DNA POLYMORPHISMS AND TYPING PROCEDURES USED FOR FORENSIC PURPOSE

T

i

pl

e

nd

i

rm

e

T

e

knikl

e

ri

Bio. Dr. Ay§e SERiN*,Pro

f.

Dr. Behnan ALPER*, Bio. Htisniye DAG*

• C;ukurova Universitesi TIp Fakiiltesi Adl; TIp Anabilim Dah, Adana, Tiirkiye

Ozet

Adli bilimler alamnda DNA tiplendirme prosedurleri gittikr;e artan oneme sahip

olmu~tur.

Bu makalede, adli

bilimlerde kullamlan insan DNA polimOljizmleri ve onlarm tiplendirilmesinde kullamlan prosedurlerin

aktanlma-Sl

amar;lanml~tlr.

peR ve RFLP yontemleri ile bu yontemle

r

e dayaZz single lokus polimorfizm ve multilokus

poli-morjizm, AMP-FLP, STR, DQAI +PM, mtDNA polimorjizmleri

tanlmlanml~

ve

tartl~llml~tlr.

Anahtar Kelimeler: DNA, genetik polimorjizm, VNTR, RFLP, peR.

DNA Polymorphisms and Typing Procedures Used/or Forensic Purpose

Summary

DNA typing procedures have become increasingly important in the jield of forensic science

s

. In this paper,

hu-man DNA polymorph isms and typing procedure

s

used for forensic purpose are reviewed. Single-and multi-locus

polymorphism, AMP-FLP, STR, DQAI +PM, mtDNA polimorphism based on peR and RFLP meth

o

ds described

and discussed.

Key Words: DNA

,

genetic polymorphi

s

m, VNTR, RFLP

,

peR.

Giri§

T

u

rleri b

irb

irin

d

en aYlran ge

n

etik §ifrenin (DNA

)

aym tilr

i~inde

de varyasyonlar gostermesi ve bu

varyasyon-lann mo

l

ek

Lil

er tekni

k

le

rl

e belirle

n

ebilmesi, adl

i

amac;h kim

li

k

l

end

irm

e ve patemite tayi

ni

nde ku

ll

ammmi g

ti

nde-me getirmi§tir. Ba§

l

ang

l

c;ta gen tirtin

l

er

i

nin olu§t

u

rdugu genetik kont

roll

ti i§aretlerin sero

l

ojik ve im

m

tino

l

ojik

yon-temlerle identi

f

ikasyon

v

e

k

i

m

liklendiri

l

mesi yap

l

hrken, gtintimtizde dogrudan DNA tekno

l

ojis

i

nin b

u

amac;la

kul-lamml vazgec;i

l

mez

h

a

l

e gelmi§tir. Boylelikle adli omeklerin kimliklendirilmesi ve akrabahk ili§kilerinin

belirlen-mesi

n

de da

h

a sag

h

k

h

ve gtivenil

ir

sonuc;lar ahnmasma o

l

anak sunulmu§tur 0-5). Bu c;a

h

§mada adli amac;

h

kulla-m

l

a

n DNA

p

olimorfizmleri ve ti

p

le

n

dirme teknik

l

erinin gozde

n

gec;irilmes

i

amac;lanmaktadlr.

Genel BilgiJer

D

NA molek

Lil

ti ic;i

n

deki poli

m

orfizmler bireysel oze

ll

ik

l

er

i

n te

m

elidir. 3 milyar bazdan olu§an insan

DNA'sm-da her bi

n

bazda

n

b

ir

ini

n

b

i

reyler aras

md

a farkh olabilecegi belirti

l

mek

t

edir

(1).

Adli omekler

d

en DNA t

i

p

l

end

i

rmesinde DNA'nm bu polimorfik oze

ll

iklerinden yar

a

rlamlmaktad

lr.

DN A ti

z

erinde c;e§i

tl

i mutasyon

l

ar sonucu ol

u

§an polimorfizmler teme

l

olarak iki sl

m

fa aynlmaktadlr (4-7).

l.

Sek

a

ns (Site) polimorfizmleri

2. Uzu

n

luk (Leng

th

)

p

o

lim

orfizmleri

1- Sekans polimorfizmleri: i

l

k ke§fedilen polimo

r

f

i

zmlerd

i

r. A

ll

elik

v

aryasyon spesi

f

ik seka

n

s bolgesin

d

eki

DNA mo

l

ekii

ll

eri

n

d

en

b

i

rin

i

n insers

i

yon, delesyon veya yer

d

egi§ikligi sonucu olu§ma

kt

ad

lr

(4). Figtir

l'de sekans

polimo

r

fizmini gosteren o

m

ek bir baz diz

i

li

m

i b

u

l

u

nmaktadlr. HLA markerlannm hi

p

ervariable bO

l

ge

le

ri ve

mito-Serin A, Alper S, Dag H

kondriyal DNA (mtDNA),mn D-loop bolgesi

adli

ama~h

kullamlan sekans polimorfizmlerine omek verilebili

r

(1,2,7).

A-) ... TTGCAGCTT AGCCCGA TTCGATCGA ... .

B-) ... TTGCAGCTT AGCCCGA TTCGATCGG

..

... .

C-)

..

... TTGCAGCTT AGCCCGA TTCGATCGA ... .

Figiir 1. A, B ve C omeklerinde baz dizilim farkhhgl sonucu

olu~an

sekans polimorfizmi. (Figiir l'de A ve C'de

beli

rt

ilen baz dizilimleri birbiri ile

e~le§irken,

B'nin baz dizilimi bu iki diziden tek baz

degi~ikligi

sonucu bir

farkh-hk

olu~turmaktadlr.)

2-

Uzunluk Polimorfizmleri: Polimorfizmler aym zamanda insan genomunda belirli baz dizilimlerinden

olu-~an ~ekirdek

iinitenin

~e~itli

sayJiarda ardarda tekran ile

olu~maktadlr.

