik analiz başlatılmadan önce yürütme kabında çözücü veya çözücü karışımı, buharıyla dengeye gelmelidir. Bunun için çözücü veya çözücü karışımı, analizden 5-10 dakika önce yürütme kabına konulur ve ağzı kapatılır.
3. 7×10 cm ölçülerinde bir İTK plakasına alt taraftan 1,5 cm yukarıya yumuşak bir kurşun kalemle bir başlangıç çizgisi çizilir. Bu çizgi üzerine 1 cm aralıklarla altı tane nokta işaretlenir ve bu noktaların altına beherlerdeki etiketler sırasıyla yazılır
Başlangıç çizgisi çizilirken ve noktalamalar yapılırken silikajel yüzeyinin aşınmamasına dikkat edilmelidir.
4. Kapiler yardımı ile tüm beherlerden bir miktar çözelti alınarak, kağıt üzerindeki ilgili noktaya damlatılır. Damlatma sonunda oluşan noktaların büyüklüklerinin aynı olmasına dikkat edilmelidir.
Her çözelti için ayrı kapiler kullanılmalıdır. Aksi halde kapiler içinde kalan bir çözelti diğeriyle karışabilir ve bu durum analizde hatalara neden olabilir.
5. Hazırlanan İTK plakası çözücü ile doldurulmuş behere konulur. Beherin üzeri saat camı ile kapatılır ve çözücü İTK plakasının üst sınırından 0,5 cm uzaklık kalıncaya kadar yürütülür. Yürütme işlemi bittiğinde kağıt bir pens yardımıyla beherden çıkartılır. Çözücünün ve maddelerin ulaştığı uzaklıklar kurşun kalem ile işaretlenir. Bu uzaklıklar ayrı ayrı cetvel ile ölçülür.
7. Analiz sonucunda oluşan her leke için Rf değerleri ayrı ayrı hesaplanır.
Gecikme faktörü (Rf): Karışımdan ayrılan bileşenin yürüdüğü uzaklığın, çözücünün yürüdüğü uzaklığa oranıdır.
Gecikme faktörü = Rf = dR/dM Gecikme faktörü;
• Tabakanın kalınlığına,
• Hareketli ve sabit fazın nem içeriğine,
• Sıcaklığına
• Uygulanan örnek miktarına bağlıdır.
Karışımdaki lekelerin Rf değerleri ile karşılaştırma standartları (a−N, AS, BY, BM ve MK) lekelerinin Rf değerleri karşılaştırılır. Hesaplanan gecikme faktörü (Rf); özellikle sabit fazın (silikajel) kalınlığına, çözücü polaritesine ve damlatılan çözeltilerin derişimine bağlıdır.
Sonuçlar ve Yorum
1. Analizi yapılan karışım ve standart indikatör çözeltilerinin Rf değerlerini ayrı ayrı hesaplayınız.
2. Rf değerleri ve lekelerin renklerini karşılaştırarak bilinmeyen karışımın hangi indikatörleri içerdiğini bulunuz ve sonucunuzu yorumlayınız.
KOLON KROMATOGRAFİSİ
Üç boyutlu olan kolon kromatografisi yönteminde adsorpsiyon mekanizması etkindir. Silindirik cam bir kolon içerisine doldurulmuş sabit faz (katı) içindeki karışımın, hareketli bir faz (sıvı) ile sürüklenerek bileşenlerine ayrılması esasına dayanır. Bu sürüklenme sırasında, diğer kromatografik yöntemlerde olduğu gibi sabit faz karışımdaki bileşenleri tutmaya çalışırken, hareketli faz sürüklemeye çalışır. Böylece analizi yapılacak örnekteki farklı bileşenler kolon içinde farklı uzaklıklara sürüklenerek ayrılırlar. Kolonun çapı genellikle ayrılacak madde miktarına göre belirlenir. Eğer çok fazla miktarda madde ayrılacaksa daha geniş kolonlar seçilir. Diğer taraftan kolon uzunluğu ve ayırma için kullanılacak çözücü (hareketli faz) belirlenirken, ayrımı yapılacak karışımdaki bileşenlerin yürüme uzaklıklarına dikkat edilir. Bunun için, ayrımı yapılacak karışım önce bir ince tabaka plakasında çeşitli çözücü veya çözücü karışımları ile yürütür. Böylece kolon için en uygun çözücü ve ayrılacak bileşenlerin yürüme uzaklıkları belirlenmiş olur. Eğer İTK’ya göre karışımda yürüme uzaklıkları birbirlerine çok yakın bileşenler var ise, bu bileşenleri daha iyi ayırmak için uzun bir kolon seçilir.
