T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TİROİD UYARICI HORMON TAYİNİ İÇİN İMPEDANS SPEKTROSKOPİSİ TEMELLİ BİR BİYOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ
UMUT DENİZ AYDIN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
Tez Danışmanı: Doç. Dr. HAKKI MEVLÜT ÖZCAN
iii Yüksek Lisans Tez
Tiroid Uyarıcı Hormon Tayini İçin İmpedans Spektroskopisi Temelli Bir Biyosensör Geliştirilmesi
Trakya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
ÖZET
Tiroid uyarıcı hormon (TSH) hipofiz ön lobundan salgılanan, glukoprotein yapılı bir hormondur. Tiroid bezini etkileyerek kana tiroid hormonlarının salınmasını uyarır. Kan konsantrasyonunun referans değerlerin üzerinde olması hipotiroidizm, referans değerlerin altında olması ise hipertroidizm olarak adlandırılır. Kan TSH konsantrasyonu pek çok hastalık ile ilişkilendirilir. Günümüzde TSH tayini için kullanılan yöntemler immünoassay temelli yöntemlerdir. Bunların çoğu zaman alıcı yöntemlerdir ve hepsi özel ekipman ve uzman personel gerektirir. TSH tayini için antikor-antijen ilişkisini temel alan biyosensörler, uygun maliyet, kısa ölçüm süresi ve yüksek hassasiyetleri gibi avantajları sayesinde alternatif ölçüm sistemleri olabilir.
Bu tez kapsamında kanda TSH tayini için elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) temelli bir immünosensör geliştirildi. Bu amaçla ilk önce altın çalışma elektrodu üzerine sisteamin ile kendiliğinden oluşan tek tabakalar oluşturuldu. İkinci aşamada poliamidoamin dendrimeri (PAMAM) ile elektrot yüzeyi modifiye edildi ve son aşamada anti-TSH antikoru modifiye çalışma elektrodu yüzeyine immobilize edildi. Geliştirilen biyosensörün TSH tayin aralığı 0.1-0.6 mIU/L olarak belirlendi ve yapay serum örneklerinin analizinde başarıyla kullanıldı.
Yıl : 2019
Sayfa Sayısı : 66
Anahtar Kelimeler : Tiroid Uyarıcı Hormon, İmmünosensör, Biyosensör, Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi, Kendiliğinden Oluşan Tek Tabaka
iv Master Thesis
Development of an Impedance Spectroscopy Based Biosensor for the Determination of Thyroid Stimulating Hormone
Trakya University Institute of Natural Science Department of Chemistry
ABSTRACT
Thyroid stimulating hormone (TSH) is a glycoprotein secreted from the anterior lobe of the pituitary. It stimulates the release of thyroid hormones into the blood by affecting the thyroid gland. The amount of TSH in the blood is greater than the reference value are called hypothyroidism, the amount of TSH in the blood is lower than the reference value are called hyperthyroidism. Blood TSH concentration is associated with many diseases. Today, the methods used for the determination of TSH are immunoassay based methods. Most of these are time consuming methods and all require special equipment and expert personnel. For the determination of TSH, biosensors based on the antibody-antigen relationship can have alternative measurement systems due to their advantages such as cost, short measurement time and high sensitivity.
In this thesis, an immunosensor based on electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was developed for the determination of TSH in the blood. For this purpose, in the first step self assembled monolayers were formed with cysteamine on the gold working electrode. In the second step, the electrode surface was modified with polyamidoamine dendrimer (PAMAM) and in the final step the anti-TSH antibody was immobilized to the modified working electrode surface. The TSH detection interval of the biosensor was determined as 0.1-0.6 mIU/L and this biosensor was used successfully in the analysis of artificial serum samples.
Year : 2019
Page Number : 66
Keywords : Thyroid Stimulating Hormone, Immunosensor, Biosensor, Electrochemical Impedance Spectroscopy, Self-Assembled Monolayer
v
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca bana yardımcı olan, yönlendiren, yol gösteren, destek ve yardımlarını esirgemeyen, bilgi ve tecrübelerini aktarırken göstermiş olduğu hoşgörü ve sabırdan dolayı tez danışmanım Sayın Hocam Doç. Dr. Hakkı Mevlüt ÖZCAN’a teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım.
