Subklinik Mastitisli İneklerde Adenozin Deaminaz Aktivitesi ve Somatik Hücre Sayısı Korelasyonu

(1)

57

Subklinik Mastitisli İneklerde Adenozin Deaminaz Aktivitesi ve Somatik Hücre Sayısı Korelasyonu

İbrahim Mert POLAT¹,*, İlknur Pir YAĞCI¹, Mustafa KAYMAZ², Gül Fatma YARIM³, Buğrahan Bekir YAĞCI⁴

1Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Kırıkkale, Türkiye

2Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye

3Samsun Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, Samsun, Türkiye

4Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Kırıkkale, Türkiye

Geliş Tarihi/Received Kabul Tarihi/Accepted Yayın Tarihi/Published

07.05.2019 25.06.2019 30.06.2019

GİRİŞ

Adenozin deaminaz (ADA), adenozinin intra ve ekstra selü- ler seviyelerinin kontrolünde rol oynayan önemli bir enzim- dir. ADA, tüm memelilerin lenfoid dokularında, lenfositlerin üretimi ve farklılaşmasına etki eder (1). Bu enzimin aktivitesi oluşan immun yanıta bağlı olarak değişim göstermektedir.

İmmun sistemin aktive olduğu durumlarda seviyesi artar- ken, baskılandığı durumlarda ise seviyesi azalmaktadır (1,2).

Adenozin deaminaz enzimi insanlarda baskın olarak CD4⁺ hücrelerin oluşumunu sağlamaktadır ki bu hücreler enfeksiyon durumlarında katil hücrelere dönüşürler ve/veya diğer antikorların oluşumunu hızlandırırlar (3). Adenozin deaminaz T lenfositlerde B lenfositlere oranla daha fazla bulun- maktadır. Bu nedenle T lenfositlerin farklılaşması sırasında ADA aktivitesi önemli düzeylerde artış göstermektedir ki, bu

durum hücresel bağışıklığın göstergesi olarak da kabul edilmektedir (2,3). Adenozin deaminaz ve izoenzimleri be- şeri ve veteriner hekimlikte oldukça yaygın kullanım alanı bulabilmektedir. Genel anlamda, serum ADA aktivite düze- yinin immun fonksiyonun değerlendirilmesinde uygun bir parametre olduğu düşünülmektedir (4,5).

Meme dokusunun yangısı olarak tanımlanan mastitis, ineklerde sıklıkla klinik veya subklinik formlarda seyreder (6). Klinik mastitislerde sütte gözle görülebilir değişiklikler olurken, subklinik olgular asemptomatik seyreder ve süt kalitesini önemli ölçüde etkileyerek ekonomik kayıplara yol açar. Klinik mastitisler, sütteki makroskobik değişiklerin görülmesiyle kolayca teşhis edilebilirken; subklinik mastitisler kaliforniya mastitis test (CMT), whiteside test, somatik hücre sayımı ve elektrik geçirgenlik testleri gibi yöntemlerle belirlenebilmektedir. Son yıllarda, subklinik mastitis olgula-

Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi

http://www.dicle.edu.tr/veteriner-fakultesi-dergisi

Araştırma Makalesi/Research Article

ISSN:1307-9972 e-ISSN:1308-0679

Öz

Bu çalışmada yangısal süreçte önemli görevleri olan adenozin deaminazın, subklinik mastitisli ineklerde serum ve süt adenozin ademinaz (ADA) düzeylerinin belirlenmesi ve bu enzimin somatik hücre sayısı ile ilişkisinin ortaya konması amaçlandı. Çalışma grubunu oluşturan Holstein inekler; subklinik mastitisli (n=40) ve sağlıklı inekler (n=15) olarak iki gruba ayrıldı. Kaliforniya mastitis testi (CMT) sonucunda şüpheli sonuç veren ve herhangi bir klinik mastitis bulgusu bulunmayan inekler subklinik mastitis grubunu, CMT negatif olan inekler ise kontrol grubunu oluşturdu. Süt örneklerindeki somatik hücre sayıları flow sitometri ile belirlendi. Subklinik mastitis grubunda serum ve süt ADA değerleri sırasıyla 8,11 ve 3,38 IU/L ölçüldü. Somatik hücre sayıları subklinik mastitis ve kontrol grubunda sırasıyla 248x103 ve 132x103 bulundu (p<0.01). Süt ADA ile somatik hücre sayısı arasında da pozitif korelasyon bulundu (p<0.01, r=0.611). Sonuç olarak, adenozin deaminazın ineklerde subklinik mastitis olgularının tanısında bir belirteç olarak kullanılabileceği kanısına varıldı.

