ÖZET
Fare embriyonik kök hücreleri 1981 y›l›nda, insan embriyonik kök hücreleri de 1998 y›l›nda in-vitro flartlarda gösteril- mifltir. 2007 T›p ve Fizyoloji Nobel ödülüne lay›k görülen Oliver Smithies, Mario Capecchi ve Sir Martin Evans fare embri- yonik kök hücrelerini “homolog rekombinasyon” yoluyla hücre içine d›flar›dan yerlefltirdikleri genlerle genetik olarak modifi- ye etmeyi baflarm›fllard›r.
Araflt›r›c›lar gen-hedefleme teknolojisi sonucunda fare hücrelerinde belirli bir genin susturulabilece¤ini (gene knock- out, K/o) göstermifllerdir. Böylece susturulan genin fizyolojik ve biyolojik önemi ile hastal›k durumlar›ndaki etkilerinin ince- lenmesi mümkün olabilmifltir. Knock-out fare modellerinin gelifltirilmesi günümüzde biyolojik ve sa¤l›k bilimlerine en çok katk›da bulunabilecek bulufllardan biri durumuna gelmifltir.
Anahtar sözcükler: embriyonik kök hücreleri, knock-out fare, transjenik fare SUMMARY
2007 Nobel Prize in Medicine and Physiology: Importance of Embryonic Stem Cells and Knock/out Mouse Models
Embryonic stem cells can form all three germ layers including mesoderm, endoderm and ectoderm. These layers can also differentiate to cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, osteoblasts, chondrocytes and endothelial cells. In the early 1980’s a novel technology known as gene transfer (transgenics) was developed. Oliver Smithies, Mario Capecchi and Sir Martin Evans created a “Knock-out, K/o” mouse by inserting gene at a precise location in the mouse genome. This leads to a process in which a particular gene of interest to be removed to define the precise effects of the gene. The gene knockout is created by selectively disabling a specific target gene in embryonic stem cells.
Keywords: embryonic stem cells, knock-out mouse, transgenic mouse
2007 NOBEL ÖDÜLÜ ÖYKÜSÜ: EMBR‹YON‹K KÖK HÜCRELER‹ VE KNOCK-OUT FARE MODELLER‹N‹N ÖNEM‹
Emin KANSU
Hacettepe Üniversitesi T›p Fakültesi, ‹ç Hastal›klar› Anabilim Dal› ve Onkoloji Enstitüsü, ANKARA ekansu@ada.net.tr
23.ANKEM ANT‹B‹YOT‹K VE KEMOTERAP‹ KONGRES‹, ÇEfiME-‹ZM‹R, 28 MAYIS – 01 HAZ‹RAN 2008
ANKEM Derg 2008;22(Ek 2):5-8
Embriyonik kök hücreleri ilk kez 1981 y›- l›nda Sir Martin Evans taraf›ndan farelerde blas- tositlerin iç hücre (inner-cell mass) kitlelerinden izole edilmifller ve fare fibroblast hücre dizileri üzerinde in-vitro flartlarda kültürlerde üretil- mifllerdir(5,6,9,10).
‹nsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ilk kez 1998 y›l›nda Wisconsin Üniversitesi T›p Fa- kültesi’nde Dr Jamie Thomson ve ark.(15)tara- f›ndan infertilite nedeniyle in-vitro fertilizasyon (IVF) ifllemi için tedavi program›na al›nan çift- lerden geriye kalan art›k embriyolardan elde edilmifllerdir. Thomson ve ark.(15) blastosit iç hücre kitlesindeki 160 ila 180 embriyonik kök hücreyi lazer diseksiyon mikro-cerrahi yönte- miyle blastosit içinden ay›rm›fllar ve fare embri-
yonik fibroblastlar› üzerinde petri kutular›nda kültüre koymufllard›r. Fare fibroblastlar› üze- rinde ço¤alan embriyonik kök hücrelerini pasaj- lar yaparak ve yeni petri kutular›nda kültür or- tamlar›na ekerek hücreleri diziler halinde uzun süre koruyabilmifllerdir. Embriyonik kök hücre- lerinin “Embriyoid cisimcikler=embriyoid bo- dies” olarak eldesi mümkün olabilmektedir.
