Genetik 9_ Antik DNA Çalışmalarında Antropologlar
DOÇ.DR. YEŞIM DOĞAN ANKARA ÜNIVERSITESI DTCF ANTROPOLOJI BÖLÜMÜ
Ülkemiz birçok farklı medeniyeti barındırmış, kültürel ve biyolojik açıdan oldukça zengin bir bölgedir. Bu bölgede tarih üzerine çalışmalar
gerçekleştiren araştırmacılar için büyük önem taşıyan çok sayıda kazı çalışması ve bu çalışmalardan elde edilen çok değerli antik materyaller vardır. Buluntuları inceleyen bilim insanları elde ettikleri veriler ile söz konusu topluluğun evrimsel geçmişi, göç yolları, diğer topluluklarla ilişkileri, beslenme şekilleri ve hastalıkları ile ilgili bilgilere ulaşarak, dönemi yeniden gözlerinde canlandırmaya çalışır. Uzun yıllar boyunca insan buluntuları ile ilgili bu çalışmalar morfolojik ve metrik yöntemler ile gerçekleştirilmiş iken, son yirmi yılda ilerleme kaydedilen antik DNA analizleri çalışmalara ivme kazandırmış ve yeni bir bakış açısı
getirmiştir.
Moleküler genetik uygulamaları açısından antik DNA analizlerini diğer örnekler üzerinde gerçekleştirilen analizlerden ayıran en önemli fark DNA’nın kalitesi ile ilgilidir. Standart DNA analizlerinde ilk aşama elde edilen DNA’nın kalite ve miktarının belirlenmesidir. Antik örneklerde ise elde edilen DNA’nın kalitesi ve miktarı ideal olmaktan çok uzaktır. Bu nedenle de modern DNA analizi gerçekleştiren uzmanların
öngöremeyeceği sorunlara gebedir. Antik DNA uygulamaları problemli örneklerle çalışma deneyimi ve standart moleküler genetik
çalışmalarından farklı bir çalışma ortamı gerektirir.
Tüm güçlüklerine rağmen bu analizler sonucunda elde edilen bilgi paha biçilemez değerdedir. Ancak çalışmaların daha verimli olması,
örneklerin mümkün olan en hassas şekilde elde edilip saklanması ve bir moleküler çalışmadan nelerin beklenebileceğinin ortaya konulması
açısından alan ile ilgili çalışmalar gerçekleştiren antropolog ve
arkeologların bu çalışmalar konusunda bilgi düzeylerinin arttırılması büyük önem taşımaktadır.
Antik DNA Analizinde Aşamalar
Antik DNA analizlerinde ilk aşama örneklerin seçilmesidir. Bu çalışmaların önemli kısmında genetik materyal kaynağı kemikler ve dişlerdir (Katzenberg 2005). Materyallerde DNA’nın ne kadar
korunmuş olduğu çevresel koşullar ve bu koşullarda kalma süresi ile bağlantılıdır. Olumsuz koşullar genellikle örneklerin morfolojik görünümlerine de zarar verecek kadar etkilidir. Bu nedenle kesin bir kanı olmamakla beraber morfolojik olarak daha iyi korunmuş örneklerin içlerindeki DNA
molekülünü de daha iyi korumuş olabilecekleri düşünülmektedir (Boberova 2012). Örnekler seçildikten sonra, bu aşamaya kadar onlarca kişinin temasına maruz kalmış ya da olumsuz koşullarda birbirine temas halinde uzun süre beklemiş olduğundan dekontamine (dış
kontaminantlardan arındırma) edilmelidir. Bu işlem farklı şekillerde yapılabilir. Ancak en çok tercih edilen yöntem örneğin her yüzeyine UV uygulaması, çamaşır suyu ile temizleme ve örnek alınacak yüzeyin ince bir tabaka halinde zımparalanmasıdır (Kemp 2005; Yang 2005). Dış
kontaminantlardan arındırılan örnekler artık DNA ekstraksiyonu (eldesi) için toz haline getirilmeye hazırdır. Bu aşama hangi iskelet kısmının kullanıldığına göre farklı uygulamalar içerebilir ancak her halükârda geri dönüşsüz olarak örneğin kullanılması anlamına gelir (Rohland 2007). Toz haline getirilen örnekten DNA elde edilir ve daha sonraki moleküler genetik analizler için DNA kalitesi değerlendirilir ve ardından hipotezi sorgulamak için gerekli analiz yöntemine geçilir.
