T.C
NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ
KOORDİNASYON BİRİMİ(NKÜBAP) BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
SONUÇ RAPORU
NKUBAP.00.20.AR.14.17 nolu proje
Bir Tümör Nekroz Faktörü-Alfaİnhibitörü olan İnfliksimab'ın Sıçanlardaki Bleomisin Kaynaklı Akciğer Fibrozisi
Üzerine Koruyucu Etkisi
Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Nejat Altıntaş Araştırmacı: Yrd. Doç. Dr. Nejat Altıntaş
2
Önsöz
İdiopatik pulmoner fibrozis akciğerlerin fibrozisi ile giden, yaşam süresi bir çok kanserden bile daha kısa olan, hali hazırda hiç bir tedavisi olmayan bir hastalıktır.
Fibrozis mekanizmasında inflamasyon ve sonucunda fibroblast artışı olduğu gösterilmiştir. Tedaviye yönelik bir çok ilaç, insan ve hayvan deneylerinde denenmiş başarılı sonuçlar elde edilememiştir. Anti-inflamatuar bir ilaç olan infliximab gerek hayvan gerek ise insan çalışmalarında akciğer fibrozisi üzerine etkileri çalışılmamıştır. Çalışmamızın amacı infliximabın sıçan akciğerinde geliştirilen akciğer fibrozisi üzerine etkilerini araştırmak. Bu Proje Namık Kemal Üniversitesi tarafından Bilimsel Araştırma Projesi olarak desteklenmiş, çalışma başarıyla tamamlanmıştır.
Çalışmanın bilime yüksek katkısından dolayı bir SCI dergi (Inflammation dergisi, DOI 10.1007/s10753-015-0224-z) tarafından hemen kabul edilerek basılmıştır.
03/01/2017
Yrd. Doç Dr. Nejat Altıntaş
3
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
İNGİLİZCE ÖZET ... 4
TÜRKÇE ÖZET ... 6
GİRİŞ ... 8
GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 10
SONUÇLAR ... 15
TARTIŞMA ... 20
REFERANSLAR ... 27
TABLO 1 ... 35
TABLO 2 ... 36
ŞEKİL 1 ... 37
ŞEKİL 2 ... 38
ŞEKİL 3 ... 39
ŞEKİL 4 ... 40
ŞEKİL 5 ... 41
ŞEKİL 6 ... 42
4
Protective Effect of Infliximab, a Tumor Necrosis Factor-Alfa Inhibitor, on Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Rats
We aimed to investigate the preventive effect of Infliximab (IFX), a tumor necrosis factor (TNF)-α inhibitor, on bleomycin (BLC)-induced lung fibrosis in rats. Rats were assigned into four gr- oups as follows: I—BLC group, a single intra-tracheal BLC (2.5 mg/kg) was installed; II—control group, a single intra-tracheal saline was installed;
III—IFX+BLC group, a single-dose IFX (7 mg/kg) was administered intraperitoneally (i.p.), 72 h before the intra-tracheal BLC installation; IV—IFX group, IFX (7 mg/kg) was administered alone i.p. on the same day with IFX+BLC (group 3) group. All animals were sacrificed on the 14th day of BLC installation. Levels of tumor necrosis factor (TNF)-α, transforming growth factor (TGF)-β, interleukin (IL)-6, periostin, YKL- 40, nitric oxide (NO) in rat serum were measured, as well as, myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathi-one peroxidase (GPx) activity, and reduced glutathione (GSH), hydroxyproline, malondialdehyde (MDA) content in lung homogenates. Lung tissues were stained with hematoxylin and eosin (H&E) for quantitative histological evaluation. The inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and cell apoptosis in the lung tissues were determined quantitatively by immunohistochemical staining (INOS) and by TUNNEL staining, respectively. BLC installation worsened antioxidant status (such as SOD, CAT, GPx, GSH, MPO), while it increased the serum TNF-α, TGF-β, IL-6, periostin, YKL-40, and lipid peroxidation, and collagen deposition, measured by MDA and hydroxyproline, respectively. IFX pretreatment improved antioxidant status as well as BLC-induced lung pathological changes, while it decreased the TNF-α, TGF-β, IL-6, periostin, YKL-40, lipid peroxidation and collagen deposition. Finally, histological, immunohistochemical, and TUNNEL evidence also supported the ability of IFX to
5
prevent BLC-induced lung fibrosis. The results of the present study indicate that IFX pretreatment can attenuate BLC-induced pulmonary fibrosis.
Key Words: idiopathic pulmonary fibrosis; inflammation; infliximab; lung fibrosis;
transforming growth factor- beta; tumor necrosis factor-alpha; tumor necrosis factor- alpha inhibitors.
6
Bir Tümör Nekroz Faktörü-Alfa İnhibitörü olan İnfliksimab'ın Sıçanlardaki Bleomisin Kaynaklı Akciğer Fibrozu Üzerine Koruyucu Etkisi
Bir tümör nekroz faktörü (TNF) -α inhibitörü olan İnfliksimab'ın (IFX), sıçanlarda bleomisin (BLC) ile indüklenen akciğer fibrozu üzerine koruyucu etkisini araştırdık.
Sıçanlar aşağıdaki gibi dört gruba ayrıldı: I-BLC grubu, intratrakeal BLC (2.5 mg / kg) verildi; II-kontrol grubu, intra-trakeal salin verildi; III-IFX + BLC grubu, tek doz IFX (7 mg / kg) intra-peritoneal (i.p.)olarak72 saat önce, intratrakeal BLC veriliminden önce uygulandı; IV-IFX grubu, IFX (7 mg / kg) tek başına i.p. olarak IFX + BLC (grup 3) grubu ile aynı gün. Bütün hayvanlar, BLC verildikten 14 sonra sakrifiye edildi. Sıçan serumunda tümör nekroz faktörü (TNF) -α, transforme edici büyüme faktörü (TGF) -β, interlökin (IL) -6, periostin, YKL-40, nitrik oksit (NO) seviyeleri yanı sıra akciğer homojenatlarında da miyeloperoksidaz, süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutation peroksidaz (GPx) aktivitesi ve redükte glutatyon (GSH), hidroksiprolin, malondialdehit (MDA) içeriği ölçüldü. Akciğer dokuları, kantitatif histolojik değerlendirme için hematoksilen ve eozin ile boyandı (H & E). Akciğer dokularında indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekspresyonu ve hücre apoptozu sırasıyla immünhistokimyasal boyama (INOS) ve TUNEL boyama ile kantitatif olarak belirlendi. BLC verilmesi serum TNF-α, TGF-β, IL-6, periostin, YKL-40 seviyesini artırdı, antioksidan durumunu kötüleştirdi (SOD, CAT, GPx, GSH, MPO gibi) ayrıca MDAile ölçülen lipid peroksidasyonu ve hidroksiprolin ile ölçülen kollajen depolanmasını artırdı. IFX ön-muamelesi TNF-α, TGF-β, IL-6, periostin, YKL-40, lipid peroksidasyonu ve kollajen depozisyonunu düşürürken, antioksidan durumunu ve BLC'nin indüklediği akciğer patolojik değişikliklerini düzeltti. Son olarak, histolojik, immünohistokimyasal ve TUNNEL boyoma, IFX'in BLC'ye bağlı akciğer fibrozunu
7
önlediğini destekledi. Bu çalışmanın sonuçları, IFX ön-muamelesinin BLC ile uyarılan pulmoner fibrozu hafifletebildiğini göstermektedir.
Anahtar kelimeler: idiyopatik pulmoner fibrozis; inflmasyon; Infliximab; Akciğer fibrozisi; transforme edici büyüme faktörü-beta; Tümör nekroz faktörü-alfa; Tümör nekroz faktörü-alfa inhibitörleri.