Hayatım boyunca her zaman yanımda olan, yardımlarını asla esirgemeyen canım aileme sonsuz teşekkür ederim.
Bu tez çalışması Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu Tarafında desteklenen 2017/109 nolu ve “Tiroid Uyarıcı Hormon Tayini İçin İmpedans Spektroskopisi Temelli Bir Biyosensör Geliştirilmesi” isimli proje kapsamında gerçekleştirilmiştir.
vi
İÇİNDEKİLER
BÖLÜM 1 ... 1 GİRİŞ ... 1 BÖLÜM 2 ... 3 KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 32.1. Kimyasal Haberci; Hormon ... 3
2.1.1. Hormonların Sınıflandırılması ... 5
2.1.2. Hormonların Etki Mekanizmaları ... 6
2.1.3. Hormonların Kontrol Mekanizması ... 7
2.1.4. Tiroid Stimüle Edici Hormon (TSH) ... 8
2.1.5. TSH Tayin Metodları ... 11
2.2. Biyolojik Belirteçler: Biyosensörler ... 17
2.2.1. Biyosensörlerin Sınıflandırılması ... 20
2.2.2. Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi ... 22
2.2.3. Dönüşümlü Voltametri ... 23
2.3. Hormon Temelli Biyosensörlerde İmmobilizasyon Yöntemleri ... 24
2.3.1. Tutuklama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi ... 25
2.3.2. Adsorbsiyon Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi ... 25
2.3.3. Çapraz Bağlama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi ... 26
2.3.3.1. Glutaraldehit ile Çapraz Bağlama ... 27
2.3.4. Kovalent Bağlama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi ... 28
2.3.4.1. Kendiliğinden oluşan tek tabakalar (SAM) yöntemi ile yapısında sülfür bulunduran organik yapının immobilizasyonu... 28
2.3.4.1.1. Sisteamin ... 31
2.3.4.2. PAMAM (Poliamidoamin) ... 33
BÖLÜM 3 ... 34
MATERYAL VE METOD ... 34
3.1. Materyal ... 34
vii
3.1.2. Biyosensörün Geliştirilmesinde Kullanılan Kimyasal Çözeltilerin
Hazırlanması ... 35
3.1.3. Biyosensörün Geliştirilmesinde Kullanılan Cihazlar ... 35
3.2. Metodlar ... 36
3.2.1. Çalışma Elektrodunun Temizlenmesi ... 36
3.2.2. Biyosensörün Hazırlanması ... 36
3.2.3. Biyosensörün Çalışma İlkesi ... 37
3.2.4. Biyosensörün İmmobilizasyon Adımlarının Optimizasyonu ... 40
3.2.4.1. Sisteamin Konsantrasyonunun Optimizasyonu... 40
3.2.4.2. Sisteamin İnkübasyon Süresinin Optimizasyonu ... 41
3.2.4.3 PAMAM Konsantrasyonunun Optimizasyonu ... 41
3.2.4.4. Anti-TSH Konsantrasyonunun Optimizasyonu ... 42
3.2.5. Biyosensörün Karakterizasyonu ... 42
3.2.5.1. Doğrusal Tayin Aralığının Belirlenmesi ... 42
3.2.5.2. Tekrar Üretilebilirlik ... 42
3.2.5.3 Yapay Serumda TSH Analizi ... 43
3.2.5.4. Biyosensörün Yüzey Alanının Hesaplanması ... 43
BÖLÜM 4 ... 44
SONUÇLAR VE TARTIŞMA ... 44
4.1. Biyosensörün İmmobilizasyon Adımlarına İlişkin Veriler ... 44
4.2. Biyosensörün İmmobilizasyon Adımlarının Optimizasyonu ... 47
4.2.1. Sisteamin Konsantrasyonunun Optimizasyonu ... 47
4.2.2. Sisteamin İnkübasyon Süresinin Optimizasyonu ... 48
4.2.3. PAMAM Konsantrasyonunun Optimizasyonu ... 50
4.2.4. Anti-TSH Konsantrasyonunun Optimizasyonu ... 52
4.3. Biyosensörün Karakterizasyonu ... 53
4.3.1. Doğrusal Tayin Aralığının Belirlenmesi... 53
4.3.2. Tekrar Üretilebilirlik ... 56
4.3.3.Yapay Serumda Analiz ... 57
4.3.4. Biyosensörün Yüzey Alanının Hesaplanması ... 58
BÖLÜM 5 ... 61
viii