Knock-out fare modelleri
2007 T›p ve Fizyoloji Nobel Ödülü, Mario Capecchi, Oliver Smithies ve Sir Martin Evans’a verilmifltir(16). Bu üç de¤erli araflt›r›c›n›n fare kök hücrelerinde gelifltirdikleri yeni teknikler genetik de¤ifliklikler sonucu memelilerdeki fiz- yolojik süreçlerin anlafl›lmas›na oldu¤u kadar Konferans
birçok hastal›¤›n fizyopatolojisinin de anlafl›l- mas›na ›fl›k tutmufltur.
Sir Martin Evans, 1941 y›l›nda ‹ngiltere’de do¤mufltur, halen Cardiff Üniversitesi’nde kis- tik fibrozis üzerinde çal›flmakta ve Genetik pro- fesörü olarak görev yapmaktad›r (Resim 1a).
Oliver Smithies, 1925 y›l›nda ‹ngiltere’de do¤mufltur. Chapel Hill’de, North Carolina Üniversitesi’nde Patoloji ve Laboratuvar T›bb›
dal›nda profesör olarak görev yapmaktad›r.
Prof Smithies, hipertansiyon ve ateroskleroz hastal›klar›n›n anlafl›lmas›na yard›mc› olabile- cek fare modelleri gelifltirmifltir (Resim 1b).
Mario Capecchi, 1937 y›l›nda ‹talya’da do¤mufltur ve doktora derecesini 1967 y›l›nda Harvard Üniversitesi’nde Biyofizik dal›nda al- m›flt›r. Halen, Salt Lake City’de Utah Üniversi- tesi’nde ‹nsan Geneti¤i ve Biyolojisi profesörü ve “Howard Hughes Medical Institute” araflt›r›- c›s› olarak görev yapmaktad›r (Resim 1c).
Kromozomlar›m›zda bulunan DNA se- kanslar› anneden ve babadan gelen kromozom çiftleri aras›nda karfl›l›kl› de¤iflirler (Exchange of DNA sequences). Bu de¤iflme bireyler aras›n-
daki genetik variyasyonu artt›r›r ve bu süreç
“Homolog rekombinasyon” olarak tan›mlan›r.
Homolog rekombinasyon evolüsyonda çok iyi korunmaktad›r ve ilk kez 1958 y›l›nda Nobel Ödülüne lay›k görülen Joshua Lederberg tara-
6 Resim 1a: Sir Martin Evans.
Resim 1b: Prof.Oliver Smithies.
Resim 1c: Prof. Mario Capecchi.
f›ndan bakterilerde tan›mlanm›flt›r.
Capecchi ve Smithies, bakteride gösteril- mifl olan homolog rekombinasyonun memeli hücrelerindeki genlerin modifikasyonunda kul- lan›labilece¤ini göstermifllerdir(1,4,11). Capecchi, memeli hücrelerindeki kromozomlarda ve hüc- reye d›flar›dan konulan DNA aras›nda homolog rekombinasyonun gerçekleflebilece¤ini ve böy- lece d›flar›dan hücreye verilen DNA ile “defek- tif=hastal›kl›” genlerin homolog rekombinas- yon yoluyla tamir edilebilece¤ini göstermifller- dir. Smithies de yapt›¤› çal›flmalarda insan hüc- relerinde mutasyona u¤ram›fl genlerin tamir olabilece¤ine iflaret etmifl ve endojen genlerin aktiviteleriyle ba¤›ms›z olarak hedeflenebile- ceklerini belirlemifltir. Bu bulgular memeli hüc- relerindeki bütün genlerin homolog rekombi- nasyona yatk›n olduklar›n› göstermifltir(3,13).
Capecchi ve Smithies, ilk çal›flmalar›nda kulland›klar› hücrelerde gen-hedeflenmesinin kolay baflar›lamayaca¤›n› görerek, yeni hücre türlerinin aray›fl›na bafllam›fllard›r. Amaçlanan hücrelerde DNA modifikasyonlar›n›n irsiyetle geçiflinin esas al›nmas› gerekti¤ini görerek Car- diff Üniversitesi’nde fare embriyonik kanser hücreleriyle çal›flan Sir Martin Evans ile temasa geçmifllerdir. Evans’›n çal›flt›¤› embriyonik kan- ser hücreleri tümöral olmas›na ra¤men “embri- yonik hücre” özelliklerini koruyarak her türlü hücreye farkl›laflabilme özelli¤inde olabilen hücreler olmas› deneylerin uygulanmas›n› daha kolaylaflt›rm›flt›r(3).