Dizinin tekrar sekansl birbirine benzemekte,

ancak

tekrann saYlsma bagh olarak

olu~an

baz dizisinin uzunlugu populasyondaki bireyler arasmda farkhh

klar

gostermektedir (8). Bu bOlgeler genellikle

degi~en

saYlda ardarda tekrarlar (Variable Number of Tandem Repeats;

VNTRs) olarak bilinmektedir. VNTR'lar niikleotid veya niikleotidlerin delesyonu, insersiyonu ve\veya

e~it

olma-yan krosing-over

sonucu

olu~abilmektedir.

Klasik Mendel Yasalan'na uygun kahtlm gostermektedirler ve

yiiksek

aylrt etme giictine sahiptirler (4,6,8-11).

Tammlanan VNTR polimorfizmlerinden

~ekirdek

tekrar dizisi 6 bp'den biiyiik olanlar minisatellit veya Long

Tandem Repeat (LTR), 2-6 bp arasmda olanlar mikrosatellit veya short tandem repeat (STR) olarak

adlandmlmak-tadIT.

~ekil

l'de VNTR lokuslannm genetik varyasyonu

~ematik

olarak sunulmaktadlT (2).

'" RFLP'de Restriksiyon tallllua bolgesi veya PCR'da amplifikasyon 1l0ktasl

c:::==J Tekrar bolge

-

SaN!. MIge

Sekil 1. VNTR lokusla

n

mn genetik varyasyonu (2).

POLiMORFizM

L

ERiN T ANIMLANMASINDA

KULLA NILAN

YONTEM VE P

R

OSEDURLER

Sekans ve uzun

l

uk polimorfizmlerinin analizi biyolojik omeklerin

i

dentifikasyonunda onemli

bilgiler

sagla-maktadJT. Pol

imorfizmlerin analizinde iki temel yontem kullamlmaktadl

f

(1

,2,6,7).

A-) Res

t

riction Fragment Length Polymorhphism (RFLP)

B-) Po

l

ymerase Chain Reaction (PCR)

Restriksiyon Endontikleaz enzim

l

erinin kullam

l

d

l

g

l

bu yontemde, Res

t

riksiyon Endontikleazlar restriksiyon

bo

l

geleri olarak bilinen

~ift

zincirli DNA'mn sadece spesifik baz dizilerini tammakta

ve diziyi bu

bolgelerden

kes-mektedir. Si

ndir

im sonucunda

k

esme

bOl

geleri arasmdaki uzakhk farklanna bagh

olarak

~e~itli

uzunl

uk

taki DNA

fr

a

gman

lannm bi

r

kan~lml

elde ed

i

lmektedir.

O\u~an

fragman

l

ar elektroforetik olarak

ayn~tlflldlgmda ~ok

saYlda-k

i

DNA fragmammn bir

stiriinttisti

olu~maktadlr.

B

u

nedenle

~ift

zincirli fragmanlar denattire edilerek tek zincirli

h

a

l

e

donii~tiiriildiikten

soma, nay

Ion membran iizerine

sabitle~tirilmekte

ve uygun radyoaktif

i~aretli

problar ile

hibr

i

d

iz

e edile

r

ek (So

ut

hern Blo

tt

i

ng)

olu~an bantlann otoradyografik analizi yapllmaktadlf. Sindirilmi~

genomik

DNA fragmanlanmn

olu~turdugu bu

tip

varyasyon Restrictio

n

Fragment Length Polymorphism (RFLP) olarak

bi-lim:nek

t

ed

i

r

(l).

Ta

blo

1 '

d

e

adli

ama~h

kullamlan

restriksiyon endoniiklea

z

enzimleri

gosterilmi~tir

(12-14).

Tablo

1.

Ad

li

RFLP anal

iz

lerinde kullamlan Restriksiyon Endoniik

l

eazlar (12-14).

Enzirnler

Kesirn Noktalan

Hae III

5'-

GG/CC-3

'

3'-CC/GG-5'

Hi

nf

I

5'-G/ANT C-3'

3'-C TNA/G-5'

Pst I

5'-C TGCA/G-3'

3'-G/ACGT C-5'

RFLP ile ori

j

inal o

l

arak spesifik bir restriksiyon enzim kesirn bOlges

i

nin varhgl veya yoklugunun ortaya

~lkan­

labi

l

rnesi

ile popu

l

asyo

n

u ikiye

aY

l

ran

n

o

kt

a

mutasyonlan

yamnda, populasyonda yiiksek polirnorfizm gosteren

VNTR

lokus

lan

tammlanabilmektedir (4,6,10,11). RFLP ile VNTR lokuslanmn analizi iki

~ekilde

yapllab

il

mekte-d

ir

;

,---,

~ R~'rtk.i,." ,",,"i i/o ,,"diftm

~

~

~

()rm:k

---

_---

---Naylon rncl11hmna transfer

C _ _ C::J Nayloll membrnn je1 I'rohl. hibridiza'y,m Ekstf'aktc DNA Southem bloting ()ror;;:1dyografj ~

Sekil 2. S

i

ngle-lokus

RFLP po

limorfizm

i

(l

,2).

..

-- -- --

-+ - -

-Elcktroforcz ik DNA fr.1gnl~\nlartntn aYfl~unhna;';l

Serin A, Alper B, Dag H

1-

Single-Iokus RFLP: Tek

bir

VNTR lokusu

ivin,

her

birey birini

anneden

diger

i

ni babadan aldlgJ

iki

allele

sahiptir. Bu

ik

i

allel jel

Uzer

i

nde her

ikisi

aym

uzunlukta

(homozigo

t

alle

l

e sahip k

i

§i

l

erde) tek

b

ant veya

f

a

rk

h

uzun

l

ukta

(

h

eteroz

i

go

t

alle

l

e

sah

i

p ki§

i

lerde) iki bant

ol

u

§

t

urmaktadlL Tek VNTR lok

u

s

u

ivin olu§t

uru

lan

RFLP

poli

m

o

r

fizmi

s

i

ngle-Iokus

RFLP adml

alIr (9,11,12).

~ekil

2'de

Single-Iok

u

s

pro

b

kullamml ile

olu§t

uru

lan

RFLP

(single-Iokus RFLP),nin

§ema

t

ik sunumu aktanlml§tlr

(1,2)

.

2- Multi-Iokus

RFLP:

Benze

r

t

ekrar diziler

aym zamanda

ve§

i

tli kromozomlarda

k

i vok

saYl

d

a lokusta o

l

u§abil

-mekte

d

i

r.

