akciğer fibrozisinde erdosteinin
inflamasyon ve fibrozis üzerine etkileri
Ersin Şükrü ERDEN1, Gamze KIRKIL2, Figen DEVECİ2, Nevin İLHAN3, Bengü ÇOBANOĞLU4, Teyfik TURGUT2, Mehmet Hamdi MUZ2
1 Erciş Devlet Hastanesi, Van,
2Fırat Üniversitesi, Fırat Tıp Merkezi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı,
3Fırat Üniversitesi, Fırat Tıp Merkezi, Biyokimya Anabilim Dalı,
4Fırat Üniversitesi, Fırat Tıp Merkezi, Patoloji Anabilim Dalı, Elazığ.
ÖZET
Ratlarda bleomisin ile oluşturulan akciğer fibrozisinde erdosteinin inflamasyon ve fibrozis üzerine etkileri
Bleomisin (BLM) uygulamasıyla ratlarda akciğer fibrozisi oluşturarak, akut inflamatuvar ve fibrotik fazlarda akciğer doku- sunda ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında bazı kemokin ve sitokinlerin düzeyini, akciğer dokusunda oluşan histopa- tolojik değişiklikleri ve antioksidan etkisi olan erdosteinin akut inflamatuvar değişiklikler ve fibrozis üzerine etkilerini araş- tırmayı amaçladık. Çalışmaya Wistar tipi 45 erkek rat alındı. Sıfırıncı günde; kontrol grubuna (grup 1, n= 15) intratrakeal salin, BLM (grup 2, n= 15) ve erdostein grubuna (grup 3, n= 15) intratrakeal BLM (7.5 U/kg) uygulandı. Erdostein grubu- na BLM uygulamasından iki gün önce peroral 10 mg/kg/gün erdostein başlandı. Tüm gruplarda 0., 14. ve 29. günde be- şer adet rat sakrifiye edilerek BAL yapıldı. BAL’da malondialdehid (MDA), makrofaj inflamatuvar protein (MIP)-1α, MIP-2 düzeylerinin ölçümü ve inflamatuvar hücre sayımı, akciğer dokusunda hidroksiprolin ölçümü ve histopatolojik inceleme yapıldı. BLM grubu ile karşılaştırıldığında erdostein grubunun BAL sıvısında nötrofil, MIP-1α, MIP-2, MDA düzeylerinin ve akciğer dokusunda hidroksiprolin (OH-P) içeriğinin akut inflamatuvar fazda (14. gün) (sırasıyla, p< 0.001, p= 0.017, p=
0.009, p< 0.001, p= 0.009) ve geç fibrozis döneminde (29. gün) BAL MIP-2 hariç (sırasıyla, p= 0.022, p= 0.025, p= 0.01, p<
0.001) anlamlı derecede azaldığı saptandı. Yirmi dokuzuncu günde fibrozis derecesi erdostein grubunda BLM grubuna gö- re anlamlı düzeyde düşük olarak bulundu (p= 0.01). Sonuç olarak, erdosteinin, nötrofil birikiminin baskılanması, lipid pe- roksidasyonunun inhibe edilmesi, kemokinlerin üretim veya salınımının engellenmesi yoluyla BLM’nin neden olduğu akut akciğer inflamasyonunu ve fibrozisini önleyebileceği düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Akciğer fibrozisi, MDA, MIP-1α, MIP-2, hidroksiprolin, erdostein.
Yazışma Adresi (Address for Correspondence):
Dr. Ersin Şükrü ERDEN, Fırat Üniversitesi, Fırat Tıp Merkezi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 23119 ELAZIĞ - TURKEY
e-mail: gamkirkil@yahoo.com
İdiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), alveolit ve pulmoner fibrozis patogenezinin aydınlatılmamış olduğu, etyolojisi bilinmeyen ve sık görülen, ge- nellikle ölümcül seyreden ve halen kullanılmak- ta olan tedavilerin hastaların prognozu üzerine çok az etkili olduğu bir interstisyel akciğer has- talığıdır (1). Bleomisin (BLM) ile oluşturulan ak- ciğer fibrozis modeli hastalığın aşamalarını ve akciğer yapısı ile fonksiyonunu açıklığa kavuş- turmak için kullanılan en önemli modeldir. Bir antineoplastik ajan olan BLM’nin etki mekaniz- ması; BLM-demir kompleksinin moleküler oksi- jeni süperoksid ve hidroksil radikaline indirgeye- rek, DNA liflerinde kırılma oluşturmasıdır (2).
Yapılan in vitro çalışmalarda antioksidan tedavi- si ile BLM’ye bağlı DNA ve hücre hasarının inhi- be olduğu gösterilmiştir (3,4).
BLM ile oluşturulan akciğer fibrozisinin patofiz- yolojisinde iki faz vardır. Erken inflamatuvar faz-
da, interstisyel ve alveoler alanlara makrofaj, nötrofil ve lenfosit infiltrasyonu olurken, ikinci fazda fibrozis gelişir. Reaktif oksijen radikalleri ve proteazlar genellikle bu inflamatuvar hücre- lerden salgılanarak akciğer dokusunda hasar oluşturur ve onarım sürecinde aşırı fibrozis geli- şir (5). İnterstisyel ve alveoler makrofajlardan bir lökosit kemotaksini olan makrofaj inflamatuvar protein (MIP)-1α üretilir. MIP-2 ise insanlardaki nötrofil kemotaktik faktör olan interlökin (IL)- 8’in murin analoğudur. İPF’nin patogenezinde nötrofiller de önemli rol oynamaktadır (6).