8
Bir Tümör Nekroz Faktörü-Alfa İnhibitörü olan İnfliksimab'ın Sıçanlardaki Bleomisin Kaynaklı Akciğer Fibrozu Üzerine Koruyucu Etki
Pulmoner fibrozis, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) de dahil olmak üzere interstisyel akciğer hastalıklarının son aşamasını temsil eder. İPF, sinsice ilerleyen, yüksek yıkıma sebep olan ve tanıdan itibaren 3 yıllık bir sağkalıma sahip olan bir hastalıktır. Anahtar patolojik mekanizmaların tam olarak anlaşılamamasından dolayı tedavi seçeneleri azdır [1]. Alveoler epitel hasarının fibroblast proliferasyonuna, aşırı kollagen depozisyonuna ve diğer hücre dışı matris proteinlerinin birikmesine neden olduğuna dair mevcut kanıtlar akciğerlerin sertleşmesine neden olur ve alveolar alanların hassas dantele benzeri yapısını bozar. Sonunda, pulmoner fonksiyonlar zayıflar ve solunum yetmezliği ve ölüme yol açar. Bu nedenle, pulmoner fibrozu hafifletmek için etkin ajanlarda tedavisi umut edilmektedir[2]. Akciğer fibrozunun bleomisin (BLC) ile yapılan hayvan modeli, elde edilmesi oldukça basit, ve kabul edilebilir bir hayvan modelidir ve bir hayvan modelinden istenen kriterleri yerine getirir, trakeaya BLC verilmesi tipik insan interstisyel akciğer fibrozunun özelliklere neden olur: intra-alveoler tomurcuklar, alveoler boşluk obliterasyonu ve kolajenin duvarla birleştirilmesine neden olur[3]. Trakea içi BLC uygulaması granülositlerin akımınıı sağlar, granülositler pro-inflamatuar salımını arttırarak hidrojen peroksitler (H2O2), süperoksit anyon radikal (-O) ve hidroksil radikaller (-OH) gibi reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır, DNA hasarına, lipidlerin peroksidasyonuna, karbonhidratların oksidasyonuna ve sonuç olarak akciğer prostaglandinlerinin sentezinde ve bozulmasında değişikliğe neden olan proteolitik enzimlerle birlikte tümör nekroz faktörü (TNF) -α gibi sitokinler [4]. Hasarlanma, iltihaplanma ve sitokin salınımındaki değişiklikler fibroblast aktivasyonunda artışa ve kollajen üretiminde artışa neden olurken, kollajen degradasyonunu azaltır [5].
9
Öncelikle aktive edilmiş makrofajlar ve T lenfositler tarafından sentezlenen, bir proinflamatuvar sitokin olan TNF-α vazodilatasyonu indükler ve vasküler permeabiliteyi, nihayetinde ekstravazasyonu ve polimorfonükleer hücrelerin sitotoksisitesini arttırır [6]. TNF-α'nın, IPF'li hastaların cerrahi biyopsilerinde tanımlandığı ve deneysel olarak TNF-α'nın bloke edilmesinde pulmoner fibrozisin azalmasına yol açtığı [8], kollajen sentezinin yolağında rolü olduğu hipotezi ileri sürülmüştür [8] . Karşıt görüş olarak, TNF-α, uzun zamandır anti-fibrotik bir sitokin olarak kabul edilmiştir; In vitro ve in vivo çalışmalar, farklı organ sistemlerinde TNF- α'nın anti-fibrotik etkilerini gösterdi [9, 10]. Infliximab (IFX), kimerik bir yapıya ve TNF- α'ya karşı yüksek bir afiniteye sahip olan insan immünoglobulin G1'dir [11]. IFX'in insan epitel hücreleri, endotelyum hücreleri ve fibroblastlar kullanan farklı invitro biyoassaylarda TNF-α aktivitesini engellediği gösterilmiştir [12]. IFX'in, oksijen serbest radikallerini temizleyerek, proinflamatuvar sitokin kaskadını inhibe ederek, inflamasyon bölgesine lökosit göçünü azaltarak, vasküler geçirgenliği azaltarak ve anjiyojenezi azalttığı gösterilmiştir. Bu nedenle, bu sitokinlerin doğrudan etkisini bloke ederek doku hasarını azaltır [11].
IFX tedavisinin Janus (ters iki yöne bakan roma tanrısı)Yüzü; IFX kullanımı bazı çalışmalarda pulmoner fibrozisli hastalarda iyileşmelere neden olmuştur [13, 14].Diğer taraftan da IFX tedavisi sırasında pulmoner fibrozis geliştiği diğer çalışmalarda bildirilmiştir [15,16].
Bu konu tartışma konusudur ve bugüne kadar IFX ön-tedavisi ile sıçanlarda BLC ile indüklenen pulmoner fibrozisi üzerinde biyokimyasal ve histopatolojik değişiklikler bildirilmediğinden, bu çalışmanın iki amacı vardır; İlk önce, IFX ön- tedavisinin BLC ile indüklenen akciğer fibrozisi üzerindeki koruyucu etkisini araştırın, ikincisi IFX'in pulmoner fibroz gelişimine olan etkisini araştırmak.
10
GEREÇ VE YÖNTEMLER Hayvanlar
Erkek Wistar Albino sıçanları (10 haftalık, 280-320 g), Namık Kemal Üniversitesi, Laboratuar Hayvanlar Araştırma Merkezi'nden temin edildi ve standart sıcaklık (22 ± 2 ° C) ve nem oranı (60 ± 5 ° C) altında ayrı kafeste barındırıldılar. %) - kontrollü oda, 12 saat aydınlık ve karanlık bir dönüşüm döngüsü ile. Sıçanlar, çalışmaya başlamadan önce 3 gün boyunca ortama alıştırıldı ve peletlenmiş sıçan yiyecek ve suyun ad libitum ile beslendi.
Çalışma, Yerel Hayvan Etik Kurulu (referans numarası: 2014 / 07-04) tarafından onaylanmış ve "Laboratuar hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuz" [17]
uyarınca gerçekleştirilmiştir.
Deneysel tasarım
Otuz iki sıçan, aşağıdaki gibi dört deney grubunanaher bir gruba sekiz hayvan olacak şekilde rasgele ayrıldı: (1) BLC grubu; (2) kontrol grubu; (3) IFX + BLC grubu ve (4) IFX grubu.
Kontrol ve BLC gruplarındaki sıçanlara tartılarak, standart protokol uyarınca intraperitoneal (i.p.), ketamine (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve xylazine (20 mg / kg vücut ağırlığı) kombinasyonu kullanılarak anestezi uygulandı [18]. Boynundan orta hat kesisi yapıldı ve trakea künt diseksiyon açığa çıkarıldı. Trakeal kanül (iç çap = 2 mm, uzunluk = 2.5 cm) doğrudan görerek trakeaya sokuldu.
1) BLC grubu; Intravenöz pulmoner fibrozis indüksiyonu için 0.25 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözülmüş 2.5 mg / kg vücut ağırlığı BLC sülfattan (Kocak Farma, Tekirdağ, Türkiye) tek bir doz verildi [19].
2) Kontrol grubu (sahte ameliyat sıçanları); Aynı gün BLC grubu ile aynı miktarda intra-trakeal salin verildi.
11
Hayvanlar, BLC'nin ve salinin akciğer boyunca dağılımını kolaylaştırmak için çalkalandı.
3) IFX + BLC grubu; BLC verilmeden 72 saat önce intraperitoneal (i.p.) 0.25 mL PBS içinde çözülmüş 7 mg / kg IFX (Remicade, Schering-Plough (Brinny) Company, Innishannon, Irlanda) tek bir doz aldı.
4) IFX grubu: IFX + BLC grubu ile aynı gün 7 mg / kg IFX tek başına i.p. aldı.
Deneysel sıçan model çalışmaları,Index Medicus veri tabanında araştırılarak, doku hasarına karşı korunmada en etkili IFX dozu [20] ve akciğer fibroz modelini indüklemede etkili BLC dozu bulundu [19].
Dört gruptaki tüm sıçanlar, BLC uygulamasının 14. gününde derin anestezi altında eksanguinasyon (ketamin, ksilazin) ile öldürüldü. Deneyin sonunda, akciğer dokuları numuneleri hızla hasat edildi ve soğuk salin ile yıkandı. Akciğerin sağ kesiti cam şişeye kondu, etiketlendi ve -80 ° C'de biyokimyasal analizler yapılıncaya kadar saklandı ve akciğerin sol kısmı ışık mikroskobu ile rutin histopatolojik ve immünohistokimyasal inceleme için Bouin solüsyonuna yerleştirildi.