Anahtar Kelimeler: Adenozin deaminaz, subklinik mastitis, inek, somatik hücre sayısı

Correlation of Adenosine Deaminase Activity and Somatic Cell Count in Dairy Cows with Subclinical Mastitis Abstract

In this study, we aimed to determine the levels of adenosine deaminase (ADA), which plays important role in inflammatory process in sera and milk in cows with subclinical mastitis and state the relationship between this enzyme with somatic cell count. Holstein cows which was consisted the study group allocated into two groups subclinical mastitis (n = 40) and healthy cows (n = 15). After performing the California Mastitis Test (CMT), the cows resulted suspicious; included the study group, the cows which showed CMT as negative constitute the control group. Somatic cell counts were determined with flow cytometry assay. In subclinical mastitis group, serum and milk ADA values were 8.11 and 3.38 IU / L, respectively. Somatic cell counts were 248x103 and 132x103 in subclinical mastitis and control groups, respectively (p <0.01). There was a positive correlation between milk ADA and somatic cell count (p <0.01, r = 0.611). As a result, adenosine deaminase can be used as a marker in the diagnosis of subclinical mastitis in cows.

Key Words: Adenosine deaminase, subclinical mastitis, cow, somatic cell count

(2)

Polat ve ark., Dicle Üniv Vet Fak Derg 2019;12(1):57-59 Subklinik Mastitisli İneklerde Adenozin Deaminaz Aktivitesi…

58 rında kolorimetrik ve florometrik yöntemlerle çalışan bazı

enzimatik değişikliklerin belirlendiği çalışmalarda bulun- maktadır (8-10). Meme inflamasyonlarında süt somatik hücre miktarındaki artış, inflamasyonun derecesine ve has- talığa neden olan mikroorganizmanın türüne göre değişiklik göstermektedir. Yangı ve enfeksiyon ne kadar şiddetliyse somatik hücre sayısı da doğru orantılı olarak artmaktadır (6).

Bu çalışmada subklinik mastitisli ineklerde kan serumu ve sütte adenozin deaminaz düzeylerinin belirlenmesi ve bu enzimin düzeyinin somatik hücre sayısı ile ilişkisinin ortaya konması amaçlanmıştır.

MATERYAL VE METOT

Çalışma Hayvanları ve Gruplandırma

Çalışma, Marmara Bölgesinde yer alan, otomatik sağım yapılan ticari bir süt ineği işletmesinde, orta laktasyon dö- neminde (ortalama 138 gün) yürütüldü. Yaşları 3-5 arasında değişen Holstein ırkı inekler, özdeş çevresel ve beslenme koşullarına sahipti. Günlük iki sağım yapılan işletmede ortalama süt verimi yıllık 6.500-8.000 arasında değişmekteydi.

Örneklemeler sonrası çalışma ve kontrol gruplarının oluştu- rulmasından sonra her olguya ait bireysel süt verimleri değerlendirilmek üzere kaydedildi. Klinik muayeneler ve CMT sonuçlarına göre çalışma grupları; subklinik mastitisli inekler (n=40) ve kontrol grubu (n=15) şeklinde oluşturuldu.

Süt ve kan örneklerinin toplanmasından önce palpasyonda meme dokunda fibrozis, şişkinlik, yangı bulguları olan ve sulu, pıhtılı, kanlı sütü olan inekler çalışmaya dahil edilmedi.