Son 10 yıl içerisinde bazı akciğer hastalıklarının tedavisi için geliştirilmiş bir preparat olan erdos- tein (dithiosteine, RV 144, N-carboxymethylthi- oacetyl-homocystein) mukolitik ilaçlar içinde yer alır. Mukus salgısını seyreltici ve düzenleyi- ci, mukosiliyer transportu artırıcı etkisinin ya- nında hem serbest radikal oluşumunu engelleyi- SUMMARY
Effects of erdosteine on inflammation and fibrosis in rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin
Ersin Şükrü ERDEN1, Gamze KIRKIL2, Figen DEVECİ2, Nevin İLHAN3, Bengü ÇOBANOĞLU4, Teyfik TURGUT2, Mehmet Hamdi MUZ2
1 Erciş State Hospital, Van, Turkey,
2Department of Chest Diseases, Fırat Medical Center, Fırat University, Elazığ, Turkey,
3Department of Biochemistry, Fırat Medical Center, Fırat University, Elazığ, Turkey,
4Department of Pathology, Fırat Medical Center, Fırat University, Elazığ, Turkey.
We aimed to investigate the levels of some chemokines, inflammatory cell counts in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, his- topathological changes in lung tissue, to determine the effect of erdosteine on acute inflammatory changes and fibrosis in a rat fibrosis model induced by bleomycine (BLM). Forty-five Wistar male rats were taken into the study. On day 0, intratrac- heal saline to control group (group 1, n= 15), intratracheal BLM 7.5 U/kg to BLM (group 2, n= 15) and erdostein group (gro- up 3, n= 15) was administered. In group 3, oral erdostein (10 mg/kg/day) was applied two days before BLM. On day 0, 14, and 29thfive rats in each groups were sacrificed, BAL fluid was performed. Malonyldialdehyde (MDA), macrophage inflam- matory protein (MIP)-1α, MIP-2 levels in BAL fluid, hydroxyproline levels in lung tissue were measured. Histopathological examination was performed. When BLM group compared to erdostein group, the levels of MDA, MIP-1α, MIP-2, and neutrop- hil counts, the hydroxyproline (OH-P) level of lung tisssue were decreased in erdostein group on acute inflammatory phase (day 14) (p< 0.001, p= 0.017, p= 0.009, p< 0.001, p= 0.009, respectively), and late fibrosis phase (day 29) except BAL MIP-2 (p= 0.022, p= 0.025, p= 0.01, p< 0.001, respectively). Fibrosis level was significantly lower in erdostein group than BLM gro- up on day 29 (p= 0.01). We conclude that erdostein may prevent the acute lung inflammation and fibrosis by supressing the accumulation of neutrophils, inhibition of lipid peroxydation, chemokine production, and release.
Key Words: Lung fibrosis, MDA, MIP-1α, MIP-2, hydroxyproline, erdostein.
ci hem de elastaz enzim aktivitesini inhibe edici etkisi vardır (7,8). Yapılan çalışmalarda erdos- teinin fare ve tavşanlarda hava yolu salgılarını artırdığı, insanlarda ise sigara ile oluşan α1-an- titripsin inaktivasyonunu baskıladığı gösteril- miştir (9,10).
BLM uygulaması ile fibrozis oluşturulan önceki çalışmalarda deney süresi 15 gün olarak belirtil- miştir (11,12). Biz deney süresini 28 güne çıka- rarak geç dönem fibrozis üzerine erdosteinin et- kilerini araştırmayı planladık. Amacımız BLM uygulamasıyla ratlarda akciğer fibrozisi oluştu- rarak, akut inflamatuvar ve fibrotik fazlarda ak- ciğer dokusunda ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında bazı kemokin ve sitokinlerin düzeyini, akciğer dokusunda oluşan histopatolojik deği- şiklikleri incelemek ve bir antioksidan olan er- dosteinin akut inflamatuvar değişiklikler ve fib- rozis üzerine etkilerini araştırmaktır.
MATERYAL ve METOD Deney Hayvanları
Çalışmamızda, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Araştırmalar Merkezi’nden temin edi- len Wistar tipi 45 adet erkek rat kullanıldı. Stan- dart rat kafeslerinde optimal şartlarda 28 gün su ve ad libitum standart pellet yem verildi. Kafes- leri, yatakları, yiyecek ve suları kullanılmadan önce steril edildi, oda sıcaklığı 24-27°C arasında tutulup, 12 saat gündüz, 12 saat gece olacak şe- kilde ışıklar ayarlandı. Deneye başlamadan önce ratlar tartıldı ve ağırlıkları 250 g’ı geçenler rast- gele alınarak 15’erli üç gruba ayrıldı.
Deney Grupları
Grup 1 (n= 15, kontrol grubu, PBS + NaH- CO3): Bu gruptaki ratlara intratrakeal fosfatla tamponlanmış steril salin (PBS) uygulamadan iki gün önce (-2 gün) sodyum bikarbonat (NaHCO3) 10 mg/kg/gün peroral başlandı ve deney süresince uygulamaya devam edildi. Sı- fırıncı gün intratrakeal olarak tek doz 0.2 mL PBS verildi.
Grup 2 (n= 15, BLM grubu, BLM + NaHCO3):
Bu gruptaki ratlara -2. günde NaHCO3 10 mg/kg/gün peroral başlandı ve deney süresince uygulamaya devam edildi. Sıfırıncı günde intrat-
rakeal BLM (Bleocin; bleomycin hydrochloride;
Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japonya) 0.2 mL PBS içinde çözdürülerek 7.5 U/kg şeklinde tek doz yapıldı (13).
Grup 3 (n= 15, BLM + erdostein grubu, BLM + E): Bu gruptaki ratlara -2. günde erdostein (İl- san, Türkiye) 10 mg/kg/gün dozunda peroral başlandı ve deney süresince uygulamaya devam edildi (12). Sıfırıncı günde BLM intratrakeal ola- rak bir kez verildi.
Tüm gruplarda 0. günde beş adet, 14. günde beş adet ve 29. günde beşer adet rat sakrifiye edildi.