Antik DNA Analizleri ile İlgili Güçlükler
Moleküler genetik çalışmalarında çoğunlukla DNA analizi için özel olarak alınmış ve özel koşullarda saklanan biyolojik örneklerden faydalanılır. Antik DNA analizleri ise tanımından da anlaşılacağı gibi özel koşullarda tutulmayan biyolojik materyal
üzerinde gerçekleştirilir. Bu nedenle antik DNA analizlerinde kullanılan teknikler modern DNA analizlerindekilerle aynı olmasına rağmen aDNA söz konusu
olduğunda kalıntıların çok az DNA içermesi ve bunun da farklı DNA kaynakları tarafından kontamine olmuş olması nedeniyle her basamak farklı zorluklarla
bezenmiştir (Handt 1993). Bu olumsuzluklar örneklerin bulundukları koşullar ve bu koşullarda bulunma sürelerine göre farklı boyutlarda olabilir. Araştırmalar örneklerin yaşından çok içinde bulundukları iklimsel koşullar ve toprağın yapısının etkili
olduğunu göstermektedir. En olumlu koşulların düzenli soğuk veya kuraklık olan bölgelerde ya da buzullarda olduğu düşünülürken, değişken sıcaklıkta ve nemli iklimlerin örnekler üzerinde olumsuz etkileri olduğu bilinmektedir (Connie 2006).
Antik DNA analizlerinde karşılaşılan güçlükleri üç ana başlıkta incelediğimiz takdirde;
Kontaminasyon (bulaş)
DNA’nın degrade (parçalara ayrılmış) olması
PCR inhibitörlerinin (PCR reaksiyonunu engelleyen bileşenler) varlığını sıralayabiliriz.
Kontaminasyon
Bir örneğin üzerinde kendi DNA’sı dışında DNA molekülü olması
anlamında kullanılır. Aslında farklı bir türe ait dış DNA’nın varlığı daha sonra yapılacak PCR reaksiyonu aşamasında elimine olacağı için önemli bir sorun teşkil etmez. Ancak insan iskeleti üzerinde modern insan
DNA’sı kontaminasyonu ciddi bir problemdir. Bunun nedeni, antik
örnekten elde edilen az miktarda ve düşük kalitedeki DNA’nın daha iyi durumdaki modern DNA örneği ile PCR koşullarında rekabet
edememesidir (Hofreiter 2003; Leney 2006).
DNA’nın degrade oluşu
Antik örneklerden elde edilen DNA miktarca çok az ve ileri düzeyde de hasarlıdır. Çevresel koşullar DNA’nın hızla küçük parçalara ayrılmasına neden olmuştur. Araştırmacılar peşinde oldukları bilgiye ulaşmak için önce milyonlarca küçük parçayı bir araya getirerek bir bütün oluşturmak durumundadır (Alonso 2004) Bunun gerçekleştirilmesi de daha fazla
emek, daha fazla tekrar, daha fazla sarf malzeme kullanılması anlamına gelir. Tüm uğraşlara ve gelişmelere rağmen antik DNA analizlerinin
düşük başarı oranları ile karakterize olduğunu bilmek gerekir.
PCR inhibitörlerinin varlığı:
PCR reaksiyonu ile az miktardaki DNA laboratuvar koşullarında sayıca çoğaltılabilir. Bu işlemde enzimler kullanıldığından, koşullar bu
enzimlerin en iyi çalışacağı şekilde ayarlanmıştır. Ancak bazı maddelerin varlığı bu koşulları değiştirir ve enzimin görevini yapmasına engel olur.
Toprak da PCR inhibitörleri açısından zengin bir ortam olduğu için bu durum antik DNA analizlerinin önemli sorunlarından biri haline gelmiştir (Prado 1997).
Antik DNA araştırmalarında göz önünde bulundurulması gereken en önemli faktörlerden birisi çalışmaların morfolojik ve metrik analizler gerçekleştiren araştırmacıların alışmadığı ölçüde büyük bütçelere mal olmasıdır. Moleküler
genetik araştırmaları hali hazırda yüksek bütçeler gerektirirken, antik örneklerde DNA’nın kalite problemleri nedeniyle sonuç alana dek defalarca tekrar analiz
yapmak gerektiğinden maliyet daha da artar. Üstelik nispeten daha kaliteli örnekler ile çalışma yapıldığında bile antik DNA analizlerinin uluslararası güvenirlilik kriterleri gereği, sonucun desteklenmesi için bağımsız laboratuvarlarda tekrarlanması
gerekir. Bu da bütçeyi zorlayan bir başka gerekliliktir.
Tüm bu teknik güçlükler ile başa çıkmanın yolları bulunduğunda DNA analizleri
prehistorya çalışan bilim insanları için farklı bir bakış açısı kazandıracak, teleskobun astronomiye, mikroskobun biyolojiye sağladığı gibi bir katkı sağlayacaktır.
Antik DNA Analizleri Hangi Sorulara Cevap Verir?