Histopatolojik Değerlendirme
Akciğer örnekleri ayrı ayrı Bouin'in solüsyonuna batırılmış, alkol içinde dehidre edilmiş ve parafin içine gömüldü. 5 um'lik kesitler elde edildi, deparafinize edildi ve standart prosedürler kullanılarak hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson trikromu ile boyandı. Akciğer dokuları incelendi ve bir histolog tarafından standart ışık mikroskopisi ile değerlendirildi. Akciğer dokusu inflamasyonu derecesi, H & E boyama yöntemi ile kantitatif olarak değerlendirildi. Ciddiyete göre 0-4 arası skorlar atandı ve skorlar grup başına ortalaması alındı [21]. Fibrotik dereceyi araştırmak için Masson trikrom boyama yöntemi kullanıldı. Hubner ve ark. Tarafından tanımlanan kantitatif gradyan sistemini kullanarak fibrozun şiddetini belirlemek için art arda artan
12
mikroskopik büyütme alanları kullanıldı. [22]. Pulmoner fibrozis derecesi, örnek başına × 200 büyütme ile rasgele seçilen 10 bölge incelenerek skorlandı. 0 (normal akciğer) ila 8 (toplam fibroz) arasında bir skor belirlendi ve skorlar grup başına ortalaması alındı.
İmmunohistokimyasal ve TUNEL Testi Değerlendirmesi
İmmünositokimyasal reaksiyonlar, Hsu ve ark. tarafından tarif edilen avidin-biyotin kompleks tekniğine göre gerçekleştirildi. [23]. Kesitler, spesifik poliklonal anti- indüklenebilir nitrik oksit sentaz (INOS) antikoru (Kat. # RB-1605-P, Neomarkers, ABD) ile inkübe edildi.
Apoptoz, terminal dUTP nick uç-etiketleme (TUNEL) tahlili ile değerlendirildi. Yerinde apoptotik hücre ölümü sırasında çekirdekte DNA parçalanmasını saptayan TUNEL yöntemi bir apoptoz tespit kiti (ApopTag® Peroksidaz Yerinde Apoptoz Algılama Kiti, Kat., SL10, Millipore, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.
Akciğer dokusunda kontrol grubu ile deney grupları arasındaki farkları saptamak için, pozitif boyanma ve TUNEL hücre sayıları ve INOS, nicel olarak skorlandı [24]. Her bölümde rastgele seçilen beş adet yüksek güçlü lens görme alanı ile (× 400) değerlendirildi. Veriler, örnek başına INOS veya TUNEL pozitif hücre sayılarının ortalaması olarak ifade edildi.
Biyokimyasal Prosedürler
Dondurulmuş akciğer dokusu örnekleri küçük parçalara bölünmüş ve bir homojenleştirici (sarı çizgi DI25 dijital, IKA, Burladingen, Almanya) ile 16,000 rpm'de 3 dakika boyunca 2 mL Tris-HC1 tamponu (pH 7.4) içinde homojenize edildi.
Homohidratlar, malondialdehit (MDA) ve nitrik oksit (NO) seviyelerini ölçmek için kullanıldı. Homojenatlar daha sonra, kalıntıları temizlemek için 60 dakika boyunca
13
5000 x g'de santrifüj edildi. Berrak üst süpernatant sıvı alındı ve katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve miyeloperoksidaz (MPO) aktiviteleri için denendi.
Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Toplam süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi, Sun ve ark.'nın yöntemine göre belirlendi. [25]. Yöntemin ilkesi, bir süperoksit üreteci olarak ksantin-ksantin oksidaz sistemi ile nitro mavi tetrazolyum (NBT) redüksiyonunun inhibisyonuna dayanmaktadır. Aktivite, aynı hacimdeki numuneye 1.0 mL etanol / kloroform karışımı (5/3, hacim / hacim) ilave edildikten sonra lisatın etanol fazında değerlendirildi ve santrifüje tabi tutuldu. Bir birim SOD, NBT redüksiyon hızında% 50 inhibisyona neden olan enzim miktarı olarak tanımlandı. SOD aktivitesi mg protein başına birim olarak ifade edildi (U / mg protein).
Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi
Toplam CAT aktivitesi, hidrojen peroksidin parçalanması ölçülen Luck Yöntemi [26]
ile değerlendirildi. Kısaca bilinen bir miktarda doku homojenatı% 0.01 soğutulmuş digitonin'e eklenir ve 4 ° C'de santrifüjlenir ve doku homojenatının üst sıvısının 0.05 mL'si 3 mL H202 fosfat tamponu ile karıştırılır. Absorbsiyon değişikliği 240 nm'de 30 saniyelik aralıklarla kaydedildi. Sonuçlar gram protein başına kilogram olarak ifade edildi (K / g protein).
Glutatyon Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi
GPx'in aktivitesi, Paglia ve Valentine tarafından daha önce tarif edilen yöntemle ölçülmüştür [27]. Bir enzimatik reaksiyon, glutatyon redüktaz, indirgenmiş glutatyon (GSH), sodyum azid, NADPH2 içeren bir tüp içine H20 eklenerek başlatıldı ve 340 nm'lik absorbans değişikliği bir spektrofotometre ile izlendi. Aktivite miligram protein (U / mg protein) başına birim olarak verilir.
14
Redükte Glutation'ın Belirlenmesi
Akciğer dokusunda protein olmayan sülfidril olarak GSH içeriği, Ellman yöntemi ile analiz edildi [28]. Tert-bütilhidroperoksit substrat olarak kullanıldı. Test, oksidize glutatyon GSSG'den, glutatyon redüktaz (GR) ile birleşmiş enzimatik reaksiyonda geri kazanılan azaltılmış glutatyonun tüketilmesi yoluyla, H2O2'nin enzimatik olarak indirgenmesini glutatyon peroksidazı ile ölçer. GR, indirgeyici bir madde olarak NADPH'yi kullanarak GSSG'yi GSH'ye indirir. 340 nm'de kaydedilen absorbans düşüşü kaydedildi ve doku gramı başına mikromol olarak ifade edildi (μmol / g doku).
Myeloperoksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi
MPO'nun aktivitesi, H2O2 ile MPO aracılı oksidasyon için substrat olarak bir 4- aminoantipirin / fenol solüsyonu kullanılarak belirlendi ve 510 nm'de absorbans değişikliği kaydedildi [29]. MPO aktivitesinin bir birimi 25 ° C'de 1 μmol H2O2 / dk degradasyona neden olan miktar olarak tanımlandı. Sonuçlar, gram protein başına birim olarak verildi (U / g protein).
Malondialdehid İçeriğinin Belirlenmesi
Doku MDA düzeyleri, MDA'nın tiobarbitürik asit (TBA) ile 95.8 ° C'de reakte edilmesine dayanan Draper ve Hadley [30] yöntemi ile belirlendi.TBA test reaksiyonunda, MDA ve TBA reaksiyona girerek 532 nm'de en çok emilimi olan pembe bir pigment oluştururlar. Reaksiyon 95 ° C'de pH 2-3'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi. Örnek, proteinin çökeltilmesi için 2.5 hacim% 10 (a / h) trikloroasetik asit ile karıştırıldı. Çökelti, merkezkaçlama ile pellet haline getirildi ve süpernatan, kaynar su banyosu içinde 15 dakika boyunca% 0,67 TBA ile reaksiyona sokuldu.
Soğuduktan sonra emilim 532 nm'de okundu. Elde edilen keyfi değerler, bir dizi standart solüsyon (1,1,3,3-tetrametoksipropan) ile karşılaştırıldı. Sonuçlar gram doku başına nanomole (nmol / g doku) ifade edildi.
15
Nitrik Oksit Ölçümü
Biyolojik numunelerde NO ölçümü zor olduğundan, doku nitriti (NO-2) ve nitrat (NO- 3) seviyeleri, NO üretiminin bir indeksi olarak tahmin edilmiştir. Akciğer nitriti ve nitrat düzeyleri için yöntem Griess reaksiyonuna dayanmaktadır [31]. Kısaca nitrat, nitrat redüktaz ile nitrite dönüştürüldü ve nitratı derin-mor bir azo bileşimine dönüştüren akciğer homojenatına Griess reaktifi ilave edildi. Absorbans 550 nm'de ölçüldü ve nitrit konsantrasyonu standart olarak sodyum nitrit kullanılarak belirlendi. Sonuçlar, gram ıslak doku (litre mol / g doku) başına litre mol olarak ifade edilmiştir.
Akciğer Dokusunda Hidroksiprolin İçeriğinin Belirlenmesi
Akciğer dokularındaki hidroksiprolin düzeyleri Brown metoduyla spektrofotometrik olarak belirlendi [32]. Sonuçlar gram protein başına mikrogram (μg / g protein) olarak ifade edildi.