Yapılan İşlemler
Tüm ilaç uygulamaları her sabah aynı saatte (08:00’de) yapıldı. İntratrakeal BLM ve PBS uy- gulaması anestezi altında yapıldı. Anestezi için 1 mg/kg xyalzine ile 0.5 mL/kg dozunda ketamin aynı enjektöre çekilerek intraperitoneal olarak uygulandı. Daha sonra ratların refleksleri kontrol edilerek anesteziye girmeleri beklendi. Bu süre- de BLM’nin 15 U’lik flakon formu PBS içinde çözdürüldü. Anestezi altındaki ratların boyun ön bölgesi orta hat kesisiyle açıldı, cilt altı dokular klemp yardımıyla dikkatlice ekarte edilerek tra- keaya ulaşıldı. Trakea içerisine 100 U’lik insülin enjektörüyle girilerek BLM uygulaması yapıldı, BLM’nin akciğere tam ulaşabilmesi için ratların kafa kısmı yukarı kaldırılarak 30 saniye kadar beklendi. Kontrol grubuna da aynı şekilde ve ay- nı miktarda PBS verildi. İşlem bittikten sonra ke- si bölgesi sütürle kapatılarak, infeksiyon geliş- memesi yönünden günlük antiseptik batikon so- lüsyonuyla silinerek yara bakımı yapıldı. Ratlar anestezik koşullar altında (100 mg/kg intraperi- toneal pentobarbital) öldürüldükten hemen son- ra 5 mL PBS trakeal kanül aracılığıyla akciğerler içine uygulandı, işlem üç kez tekrar edildi (14).
Alınan örnekler sitospinde işlem gördükten son- ra May-Grünwald-Gimsa ile boyandı, her bir smearda 200 hücre x200 büyütmede sayıldı, buna göre alveoler makrofaj, nötrofil ve lenfosit oranları değerlendirildi. Ratlar öldürülüp BAL iş- lemi yapıldıktan sonra sol akciğer %10 formal- dehid içerisinde fikse edilerek doku kesitleri ha- zırlandı. Sağ akciğer ise hidroksiprolin ölçümü için kullanıldı.
BAL Malondialdehid Ölçümü
BAL örnekleri Jouan KR221 ultrasantrifüjünde 4°C’de 15.000 rpm’de 20 dakika santrifüj edildi.
BAL süpernatant MDA düzeyi Agarwal ve arka- daşlarının kullandığı metotla yüksek performanslı sıvı kromotografi (HPLC) yöntemiyle ölçüldü (15).
%40’lık etanol solüsyonu içerisinde 5 mM 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) içeren stan- dart depo solüsyonu kullanılarak standartlar ha- zırlandı. 50 µL’lik örnek veya TEP standardına 50 µL’lik BHT solüsyonu, 400 µL’lik H3PO4so- lüsyonu ve 100 µL’lik TBA solüsyonu eklendi.
Örnek tüpleri sıkıca kapatıldı, vortekste karıştı- rıldı, bir saatliğine kuru banyo inkübatöründe 100°C’de ısıtıldı. Isıtmayı takiben örnekler soğu- maları için beş dakikalığına buza yerleştirildi.
MDA-TBA kompleksini elde edebilmek için her bir tüpe 250 µL’lik n-butanol eklendi, tüpler vor- tekslenip 14.000 rpm’de üç dakika santrifüj edil- di. Üstteki n-butanol fazı alınarak HPLC vialleri- ne buharlaştırma olmaksızın yerleştirildi.
HPLC çalışma koşulları; kromotografik sistem bir Hewlett-Packard kromotografik seri 1100 oto örnekleyicisi, isokratik pompa ve Hewlett-Pac- kard model 1046 A programlanabilir floresan detektöründen oluşmaktadır. Oto örnekleyici her örneğe bir dakikalık aralıklarla 20 µL enjekte et- mek için programlanmıştır. Pompanın akış oranı metanol çözeltisinin hareketli fazıyla uyumlu olabilecek şekilde 1 mL/dakika idi. Bu floresan detektörü 515 nm’lik eksitasyon dalga boyuna ve 553 nm’lik emisyon dalga boyuna sahiptir.
Hesaplamalar, pik altındaki alan hesabıyla stan- dartla karşılaştırılarak yapıldı.
BAL MIP-1αve MIP-2 Ölçümü
BAL’da MIP-1α ve MIP-2 düzeylerinin ölçümü Biosource (MIP-1α için; Katalog no: KMC2202, MIP 2 için; Katolog no: KRC1022, Biosource In- ternational, USA) marka immünassay kitleriyle solid faz sandwich ELISA yöntem prensibi kulla- nılarak, kit prosedürüne uygun olarak çalışıldı.
Akciğer Dokusu Hidroksiprolin (OH-P) Miktarının Tespiti
Bu işlem için ayrılan sağ akciğer bidistile suyla yıkanıp, kurutma kağıdıyla kurutuldu ve küçük
parçalara ayrıldı. BLM difüz fibrozis yaptığı için bu dokulardan bir kısmı randomize bir şe- kilde OH-P düzeylerini tespit deneyleri için ay- rıldı. -80°C’de dondurularak deney gününe ka- dar saklandı. Çalışma esnasında dondurulmuş akciğer dokuları çözülerek izotonik NaCl ile yı- kandı ve kurutma kağıdına serilerek kendi halin- de kurumaya bırakıldı, sonra tartıldı. Ağzı açık cam tüplere konularak 100°C’ye ayarlanmış etüvde 72 saat kurutuldu. Kontaminasyon en- gellenerek kurutulan dokular küçük bir havan içinde toz haline getirildi. Toz haline gelmiş kuru dokuların her birinin kuru ağırlıkları hassas tera- zide ölçülerek kaydedildi. Toz halindeki dokular 10 mL’lik balon jojeler içerisine konularak 2 mL 12 N HCl ilave edildi. Standart bir süre bekletil- dikten sonra Bunzen-Beg alevinde 130°C’de üç saat hidrolize edildi. Hidroliz işlemi sonunda asit miktarı 1 mL’nin altına düşenler ölçülerek 12 N HCl ile tekrar 1 mL’ye tamamlandıktan sonra 3000 devirde 15 dakika santrifüj edildi. Üstteki süpernatant kısımdan 0.5 mL alınıp üzerine 0.5 mL izopropanol eklenerek 2500 devirde 10 da- kika daha santrifüj edildi. Sonra üst fazdan 0.3 mL alınarak çalışıldı. Hidroksiprolin tespiti Wo- essner’in tarif ettiği yöntemle yapıldı (16).