Benzer tekrar

d

i

z

i

lerin

bul

u

ndugu

vok

saY

l

da

k

i

l

okustan

a

ll

elik varyasyonlannm her b

i

r

inin

aym anda

ta-mmlanmas

l

mUmk

U

n olabilmektedir. B

u

t

ip

u

ygulamaYI gervekle§

t

iren Dr. A

l

ec Jeffreys

ve arkada§lan (15)

1985

Yllmda

ve§i

t

li VNTR

lo

ku

slan

t

a

r

afmdan

p

ayla§

l

lan

vekirdek dizilere dayah m

u

l

t

i-

I

okus

DNA pro

b

lan (33.

1

5 ve

33.6) ile dU§Uk iyonik giivlU

hibridizasyon ko§ullannda yapt

l

k

l

an

RFLP analizler

i

nde,

birey spes

i

fik bant

patemi-nin

ol

u

§

tu

gu

kompleks

b

i

r parva

uzunluk

polimorfizmi

ortaya

v

l

karm

l

§lardlr

.

Tammlanan multi-Iokus

polimor-fizm (multi-Iokus RFLP) parmakizi gib

i

bireye ozgii oldugundan,

DNA fingerprinting (DNA Parmakizi) ad

l

i

l

e

de a

m

lmaktadlr

(15-l7).

0

donemde

DUnya'da

bUyiik yank

l

uyandlran bu teknik

i

l

e

elde edilen ver

i

le

r

in

i

l

k ke

z

yargl

d

a

d

e

l

i

l

o

l

arak

kullamm

l

ingil

t

ere'de 1986 y

Ii

mda

b

ir seksiie

l

saldlfl

ve

cinayet olg

u

sudur.

A

r

dmdan

Amerik

a

Birlqik Devletler

i

'n

d

e Fede

r

a

l

Bureau

of

Inves

t

iga

t

ion

(

FBI)

1988 sonbahannda rutin ol

gu

vah§

m

al

annda

DNA

parmakizi tekn

i

ginin k

ull

ammma

ba§

l

aml§ ve sonrasmda geli§mi§

Ulke

l

aboratuva

rl

a

n

na hlzla

girmi§t

ir

(5,

1

8).

Analiz

ivin

kullamlan

DNA

miktan do

gal

o

l

arak m

u

l

ti-Iok

u

s

ve single-Iokus

RFLP'de

f

arkhdlr. Mult

i

-

I

ok

u

s

RFLP yontemi

ile

DNA

biitiinliigU bozulmaml§

orneklerde

ba§anh sonw;:lar

almabildigi

ve

ayIrt

e

t

me

giicUniin

vok

y

U

ksek

old

u

gu

belirti

l

mektedir

(18,19).

Ancak

s

i

ng

l

e-

I

okus

RFLP'nin

m

u

l

ti-Iokus

RFLP'ye tartl§mas

l

z UstiinliigU

kabul

edilmek

t

ed

i

r (10,12,20-22)

.

Bu iki sistemin

ozellikleri a§aglda sunu

l

maktadlf:

a- Si

n

gle-

I

okus

RFLP iv

i

n 20-100

ng genomik

DNA yeterli olu

r

ken, multi-Iokus

RFLP

yak

l

a§lk

500 ng

yiiksek

m

o

l

ekUle

r

ag

l

r

hklI

DNA'ya ih

t

iyav duymaktadlr (9,10,12).

b- Single-Iok

u

s RFLP'de

tammlanan

VNTR

lok

u

s

l

an

yUksek p

r

imatlara spesifik iken, multi-lo

k

us

p

rob

l

an bi

r

-bi

r

i

ile

i

li

§kisiz t

ii

rlerde

vapraz reaksiyon ve

r

ebilmektedir (10,20-23).

c- Sing

l

e-

I

okus

RFLP'de dege

rl

endir

i

lmesi ve yorumlanmasl

daha kolay olan bir veya iki bant paterni e

l

de

edi-l

irke

n

,

multi-Iokus RFLP'de

degerlendirmesi

vok

zor o

l

an vok

say

l

da

bant paterni

elde edi

l

mektedir (10,24).

d- Single-Iokus RFLP'de

tammlanan

lokuslann kromozomal lokalizasyonu

ve dige

r l

ok

u

slarla olan baglant

l

s

l

beli

rl

eneb

i

lmekte ve

mutasyon oranl

a

n multi-Iokus RFLP ile tamm

l

anan paternlerden daha dii§iik b

u

lunmak

t

adlf

(25, 26)

.

(Ta

b

l

o

2).

MLS

SLS

Aynm

gUcU

10_

11

_10-

3

Tamml

an

an lokus

saYIsI

<;ok

say

l

da

Bir

adet

Bag

l

antl

(Linkage)

Belirsiz

Belirlenebilir

Fragmen

t

s

10-20

1-2

Hassas

i

yet

500

ng

50 ng

Tablo 2.

Sing

l

e-

I

okus (SLS) ve multi-Iokus

(MLS)

sis

t

emlerin

i

n genel

oze

ll

i

k

lerin

i

n

kar§lla§tlfl

l

mas

l

(1

0

).

Normal §artlarda

giiven

ili

r ve

etkili bir

DNA

tiplendirme

m

e

t

odu

k

ab

u

l edilen

RFLP'nin

radyoak

t

i

f

i§aret

li

p

rob\ar

kullammmda 4-6 haf

t

aya uzayan

bir ident

i

fikasyon siiresi ile zaman

ve

ekonomi

k

olarak

masrafII

bir

yon-t

ern

o

l

dugu

i

f

ade ed

i

lmektedir. Bunun

ya

n

mda,

klsmen

yUksek

molekUler

aglrlIkh

DNA ge

r

ektirdiginden

parva

l

an-m

l

§

b

iyolo

j

ik o

m

ekler

i

n

analiz

ind

e

etkinligi azalmaktadlr.

RFLP

meto

d

o

l

oj

i

sinde omek

miktannm analiti

k

ihtiyac

I

ters

i

z ka

l

maktadlr (27,28).