Kolonun Hazırlanması
Kolon dolgu malzemeleri genellikle ayrımı yapılacak maddelerin özelliklerine göre seçilir. Günümüzde dolgu maddesi olarak birçok yeni malzeme geliştirilmektedir. Ancak kolon kromatografisinde rutin analizlerde genellikle; nötür veya asidik maddeler için silikajel; nötür veya bazik maddeler için alümina ve biyokimyasal maddeler için selüloz vb. kolon malzemesi olarak kullanılmaktadır.
Hazırlanan kolonun homojen olması, yani her yerinde aynı özelliği göstermesi en çok dikkat edilmesi gereken noktadır. Dolgu maddesi kolona kuru ve ıslak olmak üzere iki şekilde doldurulabilir:
1. Kuru doldurma: Kuru doldurmada; dolgu maddesi, kolonun tepesine yerleştirilen bir huniden toz halinde doldurulur, çözücü daha sonra eklenir. Bu yöntem ile homojen bir kolon hazırlanması çok zordur, çünkü çözücü eklenmesinden sonra kolona doldurulan dolgu maddesinin tanecikleri arasında hava kabarcıkları oluşur ve kolonun homojenliği bozulur.
2. Islak doldurma: Islak doldurma yönteminde; dolgu maddesinin kullanılacak çözücü içindeki süspansiyonu, iyice karıştırılarak içindeki hava kabarcıkları yok edilir ve kolona yavaş yavaş eklenir.
Böylece daha homojen bir kolon hazırlanmış olur.
Analiz için uygun kolon seçildikten sonra dolgu maddesi kolona kuru veya ıslak olarak doldurulur.
Eklenen dolgu maddesinin üst yüzeyinin örnek madde ve çözücü eklemeleri sırasında düzgün kalması için üzerine bir miktar yıkanmış deniz kumu veya kolon çapına uygun filtreler konulur. Kolonların alt
kısmında ise dolgu maddesinin musluktan akmasını önleyecek şekilde gözenekli camlar (frit) vardır.
Bir kolon kromatografisinin genel görünümü şekilde gösterilmektedir.
Kolon kromatografisi ile ayırma işlemine başlamadan önce ayrılacak karışım İTK ile incelenir ve kolon için en uygun çözücü veya çözücü karışımı belirlenir.
Deneyin Yapılışı
1. Hareketli fazın hazırlanması: 250 mL’lik mezürde 70 mL hekzan ve 30 mL etil asetat karıştırılır. Bu karışım deney sırasında hareketli faz olarak kullanılır.
2. Musluklu ve altında gözenekli cam olan kolon, bir kıskaç yardımıyla spora tutturulur.
3. 250 mL’lik behere kolonu doldurabilecek kadar silikajel ve ayrılacak karışımı içeren çözeltiden konulur. Bu karışım iyice karıştırılarak hava kabarcıkları yok edilir ve süspansiyon haline getirilir.
4. Kolonun musluğu açılarak silikajel süspansiyonu kolona bir huni yardımıyla doldurulur. Plastik bir tıpa ile kolona yavaş yavaş vurularak varsa hava kabarcıkları yok edilir.
5. Çözücü silikajelin üst sınırına gelinceye kadar musluk açık tutulur, daha sonra musluk kapatılır ve bir filtre veya bir miktar deniz kumu silikajelin üzerine eklenir. Böylece kolon kullanıma hazır hale getirilir.
6. Temiz ve kuru bir pipetle hazırlanan pigment çözeltisi kolona yavaş yavaş eklenir. Çözeltinin tamamı eklendikten sonra musluk açılır ve renkli çözeltinin silikajele adsorplanması sağlanır.
7. Musluk tekrar kapatılarak kolona bir huni yardımıyla çözücü eklenir ve kolon musluğu altına 25 mL’lik bir erlen konularak musluk açılır ve çözücünün damla damla akması sağlanır.
Çözücü akış hızı kolon kromatografisinde çok önemlidir. İyi bir ayırım için akış hızı genellikle yavaş olacak şekilde ayarlanır.
9. Çözücü aktıkça pigment karışımındaki bileşenler ayrılmaya başlar. Bir bileşen ayrıldıktan sonra diğer bileşenler için toplama kapları sürekli değiştirilir.
Deney süresince kolonda meydana gelebilecek değişiklikler şekilde gösterilmektedir. Şekilde görüldüğü gibi maddeler, kolonda sürüklendikçe birbirlerinden ayrılmaktadırlar.
Sonuçlar ve Yorum
Ayrılan bileşenler ayrı ayrı balonlarda toplanarak etiketlenir. Ardından çözücüleri döner buharlaştırıcıda buharlaştırılıp madde ayrı ayrı elde edilir.