Histopatolojik İnceleme
Sol akciğer %10 formalin solüsyonunda fikse edilip parafin blok haline getirildi ve 3 µ kalınlı- ğında kesitler elde edildi. Kesitler Hematoksilen- Eozin (HE) ve fibrozisin değerlendirilmesi için Masson Trichrom (MT) boyasıyla boyandı.
Fibrozisin derecelendirmesi; MT ile boyalı kesit- lerde x100’lük büyütmede rastgele seçilen 10 alanda Ashcroft skorlamasına göre 0-8 arasında derecelendirildi (Tablo 1) (17). Mikroskobik in- celeme kör olarak yapıldı.
İstatistiksel Değerlendirme
Elde edilen verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi SPSS 12.0 paket programı kullanılarak yapıldı. Değerler ortalama ± stan- dart sapma şeklinde ifade edildi. p< 0.05 olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Gruplar arası karşılaştırma varyans analiziyle yapıldı ve ikili karşılaştırmalarda posthoc test olarak Bonferroni testi kullanıldı.
BULGULAR BAL Nötrofil Düzeyleri
Sıfırıncı günde tüm grupların BAL nötrofil düzey- leri benzer bulundu (Şekil 1A).
On dördüncü günde BLM grubunun nötrofil dü- zeyi kontrol grubundan yüksekti (p< 0.001), er- dostein grubunda bu düzeyin BLM grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu saptandı (p<
0.001) (Şekil 1B).
Yirmi dokuzuncu günde nötrofil değerleri karşı- laştırıldığında; BLM grubunun nötrofil değeri kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek (p< 0.001) iken, BLM ile er- dostein grubu karşılaştırıldığında; erdostein gru- bunda istatistiksel olarak anlamlı düşük olarak tespit edildi (p= 0.022) (Şekil 1C).
BLM grubunda BAL nötrofil değerleri 14 ve 29.
günlerde 0. güne göre istatistiksel olarak yüksek (her ikisi için de p< 0.001) iken, erdostein gru- bunda 14 ve 29. günlerdeki nötrofil değerleriyle 0. gündeki nötrofil değerleri arasında istatistiksel fark saptanmadı.
BAL Lenfosit Düzeyleri
Sıfırıncı günde gruplar arasında BAL lenfosit dü- zeyleri benzerdi (Şekil 1A).
On dördüncü günde kontrol grubu ile karşılaştı- rıldığında BLM grubunda anlamlı yükseklik sap- tandı (p= 0.008). Kontrol grubu ile erdostein grubu karşılaştırıldığında; erdostein grubunun
BAL lenfosit değerinin daha yüksek olduğu an- cak gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı tespit edildi. BLM ile erdostein grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadı (Şekil 1B).
Yirmi dokuzuncu günde kontrol grubu ile karşı- laştırıldığında BLM grubunda BAL lenfosit de- ğerlerinin halen yüksek olduğu fakat istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı tespit edildi. Hem kontrol grubu hem de BLM gruplarının erdostein grubu ile karşılaştırılmasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadı (Şekil 1C).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. günlerdeki de- ğerleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak an- lamlı fark olmadığı tespit edildi.
BAL MIP-1αDüzeyleri
Sıfırıncı günde BAL MIP-1α düzeyleri gruplar arasında benzerdi.
On dördüncü günde; hem BLM hem de erdoste- in grubunun MIP-1α düzeylerinin kontrol gru- bundan yüksek olduğu (BLM grubu için p<
0.001, erdostein grubu için p= 0.0012) ve er- dostein grubunun değerlerinin BLM grubuna gö- re anlamlı derecede düşük olduğu gözlendi (p=
0.028).
Yirmi dokuzuncu günde; BLM grubunda kontrol grubuna göre yükseklik görülürken (p= 0.003), erdostein grubu ile kontrol grubu arasında fark olmadığı izlendi. Erdostein grubunun MIP-1αdü- zeylerinin BLM grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu tespit edildi (p= 0.0025) (Şekil 2).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. günlerdeki düzeyleri karşılaştırıldığında; 14. günde 0. güne göre istatistiksel olarak anlamlı yükseklik tespit edilirken (p= 0.017), 29. günde 14. güne göre istatistiksel olarak anlamlı olmasa da BAL MIP- 1αdüzeylerinin azaldığı görüldü. Sıfırıncı gün ile 29. gün düzeyleri karşılaştırıldığında ise istatis- tiksel olarak anlamlı fark tespit edilemedi.
BAL MIP-2 Düzeyleri
Sıfırıncı günde her üç grubun BAL MIP-2 düzey- leri benzerdi.
On dördüncü günde; BLM grubunda kontrol gru- buna göre yükseklik görülürken (p< 0.001), er- Tablo 1. Akciğer fibrozisinin derecelendirilmesi.
Derece Histolojik özellik Grade 0 Normal akciğer
Grade 1 Alveoler ya da bronşiyal duvarda mini- mal fibröz kalınlaşma
Grade 3 Akciğer yapısında hasar olmaksızın duvarda orta derecede fibröz kalınlaşma Grade 5 Akciğer yapısında hasarla birlikte artmış fibrozis, fibröz bant formasyonu veya küçük fibröz kitleler
Grade 7 Şiddetli hasar ve geniş fibrozis Grade 8 Total fibröz obliterasyon
dostein grubu ile kontrol grubu arasında fark ol- madığı izlendi. Erdostein grubunda MIP-2 düzey- lerinin BLM grubuna göre düşük olduğu tespit edildi (p< 0.001).
Yirmi dokuzuncu günde BLM grubunun MIP-2 dü- zeyinin kontrol grubundan yüksek olduğu ancak istatistiksel olarak fark olmadığı izlendi. Yine kont- rol grubu ile kıyaslandığında erdostein grubunda
da istatistiksel olarak anlamlı farklılık olmadığı saptandı. Erdostein grubunda BAL MIP-2 düzeyle- rinin BLM grubuna göre azaldığı gözlendi fakat is- tatistiksel olarak fark saptanmadı (Şekil 3).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. günlerdeki dü- zeyleri karşılaştırıldığında gruplar arasında ista- tistiksel olarak anlamlı farklılık olmadığı görüldü.