Süt örnekleri sabah sağımı öncesi her bir meme lobundan alındı ve meme loblarının en az bir tanesinde şüpheli CMT skoru olan (hafif jel kıvamı oluşan) ve klinik olarak enfeksiyon bulguları göstermeyen inekler subklinik mastitis grubuna dahil edildi ve daha sonrasında yapılan somatik hücre sayımı ile subklinik mastitis olguları kesinleştirildi. Somatik hücre sayımları ve süt ADA ölçümleri sadece hasta meme loblarından alınan süt örneklerinde gerçekleştirildi. CMT skoru negatif olanlar ise kontrol grubunu oluşturdu.

Kan ve Süt Örneklerinin Hazırlanması

ADA analizleri için kullanılacak kan örnekleri kuyruk vena- sından antikoagulansız vakumlu tüplere alındı. Kan örnekle- ri +4^oC’de ve 1550 rpm ‘de 10 dakika santrifüj edilerek serum örnekleri elde edildi. Serumlar analizler yapılıncaya kadar -80^oC’de saklandı. Süt örnekleri polietilen steril tüple- re alındı, numunelerin korunması amacıyla azidiol eklendi ve soğuk zincirde bir gün içerisinde laboratuvara ulaştırıldı.

ADA analizleri için gerekli olan süt serumu eldesi için Alais tarafından belirlenen yöntem kullanıldı (11).

ADA Ölçüm Prosedürü

Serum ve süt ADA aktiviteleri Guisti ve Galantinin (1984) yöntemine göre ölçüldü (12). Numuneler, adenozinle 60 dakika boyunca 37 °C’de inkube edildikten sonra fenol ve sodyum nitroprusid eklenmiş hipoklorid solüsyonua aktarıldı. Renklenen solüsyon 640 nm dalga boyunda uv-vis spektrofotometre ile ölçüldü (Shimadzu-3100). ADA aktivi-

teleri standart eğrinin optik dansiteleri ile karşılaştırılarak hesaplandı.

Süt Somatik Hücre Sayımı

Süt somatik hücre sayıları flow sitometri ile belirlendi (Bent- ley Instruments, USA).

İstatistiksel Analiz

Verilerin normalite ve homojenite dağılımları Shapiro Wilk ve Levene testleri ile belirlendi. Gruplar arasında ADA ve SHS seviyelerinin istatistiksel değerlendirmesinde t-test, veriler arasındaki ilişkinin hesaplanmasında ise Pearson korelasyon testi kullanıldı. Bulgular, korelasyon kat sayısı (r) ve p değeri olarak gösterildi. Tüm bulgular ortalama ve standart hata (S.H) şeklinde sunuldu. İstatistiksel önemlilik P<0,05 olarak kabul edildi.

BULGULAR

Her iki çalışma gruplarına ait serum ve süt ADA değerleri Şekil 1’de sunuldu. Subklinik mastitisli ineklerin serum ADA seviyeleri kontrol grubuna oranla daha yüksek bulundu (p<0.01). Subklinik mastitis grubunda serum ve süt ADA değerleri sırasıyla 8,11±0,83 ve 3,38±0,42 IU/L ölçüldü.

Kontrol grubunda ise bu değerler sırasıyla 7,05±0,62 ve 2,22±0,37 U/L belirlendi. Süt ADA değerleri kontrol grubunda, subklinik mastitisli ineklerin değerlerine oranla düşük bulundu (p<0.05). CMT skoru şüpheli olan subklinik mastitisli ineklerin somatik hücre sayıları ortalama 248x10³ hüc- re/mL (196 x10³- 294 x10³) olarak belirlendi. CMT pozitif meme lobları ile somatik hücre sayısı arasında pozitif korelasyon bulundu. Kontrol grubunda ise somatik hücre sayısı 132x10³ bulundu. Kontrol grubunun serum ve süt ADA değerleri ile somatik hücre sayıları arasında herhangi bir istatistiksel fark bulunmadı. Subklinik mastitisli ineklerin süt verimleri (6740 kg) ise kontrol grubuna (7112 kg) oranla daha düşüktü (p<0.05).