Tahmini Inflamatuar ve Fibroz belirteçlerinin ölçümü; TNF-α, TGF-β, IL-6, Periostin, YKL-40
Ticari enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) kitleri (eBioscience, Viyana, Avusturya) ile TNF-α, TGF-β, IL-6 konsantrasyonları ölçülmüştür. Periostin (MyBioSource, San Diego, California, ABD) ve YKL-40 (SunRed, Baoshan Bölgesi, Şangay) de imalatçının talimatlarına göre ticari ELISA tahlilleri ile ölçüldü.
SONUÇLAR
Histopatolojik Bulgular
Akciğer dokusunun histopatolojik değişikliklerini incelemek için Masson trikromu ve H & E boyaması yapıldı. Yalnız IFX ile tedavi edilen grubun akciğer yapısı kontrol grubununkine benzerdi; Akciğer dokuları, tipik açık alveol, özel terminal bronşlu inter- alveoler alanlar, bronşiyolar epitelin normal görünümü, ince interalveoler septa, inflamatuvar hücrelerin eksikliği ve fibrozizyokluğu idi(Şekil 1a, b).
16
Bununla birlikte, BLC grubunun akciğer dokusunda gözle görülür şekilde artmış histopatolojik anormallikler görüldü; intra alveoler septal kalınlaşma, geniş lifli alanlar ve çökmüş alveoler alanlardaki geniş alveol hasarı da vardı. Buna ek olarak, şiddetliInflamatuar hücre infiltrasyonu ve alveollerin çoğunun engellenmesi gözlendi.
Inflamatuar hücre infiltrasyonu ve alveollerin çoğunun tıkanması gözlendi.
İnflamatuvar hücreler interstisyumda, küçük hava yollarının çevresinde ve mukozal epitelde de belirgindi. Ayrıca, bu grupta önemli pulmoner ödem ve alveolar eksüda da gözlenmiştir (Şekil 1c-e). Aksine, IFX ön-muamelesi (BLC + IFX grubu), BLC kaynaklı akciğer dokusu hasarına karşı koruma sağlamıştır. Akciğer interstisyumu daha ince göründü ve iltihap hücrelerinin sayısı görünüşte azaldı. Buna ek olarak, infliksimab ile tedavi edilen sıçanlarda pulmoner ödem, alveolar eksüdat ve alveolar hava yolu patolojisi gözlemlendi (Şekil F1 ve Tablo 1).
Alveol duvarındaki birçok hücre, alveolar keseler ve alveolar kanallar, INOS için güçlü pozitifti (Şekil 3c, d). IFX'in ön tedavisi, INOS pozitif hücrelerin sayısını belirgin bir şekilde azaltmıştır (Şekil 3e ve Tablo 1).
Apoptotik alveolar hücrelerin sayısı BLC ile tedavi edilen grupta kontrol grubuna göre daha yüksekti ve tek başına IFX grubu ile tedavi edildi (Şekil 4a-c). IFX tedavisi, apoptotik alveolar hücrelerin sayısını belirgin bir şekilde azalttı (Şekil 4d ve Tablo 1).
Oksidatif Stres Parametrelerindeki Değişiklikler, Nitrik Oksit Seviyesi ve Hidroksiprolin İçeriği IFX ön-muamelesinin oksidatif stres parametreleri, nitrik oksit seviyesi ve akciğer homojenatlarının hidroksiprolin içeriği üzerindeki etkisi Tablo 2'de sunulmuştur.
İmmunohistokimyasal ve TUNEL Bulguları
Kontrol ve IFX tek başına gruplarla tedavi edilen, birkaç indüklenebilir NO sentaz (INOS) pozitif hücre gözlendi (Şekil 3a, b). BLC ile indüklenen akciğer fibrozu,
17
akciğer dokularındaki INOS pozitif hücrelerin sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden oldu.Alveol duvarındaki birçok hücre, alveolar keseler ve alveolar kanallar, INOS için güçlü pozitifti (Şekil 3c, d). IFX'in ön tedavisi, INOS pozitif hücrelerin sayısını belirgin bir şekilde azaltmıştır (Şekil 3e ve Tablo 1).
Apoptotik alveolar hücrelerin sayısı BLC ile tedavi edilen grupta kontrol grubuna göre daha yüksekti ve tek başına IFX grubu ile tedavi edildi (Şekil 4a-c). IFX tedavisi, apoptotik alveolar hücrelerin sayısını belirgin bir şekilde azalttı (Şekil 4d ve Tablo 1). Oksidatif Stres Parametrelerindeki Değişiklikler, Nitrik Oksit Seviyesi ve Hidroksiprolin İçeriği IFX ön-muamelesinin oksidatif stres parametreleri, nitrik oksit seviyesi ve akciğer homojenatlarının hidroksiprolin içeriği üzerindeki etkisi Tablo 2'de sunulmuştur.
1. Lipid Peroksidasyonu
Bu çalışma, BLC kurulumunun kontrol grubu (P <0.001) ve IFX grubu (P <0.001) ile karşılaştırıldığında lipid peroksidasyonunu belirten MDA düzeyini yükselttiğini gösterdi. Bununla birlikte, IFX uygulaması, tek başına BLC ile tedavi edilen gruba kıyasla lipit peroksidasyonunu önemli ölçüde azalttı (P <0.001).
2. Süperoksit dismutaz aktivitesi
BLC ile tedavi edilen sıçanlarda SOD aktivitesi kontrol grubuna (P <0.001) ve IFX grubuna (P <0.001) göre belirgin şekilde azaldı. IFX'in ön tedavisi antioksidan enzim SOD aktivitesini BLC grubuna kıyasla belirgin şekilde yeniden saklamıştır (P <0.001).
3. Katalaz aktivitesi
BLC ile tedavi edilen sıçanlarda akciğer homojenatındaki CAT aktivitesi, kontrol farelerine (P <0.001) ve IFX sıçanlara (P <0.001) göre anlamlı derecede düşüktü.
Bununla birlikte, IFX ön tedavi grubunda, CAD aktivitesi BLC grubundan kıyaslanamaz derecede yüksekti (p <0.001).
18
4. İndirgenmiş Glutatyon
Akciğer homojenatının GSH içeriği düzeyi BLC grubunda kontrol grubuna göre (P
<0.001) ve IFX grubunda (P <0.001) belirgin olarak daha düşüktü. Bununla birlikte, IFX kullanan sıçanlar, karşılık gelen BLC ile tedavi edilen sıçanlara kıyasla, GSH düzeylerini anlamlı olarak daha yüksek seviyede göstermiştir (P <0.001)
5. Glutatyon peroksit aktivitesi
Dokuda GPx aktivitesindeki azalma, dolaylı olarak serbest radikal üretimini gösterir.
GPx aktivitesi, kontrol grubuna (P <0.001) ve IFX grubuna (P <0.001) göre anlamlı şekilde azaldı. IFX uygulamasının GPx aktivitesini önemli derecede geri kazandığı bulundu.
6. Myeloperoksidaz aktivitesi
MPO'nun aktivitesi, kontrol grubu ve IFX grubu ile karşılaştırıldığında BLC maruziyeti ile arttırılmıştır. IFX'in kontrolü, MPO aktivitesini önemli ölçüde azalttı.
7. Nitrik Oksit
İNOS kaynaklı NO üretiminin artması, pulmoner fibroz üzerinde zararlı etkilere neden olur. Buna göre, kontrol grubundaki sıçanlara (P <0.001) ve IFX grubuna (P <0.001) kıyasla BLC ile indüklenen PF model sıçanlarında NO seviyesi yükselmiştir. IFX ön- muamelesi, BLC ile indüklenen NO düzeylerinin yükselişini BLC grubuna kıyasla önemli derecede bastırdı (P <0.001).
8. Hidroksiprolin içeriği
Hidroksiprolin ölçümü, kollajenin önemli miktarda amino asit bulunduğundan, kollajen depozisyonunun değerli bir göstergesidir. BLC ile doldurulan sıçanlardaki hidroksiproprol içeriği, kontrol grubuna (P <0.001) ve IFX grubuna (P <0.001) göre anlamlı olarak arttı. Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi, hidroksiprolin'i BLC grubuna kıyasla önemli ölçüde düşürdü (p <0.001).