SEMBOLLER ve KISALTMALAR DİZİNİ
TSH :Tiroid Uyarıcı Hormon T3 :Triiyodotironin
T4 :Tiroksin
TRH :Tirotropin Salıcı Hormon PTH :Paratiroid Hormon RIA :Radyoimmunoassay
IRMA :İmmüno Radyometrik Assay
EIS :Elektrokimyasal impedans spektroskopisi CV :Dönüşümlü voltametri
Rct :Yük transfer direnci Zw :Warburg impedansı Rs :Çözelti direnci
ELISA :Enzim bağlı immünosorban yöntem FSH :Folikül uyarıcı hormon
ACTH : Adrenokortikotropik Hormon RNA :Ribonükleikasit
CPE-alpha :Sabit faz elemanı kapasitansı FIA :Floresans immünassay metodu GA :Glutaraldehit
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. Sinirsel uyarı oluştuktan sonra endokrin sistemlerdeki mekanizma ve hedef
dokular ...4
Şekil 2.2. Kimyasal yapılarına göre hormonların sınıflandırılması………...………5
Şekil 2.3. Hücre yüzey reseptörü ve hücre içi reseptör etki mekanizması……….……...7
Şekil 2.4. TSH molekülünün 3 boyutlu yapısı………..……….8
Şekil 2.5. TSH etki ve salınım mekanizması………...………10
Şekil 2.6. İmmunoassay yöntemlerinin esası……….…..12
Şekil 2.7. ELISA metodunun esası………..…13
Şekil 2.8. TSH molekülünün RIA metodu ile ölçülmesinin esası…………...…..……..14
Şekil 2.9. IRMA metodunun esasına ait görsel………...16
Şekil 2.10. FIA Metoduna ait görsel………17
Şekil 2.11. Biyosensörlerin şematik olarak gösterimi……….………18
Şekil 2.12. Biyosensörler için farklı elektrokimyasal ölçüm metodları…………..……21
Şekil 2.13. Potansiyel-Zaman ve Akım-Zaman büyüklerine bağımlı olan bir impedansın matematiksel olarak gösterim...……….………..………22
Şekil 2.14. Üçgen dalga potansiyel uygulandığında meydana gelen voltammogram.…24 Şekil 2.15. Tutuklama metodu ile immobilizasyon ………..………….….25
x
Şekil 2.17. Çarpraz bağlama metodu ile immobilizasyon………..………..…...26
Şekil 2.18. Glutaraldehit molekül yapısı……….…………..…..27
Şekil 2.19. Glutaraldehit çapraz bağlama reaksiyonu………...……..……27
Şekil 2.20. Kovalent bağlama metodu ile immobilizasyon………..………..……28
Şekil 2.21. SAM tabakasının şematik gösterimi………..…..……..29
Şekil 2.22. A: Altın bir yüzeye fonksiyonel grubunda tiyol içeren bileşiklerin oluşturduğu SAM ve B: yüzeyi hidroksillenmiş silisyum dioksitin alkilsiloksan ile SAM yapısının şematik gösterimi……….……….…….…..30
Şekil 2.23. Rosuhani ve arkadaşlarının tasarladığı sisteamin bazlı biyosensöre ait görsel………...….…...31
Şekil 2.24. Sisteamin molekülünün yapısı……...………32
Şekil 2.25. Sisteamim kullanılarak ALP’nin elektrot yüzeyine immobilizasyonu …….32
Şekil 2.26. PAMAM Dendrimeri (Gen.2.0)……….………...……33
Şekil 3.1. Biyosensörün tasarımı………..……….……..37
Şekil 3.2. Eş-değer devre modeli……….……38
Şekil 3.3. Gambry Analyst® yazılımındaki hesaplama yapılabilen devre modelleri ………..……..….39
Şekil 3.4. Yazılım Hesaplama Ekranı………..………40
Şekil 4.1. Biyosensörün immobilizasyon basamaklarının impedans spektrumları…….45
Şekil 4.2. Biyosensörün immobilizasyon basamaklarının döngüsel voltogramları…...45
Şekil 4.3. Farklı sisteamin miktarları kullanılarak hazırlanan biyosensörlerin kalibrasyon grafikleri ……….…47
xi
Şekil 4.4. Farklı sisteamin inkübasyon süreleri kullanılarak hazırlanan biyosensörlerin
kalibrasyon grafikleri………..……….49