Adli analizlerde ciddi sorun olan bu engel,

1985

Ylhnda Saiki (29) ve

arkada~lanmn geli~tirdigi

peR

yontem

i

ile

a~llml~

bulunmaktadlr.

B-) peR

Yontem, DNA'mn

lSI

ile denatiire edilerek c;:ift iplikc;:igin birbirinden aynlmasml (denatiirasyon, 90-95°C)

taki-ben, primer

olarak adlandmlan klsa oligoniikleotid diziierin templat DNA 'ya

yapl~masl

(primer

annealing,

55-60°C)

ve

DNA polimeraz enzimi

varhgmda

templat DNA'ya komplementer olarak uzamasl

(70-75°C)

a~amalann­

d

a

n

olu§maktadlr.

Bu iic;:

a~ama

bir

dongii kabul edilmekte ve dongii saylSl

ara~tmlan

hedef DNA diziye

bagh

ola-rak

degi~mektedir

(28,

30)

(~ekil

3

)

.

~sentezj

1

111

1

111

H.,defDNA

5'

3'

.

. . . .

111

_11111111

I

I

I

III'

~

3'

5'

11111111

5'

3'

,/

. . . 1

II

1

1111111

3'

III

~

5'

11111111

~

5'

3'

11

1

1

1

11

1

... 1

11

1

11

11

1

1

1

111

"-

5'

3'

5'

3'

,/

1111

1

111

... 1

I

I

~

III

~

_5'

111111

1

1

35'

3'

...

111

11111111

III

~

~

5'

1

1

1

1

1111

3'5'

3'

... 1

II

1

11

1

1111

111

"-

5'

~

1

1

111

111

35'

3'

...

111

1

1

1

11111

~

III

III'

5'

,/

1111111

1

3'

20-30 di:;0l!U

$ekil 3.

peR

dongiisii

(28

)

.

peR

ile hedef

DNA dizisinin milyonlarca kopyasl yapilabildiginden, Adli amac;:h kimlikiendirme

ve

patemite

Serin A, Alper B, Dag H

Adli

ama~h

k

u

llam

i

an PCR 'a dayah polimorfizmler;

1. Amplifiye

par~a

uzunluk polimorfizmi (Amplification Fragment Length Polymorphism AMP-FLP, STR)

2.

Reverse dot-b

l

ot

analizi (HLA-DQ a

l

pha, amplitype

PM)

3. Sekans an

a

lizi

(mtDNA-

mitokondr

i

yal DNA)

1. Amplifiye

Par~a

Uzunluk Polimorfizmi (AMP

-

FLP, STR)

8-16

bp'lik

~ekirdek

iiniten

i

n tekran

i

le

100-

13

00

bp uzunlugunda tekrar

iinite

i~eren

yapiiar

AMP-FLP, 2-7 bp

uzunlugundak

i

~ekirdek

iinitenin

10-50 kopya ardarda

tekran

ile

100-400 bp uzunlugunda tekrar

ii

nite

i~eren

yapl-lar STR ad

l

Dl

almaktadlr

(1).

PCR'a dayah t

i

plend

i

rrne

yapiiabilen

AMP-FLP ve STR

sistemlerinin

RFLP'ye

daya-h tiple

n

dirrneden prens

i

p olar

a

k

bir

f

arkl

yoktur. Baz dizilim

uzunl

u

klanmn klsa

olmasl

nedeniyle, restr

i

ksiyon

en-zimlerine gereks

i

nim

duymadan

hedef baz

dizilerinin

~ogaltIlmasl

ve agaroz jelde

yiiksek

verimle aynm

l

miimkiin

olmaktadlf (33-36).

Ancak

STR

lokuslannm

AMP-F

L

P

ve

t

amm

l

anan diger

polimorfik

l

okus

l

a

r

dan daha klsa

olmasl, oze

Il

ikle ad

li

ornekle

r

in

ana

l

izinde

avantaj sag

l

amaktadlr.

ilk

o

l

ar

a

k Edwards

ve arkada§lan

(3

1

,32) tarafm

d

an tammladlk

t

an

soma, geno

m

boyunca

dagIlml§

'Yok

saYlda STR

l

ok

u

su

bi

l

dirilmi§

ve

adli

ama'YiI

kullamiabilirligi

ara§tmlml§tIr.

L

okus

saY

l

s

I

Dln

'Yoklugu

adli omeklerin DNA

analizi

i'Yin gen

i

§

b

i

r

k

aynak

olu§turrna

k

t

adlr.

Ancak adli

ama'Y

iI

kim-liklendirrne

ve paternite

t

ayin

i

nde

bazl

t

emel kriterleri

ta§lyan STR lokusla

n

kuIlanllmaktadlr. Bu

temel

kriterle

r

kullamlan lokus

u

n

aynm.

giiciiniin %90'10

ii

zer

i

nde ve gozlenen

heterozigotlugun %

70'in

ii

zerin

d

e o

l

mas

l

, alle

ll

erin

tahmin edile

n

uzun

l

uklannm

90-500 bp arasmda

olmas

l

,

hassasiyeti

yiiksek

lokuslann

se'Yi

l

mesi, biyolo

j

ik

omekle

r

i'Yin uygun

olmayan 'Yevre ko§ulla

n

ndan

to

p

lanan orneklerden saghkh sonu'Y ahnabi

l

mesi ve

farkh

biyolojik

mater-yalle

r

den elde ed

i

len DNA

omekler

i

nden i

n

ce

l

emeler

i

n

saghkh yapiiabilmes

i

gibi

oze

ll

ik

l

e

r

i

i'Yerrnektedir

(35-40).

Bu

deger

l

endirrne

l

er dikkate

almdlgmda,

k

im

lik

l

endirrne ve pa

t

emite tayininde genelli

k

le

t

etrame

r

ik STR

10-k

us

l

an terc

i

h edilmektedir. Aynca

t

etramerik

STR lokuslannm dim erik

ve trimerik

STR lokuslanna

oran

l

a

tamm-lanmasl esnasmda

h

ata paymm dii§iik olmasl, jel iizerinde aynmmm kolay

yapIlmasl

ve

amplifikasyon

u

yapiian o

r

-neklerin ele

kt

roforezinde

artJk iiriin o

l

u§umunun

daha az

olmasl

gi

bi

avantajlan

bildir

i

l

mektedir (38-42).