Kontrol Bleomisin Erdostein Lenfosit
Nötrofil 40
30
20
10
0
BAL hücre (%)
Kontrol Bleomisin
BAL hücre (%)
Lenfosit 16
14 12 10 8 6 4 2 0
Nötrofil
Erdostein
A B a
b
c
Lenfosit Nötrofil
Kontrol Bleomisin Erdostein 30
20
10
0 C
BAL hücre (%)
a
b
Şekil 1. A. Sıfırıncı günde bronkoalveoler lavaj (BAL) nötrofil ve lenfosit düzeylerinde gruplar arasında istatistik- sel olarak anlamlı fark saptanmadı.
B. On dördüncü günde; BAL nötrofil düzeyleri için:
ap< 0.001 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp< 0.001 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında;
BAL lenfosit düzeyleri için: cp= 0.008 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında.
C. Yirmi dokuzuncu günde; BAL nötrofil düzeyleri için:
ap< 0.001 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp= 0.022 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
BAL Malondialdehid Düzeyleri
Sıfırıncı günde her üç grubun BAL MDA düzey- leri benzerdi.
On dördüncü günde kontrol grubu ile karşılaştı- rıldığında BLM grubunda MDA seviyesinin yük- sek olduğu tespit edildi (p< 0.001). Kontrol gru- bu ile erdostein grupları arasında istatistiksel
olarak fark saptanmadı. Erdostein grubunun de- ğerlerinin BLM grubundan anlamlı derecede dü- şük olduğu görüldü (p< 0.001).
Yirmi dokuzuncu günde kontrol grubu ile BLM ve erdostein grupları karşılaştırıldığında anlamlı fark- lılık olmadığı görüldü. BLM grubu ile karşılaştırıldı- ğında erdostein grubunun değerlerinin anlamlı de- recede düşük olduğu izlendi (p= 0.010) (Şekil 4).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. günlerdeki BAL MDA düzeyleri karşılaştırıldığında; gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık ol- madığı görüldü.
Doku Hidroksiprolin Düzeyleri
Sıfırıncı gün doku hidroksiprolin (OH-P) düzey- leri her üç grupta benzerdi.
On dördüncü günde; kontrol grubu ile karşılaştı- rıldığında BLM grubunun değerlerinin istatistik- sel olarak anlamlı derecede yüksek olduğu (p=
0.002), kontrol grubu ile erdostein grubu karşı- laştırıldığında iki grup arasında istatistiksel ola- rak anlamlı fark olmadığı görüldü. Erdostein grubunda bu değerin BLM grubuna göre anlam- lı derecede düşük olduğu gözlendi (p= 0.009).
Yirmi dokuzuncu günde; kontrol grubu ile karşı- laştırıldığında BLM grubunda doku OH-P düzeyi- Kontrol
Bleomisin Erdostein 0. gün 14. gün 29. gün
16 14 12 10 8 6 4 2 0
BAL MIP-1α (pg/mL)
a
bc a
b
Şekil 2. On dördüncü günde;
ap< 0.001 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp= 0.012 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, cp= 0.028 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
Yirmi dokuzuncu günde;
ap= 0.003 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp= 0.025 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
Kontrol Bleomisin Erdostein 0. gün 14. gün 29. gün
600
500
400
300
200
100
BAL MIP-2 (pg/mL)
a
b
Şekil 3. On dördüncü günde;
ap< 0.001 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp< 0.00 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
Kontrol Bleomisin Erdostein 0. gün 14. gün 29. gün
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
BAL MDA (nmol/mL)
a
b
a
Şekil 4. On dördüncü günde;
ap< 0.001 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, bp< 0.00 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
Yirmi dokuzuncu günde;
ap= 0.010 bleomisin grubu ile karşılaştırıldığında.
nin istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olduğu (p< 0.001), kontrol grubu ile erdostein grubu karşılaştırıldığında iki grup arasında ista- tistiksel olarak anlamlı farklılık olmadığı görül- dü. Erdostein grubunda bu düzeyin BLM grubu- na göre anlamlı derecede düşük olduğu tespit edildi (p< 0.001).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. günlerdeki de- ğerleri istatistiksel olarak anlamlı farklılık göster- medi. Grupların doku OH-P düzeyleri Tablo 2’de görülmektedir.
Fibrozis
Sıfırıncı günde fibrozis derecesi gruplar arasında benzerdi.
On dördüncü günde; kontrol grubu ile karşılaştı- rıldığında BLM grubunun değerinin anlamlı yük- sek olduğu (p= 0.01), kontrol grubu ile erdoste- in grubu karşılaştırıldığında erdostein grubunun değerinin yüksek olduğu fakat istatistiksel ola- rak anlamlı olmadığı saptandı. Yine BLM ile er-
dostein grupları arasında istatistiksel olarak an- lamlı fark saptanmadı.
Yirmi dokuzuncu günde; kontrol grubu ile karşı- laştırıldığında hem BLM hem de erdostein grupla- rının değerinin istatistiksel olarak anlamlı yüksek olduğu saptandı (sırasıyla p< 0.001, p= 0.01). Er- dostein grubunda bu değerin BLM grubuna göre anlamlı düşük olduğu görüldü (p= 0.01).
Erdostein grubunun 0., 14. ve 29. gün fibrozis dereceleri karşılaştırıldığında; gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olmadığı görüldü. Grupların fibrozis skorları Tablo 2’de görülmektedir.
Kontrol grubunun akciğer dokusu histopatolojik görünümü ve BAL sıvısı hücre içeriği Resim 1A ve 1B’de, BLM grubunun akciğer dokusu histopato- lojik görünümü ve BAL sıvısı hücre içeriği Resim 2A, 2B ve 2C’de, erdostein grubunun akciğer do- kusu histopatolojik görünümü ve BAL sıvısı hücre içeriği Resim 3A, 3B ve 3C’de görülmektedir.