Şekil 1. Çalışma ve kontrol gruplarında serum ve süt ortalama ADA değerleri

SKM: Subklinik mastitis, K: Kontrol, * P < 0.01, ** P < 0.05

Subklinik mastitis grubunda serum ADA ile süt ADA (p<0.01, r=0.765) ve SHS arasında (p<0.05, r=0.498) pozitif korelasyon bulundu (Tablo 1). Ek olarak, süt ADA ile somatik hücre sayısı arasında da pozitif korelasyon bulundu (p<0.01, r=0.611).

*

**

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Serum Süt

U / L

SKM (n=40)

(3)

Polat ve ark., Dicle Üniv Vet Fak Derg 2019;12(1):57-59 Subklinik Mastitisli İneklerde Adenozin Deaminaz Aktivitesi…

59 Tablo 1. Subklinik mastitisli inekler serum ve süt ADA değerleri ve

somatik hücre sayıları arasındaki korelasyon katsayıları

Korelasyon Katsayısı (Pearson)

Serum ADA

Süt

ADA SHS

Serum

ADA r 1 0,765* 0,498**

Süt ADA r 0,765* 1 0,611**

SHS r 0,498* 0,611* 1

*

P < 0.01, ** P < 0.05

TARTIŞMA VE SONUÇ

Meme bezi yangılarında perivasküler aralıktan alveoler lümene bazı bileşenlerin geçişiyle sütün yapısında değişiklik- ler olur (8,13). Bu yangısal değişiklikler sonucu sütteki bazı hücreler, enzimler ve antioksidan aktivitesi etkilenir. Me- menin doğal savunma mekanizmasının yetersiz kaldığı durumlarda makrofajlar ve lenfositlerin aktivasyonu sonucu immun yanıt şekillenir. Yangı sürecinde önemli rol oynayan ve başlıca lenfositler olmak üzere birçok immun sistem hücresinde bulunan ve immunitenin endojen regülatörü olan ADA enzimi, organizmayı doku hasarına karşı korur (14, 15). Bu çalışmada, ADA seviyelerindeki artışın çalışma grubunda yüksek bulunması subklinik mastitise bağlı gelişen lenfosit aktivasyonu ile ilişkilendirildi. Ayrıca, yüksek somatik hücre sayısının bulunması ve bu parametrenin hem serum hem de süt ADA seviyeleri ile pozitif korelasyona sahip olması, subklinik mastitis olgularının teşhisinde bu enzimin güvenle kullanılabileceği kanısına varıldı. Bir çalışmada, subklinik mastitisli ineklerde meme içi levamizol uygulama- larının memenin bağışıklık sistemi üzerine etkileri araştırıl- mış ve ilaç uygulama sonrası serum ve süt ADA düzeylerin- de bir değişiklik olmadığı bildirilmiştir (16). Çalışmamızda ise her ne kadar herhangi ilaç uygulanmamasına rağmen subklinik mastitisli ineklerde, kontrol grubuna oranla elde edilen yüksek ADA seviyelerinin, bu enzimin doğrudan hücresel immunite ile ilişkili olduğu ve lenfositlerin doğal aktivasyo- nuna bağlı bir artış olduğu düşünüldü.

ADA aktivitesi, adenozinin degradasyonunu sağlayarak doku hasarını önler. ADA seviyelerindeki azalma ise enfeksi- yona bağlı olarak dokulardaki hasarın önlenememesine sebep olur (15). Çalışmamızda, yüksek serum ve süt ADA aktivitesinin bulunması nedeniyle, ineklerin meme dokula- rında yıkımlayıcı bir hasar olmadığı, yangısal yanıtın devam ettiği ve bu sürecin tedaviye destek olabileceği kanısına varıldı. Gerek beşeri gerekse veteriner hekimlik alanında adenozin deaminaz hakkında yapılan çalışmalar, bu enzimin metabolik, otoimmun, bakteriyel, viral ve paraziter hastalık- lar gibi birçok olguda erken tanı belirteci olarak kullanılan ADA aktivitesinin (1,3,4) çalışmamızın bulguları ışığında süt ineklerinde meme sağlığının ortaya konmasında diğer kon- vansiyonel parametrelerin yanında yerini alması gerektiği düşünüldü.