19
Enflamasyon ve Fibrozun göstergeleri TNF-α Konsantrasyonu
TNF-α serum seviyeleri Şekil 2'de gösterildi. 5a. TNF-α düzeyleri BLC grubunda belirgin olarak daha yüksek bulundu(93.4 ± 7.2 pg / mL, P <0.001) ve IFX grubuna (100.7 ± 11.4 pg / mL, P <0.001) göre istatistiksel olarak anlamlı farklılık (146.9 ± 10.9 pg / mL) bulundu. Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi BLC grubuna kıyasla TNF-α seviyelerini (101.1 ± 4.9 pg / mL) önemli ölçüde azalttı (P <0.001).
TGF-β Konsantrasyonu
TGF-β serum düzeyleri Şekil 2'de sunulmuştur. 5b. TGF-β düzeyleri BLC grubunda (76.2 ± 8.4 pg / mL) kontrol grubuna (35.6 ± 5.8 pg / mL, P <0.001) ve IFX grubuna (37.7 ± 7.4 pg / mL, P <0.001) göre belirgin olarak yüksek bulundu. Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi TGF-β düzeylerini (50.6 ± 7.1 pg / mL) BLC grubuna kıyasla önemli ölçüde azalttı (P <0.001).
IL-6 Konsantrasyonu
Serum IL-6 seviyeleri Şekil 3'de gösterildi. 5c. IL-6 düzeyleri kontrol grubuna (42.8 ± 2.9 pg / mL, P <0.001) ve IFX grubuna (42.9 ± 2.9 pg / mL, P <0.001) göre BLC grubunda (58.9 ± 1.5 pg / mL) belirgin olarak daha yüksek bulundu. Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi, BLC grubuna kıyasla IL-6 düzeylerini (44.9 ± 3.3 pg / mL) önemli ölçüde azalttı (P <0.001).
Periostin Konsantrasyonu
Şekil 1'de periostinin serum seviyeleri gösterildi. 5d. Periostin düzeyleri BLC grubunda (204.6 ± 11.1 pg / mL) kontrol grubuna (170.7 ± 11.5 pg / mL, P <0.001) ve IFX grubuna (170.5 ± 17.6 pg / mL,P<0.001) göre anlamlı derecede yüksek bulundu.
Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi, periostin düzeylerini (178.9 ± 13.2 pg / mL) BLC grubuna kıyasla önemli ölçüde azalttı (P <0.001).
20
YKL-40 Konsantrasyon
YKL-40'ın serum seviyeleri Şekil 1'de sunulmuştur. 5e. YKL-40 düzeyleri BLC grubunda (42.9 ± 4.6 ng / mL) kontrol grubuna (29.2 ± 4.4 ng / mL, P <0.001) ve IFX grubuna (33.1 ± 1.4 ng / mL, P <0.001) göre anlamlı derecede yüksek bulundu.
Bununla birlikte, IFX ön-muamelesi BKK grubuna kıyasla YKL-40 düzeylerini (34.1 ± 2.3 ng / mL) belirgin olarak düşürdü (P <0.001).
TNF-α ve TGF-β arasındaki korelasyon
Pearson korelasyonu, Şekil 6'da gösterildiği gibi, TNF-α ve TGF-β arasında güçlü bir pozitif korelasyon olduğunu göstermiştir (r = 0.789, P <0.001).
TARTIŞMA
Bu çalışma, IFX ön tedavisinin, sıçanlarda BLC ile indüklenen akciğer fibroz modelinin kantitatif histopatolojik, immünohistokimyasal ve TUNNEL değerlendirmesinden ölçülen inflamatuvar ve fibrotik cevabı önlediğini göstermektedir. Buna ek olarak, IFX'in hasar gören akciğer dokusunda TNF-α, TGF- β, IL-6, periostin, YKL-40, lipid peroksidasyonu, kollajen birikimi ve artan antioksidan enzim aktivitelerini azaltarak BLC'nin indüklediği fibrozu hafiflettiğini önermektedir.
Sıçanlarda IFX kendi başına pulmoner fibrozise neden olmaz. Bildiğimiz kadarıyla bu, hayvan modelinde BLC ile indüklenen akciğer fibrozu üzerindeki IFX'in ön tedavisinin etkisini değerlendiren ilk çalışmadır.
Bu çalışmada, akciğer fibrozu için Wistar albino sıçan modeli kullanılmıştır.
Akciğer fibrozu, tek doz intra-trakeal BLC instilasyonu ile oluşturuldu. BLC uygulaması, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve geniş kollajen birikimi ile peribronşiyal ve perialveolar sepranın kalınlaşmasını üretti. Ayrıca akut akciğer hasarı ve pulmoner
21
fibrozu taklit ederek, paranki- nin tıkanıklığı, alveoler boşluğun obliterasyonu ve epitel apoptozunda bir artış gözlenmiştir [5, 33].
Oksidan ve antioksidan savunma mekanizmaları arasındaki dengesizlik doku hasarına katkıda bulunabilir. BLC idaresi, ROS ve reaktif nitrojen türlerini arttırarak ve SOD, CAT, GPx ve GSH gibi antioksidan mekanizmaları azaltarak inflamasyon ve oksidatif stres, dolayısıyla doku hasarını indükler. [24]. Yapısal hücre apoptozuna, lipid peroksidasyona ve TNF-α ve IL-6 gibi pro-inflamatuvar sitokin sentezninin düzeltilmesinde ROS'un önemli rol oynadığına dair kanıtlar bulunmaktadır [34] ve bu da akciğer endotelini artırır Inflamatuvar hücrelerin ekstravazasyonu ve sitotoksisitesi ve doku hasarı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir [35].
Bu çalışmada, BLC verilmesi inflamasyon ve oksidatif strese yol açtı; bunlar öncelikle akciğer dokusunun H & E boyaması, ikinci olarak MPO aktivitesinin artmasıyla teyit edildi; Üçüncü olarak antioksidan enzimlerin SOD, CAT, GPx ve substrat GSH düzeylerini kontrol grubuna kıyasla artmış polimorfonükleer lökosit (PMN) aktivitesini belirtirken, nihayetinde yüksek lipid peroksidasyon ürünü olan MDA ), Aynı zamanda oksidatif stresin bir işaretidir.Dahası, BLC ile tedavi edilen grupta TNF-α ve IL-6 düzeylerinde belirgin artış bulundu. IFX, TNF-α'nın direkt etkisini ve bunların oksidatif stres uyarımı- nı bloke ederek inflamasyonu, dolayısıyla doku hasarını azaltır [36].
Yara ve ark. Anti-TNF-α antikorunun uygulanmasının BLC ile indüklenen akciğer hasarını baskılamak için yararlı olduğunu göstermiştir [37]. Yeniden gönderilen çalışmada, IFX uygulaması, inflamatuvar hücre infiltrasyonu, MDA, MPO, TNF-α, IL-6 düzeylerini azaltarak, ancak SOD, CAT, GPx ve GSH düzeylerini artırarak inflamasyonu ve oksidatif stresini önemli ölçüde azalttı.
Oksidatif ortam, dolayısıyla TNF-α gibi artmış sitokin salınımı, NO sentezleyen enzim olan indüklenebilir NO sentezinin (INOS veya NOS2) ekspresyonunu aktive eder.
22
INOS'un aşırı ekspresyonundan kaynaklanan aşırı üretimin NO'nun hayvan modellerinde ve insanlarda pulmoner fibrozun başlangıcında önemli bir rolü olduğu gösterilmiştir [38]. Zhu ve arkadaşları, INOS ekspresyonunu baskılamanın BLC ile uyarılan pulmoner fibroziyi iyileştirdiğini gösterdi [38]. Çalışmamızda, BLC uygulaması, INOS immün boyamayla nicel olarak gösterilen INOS ifadesini artırdı.
Bununla birlikte, IFX tedavisi INOS ekspresyonunu azaltmıştır. INOS aktivitesini azaltarak IFX'in fibrozis geliştireceği mekanizmalardan biri olabileceğini öneriyoruz.
Halen, güçlü kanıt pulmoner fibrozun tekrarlayan epitel hasarının ve apoptozun bir sonucu olduğunu, bunu takiben yetersiz yeniden epitelyalizasyon ve abartılı yara iyileşmesinin olduğunu ispatlamaktadır [39]. TNF-α, vasküler bariyerin bütünlüğünü tehlikeye atan endotel hücrelerinde kaspaz enzim sistemini aktive ederek apoptosise yol açar [40]. Çalışmamızda, trakea içi BLC doğumu apoptozu arttırdı, ancak IFX, TUNEL boyaması ile gösterilen apoptozu iyileştirdi.