Tablo 2. Tüm gruplarda doku hidroksiprolin düzeyleri ve fibrozis skorları.
Kontrol grubu (n= 15) Bleomisin grubu (n= 15) Erdostein grubu (n= 15) Sıfırıncı gün
Hidroksiprolin (mg/g kuru doku) 9.73 ± 1.86 10.63 ± 2.44 10.42 ± 2.03
Fibrozis 0.40 ± 0.54 0.40 ± 0.54 0.40 ± 0.54
On dördüncü gün
Hidroksiprolin (mg/g kuru doku) 10.52 ± 1.65 15.90 ± 1.99* 11.06 ± 1.94**
Fibrozis 0.20 ± 0.44 1.60 ± 0.89* 1.40 ± 0.54***
Yirmi dokuzuncu gün
Hidroksiprolin (mg/g kuru doku) 10.12 ± 2.40 19.33 ± 1.15* 11.45 ± 0.94**
Fibrozis 0.20 ± 0.44 3.00 ± 0.00* 1.60 ± 0.54**,***
* Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında p< 0.05.
** BLM grubu ile karşılaştırıldığında p< 0.05.
*** Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında p< 0.05
Resim 1. A. Kontrol grubunun akciğer histopatolojik görüntüsü (HE, x200), B. Kontrol grubunun BAL sıvı hücre görünümü (MGG, x200) (sitospin inceleme).
A B
Resim 2. A. BLM grubunda belirgin doku iltihabi hücre infiltrasyonu, alveollerde kistik genişleme ve duvar harabiyeti (HE, x200), B. BLM grubunda Grade 3 fibrozis (MT, x200), C. BLM grubunda BAL sıvısında belirgin inflamatuvar hücre artışı (MGG, x200).
A B
C
Resim 3. A. Erdostein grubunda alveollerde daha az duvar harabiyeti ve daha hafif inflamatuvar hücre infiltrasyonu (HE, x200), B. Erdostein grubunda alveollerde daha az fibröz doku artışı (MT, x200), C.
Erdostein grubunda BAL sıvısında daha hafif inflamatuvar hücre infiltrasyonu (MGG, x200).
A B
C
TARTIŞMA
BLM ile akut akciğer inflamasyonu ve geç dö- nem fibrozis oluşturduğumuz bu deneysel çalış- mada, erdostein uygulamasıyla BLM’nin neden olduğu patolojik ve biyokimyasal değişikliklerin önlenebileceğini tespit ettik.
BLM’nin indüklediği pnömonitisin patofizyolojisi iki fazdan oluşmaktadır. Birinci fazda interstisyel alanda ve alveoler boşlukta nötrofil, lenfosit, makrofaj gibi inflamatuvar hücrelerin birikimi söz konusu iken, ikinci fazda geç fibrozis gelişi- mi mevcuttur (5). Yapılan çalışmalarda BLM uy- gulaması ile BAL sıvısında nötrofillerin ilk gün- lerde artmaya başladığı, 14. günde pik yaptığı ve daha sonraki günlerde kademeli olarak azal- dığı ve antioksidan ajan uygulamasının akciğer dokusunda ve BAL sıvısında polimorfonükleer lökosit (PNL) birikimini azalttığı bildirilmiştir (5,18-20). Çalışmamızda intratrakeal BLM uy- gulamasının BAL nötrofil oranlarında bariz artışa neden olduğu, 14. gün plato değere ulaştığı, nöt- rofil oranının 29. günde de hala yüksek olduğu ve erdostein tedavisinin BLM enjeksiyonuna bağlı nötrofil artışını 14. ve 29. günde anlamlı derecede baskıladığını gördük. BAL lenfosit oranlarının sadece BLM uygulanan ratlarda kontrol grubuna göre 14. ve 29. günlerde bariz olarak yükseldiği, erdostein ile tedavi edilen rat- larda ise lenfosit oranlarında artış olmasına rağ- men kontrol grubuyla anlamlı farklılık gösterme- diği tespit edildi. Erdostein ile tedavi edilen rat- ların 0., 14. ve 29. günlerdeki lenfosit oranları arasında da anlamlı düzeyde fark izlenmedi. Bu bulgu erdosteinin nötrofillerin inflamasyon alanı- na göçünü engelleyerek akut inflamasyonu inhi- be edebileceğini düşündürmektedir.
BLM’nin indüklediği fibrotik değişikliklerin geli- şimi esnasında akciğerde MIP-1αve MIP-2 üreti- minin arttığı ve bu kemokinlere karşı nötralizan monoklonal antikorlar uygulandığında fibroziste azalma olduğu gösterilmiştir (21,22). Theodore ve arkadaşları, MIP-1α’nın PNL ve monositlerin kemotaksisini indüklediğini, sarkoidozlu ve İPF’li hastalarda BAL sıvısında sağlıklılara kıyasla MIP-1α’nın belirgin miktarda yüksek olduğunu bildirmişlerdir (23). Başka bir çalışmada, fare- lerde BLM ile indüklenen akciğer fibrozisinde
MIP-1α’nın üçüncü gün arttığı, yedinci ve 14.
günlerde maksimum düzeye ulaştığı ve 28. gün- de azalmaya başladığı, MIP-2’nin ise üçüncü ve yedinci günlerde maksimum düzeye ulaştığı, 14.
ve 28. günlerde azaldığı bildirilmiştir (24). Hagi- wara ve arkadaşları, BLM verilen ratlarda MIP-1α ve MIP-2 seviyelerinin yedinci günde pik yaptığı- nı ve sonrasında hızlı bir şekilde azaldığını, N- asetilsistein (N-AC) uygulamasının kemokinler- deki bu artışı engellediğini göstermişlerdir (5).
Bizim çalışmamızda MIP-1α’nın sadece BLM ve- rilen ratlarda belirgin olarak arttığı ve 14. günde pik değere ulaştığı ve daha sonra bir miktar düş- me olmakla birlikte 29. günde hala yüksek oldu- ğu, erdostein ile tedavi edilen ratlarda ise MIP- 1α’da yükselme olmakla birlikte 14. ve 29. gün- lerde BLM grubuna göre anlamlı düzeyde düşük kaldığı ve 29. günde bazal değere indiği görüldü.