Buna

k

ar

§m, STR lok

u

slanmn

alle

li

k varyasyonlan

diger

l

ok

u

s

l

ara

or

an

l

a

daha az

o

l

dugundan

aynm giicii

daha

dii§iiktiir.

Bu durum

bi

r

den faz

l

a STR

lokusunun

aym

anda

amplif

i

kasyo

n

u

ve elektroforez

i

ile

'Yoziimlenmektedir

(2). Boyle

b

i

r

m

u

l

tipleks

reaksiyon

i

le

c;:ok

az

miktardaki

(2-10

ng)

adli o

rn

eklerin

daha

verimli

k

u

ll

amlmas

l

yanm-da, zaman ve malzemeden ekonomi sag

l

anmaktadlr (38,39). Ancak mul

t

ipleks reaksiyonun se'Yimi ras

t

ge

l

e

olma-Y

I

P, se'Yi1en lokuslann kromozomallokalizasyonu ve baz dizilimi dikka

t

e ahnarak yapllmaktadlr (2).

Amplifikasyon

iiriinleri

flo

r

esan

i§a

r

etli primerler

(42,43)

kullamldlgmda

otomatik jel okuy

u

cuda

incelenebi

l

-mek

l

e birlik

t

e, giimii§

boya ile

makroskopik

olarak

goriintiilenmesi miimkiin

o

l

abilmektedir (44,45).

2. Reverse Dot-Blot Analizi [Allel Spesifik Oligoniikleotid(ASO)'Jer ile Hibridizasyon]

B

u

teknik

i

l

e tamm

l

a

n

an polimorfizm

l

erden adli amac;:h kullamlanlar HLA

marker'lanmn

hipervariab

l

e

bolgele-ri

(HLADQ

alpha

typ

i

ng)

ve

i

lave 5

farkh

genetik

lokusu ic;:eren

AmpJi Type PM

sistem

l

eridir(46-50).

Tammlanan

Ampli Type PM sistemleri Low Density Lipoprotein Receptor

(LDRL),

Glycophorin

A

(GYPA), Hemoglo

b

in G

Gamma-Globin Chain (HBGG), D7S8

ve

Group Spesific Componen

t

(GC) s

i

s

t

emlerinden o

l

u§mak

t

adlr. HLADQ

alpha

lok

u

su

ve

Amp

li

type PM sis

t

emle

r

i ic;:in geli§tirilen allel spes

i

fik

oligonii

k

leotid

l

er

i

l

e

t

amm

l

anan

aBel

spes

i

-fik varyasyon

l

ar

tek

niik

l

eotid yer

degi§ikleri

sonucu sekans

varyasyonlan 0I

u

§turrnaktadlr

(l

,46).

B

u

ik

i

s

i

stem son donemlerde Ampli Type PM+DQA

l

adlyla

bir ki

t

olara

k

elde edilebilmekted

i

r(50). i

k

i

s

i

s-temden

ol

u

§an

a

l

tl

lokusun

a

li

eBer

i

n

i

n

am

p

lif

i

kasyonu ve

hibridizasyonu aym

anda

yap

Ji

abilmek

t

edir.

Boy

l

ece

da-ha

az

omekle (2-10

ng) daha

fazla c;:a

h

§ma

ya

p

llabilmektedir(

46-49).

Yontem,

tes

t

edilecek

n

ii

kleer

hii

crelerden

ekstrakte edi

l

en

genomik

DNA'da

he

d

ef dizinin biyo

t

in ile i§are

t

li

Adli Tıp Dergisi 2002; 16(2-4): 72-81

ko~ullarda

t

am

e~le~mesi

prensibine dayanmaktadlr. Membran iizerine sabitle§tirilmi§ ASO (Allel Spesif

i

k

Oligo-niikleotid) prob

l

an ile c;:ogalttlan peR iiriinleri hibridize edildikten sonra, streptavidin-horseradish peroxidase

con-jugate biyot

i

n i

l

e i§aretli peR iiriin

l

erine baglamr.

Olu~an

renksiz kompleksin kromojen solusyonu ile

muamelesin-de ilgi

l

i alle

ll

erin mavi renge donii§mesi beklenir (1 ,2,50)

(~ekil

4).

~~---~-

I

(~'"";' ,"b>"".'..-~:) ~

L _ _ _ _ R_.

_cn_k_

'

1_1

"_'(}_'k_-c_h_i _ _ _ ----'

2

3

•

0

TITI

4

c

PROB

T

T

1.1 aU but" 1.3

1.3

•

@

•

•

~ekil

4. H

i

bridizasyon ve renklend

i

rme reaksiyonu (1,57)

.

3. MtDNA Analizi

4.1 4.2

4.3

•

o

Amp IifiycIJN A Sabitlc~tirilmi~ ;\50 proou Dcstck ortanH HLA-DQalpha

1.1,4.1

Insanlarda mtDNA genomu 16569 bp uzunlugunda kapah sirkiiler bir yaplya sahipt

ir

. MtDNA niikleer DNA'ya

benzer §ekilde 13 protein, 2

r

ibozomal RNA (riboniikleik asit) ve 22 tRNA'Yl kodlayan cod

i

ng bolge ve tek kopya

kodlanmayan non-coding bolgeden

olu~maktadlr.

Yakla§lk 1000 bp'lik kodlanmayan bu bOlge control reg

i

on,

disp-lacement loop veya k

l

saca D-Ioop bolges

i

olarak adlandm

h

r. MtDNA'mn D-Ioop bolgesi bilinen iic;: hipervar

i

able

bolgeden olu§maktadlr. Ad

l

i analizler

d

e §u anda bunlardan iki tanesi kullamlmaktadlr (51-54). Kullamla

n

bolge

l

er,

Hiperva

r

iab

l

e bolge I: 16024-16365 niik

l

eotid pozisyonlan arasmda bul

u

nan bo

l

ge (HVR1)

Hipervariable bOige II: 73-340

nii

k

l

eotid pozisyonlan arasmda b

u

lunan bOige (HVR2)'dir.