BLC modelindeki fibrozun, fibroblastların aktivasyonunda ve ardından fibrozda kritik bir rol oynayabilecek akut akciğer hasarı ve inflamasyonun erken indüksiyonuna bağımlı olduğu bilinmektedir [41]. Bir çalışmada, artmış sitokinler ile pulmoner fibroz arasında yakın ilişki gösterildi [42]. BLC ile indüklenen akciğer fibrozisindeki sitokinlerin rolünü değerlendiren bir başka çalışma, BLC'nin IL-6 ekspresyonuna neden olduğunu ve diğer sitokinlerin BLC hasarını şiddetlendirebileceğini öne sürdü [43]. Yapılan çalışmada önceki çalışmalarda BLC grubundaki inflamatuvar sitokin IL- 6'nın anlamlı olarak arttığı ve IFX tedavisinin IL-6 düzeyini anlamlı olarak azalttığı gösterilmiştir.
Bir matrixcellular protein olan periostin, fibrozu arttırır ve IPF'li hastalarda bozulmayı belirtir. Periostin, BLC kaynaklı fibroproliferatif fazı etkilerAkciğer hasarı [44]. Son zamanlarda, Uchida ve arkadaşları, BLC'ye maruz kalmanın periostinin aşırı
23
ekspresyonunu başlattığını ve buna ek olarak periostinle nakavt edilen farelerin BLC'nin indüklediği akciğer fibrozundan korunduğunu gösterdi [44]. Ayrıca, mekanik çalışmaları, periostinin BCR hasarına yanıt olarak nötrofillerin ve makrofajların uygun kemokin salınımı ve toplanması için şart olduğunu savunuyor. Buna göre, bu çalışmada, BLC'ye maruz kalmış sıçanlarda artmış periostin seviyeleri gözlemlenirken IFX'in uygulanması ile belirgin olarak azalmıştır.
Memeli kitinaz benzeri proteinlerin bir üyesi olan YKL-40, iltihaplanma koşullarında yükselir. Ayrıca, fibroblast büyümesini stimüle ettiği gösterilmiştir ve doku remodelinginde yer alabilir [45]. Son zamanlarda immünhistokimyasal incelemede, IPF'li hastalarda fibrotik lezyonların yakınında alveolar makrofajlar ve alveolar epitel hücreleri tarafından eksprese edilecek YKL-40 gösterilmiş ve bu hastaların serum ve akciğerlerinde arttığı gösterilmiştir [46]. Korthagen ve ark. YKL-40 düzeyleri artmış IPF hastalarının sağkalım sürelerinin anlamlı olarak daha kısa olduğunu göstermiştir [45]. Bu çalışmada, BLC uygulaması YKL-40 düzeyini anlamlı olarak artırırken, IFX ön tedavi ile azalmıştır.
Aktive alveolar makrofajlar, nötrofiller ve endotel hücreleri tarafından salgılanan TGF- β, pulmoner fibrozda temel bir sitokindir. TGF-β, fibroblastların proliferasyonunu indükler ve otokrin stimülasyon ile özerk fibroblast aktivasyonunu düzenler. TNF-α sinyallerine endothelial hücreler TGF-β salınması için ihtiyaç duyulmaktadır [35].
Oikonomou ve arkadaşları, TNF-α'nın makrofaj / fibroblastı TGF-β üretimi için uyartığını gösterdi [47]. Çalışmamız, önceki çalışmalarla uyumlu olarak, Şekil 1'de gösterildiği gibi, TNF-α ve TGF-β arasında güçlü bir pozitif korelasyon mevcuttu. 6.
Ayrıca, TNF-α'nın fibrotik etkisini TGF-β'ya uyguladığını düşündüren IFX tedavisi ile TGF-β seviyesi düşmüştür.
24
Son veriler, TNF-α'nın kollajen üreten miyofibroblastları uyararak ve kollajen yıkımında rol oynayan matriks metallo- proteinaz-2 (MMP2) aktivitesini azaltarak kollajenin çökelmesine katkıda bulunduğunu göstermektedir [48]. Anti-TNF-α antikorları ile tedavi edilen BLC-aşılanmış TNF-α reseptör çift knockout farelerinde yapılan çalışmalar, pulmoner fibroz gelişimi için TNF-α-reseptör sinyalizasyonuna ihtiyaç duyulduğunu önermiştir [8, 41, 49]. Önceki çalışmaların teyitinde, histolojik olarak BLC ile doldurulan sıçanların akciğerlerinde güçlü iltihaplanma ve kollajen birikimi gözlemledik ve hidroksilprolin içeriği arttı; TNF-α'nın akut akciğer hasarı, inflamasyonun başlangıcında çok sayıda role sahip olduğunu düşündürüyordu - çiftleşme ve ardından fibroz.
Karşıt bir argüman olarak, bazı in vitro çalışmalar, TNF-α'nın dermal fibroblastlarda "anti-fibrotik" role sahip olduğunu önermiştir [9, 50]. Bu çalışmalarda TNF-α'nın fibroz üretimi üzerindeki etkilerinin önceki araştırmalarda bulunanlardan farklı neden belirsizliğini koruyor [8, 41, 49]. Görüşümüze göre, muhtemel bir senaryo, TNF-α'nın, organa bağlı olarak, farklı roller ve yaralanmanın farklı hastalık ekspresyonu olarak ortaya çıktığı görülmektedir [35]. Buna ek olarak, inflamatuar hücrelerin ağ için gerekli olan inflamatuvar durumlar, hücresel inflamatuvar filtrasyon maddeleri ve sitokinler gibi haberci moleküller in vitro sistemlerde yoktur. Bu nedenle, TNF-α'nın fibroblastlar üzerindeki direkt fibrotik etkileri, iltihaplanmanın önemli bir rolünü ihmal ederek deneysel hücre fibröz modellerinde geçersiz kılınabilir. Yeni yapılan bir in vivo çalışmadan elde edilen bir diğer aksine sonuç, TNF-α'nın pulmoner iletiminin sıçanlarda pulmoner fibrozu azalttığını göstermiştir [10]. TNF-α tedavisinin bu kadar farklı klinik sonuçlara neden neden benzediğine şaşırmış durumdayız.
Bununla birlikte, bu çelişkiyi iyi tasarlanmış bir çalışmanın yazarının alıntılayarak açıklayabiliriz: "Endojen TNF-α, diğer raporda gösterildiği gibi fibroz gelişiminde
25
önemli olabilir, ancak TNF-α veya ekzojen TNF-α'nın aşırı ekspresyonu Farelerde akciğer fibrozisini sınırlar "[51].
Deneysel modellerde TNF-α'nın bloke edilmesinin pulmoner fibrozun azalmasına neden olduğu gösterilmiştir [8, 13, 52, 53]. Bununla birlikte, geniş veritabanlarından retrospektif çalışmaların arttığı ve vaka raporlarından [15, 16, 54] artan sayıda TNF-α inhibitörü (TNFİ) ile pulmoner fibrozis riski arttığını gösterdi. İngiliz Romatizma Birliği (BSR) yönergeleri, altta yatan ya da daha önce mevcut olan akciğer hastalığı olan hastalarda TNFİ'nin (özellikle infliximab) başlatılması konusunda uyarıda bulunmuş ve bu hastalarda yüksek bir ma- kalite riski belirtmiştir [55]; Bununla birlikte pulmoner fibrozis American College of Rheumatologie (ACR) kılavuzlarındaki TNF-α inhibitörü tedavisi için bir kontrendikasyon olarak sayılmamaktadır [56]. Günümüzde TNFİ ile ilişkili pulmoner fibroz ile ilgili birçok soru çözülmemiştir; "Bazı hastalarda pulmoner fibroz neden gelişir?" Gibi. Bununla birlikte, IFX'in pulmoner fibroz üzerine direkt etkisine cevap verecek bir çalışma yoktur. Tüm fibroz raporları, vaka sunumlarında veya retrospektif veri kayıtlarında IFX tedavisinin yan etkisine dayanmaktadır.
Çalışmamız pulmoner fibrozda IFX'in önleyici etkisini değerlendiren ilk çalışmadır.