Sonuç olarak, elde edilen yüksek ADA seviyelerinin; bu enzimin subklinik mastitis olgularında önemli bir role sahip olduğu, somatik hücre sayısı ile pozitif korelasyon gösterdiği

ve ineklerde subklinik mastitis olgularının tanısında diğer parametrelere ek olarak güvenle kullanılabileceği kanısına varıldı.

KAYNAKLAR

1. Kumar V, Sharma A. (2009). Adenosine: An Endogenous Modulator of Innate İmmune System with Therapeutic Poten- tial. Eur J Pharmacol. 15: 7-15.

2. Fredholm BB, Johansson S, Wang YW. (2011). Adenosine and the Regulation of Metabolism and Body Temperature Adv Pharmacol. 61: 77-94.

3. Antonioli L, Fornai M, Blandizzi C, Pacher P, Haskó G. (2019).

Adenosine Signaling and the Immune System: When a lot Could be too Much. Immunol Lett. 205:9-15.

4. Fávero JF, Da Silva AS, Bottari NB, et al. (2018). Physiological Changes in the Adenosine Deaminase Activity, Antioxidant and Inflammatory Parameters in Pregnant Cows and at Postpar- tum. J Anim Physiol Anim Nutr. 102(4): 910-916.

5. Rodney EK, Yeung CY, Ingolia DE. (1985). Adenosine Deami- nase Deficiency and Severe Combined Immunodeficiencies.

Trends Genet. 1: 278-283.

6. Baştan A. (2013). İneklerde Meme Sağlığı ve Sorunları Genişle- tilmiş II. Baskı. Kardelen Ofset Matbaacılık Tanıtım Hiz. Ankara, Türkiye.

7. Kossaibati MA, Esslemont RJ. (2007). The Costs of Production Diseases in Dairy Herds in England. Vet J. 154: 41-51.

8. Pyörälä S. (2003). Indicators of Inflammation in the Diagnosis of Mastitis. Vet Res. 34(5): 565-578.

9. Sharma N, Singh NK, Bhadwal MS. (2011). Relationship of Somatic Cell Count and Mastitis: An Overview. Asian-Australas J Anim Sci. 24 (3): 429-438.

10. Antanaitis R, Žilaitis V, Juozaitienė V, et al. (2015). Efficient Diagnostics and Treatment of Bovine Mastitis According to Herd Management Parameters. Veterinarija İr Zootechnika. 69 (91):3-10.

11. Alais C. (1974). Science du Lait. Principes des Techniques Laitières. Editeurs Boulevard, Paris.

12. Guisti G, Galanti B. (1984). Adenosine Deaminase: Colorimetric Method. Methods of Enzymatic Analysis. 5^th edition. Bergme- yer HU (Ed). Pp. 315-323. Verlag Chemie Weinheim, Germany 13. Kehrli ME, Harp JA. (2001). Immunity in the Mammary

Gland. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 17(3): 495-516.

14. Pilla R, Malvisi M, Snel GGM, et al. (2013). Differential Cell Count as an Alternative Method to Diagnose Dairy Cow Masti- tis. J Dairy Sci. 96(3): 1653-1660.

15. Conlon BA, Law WR. (2004). Macrophages Are a Source of Extracellular Adenosine Deaminase 2 During Inflammatory Re- sponses. Clin Exp Immunol. 138(1): 14-20.

16. Salmanoğlu B, Pamukçu T, Yarım G. (2002). Subklinik Mastitisli Süt İneklerinde Meme içi Levamizol Uygulanmasında Süt ve Kanda Adenozin Deaminaz, Vitamin A, B-Karotin Düzeyle- ri. Ankara Üniv Vet Fak Derg. 49: 17-21.

Yazışma Adresi:

*İbrahim Mert POLAT

Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jineko- loji Anabilim Dalı, Kırıkkale, Türkiye

e-mail: vethekmert@gmail.com