Uygulama Muhtemel Çıkarımlar Analiz Yöntemi Örnek Çalışmalar
-Cinsiyet Belirlenmesi (morfolojik olarak cinsiyetin belirlenmesinin mümkün olmadığı
durumlarda)
-Gömü gelenekleri, -Cinsiyete bağlı ölüm oranları,
-Hastalıkların ya da varyasyonların cinsiyet ile ilişkileri
Seks kromozomlarında amelogenin
bölgesi analizi Faerman 1995
Lassen 2000 Alakoc YD., Stone 1996
-Anasal ve Babasal soy analizi - Grup gömülerde ortak ata analizi
- Gömü gelenekleri - Sosyal yapı, evlilik gelenekleri
- Göç olaylarının analizi
- Populasyon devamlılığı (belli bir nüfus daha önce aynı bölgede yaşayanlarla akraba mı)
- Populasyon yerdeğiştirme (yeni popülasyon göç ile daha sonra mı geldi) - Belli bir buluntunun spesifik bir popülasyonla ilişkisinin çözümlenmesi
- Karışık iskeletlerde bireyin iskelet parçalarının belirlenmesi
mtDNA analizi, Y STR ve otozomal STR analizi
Haak 2008 Kuhn 2018 Hanna 2012
Gill 1994 Stoneking 1992
Carlyle 2000 -Genetik çeşitlilik / Populasyon Boyutu
analizleri - Belli bir popülasyonda herhangi bir olay nedeni ile küçülme / genetik çeşitlilikte azalma olup olmadığının analizi
(örn. Avrupalıların teması Amerikan yerlilerinin sayısında/ dolayısıyla genetik çeşitliliğinde azalmaya neden olmuş mudur?)
Haplogrup analizleri Gonzalez-Oliver 2001
Kaestle 2001 Malhi 2004 Monsalve 1996 Stone & Stoneking 1999
Gamba 2014 -Genetik bozukluklara yol açan
mutasyonların taranması - Evrimsel öneme sahip, orak hücre anemisi, Akdeniz ateşi, FVL ve bunun gibi mutasyonların söz konusu toplumlarda araştırılması ve mutasyon bağlantılı
evrimsel ilişkilerin ışığında dönemin özelliklerinin yeniden yapılandırılması
- Genetik bozukluk ile ilişkilendirilmiş
mutasyonun sekans analizi ile tespiti
Beraud 1995 Filon 1995 Alakoc 2010
-Filogenetik analiz - Tür evrim modeli
- Soyu tükenen canlıların en yakın yaşayan akrabalarını bulmak - Modern insanın orijini
- Evcilleştirme süreci -Çevrenin yeniden yapılandırılması
-Türler ile ilişkili farklı genlerin sekans analizi
-mtDNA sekansı
Akış 2016 Hajdinjak 2018
Reich 2011 Slon 2018 Rogaev 2006 Willerslev 2009
-Mikrobiyal DNA analizi - İnsan ya da hayvan patojenlerinin orijini ve evrimi
- Dönemin etkin enfeksiyonlarının belirlenmesi -Türler ile ilişkili farklı genlerin sekans
analizi Donoghue 2004
Salo 1994 Drancourt 2002
-Kaprolit DNA Analizi - Beslenme alışkanlıkları
- Dönemin fauna ya da florasına yönelik bilgi - Çevrenin yeniden yapılandırması
-Sekans analizi
Poinar 1998
Poinar 2001 Sutton 1996 -Antik epigenetik - Çevresel koşullara göre genomde değişen epigenetik özellikler aracılığı ile
dönemin diyet alışkanlıkları, kıtlık, kuraklık bilgisi, hastalık etkileri ve iklimsel koşullar
- Sitozin metilasyon profili analizi Smith 2015
Antik DNA Yapılacak Örnekler için Antropolog ve Arkeologların Alması Gereken Önlemler Nelerdir?
Antik bir biyolojik materyalin içerisindeki DNA molekülü zaten
araştırmacılar tarafından kazı ortamında bulunana kadar içerisinde
kaldığı koşullar ve bu koşullarda kaldığı süre nedeni ile zarar görmüştür.
Ancak yine de bugüne kadar varlığını sürdürebilmiş olması, o koşulların nispeten uygun olmasındandır. Kazıyı gerçekleştiren uzmanlar
tarafından bulunduğu ortamdan çıkarılıp oksijen, nem, güneş vb. gibi ortam koşullarına maruz bırakılan örnek çok daha hızlı bir bozulma sürecine girer (Martinez 2015). Bu açıdan önemli olan örneklerin DNA analizi için ilk bulundukları durumdan daha dezavantajlı hale gelmemesi için çaba göstermektir. Bunun yolu da örneklere ilk temas etme olasılığı olan antropolog ve arkeologların konu ile ilgili donanımlı hale
gelmesidir. Bir kazıda örnek ilk çıkartıldığı andan itibaren yapılması ve yapılmaması gerekenler aşağıda sıralanmıştır.