Şekil 4.5. Farklı pamam konsantrasyonları (w/v) kullanılarak hazırlanan biyosensörlerin kalibrasyon grafikleri………..……….51
Şekil 4.6. Farklı anti-tsh konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan biyosensörlerin kalibrasyon grafikleri………..……….52
Şekil 4.7. Artan tsh konsantrasyonlarında eıs spektrumları……….………..….55
Şekil 4.8. Artan tsh konsantrasyonlarında döngüsel voltogramlar……..………55
Şekil 4.9. Biyosensörün kalibrasyon grafiği………..……..56
Şekil 4.10. Yalın elektrot ile 10 farklı potansiyelde elde edilen döngüsel voltogramlar………..…...58
Şekil 4.11. Tasarlanan biyosensör ile 10 farklı potansiyelde elde edilen döngüsel voltogramlar………..……….……..59
xii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Kimyasal yapıları farklı olan hormonların sınıflandırılması………6 Çizelge 2.2. Biyosensörlerin bileşenleri ………..………...……19 Çizelge 2.3. Biyosensörü oluşturan bileşenlerin içerikleri………...………...20 Çizelge 4.1. İmmobilizasyon basamaklarının yük transfer direnci değerleri…………..46 Çizelge 4.2. Farklı sisteamin konsantrasyonlarında elde edilen doğru denklemleri ve doğrusallık katsayıları………...………..….48 Çizelge 4.3. Farklı sisteamin inkübasyon süreleri kullanılarak hazırlanan biyosensörlerle elde edilen doğru denklemleri ve doğrusallık katsayıları………..…….….49 Çizelge 4.4. Farklı pamam konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan biyosensörlerle elde edilen doğru denklemleri ve doğrusallık katsayıları…..….……….…..…..51 Çizelge 4.5. Farklı anti-tsh konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan biyosensörlerle elde edilen doğru denklemleri ve doğrusallık katsayıları……...…53 Çizelge 4.6. Biyosensörün tekrar üretilebilirlik sonuçları………….………..……..…..57 Çizelge 4.7. Yapay serum örneklerinde tsh analizi sonuçları………..……...……...57
1
BÖLÜM 1
GİRİŞ
Hormonlar, değişik iç salgı bezlerinde sentezlenen ve salgılanan, organların ve sistemlerin belirli görevlerini yerine getirmesinde ve kontrol mekanizmalarının düzenlenmesinde önemli rol oynayan, metabolizmada hayati öneme sahip kimyasal habercilerdir (Nelson & Cox, 2013).
Tiroid uyarıcı hormon (TSH), hipofiz ön lobundan salınan, tiroid bezini uyararak birçok dokunun metabolizmasını düzenlemekle görevli olan tiroid hormonlarının kana salgılanmasını ve canlının büyümesinde ve gelişmesinde etkili olan hormondur (Rugge, Bougatsos & Chou, 2015).
TSH, metabolizmanın düzenlenmesinden sorumludur. Sinir sistemi, kas-iskelet sistemi ve üreme dokusunun işlevini düzenler. Ayrıca vücut ısısını, vücut ağırlığını ve kan kolesterol seviyesini düzenlemede kritik öneme sahiptir (Iwen, Schröder, & Brabant 2013). Düşük TSH düzeyleri, hipopitüitarizme, multinodüler guatr, Graves hastalığı ve kardiyovasküler hastalıklara yol açabilir (Green vd., 2014). Yüksek serum TSH düzeyleri konjenital hipotiroidi, Hashimoto tiroiditi ve hipofiz tümörlerine neden olabilir. Hipotiroidizmin lipid profili, kan şekeri düzeyi, yüksek tansiyon ve insülin direnci gibi önemli metabolik parametreleri olumsuz etkileyebileceği bildirilmiştir (Neto vd., 2014). Bu sebeple TSH’ın kan konsantrasyonunun tespiti çok önemlidir ve kandaki seviyelerinin takip edilmesi gereklidir.