IFX'in BLC indüksiyonundan önce uygulanmasının pulmoner fibrozun azalmasına neden olduğunu gösterdik. Bununla birlikte, çalışmamız çelişkili sonuçların mekanizmasını açıklamaya güç teşkil etmemektedir. TNFi ile müdahale zamanlamasının veya olası alternatif yolların pulmoner fibroz oluşumundan sorumlu olduğunu düşünebiliriz.
Çalışmanın Limitasyonları
Bu çalışmada bazı sınırlamalar vardı. Birincisi, çalışmamız nispeten az sayıda deney hayvanı içeriyordu. Bunun için, küçük örneklem büyüklükleri için daha sağlam olan istatistiksel yöntemler kullanarak bunlara uyum sağlamaya çalıştık. İkincisi,
26
sıçanlarda değil insanlarda kullanılmak üzere tasarlanmış bir anti-TNF-α kullandık.
Bununla birlikte, sıçanlarda kullanım için piyasada bulunan bir anti-TNF-α yoktur.
Buna ek olarak, çeşitli sıçan modellerinde anti-TNF-α'nın rolünü değerlendiren daha önceki çalışmalar, deneyimizde yaptığımızın aynısını kullanmıştır. Üçüncüsü, klinik uygulamada, İPF hastalarının çoğunluğu hastalığın geç döneminde görülmektedir.
Bu nedenle, insanların IPF'sini taklit eden BLC kaynaklı akciğer fibroz modelinde ilaçların koruyucu etkiden başka bir terapötik model olarak erken ve geç evrelerdeki etkisini araştırmak için yeni çalışmalara ihtiyaç olduğu açıktır. İkincisi, çalışmamızda 7 mg / kg IFX kullanıldı. Yeni çalışmalar farklı dozajlar kullanabilir ve diğer dozların önleyici etkisi araştırılabilir. IFX tedavisine bağlı pulmoner fibroz hala tartışma konusudur ve inflamasyondan kaynaklı fibrozisin IFX'in rolü kompleks görünür, IFX'e bağlı fibrozisin IFX müdahalesinin zamanlamasıyla ilişkili olup olmadığını araştırmak için uzun aralıklarla yeni çalışmalara ihtiyaç vardır, Ayrıca, IFX'in önleyici etkisi zamanla artar ya da azalır.
Sonuç olarak, bu çalışma ilk kez iki sonuç ortaya koymuştur: Birincisi, IFX'in kendisi pulmoner fibroza yol açmaz; Ikincisinde, IFX, antioksidan hasarın düzeltilmesi, inflamatuar sitokinlerin derecesinin azalması ve kollajen birikimiyle akciğer koruyucu özelliğini sergiledi. Sonuçlarımız, IFX'in BLM kaynaklı akciğer hasarının veya diğer interstisyel PF'nin zayıflatılması için umut verici bir koruyucu aday olabileceğini önermektedir. Bununla birlikte, İPH'lı hastalar genellikle fibrozun geç evresinde teşhis edildiğinden, ileri araştırmalarda tedavi edici etki ve farklı IFX dozları araştırılmalıdır.
27
Referanslar
1. Mercer, P.F., K. Abbott-Banner, I.M. Adcock, and R.G. Knowles. 2015.
Translational models of lung disease. Clinical science (London, En- gland : 1979) 128: 235–256.
2. Daba, M.H., K.E. El-Tahir, M.N. Al-Arifi, and O.A. Gubara. 2004. Drug-induced pulmonary fibrosis. Saudi Medical Journal 25: 700–706.
3. Sabry, M.M., S.A.-E. Elkalawy, R.K.E.-D. Abo-Elnour, and D.F. Abd- El- Maksod. 2014. Histolgical and immunohistochemical study on the effect of stem cell therapy on bleomycin induced pulmonary fibrosis in albino rat.
International Journal of Stem Cells 7: 33–42.
4. Bargagli, E., C. Olivieri, D. Bennett, A. Prasse, J. Muller-Quernheim, and P.
Rottoli. 2009. Oxidative stress in the pathogenesis of diffuse lung diseases: a review. Respiratory Medicine 103: 1245–1256.
5. Ahluwalia, N., B.S. Shea, and A.M. Tager. 2014. New therapeutic targets in idiopathic pulmonary fibrosis. Aiming to rein in runaway Wound-healing responses. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 190:
867–878.
6. Black, R.A., C.T. Rauch, C.J. Kozlosky, J.J. Peschon, J.L. Slack, M.F.
Wolfson, B.J. Castner, et al. 1997. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature 385: 729–733.
7. Piguet, P.F., C. Ribaux, V. Karpuz, G.E. Grau, and Y. Kapanci. 1993.
Expression and localization of tumor necrosis factor-alpha and its mRNA in idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of Pathology 143: 651–
655.
8. Piguet, P.F., M.A. Collart, G.E. Grau, A.P. Sappino, and P. Vassalli. 1990.
28
Requirement of tumour necrosis factor for development of silica- induced pulmonary fibrosis. Nature 344: 245–247.
9. Chizzolini, C., Y. Parel, C. De Luca, A. Tyndall, A. Akesson, A. Scheja, and J.- M. Dayer. 2003. Systemic sclerosis Th2 cells inhibit collagen production by dermal fibroblasts via membrane associated tumor ne- crosis factor alpha.
Arthritis and Rheumatism 48: 2593–2604.
10. Redente, E.F., R.C. Keith, W. Janssen, P.M. Henson, L.A. Ortiz, G.P.
Downey, D.L. Bratton, and D.W.H. Riches. 2014. Tumor necrosis factor-α accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 50: 825–837.
11. Tracey, D., L. Klareskog, E.H. Sasso, J.G. Salfeld, and P.P. Tak. 2008. Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehen- sive review.
Pharmacology & Therapeutics 117: 244–279.
12. Di Sabatino, A., R. Ciccocioppo, L. Benazzato, G.C. Sturniolo, and G.R.
Corazza. 2004. Infliximab downregulates basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in Crohn’s disease patients. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 19: 1019–1024.
13. Bargagli, E., M. Galeazzi, and P. Rottoli. 2004. Infliximab treatment in a patient with rheumatoid arthritis and pulmonary fibrosis. The Euro- pean Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 24: 708.
14. Antoniou, K.M., M. Mamoulaki, K. Malagari, H.D. Kritikos, D. Bouros, N.M.
Siafakas, and D.T. Boumpas. 2007. Infliximab therapy in pulmonary fibrosis associated with collagen vascular disease. Clin- ical and Experimental
29
Rheumatology 25: 23–28.
15. Ostor, A.J.K., A.J. Crisp, M.F. Somerville, and D.G.I. Scott. 2004. Fatal exacerbation of rheumatoid arthritis associated fibrosing alveo- litis in patients given infliximab. BMJ (Clinical Research ed.) 329: 1266.
16. Chatterjee, S. 2004. Severe interstitial pneumonitis associated with infliximab therapy. Scandinavian Journal of Rheumatology 33: 276– 277.
17. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 1996. Guide for the care and use of laboratory animals. Washington (DC): National Academies Press (US).
18. Teixeira, K.C., F.S. Soares, L.G.C. Rocha, P.C.L. Silveira, L.A. Silva, S.S.
Valença, F. Dal Pizzol, E.L. Streck, and R.A. Pinho. 2008. Attenuation of bleomycin-induced lung injury and oxidative stress by N-acetylcysteine plus deferoxamine. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 21: 309–316.
19. Akgedik, R., Ş. Akgedik, H. Karamanlı, S. Uysal, B. Bozkurt, D. Ozol, F.
Armutçu, and Z. Yıldırım. 2012. Effect of resveratrol on treatment of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Inflamma- tion 35: 1732–1741.
20. Gonçalves, D.C., R.C. Evangelista, R.R. da Silva, M.J.S. Santos, F.S. Silva, K.S. Aragão, G.A.C. Brito, H.B.M. Lucena, R.C. Leitão, and R.B. Oriá. 2014.
Infliximab attenuates inflammatory osteolysis in a model of periodontitis in Wistar rats. Experimental Biology and Med- icine (Maywood, N.J.) 239: 442–
453.
21. Chen, C.-Y., W.-H. Peng, L.-C. Wu, C.-C. Wu, and S.-L. Hsu. 2010. Luteolin ameliorates experimental lung fibrosis both in vivo and in vitro: implications for therapy of lung fibrosis. Journal of Agricul- tural and Food Chemistry 58:
11653–11661.