Her iki bolgedek

i

varyasyonlar dizi analizi ile tammlanmaktadlr. Dizi ana

l

izi genetik alfabeyi olu§turan dort

niikleotidin lineer diizenleni§inin direk

t

o

l

arak tammlanmasldlr. Kullamlan standar

t

dizi analizi proto

k

ollerinden

bi-ri dideoxy zincir sonlandlrma

i

le dizi analizi (dideoxy-chain termination sequencing)'dir (55,56)

.

Sange

r

metodu

o

l

arak b

i

linen

m

etodll>IL.prosediirii, DNA polimeraz enziminin DNA kahbl ile hibridize alan primerle

r

i uzatma

ka-biliyetine dayanmaktadIT.

Sekansm belirlenmesi, Ade

n

in

(A),

Guanin (G), Sitosin

(C)

ve Timin

(T)

bazlan ile bir bazm d

i

deoksi

formu-nun her birinin bir re

a

ks

i

yonda smldl konsantrasyonda bulunmasl ile olu§turulan 4 ayn reaks

i

yona

i

htiyac;:

duymak-tadlT. 3'OH grubunun yoklugu nedeni

i

le ddNTP'lerin inkorporasyonu zincir sentez

i

ni durdurmaktadlr.

Reaksiyon-da dNTP ve ddNTP konsantrasyonlan dizi analizi yapllacak iiriin ic;:in bir nested seti ol

u

§turacak

~ekilde

ayarlan-Serin A, Alper B, Dag H

maktadlr.

Bunlann

her

biri

ortak

bir

orijine sahip olmakla

beraber, farkh bir niikleotid ile sonlanmaktadlr. Reaks

i

-yon sonunda

olu~an

DNA par9aian

[

a-35S

]

dATP

veya [a-33P]

dCTP

ile

primerierin

u9

i~aretlenmesi

veya uzama

reaksiyonu

esnasmda

radyoaktif olarak

i~aretlenmekte

ve DNA par9alan denatiirasyon

~artlannda

akrilamid

j

el

elektroforez

i

i

l

e

ayn~tlfllmaktadlr

(2).

MtDNA

bab

adan

baglmslz olarak direkt

anneden 90cuga aktanlmaktadlr. Bbylece ilgili mtDNA dizilerinin

kar-§Ila§tmimas

l

materna

l

neslin

belirlenmesini

miimkiin

k

l

lmaktadlr. Bu

durum

a§lfI dekompoze olmu~

veya

ka91f11an

bireylerden referans brnek

almamadlgl

durumlarda,

ki~inin ya~ayan

herhangi b

ir

materna

l

akrabasmdan referans

broek a

l

mmasl baklmmdan

bnemlidir. Niiklee

r

DNA'daki diploid kahtlm

ve

mayotik rekombinasyon nedeniyle

niikleer

profilin

dogrudan

yaratIimasl sadece 1. derece akrabalardan saglanabilmekted

i

r

(57).

MtDNA bzellikle tiikiiriik

lekesi,

kIl shaftl

(niikleer

DNA'mn hemen hi9 bulunmadlgl) veya

eski

ve

par9alanml~

iskelet

kah

ntIi

an g

ibi

90k az

miktardaki

adli

brneklerin

analizinde kullamlabilmekted

i

r (58-60). Ev

ri

m

i

nin

n

ii

kleer

DNA'ya

oranla 10

kat daha

hlzh o

l

dugu ifade edilmektedir. Bu nedenle mtDNA

bmek

populasyon 9aiJ§masmm 90k

daha geni§ bi

r

popu

l

asyon arahgmda yapllmasl

gerekmekted

ir

(61-62).

Sonu.;

Ya

p

l

l

an ara§tJrmalar

s

i

ngle

lokus

prob

ve

RFLP teknigi ile VNTR lokuslanmn ara§tm

l

ma

yiizdesinin

1

997'de

%

83'ten

1999'da

%66'ya

dii§tiigiinii

gbstermektedir. Bunun aksine PCR'a

dayah

STR sis

t

emlerinin ana

li

zin

i

n

ise

yiiksele

r

ek

1

999 yIlmda

%90'

m iiz

erine yiikseldigini gbstermektedir. Benzer §eki

l

de, HLA

ve

Polymarker

(Amp-li

T

ye PM) sistemleri i

le

mtDNA'mn

diz

i

ana

l

iz

i

9aiI§malan yiikselen

b

i

r gra

f

ik 9

i

zmektedir.

Laborat

uarl

ar arasmda

yapiian

standardizasyon 9aiI§ma

l

annda,

laboratuarlar arasmdaki sonu9 farkhhklannm RFLP ile

yap

Ii

an VNTR

tip-lendirmeler

i

nde

%

1.2-1.3

iken,

PCR' a dayah test

sonu~larmda

%0.3'

e dii§mesinin bu sonucun ortaya 91kmasmda

bnemli bir etken oldugu

kabul edi

l

mektedir (63).

HIZiI

ve

kolayla§tlfllml~

DNA

testi hedefi,

DNA tiplendirme prosediirlerini

n

hlz

l

a evrim ge9irecegini

ve

yarar-lan

m

a

yollanmn

geni§

l

eyecegin

i

gostermektedir.

Kaynaklar

1. Duncan GT, Tracey ML. Serology and DNA typing, in Introduction to Forensic Science, Eckert WG, Ed. New York: Elseiver Science Publishing Co, 1992: 233-293.

2. Lee HC, Ladd C, Bourke MT, Pagliaro E, Tirnady F. DNA typing in forensic science. Am J Forensic Med and Pathol, 1994; 15(4):269-282.

3. Sensabaugh GF, Crim D. Biochemical markers of individuality, in Forensic Science Handbook, Saferstein R, Ed. New Jersey: A Simon and Schuster Company, 1982:338-415.

4. Balazs I. Properties of hypervariable single locus polymorphisms and their application to identity testing, in DNA in Forensic Science, Robertson J, Ross AM, Burgoyne LA. Ed. England: Ellis Horwood Limited, 1990: 112-124.