Örnekleri çıkartan ve daha sonra üzerinde morfolojik ve metrik çalışmalar yapan bilim insanları haliyle örnekleri üzerlerindeki bazı detayları görebilmek ve
çalışma yapabilmek için temizlemek isteyecektir. Bu aşamada ıslak bir temizlik yönteminin uygulanması örneğin dışında bulunan kontaminantların (bulaşan yabancı DNA gibi) porlu kemik içerisine nüfus etmesine neden olur. Bu şekilde muamele gören bir iskelet parçasının dekontaminasyon ancak örneğin dış
yüzeyine uygulanabildiğinden daha sonra laboratuvarda dekontaminasyon sürecinden geçmesi etkili olmayacaktır. Örneklerden DNA analizi yapılması planlanıyor ise en ideali bu örneklerle ilgili temizlik aşamasının DNA
laboratuvarında gerçekleştirilmesidir. Bu mümkün değil ise örneklerin kuru fırçalama ile temizlenmesi gerekir.
Biyolojik örneklere en çok zarar veren çevresel koşullardan birisi de nemdir.
Örneklerin yıkanarak temizlenmesi bu açıdan da zararlıdır.
Örneklerin kırılganlıkları ile ilgili bir endişe olduğunda araştırmacılar güçlendirmeye yönelik bazı uygulamalar yapabilir. Bu uygulamalarda kullanılan kimyasal maddelerin daha sonra gerçekleştirilecek PCR
reaksiyonunu olumsuz etkileme olasılığı vardır. Bu nedenle mümkünse örneğe herhangi bir güçlendirme işlemi uygulanmamalıdır.
Sıcak nemli hava biyolojik bir materyale en fazla zarar verecek
şeylerden biridir. Bu nedenle ideal olan örneklerin bulundukları andan itibaren kuru serin koşullarda tutulmasıdır. Bunun için özel bir imkân sağlanamadığı takdirde, örneklerin dondurularak saklanması tavsiye edilebilir. Buzdolabı koşulları kısa süreli olarak yeterli olsa da uzun vadede nemlenmeye neden olacağından tercih edilmez.
Var olan kontaminantlara yenisini eklememek adına örneklere her temasta eldiven kullanılması önerilmektedir. Her ne kadar literatür çıplak elle örneklere dokunmanın sakıncasını anlatan makalelerle doluysa da aslında yukarıda belirtilen hatalı uygulamalar ile
kontaminantların örneğin içine nüfus etmesine neden olunmadığı
takdirde dış kontaminantların temizlenmesi mümkündür. Bugüne kadar gerçekleştirilmiş çalışmaların önemli bir kısmı henüz aDNA analizlerinin duyulmadığı ve bu nedenle özel önlemlerle toplanmamış ve
depolanmamış örnekler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Burada söylenmek istenen, aDNA çalışmalarının başarı yüzdesini arttırmak için mümkün olduğunca koşulların düzeltilmesi gerektiğidir.
En ideal durum bir kazı ekibinin, daha sonra DNA analizi yapacak olan uzmanlar ile düzenli bir temas halinde olmasıdır. Bu şekilde her
aşamada DNA analizine girecek olan örnek ile ilgili tavsiye almaları ve ekstrem önlemleri sadece bu örneklere uygulamaları mümkün olacaktır.
Aksi takdirde bir kazıdan elde edilen tüm materyalin dondurularak saklanması veya özel koşullarda tutulması çalışmanın seyri açısından zorlayıcı olacaktır.
Mümkün ise üzerinde DNA analizi gerçekleştirilecek örnekler herhangi bir ön çalışmaya maruz kalmadan ilgili laboratuvara hızla ulaştırılmalıdır (Leney 2006).
Bütün güçlüklerine ve başarı yüzdesinin düşük oluşuna rağmen antik DNA analizlerinin tarih öncesi dönemleri araştıran bilim insanlarına potansiyel faydaları göz ardı edilemeyecek kadar fazladır. Bu nedenle Anadolu gibi tarihin önemli aşamalarına tanıklık yapmış topraklarda araştırmalarını yürüten her uzmanın antik DNA analiz alanı ile ilgili bilgi düzeyini arttırması ve başarılı sonuçların alınması için üzerine düşen sorumlulukların bilincinde olması önemlidir. Başarılı bir antik DNA
çalışması ancak disiplinlerarası bir anlayışla bir araya gelen antropolog, arkeolog ve uzman moleküler genetikçilerin varlığında
gerçekleştirilebilir.