Bu hücrelerin arzu edilmeyen taraf› anor- mal kromozomlara sahip olmalar› nedeniyle ye- ni hücre aray›fllar› içine giren Martin Evans k›sa süre içinde normal say› ve nitelikte kromozom- lar› olan fare embriyonik kök hücrelerini elde etmeyi baflarm›flt›r. Takiben, fare embriyonik kök hücrelerinin “germ-line”› etkiledi¤ini gös- termek amac›yla yap›lan deneylerde bir fare tü- ründen elde edilen embriyolara baflka bir fare türünden embriyonik kök hücreler injekte edil- mifltir. Her iki ayr› tür farenin hücrelerinde olu- flan bu “mosaik embriyolar” do¤uma kadar ge- liflimlerini tamamlamak üzere baflka bir difli an- ne fareye yerlefltirilmifltir. Sonunda canl› do¤an
“mosaik” fare yavrular birlefltirilmifller ve em- briyonik kök hücrelerden gelen genlerin yeni
do¤anlara Mendel kanunlar›na göre geçiflleri gerçekleflmifltir. Martin Evans, bu deneylerden sonra fare embriyonik kök hücrelerini genetik olarak modifiye etmifl ve retrovirüsleri kullan- m›flt›r. Retrovirüslerin kendi genlerini fare em- briyonik hücrelerin kromozomlar›na integre et- meleri sonucunda fare germ-line’›na yerleflme- leri gerçekleflmifltir(7,8,14).
1986 y›l›na kadar yap›lan araflt›rmalar so- nucunda Capecchi ve Smithies genlerin kültür- deki hücrelere homolog rekombinasyon yoluyla yerlefltirilmesinin mümkün olabilece¤ini göster- mifllerdir. Sir Martin Evans da fare germline’›
için gereken fare embriyonik kök hücrelerini üretti¤i için bu aflamada homolog rekombinas- yonun emriyonik hücrelerde gerçekleflmesi ko- lay olmufltur ve ilk deneylerde Lesch-Nyhan sen- dromu’ndan sorumlu “HPRT” geni seçilmifltir.
Fare embriyonik kök hücrelerinin homo- log rekombinasyonda kullan›m› sonucu “gen- hedeflenmifl – Knock-out (K/o)” farelerin olufl- turulmas› 1989 y›l›nda yay›nlanm›flt›r(2).
Gen-hedefleyerek, belirli geni susturul- mufl “gene knock-out mouse K/o) fare modelle- ri” 1989 y›l› sonras›nda h›zla üretilmeye bafllan- m›flt›r. Genetik ve moleküler biyoloji alan›nda en önemli ve etkin bir teknoloji haline gelmifltir.
Fare genomunda çal›fl›lmas› amaçlanan herhan- gi bir gende mutasyon yaratmak mümkün ola- bilmifltir.
Nobel ödülüne lay›k görülen bu üç araflt›- r›c›n›n gelifltirdikleri “knock-out” teknolojisi sa- yesinde fare genomunda bulunan özgül genle- rin susturulmas› sonucu geliflen durumlar›n ta- kibi ve de¤iflik tür hastal›klar›n geliflimi izlene- bilmektedir. Fare genomunda bulunan 20,000 genin 10,000 kadar›nda genin susturulmas›
(knock-out) mümkün olabilmifltir. Bu tekni¤in uygulanmas› sonucunda insanda görülen kardi- yovasküler, nöro-dejeneratif hastal›klar, diabet, kanser ve di¤er birçok hastal›klar›n çal›fl›labile- ce¤i ve araflt›rmac›lar›n kullanabilecekleri 500 farkl› “knock-out fare” modeli gelifltirilmifltir.