S. Jeffreys AJ, Royle NJ, Patel I, Armour JAL, McLeod A, Collick IC, Gray IC, Neumann R, Gibbs M, Croiser M, Hill M, Signer E, Monckton D. Principles and recent advances in DNA fingerprinting, in DNA-Technology and Its Forensic Application, Berghaus G, Brinkmann B, Rittner C, Staak M, Ed. Berlin: Springer-Verlag, J 990: 3-19.

6. Fowler JCS, Burgoyne LA, Scott AC, Harding HWJ. (1988) Repetitive deoxyribonucleic acid (DNA) and human genome variation- A concise review relevant to forensic biology. J Forensic Sci (lFSCA), 33(5), 1111-1126.

7. Sensabaugh GF. Genetic typing of biological evidence using the polymerase chain reaction, in DNA Technology and Its Forensic Application, Berghaus G, Brinkmann B, Rittner C, Staak M, Ed, Berlin: Springer-Verlag, 1990:33-40.

8. Wyman AR, White R. A highly polymorphic locus in human DNA. Genetics, 1980; 77: 6754-6758.

9. Nakamura Y, Leppert M, O'Connell P, Wolff R, Holm T, Culver M, Martin C, Fujimoto E, Hoff M, Kumlin E, White R. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science, 1987(235): 1616-1622.

10. Brinkmann B, Wiegand P, Rand S. A critical review of the forensic application of DNA technology, in DNA-Technology and Its Forensic Application, Berghaus G, Brinkmann B, Rittner C, Staak M, Ed., Berlin: Springer-Verlag, 1990:41-49.

11. Rittner C, Schacker U, Schneider PM. DNA fingerprinting as a tool of paternity testing in Germany, in DNA-Technology and Its Forensic Application, Berghaus G, Brinkmann B, Rittner C, Staak M, Ed., Berlin: Springer-Verlag, 1990:20-32.

12. Schacker U, Kaufmann T, Schneider PM, Rittner C. Reliability ofrestriction enzyme digestions of genomic DNA for the generation of DNA fingerprints, in DNA-Technology and Its Forensic Application, Berghaus G, Brinkmann B, Rittner C, Staak M, Ed., Berlin: Springer-Verlag, 1990:103-108.

13. Budowle B, Waye JS, Schutter GG, Baechtel FS. Hae IlI- a suitable restriction endonuclease for restriction fragment length polymorphism analysis of biological evidence samples. J Forensic Sci (JFSCA), 1990; 35(3): 530-536.

14. Von Eede PH, Henke L, Fummers R, Henke J, de Lange GG. Forensic Sci Int, 1991; 49: 21-31.

15. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. Hypervariable 'minisatellit' regions in human DNA. Nature, 1985; 314: 67-73. 16. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. Individual-specific 'fingerprints' of human DNA. Nature, 1985; 316: 76-79. 17. Gill P, Jeffreys AJ, Werrett DJ. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature, 1985; 318: 577-579.

Ann Hum Genet, 1989; 51:269-271.

20. Fowler C. Polymorphism in the major human repetitive DNA sequences: theory, practice and comparison with other methods of measuring human genome variation, in DNA in Forensic Science, Robertson 1, Ross AM, Burgoyne LA. Ed. England:Ellis Horwood Limited, 1990:87-111.

21. Hill WG. DNA fingerprinting applied to animal and bird populations. Nature, 1987; 327:98

22. Dallas IF. Detection of DNA fingerprints of cultivated rice by hybridisation with a human minisatellite DNA probe. Proc Natl Acad Sci, 1988; 85: 6831

23. Rogstad SH, Palton lC, Scheal BA. A human minisatellite probe reveals RFLPs among individuals of two angiospenns. Nuc Acids Res,

1988; 16:11378.

24. Kanter E, Baird M, Shaler R, Balazs I. Analysis of restriction fragment length polymorphisms in deoxyribonucleic acid (DNA) recovered from dried bloodstains. 1 Forensic Sci, 1986; 31: 403-408.

25. Wong Z, Wilson V, leffreys AJ, Thein SL. Cloning a selected fragment from a human DNA fingerprint isolation of an extremely polymorphic minisatelite. Nuc Acids Res, 1986; 14:4605

26. Lynch M. Estimation of relatedness by DNA fingerprint. Mol Bioi Evol, 1988; 5:584

27. Budowle B, Guisti AM, Waye IS, Baechtel FS, Fourney RM, Adams DE, Presley LA, Deadmann HA, Monsol KL. Fix-bin analysis for

statistical evaluation of continuous distributions of allelic data from VNTR loci for use in forensic comparisons. Am 1 Hum Genet, 1991;

48: 841-855.

28. Horn GT, Richards B, Klingen KW. Amplification of a highly polymorphic VNTR segment by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res, 1989; 17:2140.

29. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Hom G, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985; 230: 1350-1354.

30. Ross MD. Polymerase chain reaction. Arch Pathol Lab Med, 1990; 114: 627.

31. Edwards A, Hammond HA, lin L, Caskey CT, Chakraborty R. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four

human population groups. Genomics, 1992; 12: 241-253.

32. Edwards A, Civitello A, Hammond H, Caskey CT. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am 1 Hum Genet, 1991; 49: 746-756.

33. Kasai K, Nakamura Y, White R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCTI18) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. 1 Forensic Sci(1FSCA), 1990; 35(5): 1196-1200.

34. Boerwinkle E, Xiong W, Fourest E, Chang L. Rapid DNA typing of tandemly repeated hypervariabe loci by the polymerase chain reaction

to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proc Natl Acad Sci, 1989; 86: 212-216.

35. Rand S, Puers C, Skowasch K, Wiegand P, Budowle B, Brinkmann B. Population genetics and forensic efficiency data of 4 AMPFLP's.

Int 1 Legal Med, 1992; 104: 329-333.

36. Sparkes R, Kimpton C, Watson S, Oldroyd N, Clayton T, Barnett L, Arnold 1, Thompson C, Hale R, Chapman J, Urquhart A, Gill P. The validation of a 7-locus multiplex STR test for use in forensic casework: (I) mixtures, ageing, degradation and species studies. Int 1 Legal

Med, 1996; 109: 186-194.