30
22. Hübner, R.-H., W. Gitter, N. Eddine El Mokhtari, M. Mathiak, M. Both, H. Bolte, S. Freitag-Wolf, and B. Bewig. 2008. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. BioTechniques 44: 507–517.
23. Hsu, S.M., L. Raine, and H. Fanger. 1981. Use of avidin-biotin- peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a com- parison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society 29: 577–580.
24. Kanter, M., S.H. Sahin, U.N. Basaran, S. Ayvaz, B. Aksu, M. Erboga, and A.
Colak. 2015. The effect of methylene blue treatment on aspiration pneumonia.
The Journal of Surgical Research 193: 909–919.
25. Sun, Y., L.W. Oberley, and Y. Li. 1988. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clinical Chemistry 34: 497–500.
26. Luck, H. 1963. A spectrophotometric method for the estimation of catalase. In Methods of enzymatic analysis, ed. H.U. Bergmeyer, 886– 887. New York:
Academic.
27. Paglia, D.E., and W.N. Valentine. 1967. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine 70: 158–169.
28. Ellman, G.L. 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemis- try and Biophysics 82: 70–77.
29. Wei, H., and K. Frenkel. 1993. Relationship of oxidative events and DNA oxidation in SENCAR mice to in vivo promoting activity of phorbol ester-type tumor promoters. Carcinogenesis 14: 1195–1201.
31
30. Draper, H.H., and M. Hadley. 1990. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation. Methods in Enzymology 186: 421–431.
31. Cortas, N.K., and N.W. Wakid. 1990. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method. Clinical Chemistry 36: 1440–1443.
32. Brown, S., M. Worsfold, and C. Sharp. 2001. Microplate assay for the measurement of hydroxyproline in acid-hydrolyzed tissue samples.
BioTechniques 30: 38–40.
33. Mouratis, M.A., and V. Aidinis. 2011. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine 17: 355– 361.
34. Rossi, R.E., I. Parisi, E.J. Despott, A.K. Burroughs, J. O’Beirne, D. Conte, M.I. Hamilton, and C.D. Murray. 2014. Anti-tumour necrosis factor agent and liver injury: literature review, recommendations for management. World Journal of Gastroenterology: WJG 20: 17352– 17359.
35. Khasnis, A.A., and L.H. Calabrese. 2010. Tumor necrosis factor inhibitors and lung disease: a paradox of efficacy and risk. Seminars in Arthritis and Rheumatism 40: 147–163.
36. Jenkins, G., and A. Goodwin. 2014. Novel approaches to pulmonary fibrosis.
Clinical Medicine (London, England) 14(Suppl 6): s45–49.
37. Yara, S., K. Kawakami, N. Kudeken, M. Tohyama, K. Teruya, T. Chinen, A.
Awaya, and A. Saito. 2001. FTS reduces bleomycin- induced cytokine and chemokine production and inhibits pulmonary fibrosis in mice. Clinical and Experimental Immunology 124: 77–85.
38. Zhu, B., A.-Q. Ma, L. Yang, and X.-M. Dang. 2013. Atorvastatin attenuates
32
bleomycin-induced pulmonary fibrosis via suppressing iNOS expression and the CTGF (CCN2)/ERK signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences 14: 24476–24491.
39. Williamson, J.D., L.R. Sadofsky, and S.P. Hart. 2015. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research 41: 57–73.
40. Goldblum, S.E., and W.L. Sun. 1990. Tumor necrosis factor-alpha augments pulmonary arterial transendothelial albumin flux in vitro. The American Journal of Physiology 258: L57–67.
41. Ortiz, L.A., J. Lasky, R.F. Hamilton, A. Holian, G.W. Hoyle, W. Banks, J.J.
Peschon, A.R. Brody, G. Lungarella, and M. Friedman. 1998. Expression of TNF and the necessity of TNF receptors in bleomycin-induced lung injury in mice. Experimental Lung Research 24: 721–743.
42. Carré, P., and P. Léophonte. 1993. Cytokines and pulmonary fibroses. Revue des Maladies Respiratoires 10: 193–207.
43. Underwood, D.C., R.R. Osborn, S. Bochnowicz, E.F. Webb, D.J. Rieman, J.C.
Lee, A.M. Romanic, J.L. Adams, D.W. Hay, and D.E. Griswold. 2000. SB 239063, a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia, inflammatory cytokines, MMP-9, and fibrosis in lung. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology 279: L895–902.
44. Uchida, M., H. Shiraishi, S. Ohta, K. Arima, K. Taniguchi, S. Suzuki, M.
Okamoto, et al. 2012. Periostin, a matricellular protein, plays a role in the induction of chemokines in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 46: 677–686.
45. Korthagen, N.M., C.H.M. van Moorsel, N.P. Barlo, H.J.T. Ruven, A. Kruit, M.
33
Heron, J.M.M. van den Bosch, and J.C. Grutters. 2011. Serum and BALF YKL-40 levels are predictors of survival in idio- pathic pulmonary fibrosis.
Respiratory Medicine 105: 106–113.
46. Furuhashi, K., T. Suda, Y. Nakamura, N. Inui, D. Hashimoto, S. Miwa, H.
Hayakawa, et al. 2010. Increased expression of YKL-40, a chitinase-like protein, in serum and lung of patients with idiopathic pulmonary fibrosis.
Respiratory Medicine 104: 1204–1210.
47. Oikonomou, N., V. Harokopos, J. Zalevsky, C. Valavanis, A. Kotanidou, D.E.
Szymkowski, G. Kollias, and V. Aidinis. 2006. Soluble TNF mediates the transition from pulmonary inflammation to fibrosis. PLoS One 1: e108.
48. Theiss, A.L., J.G. Simmons, C. Jobin, and P.K. Lund. 2005. Tumor necrosis factor (TNF) alpha increases collagen accumulation and proliferation in intestinal myofibroblasts via TNF receptor 2. The Journal of Biological Chemistry 280: 36099–36109.
49. Piguet, P.F., M.A. Collart, G.E. Grau, Y. Kapanci, and P. Vassalli. 1989.
Tumor necrosis factor/cachectin plays a key role in bleomycin- induced pneumopathy and fibrosis. The Journal of Experimental Medicine 170: 655– 663.
50. Mauviel, A., M. Daireaux, F. Rédini, P. Galera, G. Loyau, and J.P. Pujol. 1988.
Tumor necrosis factor inhibits collagen and fibronectin synthesis in human dermal fibroblasts. FEBS Letters 236: 47–52.
51. Fujita, M., J.M. Shannon, O. Morikawa, J. Gauldie, N. Hara, and R.J. Mason.
2003. Overexpression of tumor necrosis factor-alpha dimin- ishes pulmonary fibrosis induced by bleomycin or transforming growth factor-beta. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 29: 669–676.
34
52. Piguet, P.F., and C. Vesin. 1994. Treatment by human recombinant soluble TNF receptor of pulmonary fibrosis induced by bleomycin or silica in mice. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 7: 515–518.
53. Bargagli, E., M. Galeazzi, F. Bellisai, L. Volterrani, and P. Rottoli. 2008.
Infliximab treatment in a patient with systemic sclerosis associ- ated with lung fibrosis and pulmonary hypertension. Respiration 75: 346–349.
54. Cairns, A.P., and A.J. Taggart. 2002. Anti-tumour necrosis factor therapy for severe inflammatory arthritis: two years of experience in Northern Ireland. The Ulster Medical Journal 71: 101–105.
55. Ledingham, J., C. Deighton, British Society for Rheumatology Stan- dards, Guidelines and Audit Working Group. 2005. Update on the British Society for Rheumatology guidelines for prescribing TNFalpha blockers in adults with rheumatoid arthritis (update of previous guidelines of April 2001).
Rheumatology (Oxford, England). Oxford University Press.
56. Saag, K.G., G.G. Teng, N.M. Patkar, J. Anuntiyo, C. Finney, J.R. Curtis, H.E.
Paulus, et al. 2008. American College of Rheumatology 2008 recommendations for the use of nonbiologic and biologic disease-modifying antirheumatic drugs in rheumatoid arthritis. Ar- thritis and Rheumatism 59:
762–784. Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company.
35
Tablo 1
36
Tablo 2
37
Şekil 1
38
Şekil 2.
39
Şekil 3.
40
Şekil 4.
41
Şekil 5.
42
Şekil 6.