BAL MIP-2 düzeylerinin BLM grubunda anlamlı derecede yükseldiğini, 14. günde plato değere ulaştığını ve 29. günde istatistiksel olarak an- lamlı olmasa da hala yüksek olduğunu, erdoste- in tedavisinin bu yükselmeyi özellikle erken dö- nemde engellediğini saptadık. Aynı zamanda BLM grubu ile erdostein grubundaki ratlarda ke- mokin ve PNL düzeylerinin paralellik gösterdiği- ni tespit ettik.
Lipid peroksidasyonunun indirekt bir göstergesi olarak kabul edilen MDA ile ilgili bir çalışmada;
tavşanlara hidroklorik asidin intratrakeal uygu- lamasıyla oluşturulan akut akciğer hasarında BAL MDA düzeyinin anlamlı derecede yükseldi- ği gösterilmiştir (25,26). Ratlarda oral uygula- nan erdosteinin, antioksidan aktiviteyle koruyu- cu etkisi olduğu bilinmektedir (27-30). BLM’nin neden olduğu akciğer hasarında ROS ve nitrojen türlerinin ilişkisi bilindiğinden beri ambroksol ve N-AC gibi antioksidanlar BLM’nin indüklediği akciğer hasarını önlemek için kullanılmıştır (5,31,32). Bizim çalışmamızda lipid peroksidas- yonunun göstergesi olarak MDA kullanılmıştır.
Erdosteinin BLM’nin neden olduğu lipid peroksi- dasyonunu engellediği gösterilmiştir. Erdosteinin bu koruyucu etkisinin onun serbest radikalleri ortamdan uzaklaştırıcı ve antioksidan aktivitesi- ne bağlı olabileceği düşünülmüştür.
BLM’nin süperoksit ve hidroksil radikallerini içeren reaktif oksijen ürünlerini ürettiği bilin-
mektedir. Bu ürünler akciğer dokusunda DNA hasarı, lipid peroksidasyonu, akciğer prostag- landin sentezi ve yıkımında değişikliklere neden olur ve akciğerde kollajen sentezi artar. BLM uygulandıktan sonra sitokin disregülasyonu ve inflamasyon gelişir, fibroblastlar aktifleşir ve kollajen üretimi uyarılırken, kollajen yıkımı inhi- be olur (33). Yara ve arkadaşlarının çalışmasın- da, farelere intratrakeal BLM uygulamasıyla ak- ciğerde yedinci gün OH-P birikiminin başladığı ve 28. günde maksimum düzeye çıktığı (kontrol grubuna göre yaklaşık %180 daha fazla) bildiril- miştir (24). Yapılan çalışmalarda BLM uygula- ması ile artan OH-P düzeylerinin N-AC tedavi- siyle azaltılabileceği gösterilmiştir (34-36). Sö- ğüt ve arkadaşlarının çalışmasında, BLM’nin OH-P içeriğini ve fibrozis skorunu artırdığı ve erdostein tedavisiyle bu bulguların anlamlı de- recede azaldığı bildirilmiştir (37). Çalışmamızda akciğer fibrozisi, kollajen birikiminin bir göster- gesi olan akciğer OH-P içeriği ölçülerek belir- lendi. BLM uygulamasıyla fibrozis derecesinin kontrol grubuna göre yaklaşık yedi kat, akciğer OH-P içeriğinin iki kat arttığını ve erdostein te- davisinin bu değişiklikleri anlamlı derecede azalttığını saptadık. Erdosteinin fibrozisi engel- lemesini açıklayabilecek muhtemel mekaniz- malar; akciğerde inflamatuvar hücrelerin biriki- minin inhibisyonu, böylece sekonder etki olarak serbest oksijen radikali üretiminin azalması, ak- ciğerde mevcut bulunan inflamatuvar hücreler- ce üretilen serbest oksijen radikallerinin ortam- dan uzaklaştırılması, BLM’nin neden olduğu ser- best radikallerin doğrudan detoksifiye edilmesi, dolayısıyla fibroblast proliferasyonunun inhibis- yonu şeklinde düşünülebilir.
Sonuç olarak; ratlarda BLM’nin neden olduğu akut akciğer inflamasyonu ve geç dönem fibro- zisin erdostein uygulamasıyla azaltılabileceğini gördük. Erdosteinin bu koruyucu etkisi, akci- ğerlerde lökositlerin birikimini inhibe etmesi, çeşitli kemokinlerin üretiminin ve salınımının engellenmesi veya ortamdan uzaklaştırılması, serbest oksijen radikallerinin oluşumunun en- gellenmesi ya da ortamdan eliminasyonuyla olabilir.
KAYNAKLAR
1. Goldstein RH, Fine A. Potential therapeutic initiatives for fibrogenic lung disease. Chest 1995; 108: 848-55.
2. Sausville EA, Stein RW, Peisach J, Horwitz SB. Properti- es and products of degradation of DNA by bleomycin and iron (II). Biochemistry 1978; 17: 2746-54.
3. Galvan L, Huang CH, Prestayko AW, et al. Inhibition of bleomycine-induced DNA breakage by superoxide dis- mutase. Cancer Res 1981; 41: 5103-6.
4. Cunningham ML, Ringrose PS, Lokesh BR. Inhibition of the genotoxicity of bleomicin by superoxide dismutase.
Mutat Res 1984; 135: 199-202.
5. Hagiwara S, Ishii Y, Kitamura S. Aerolized administrati- on of N-acetylcysteine attenuates lung fibrosis induced by bleomicin in mice. Am J Respir Crit Care Med 2000;
162: 225-31.
6. Crystal RG, Bitterman PB, Rennard SI, et al. Interstitial lung diseases unknown cause: Disorders characterized by chronic inflammation of the lower respiratory tract. N Engl J Med 1984; 310: 154-66.
7. Olivieri D, Del-Donno M, Casalini A, et al. Activity of er- dosteine on mucociliary transport in patients affected by chronic bronchitis. Respiration 1991; 58: 91-4.