37. Sparkes R, Kimpton C, Gilbard S, Carne P, Andersen 1, Oldroyd N, Thomas D, Urquhart A, Gill P. The validation of a 7-locus multiplex

STR test for use in forensic casework: (II) artefacts, casework studies and succes rates. Int 1 Legal Med, 1996; 109: 195-204. 38. Gill P, Urquhart A, Millican E, Oldroyd N, Watson S, Sparkes R, Kimpton CPo A new method of STR interpretation using inferential

logic-development of a criminal intelligence database. Int 1 Legal Med, 1996; 109: 14-22.

39. Urquhart A, Kimpton CP, Downes

n,

Gill, P. Variation in short tandem repeat sequences- a survey of twelve microsatellite loci for use as

forensic identification markers. Int 1 Legal Med, 1994; 107: 13-20.

40. Gill P, Kimpton CP, D'Aloja E, Andersen IF, Bar W, Brinkmann B, Holgersson S, 10hnsson V, Kloostennan AD, Lareu MV, Nellemann

L, Pfitzinger H, Phillips CP, Schmitter H, Schneider PM, Stenerson M. Report of the European DNA profiling group (EDNAP)-towards standardisation of short tandem repeat (STR) loci. IntJ Legal Med, 1994; 65: 51-59.

41. Wiegand P, Ambach E, Augustin C, Bratzke H, Cremer U, Edelmann 1, Erikson B, Gennan U, Haas H, Henke L, Holtz Z, Keil W, Kreike

1, Nagy M, Prinz M, Rand S, Rothamel T, Scheithauer R, Schneider HR, Schiirenkamp M, Teifel-Greding 1, Bar W. GEDNAP IV and V.

The 4th and 5th stain blind trials using DNA technology. Int 1 Legal Med, 1995; 108: 79-84.

42. Schneider HR, Rand S. High resolution vertical PAGE: an alternative electrophoretic system with multipl forensic application. Int 1 Legal

Med, 1996; 108: 276-279.

43. Fregeau C, Fourney R.M. DNA typing with flourescently tagged short tandem repeats: a sensitive and accurate approach to human identification. BioTechniques, 1993; 15:100-119.

44. Budowle B, Chakraborty R, Giusti AM, Eisenberg AI, Allen RC. Analysis of the VNTR locus DIS80 by the PCR followed by high resolution PAGE. Am 1 Hum Genet, 1991; 48: 137-144.

45. Allen RC, Graves G, Budowle B. Polymerase chain reaction amplification products separated on rehydratable polyacrylamide gels and

stained with silver. BioTechniques, 1989; 7:736-744.

46. Herrin G, Fildei N, Reynolds R. Evaluation of the AmpliType PM DNA test system on forensic case samples. 1 Forensic Sci (lFSCA), 1994; 39(5): 1247-1253.

47. Scholl S, Budowle B, Radecki K, Salvo M. Navajo, Pueblo, and Sioux population data on the loci HLADQAI, LDRL, GYPA, HBGG,

D7S8, Gc and O1S80. 1 Forensic Sci (1FSCA), 1996; 41(1): 47-51.

48. Tsongalis Gl, Anamani DE, Wu AHB. Identification of urine specimen donors by the PM+DQAI amplification and typing kit. 1 Forensic

Sci (JFSCA), 1996; 41(6): 1031-1034

49. Gross AM, Guerrieri RA. HLADQAI and polymarker validations for forensic casework: standard specimen, reproducibility, and mixed specimens. 1 Forensic Sci (1FSCA), 1996; 41(6): 1022-1026.

50. AmpliType User Guide Perkin Elmer, 1995.

51. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MHL, Coulson AR, Drouin 1, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH,

Smith AIH, Staden R, Young IG. Sepuence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981; 290:457-465. 52. Lewin B. Genes V. 2th ed. Oxford University Press and Cell Press, 1994:733-748.

53. Lutz S, Weisser HI, Heizmann 1, Pollak S. Location and frequency of polymorphic positions in the mtDNA control region of individuals from Gennany. Int 1 Legal Med 1998; 111:67-77.

54. Lutz S, Weisser HI, Heizmann 1, Pollak S. Mt DNA as a tool for identification of human remains identification using mtDNA. Int 1 Legal

Serin A. Alper B. Dag H

55. Gylensten VB. peR and DNA sequencing. BioTechniques. 1989; 7: 700-708.

56. Maniatis T. Fritsch EF. Sambrook 1. Molecular Cloning: A Laboratory Manuel. New York: Cold Springer Harbour. 1982:

57. Allen M. Engstrom A-S. Meyers S. Hanth O. Saldeen T. von Haese1er A. Paobo S. Gyllensten U. Mitochondrial DNA sequencing of shed hairs and saliva on robbery caps: sensitivity and matching probabilities. 1 Forensic Sci 1998;43(3):453-464.

58. Gill p. Ivanov PL. Kimpton C. Piercy R. Bensdn N. Tully G. Evett I. Hagelberg E. Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet. 1994; 6:130-135.

59. Vigilant L. Pennington R. Harpending H. Kocher TD. Proc Nat! Acad Sci. 1989; 86: 9350-9354.

60. Yamamato T. Vchihi R. Kojima T. Nozawa H. Huang XL. Tamaki K. Katsumata Y. Maternal identification from skeletal remains of an infant kept by the alleged mother for 16 years with DNA typing. J Forensic Sci (JFSCA). 1998; 43(3): 701-705.

61. Cann RL. Stokening M. Wilson AC. Mitochondrial DNA and human evolution. Nature. 1987; 325:31-36.

62. Howell N. Kubacka I. Mackey DA. How rapidly does the human mitochondrial genome evolve? Am J Hum Genet. 1996; 59:501-509. 63. Hallenberg C. Morling N. A report of the 1997. 1998 and 1999 paternity testing workshops of the English speaking working of the

international society for forensic genetics. Forensic Sci Int. 2001; 116(1):23-33. Klsaltmalar:

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

PCR: Polymerase Chain Reaction

AMP-FLP: Amplification Fragment Length Polymorphism

STR: Short Tandem Repeat ASO: Allel Spesific Oligoniikleotid HVR: Hypervariable region

ileti~im Adresi: Ay§e Serin <;:ukurova Universitesi TIp Fakiiltesi

Adli TIp Anabilim Dall 01330/ Balcall -ADANA