“Knock-out fare” teknolojisi Cardiff Üni- versitesi’nden Sir Martin Evans taraf›ndan 1980’lerin bafl›nda tan›mlanan fare embriyonik kök hücrelerinin bir yan ürünü olarak düflünü- lebilir. Gen hedefleme veya “ knock-out” tekno-
7
lojisinden sonra memelilerin geliflim biyolojisin- de, fötal yaflam›n idamesinde, organlar›n oluflu- munda görev alan sorumlu aflamalar›n tan›n- mas›nda önemli geliflmeler olmufltur. Capecc- hi’nin çal›flmalar› sayesinde özellikle do¤umsal malformasyonlara neden olan genetik bozuk- luklar daha iyi anlafl›lmaya bafllanm›flt›r. Smit- hies de kistik fibrozis veya talassemi gibi baz›
kal›tsal hastal›klar›n yan›nda aterosklerozis ve hipertansiyonda yeni “knock-out” fare modelle- ri gelifltirmifltir. Gen-hedefleme veya “knock- out fare” modelleriyle yaflam›n ilk evrelerinden, embriyo, fetüs ve yafllanmaya kadar tüm nor- mal geliflim biyolojisinin çal›fl›lmas› mümkün görünmektedir.
Martin Evans, ayn› teknolojiyle kistik fib- rozis ve di¤er kal›tsal hastal›klar için “knock- out” fare modelleri oluflturmufl ve gen-tedavisi- nin etkilerini ölçebilecek sistemler gelifltirmifltir.
Farelerde gen-hedefleme (knock-out fare mode- li) günümüzde biyolojik ve t›p bilimlerine en çok katk›da bulunabilecek bulufllardan biri du- rumuna gelmifltir.
“Knock-out fare” modelleri yard›m›yla ge- nomdaki her bir genin görevi çok daha güveni- lir ve kolay anlafl›labilir hale gelmifltir. Fare ve insan genomlar›n›n 2000-2001 y›llar›ndan sonra çözümü sonucu önümüze ç›kan binlerce yeni genin fonksiyonlar› bu teknoloji sayesinde anla- fl›labilmektedir. Fareden elde edilen bilgilerle insan genlerinin de önemli bir bölümü çözüm- lenmektedir, çünkü fare genlerinin sekanslar›
% 95 oran›nda insan genlerine eflde¤er özellik tafl›maktad›r. Araflt›rmac›lar, insanda s›k rastla- nan aterosklerozis, kistik fibrozis, diabetes mel- litus ve kanser gibi hastal›klar da dahil olmak üzere “knock-out fare” modeli gelifltirmifllerdir.
KAYNAKLAR
1. Capecchi MR: High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mam- malian cells, Cell 1980;22(2):479-88.
2. Capecchi MR: The new mouse genetics: Altering the genome by gene targeting, Trends Genet 1989;5(3):70-6.
3. Capecchi MR: Generating mice with targeted mu- tations, Nat Med 2001;7(10):1086-90.
4. Doetschman T, Gregg RG, Maeda N et al: Targe- ted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells, Nature 1987;330(6148):576- 8.
5. Evans MJ: The isolation and properties of a clonal tissue culture strain of pluripotent mouse terato- ma cells, J Embryol Exp Morphol 1972;28(1):163- 76.
6. Evans MJ, Kaufman MH: Establishment in cultu- re of pluripotential cells from mouse embryos, Nature 1981;292(5819):154-6.
7. Ishibashi S, Brown MS, Goldstein JL, Gerard RD, Hammer RE, Herz J: Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knock-out mice and its reversal by adeno-virus mediated gene deli- very, J Clin Invest 1993;92(2):883-93.
8. Martin GR: Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells, Proc Natl Acad Sci (USA) 1981;78(12):7634-8.
9. Martin GR, Evans MJ: The morphology and growth of a pluripotent teratocarcinoma cell line and its derivatives in tissue culture, Cell 1974;2(3):163-72.
10. Papaioannou VE, McBurney M, Gardner RL, Evans MJ: Fate of teratocarcinoma cells injected into early mouse embryos, Nature 1975;258(5530):
70-3.
11. Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS: Insertion of DNA sequences in- to the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination, Nature 1985;317 (6034):230-4.
12. Smithies O, Maeda N: Gene targeting approaches to complex genetic diseases: Atherosclerosis and essential hypertension, Proc Natl Acad Sci (USA) 1995;92(12):5266-72.
13. Thomas KR, Capecchi MR: Site-directed mutage- nesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells, Cell 1987;51(3):503-12.
14. Thomas KR, Capecchi MR: Targeted disruption of the murine int-1 proto-oncogene resulting in se- vere abnormalities in midbrain and cerebellar de- velopment, Nature 1990;346(6287):847-50.
15. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al:
Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts, Science 1998;282(5391):1145-7.
16. www.nobelprize.org
8