8. Biagi GL, Fregnan GB, Gazzani G, Vandoni G. Erdosteine protection from cigarette smoke-induced loss of α1-an- titrypsin activity in rat lungs. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol 1989; 27: 235-7.
9. Inglesi M, Nicola M, Fregnan GB, et al. Synthesis and free radical scavening properties of the enantiomers of erdos- teine. Farmaco 1994; 40: 703-8.
10. Vagliasindi M, Fregnan GB. Erdosteine protection aga- inst cigarette smoking-induced functional antiprotease deficiency in human bronchiolo-alveolar structures. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol 1989; 27: 238-41.
11. Ozyurt H, Söğüt S, Yildirim Z, et al. Inhibitory effect of caffeic acid phenethyl ester on bleomycine-induced lung fibrosis in rats. Clin Chim Acta 2004; 339: 65-75.
12. Boyaci H, Maral H, Turan G, et al. Effects of erdosteine on bleomycin-induced lung fibrosis in rats. Mol Cell Bioc- hem 2006; 281: 129-37.
13. Wang HD, Yamaya M, Okinaga S, et al. Bilirubin ameli- orates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.
Am J Respir Crit Care Med 2002; 165: 406-11.
14. Wang YH, Bai CX, Hong QY, Chen J. Anti-inflammatory effect of methoxyphenamine compound in rat model of chronic obstructive pulmonary disease. Acta Pharmacol Sin 2003; 24: 1324-7.
15. Agarwal R, Chase SD. Rapid, fluorimetric-liquid chro- matographic determination of malondialdehyde in biolo- gical samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2002; 775: 121-6.
16. Woessner JF. The determination of hydroxyproline in tis- sue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys 1961; 93: 440-7.
17. Ashcroft T, Simpson JM, Timbrell V. Simple method of es- timating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol 1988; 41: 467-70.
18. Gurujeyalakshmi G, Wang Y, Giri SN. Suppression of ble- omycin-induced nitric oxide production in mice by tauri- ne and niacin. Nitric Oxide 2000; 4: 399-411.
19. Yildirim Z, Kotuk M, Iraz M, et al. Attenuation of bleomy- cin-induced lung fibrosis by oral sulfydryl containing antioxidants in rats: Erdosteine and N-acetylcysteine.
Pulm Pharmacol Ther 2005; 18: 367-73.
20. Serrano-Mollar A, Closa D, Prats N, et al. In vivo antioxi- dant treatment protects against bleomycin-induced lung damage in rats. Br J Pharmacol 2003; 138: 1037-48.
21. Smith RE, Strieter RM, Zhang K, et al. A role for C-C che- mokines in fibrotic lung disease. J Leukoc Biol 1995; 57:
782-7.
22. Keane MP, Belperio JA, Moore TA, et al. Neutralization of the CXC chemokine macrophage inflammatory protein-2 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Im- munol 1999; 162: 5511-8.
23. Theodore J, Standiford TJ, Rolfe MW, et al. Macrophage inflammatory protein-1α expression in interstitial lung disease. J Immunol 1993; 151: 2852-63.
24. Yara S, Kawakami K, Kudeken N, et al. FTS reduces ble- omycin-induced cytokine and chemokine production and inhibits pulmonary fibrosis in mice. Clin Exp Immu- nol 2001; 124: 77-85.
25. Sayman S, Meyancı Köksal G, Erdamar S ve ark. Tav- şanlarda akut akciğer hasarında nedokromil sodyumun tedavideki yerinin araştırılması. GKD Anest Yoğ Bak Dern Derg 2003; 9: 52-5.
26. Meyancı G, Arıcıoglu F, Oz H, Aydemir A. The effects of intratracheal dexamethasone on lipid peroxidation in acute lung injury. Cerrahpaşa J Med 2001; 32: 20-4.
27. Yildirim Z, Sogut S, Odaci E, et al. Oral erdosteine admi- nistration attenuates cisplatin-induced renal tubular da- mage in rats. Pharmacol Res 2003; 47: 149-56.
28. Yagmurca M, Fadillioglu E, Erdogan H, et al. Erdosteine prevents doxorubicin-induced cardiotoxicitiy in rats.
Pharmacol Res 2003; 48: 377-82.
29. Ege E, Ilhan A, Gurel A, et al. Erdosteine amilorates ne- urological outcome and oxidative stres due to iscehe- mia/reperfusion injury in rabbit spinal cord. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 28: 379-86.
30. Dechant KL, Noble S. Erdosteine. Drugs 1996; 52: 875-81.
31. Tamagawa K, Taooka Y, Maeda A, et al. Inhibitory effects of a lecithinized superoxide dismutase on bleomycin-in- duced pulmonary fibrosis in mice. Am J Respir Crit Ca- re Med 2000; 161: 1279-84.
32. Hong JS, Ko HH, Han ES, Lee CS. Inhibition of bleomy- cin-induced cell death in rat alveolar macrophages and human lung epithelial cells by ambroxol. Biochem Phar- macol 2003; 66: 1297-306.
33. Sleijefer S. Bleomycin-induced pneumonitis. Chest 2001;
120: 617-24.
34. Cortijo J, Cerda-Nicolas M, Serrano A, et al. Attenuation by oral N-acetylcysteine of bleomycin-induced lung in- jury in rats. Eur Respir J 2001; 17: 1228-35.
35. Serrano-Mollar A, Closa D, Cortijo J, et al. P-selectin up- regulation in bleomycin-induced lung injury in rats: Ef- fect of N-acetylcysteine. Thorax 2002; 57: 629-34.
36. Mata M, Ruiz A, Cerda M, et al. Oral N-acetylcysteine re- duces bleomycin-induced lung damage and mucin Muc- 5ac expression in rats. Eur Respir J 2003; 22: 900-5.
37. Sogut S, Ozyurt H, Akyol O, et al. Protection of erdoste- ine on bleomycine-induced lung fibrosis in rats. Eur J Pharmacol 2004; 494: 213-20.