Günümüzde biyoteknolojik gelişmeler sayesinde TSH’ın kandaki miktarının tayin edilmesi için çeşitli yöntemler tasarlanmıştır. TSH tayin yöntemleri içerisinde en
2
çok kullanılanı ELISA metodudur, ayrıca bu amaçla RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECLIA metodları da kullanılmaktadır (Choi vd., 2017; Wilson vd., 1987). Fakat bu metodların pahalı ekipman gereksinimi, zaman alıcı olması ve uzman personel gerektirmesi gibi dezavantajları vardır. Bu nedenle bu metodların yerine daha pratik, ucuz ve zamandan kazanç sağlayan biyosensörlerin kullanımı ilgi uyandırmaktadır.
Bu tez çalışmasında TSH’ın kandaki seviyesini belirleyebilmek için elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) temelli bir immunosensör tasarlanmıştır.
3
BÖLÜM 2
KAYNAK ARAŞTIRMASI
2.1. Kimyasal Haberci; Hormon
Hormonlar, farklı salgı bezlerinde üretilen ve salgılanan hedef dokularda etkili olan haberci moleküllerdir. Omurgalıların hedef dokularında metabolik ve fizyolojik olayların düzenlenmesinden sorumludurlar (Keha ve Küfrevioğlu, 2014). Hormonların salgılanması endokrin hücreler tarafından gerçekleştirilir, enerji metabolizmasını, üremeyi, gelişmeyi, büyüme ve farklılaşmayı düzenlerler.
Hormonlar ihtiyaç anında, özelleşmiş salgı bezlerinde belirli miktarlarda üretilir ve kana salınarak tüm vücuda yayılırlar (Nelson & Cox, 2013).
Hormonların sentezi ve salgılanması, hormon ve hedef hücre arasındaki etkileşimin sıralı basamakları yardımıyla kontrol edilir. Hipotalamustan kana küçük miktarlarda salgılatma faktörlerinin salınması, hipotalamusun özgül bir sinirsel haberciyle uyarılması sonucunda gerçekleşir; bu haberciler kapı toplar damarı sistemi üzerinden adenohipofize varırlar.
Bir hastalığın tanısı ve tedavisi, hastalıkla ilgili patofizyolojiyi anlayabilme ve test edebilme (miktarlayabilme) yeteneğine bağlıdır. Endokrin sistem rahatsızlıkları genellikle bir nedenden dolayı hormonların normal miktarların dışında üretimi ile ortaya çıkar. Hormon dengesizliği sonucu organizma normal işleyişinin dışına çıkar. Bu durum çok farklı sendromlar oluşturur. Bu sendromlarını tanımak ve etkili tedaviyi uygulamanın ilk aşaması; Hormonların etkisini detaylı olarak bilmek ve spesifik bir
4
hormonun fizyolojik ve metabolik etkilerini anlamaktır (Murray, Mayes, Granner, Rodwell, 1993).
Hormonlar işlevlerine göre üç grupta incelenebilir;
Büyüme ve farklılaşma
Vücut dengesinin sağlanması
Üreme
Büyüme ve farklılaşma işlevi üzerinde etkili olan hormonlar arasında en önemlileri büyüme hormonu ve tiroid hormonlarıdır. Vücut dengesinin sağlanmasında ise tiroid hormonları, paratiroid hormon (PTH), kortizol, aldosteron, insülin, vazopressin görev alır (Özata, 2019).
Temel iletişim kontrol sisteminde etkin olan nöronlar sinir sistemini oluştururlar. Nöronların oluşturduğu uyarılar hipotalamusu etkileyerek hormon salınımı düzenlenir. Hedef dokular Şekil 2.1’de gösterilmiştir.
5
Şekil 2.1. Sinirsel uyarı oluştuktan sonra endokrin sistemlerdeki mekanizma ve hedef dokular (Nelson & Cox, 2013)
2.1.1. Hormonların Sınıflandırılması
Sentezleri belirli organlarla sınırlı olmadığı ve hormon kavramı yeterli nitelikte diğer endojen maddelerden ayrılmadığı için hormonların sınıflandırılması güçtür. Bu sebeple hormonlar en genel anlamda sınıflandırılmışlardır ve kimyasal yapılarına göre 3 ana başlıkta incelenir (Ası, 2009).
Şekil 2.2’de ki tabloda en genel anlamda hormon sınıflandırılması gösterilmiştir.
Şekil 2.2. Kimyasal yapılarına göre hormonların sınıflandırılması (Ası, 2009)
Aminoasit yapısındaki hormonlar, en basit yapılı hormonlardır. Aminoasitlerden oluşurlar ve suda çözünebilirler. Endokrin bezlerde depolanırlar ve ihtiyaç halinde kana salınımları gerçekleşir. Dopamin ve epinefrin aminoasit yapısındaki hormonlara örnek olarak gösterilebilir.
6
Steroid yapıdaki hormonlar ise yağda çözünen ve vücut içerisinde kolesterolden sentezlenen hormonlardır. Hücre içerisinde depolanamadıkları için hızlıca kana salınırlar. Progesteron, aldosteron ve östrojen örnek olarak verilebilir.
Bir diğer hormon sınıfından olan peptid yapılı hormonlar ise karmaşık yapılardır ve büyük önem taşırlar. Yapısında uzun aminoasit zinciri içerirler ve suda çözünebilirler. Büyüme, hücrelerin çoğalması gibi metabolik olaylarda görevlidirler. Endokrin bezde depolanırlar ve endokrin bez sinirsel uyarım aldıktan sonra ihtiyaç duyulduğu anda salgılanırlar. TSH, insülin, PTH peptid yapılı hormonlara örnek olarak gösterilebilir (Akay, 2014)
Çizelge 2.1’de ise hormonların bir başka sınıflandırılması da gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Kimyasal yapıları farklı olan hormonların sınıflandırılması (Nelson & Cox, 2013)
2.1.2. Hormonların Etki Mekanizmaları
Hipotalamus, sinirsel uyarım aldıktan sonra endokrin bezlerini uyarır ve hormonlar kana salınır. Bu etki mekanizması hormon-reseptör sistemi ve hormon içi protein sentez sistemi olmak üzere 2 şekilde gerçekleşir.
7
Hormon-Reseptör sistemlerinde, hücrelerin zarı üzerinde protein yapısında bir reseptör vardır ve hormon bu reseptörü tanır. Buna göre her hormon için spesifik bir reseptör bulunmaktadır.
Hipofiz ön lob hormonları olan TSH, ACTH, FSH ve hipofiz arka lob hormonları olan vazopressin, PTH, glukagon, epinefrin, hipotalamik bölgeden salınan faktörler bu tip reseptör sistemi yolu ile etki yapan hormonlardır.
Hücre içi protein sentez sistemlerinde ise hormonlar çekirdekte yer alan genlere etki ederek haberci-RNA sentezini uyarır ve sonuç olarak ribozomlarda belirli proteinlerin biyosentezini arttırırlar. Steroid hormonlar bu etki ile çalışırlar (Ası, 2009). Şekil 2.3’te hormonların etki mekanizmaları şematize edilmiştir.
Şekil 2.3. Hücre yüzey reseptörü ve hücre içi reseptör etki mekanizması (Özdoğan, 2019)
2.1.3. Hormonların Kontrol Mekanizması
Hormonların sentezlenmesi ve hedef dokuya ulaşması için kana salınmaları, hiyerarşik bir kontrol mekanizmasının denetimi altında gerçekleşir. Genellikle hormonların büyük bir kısmının kana salınması birden fazla basamağın yer aldığı bir kontrol sistemi tarafından düzenlenir.
8
Hipotalamus bu kontrol sisteminin en üstünde yer alır. Hipotalamus’a ulaşan sinirsel bir uyarım bu bölgede salgılatıcı faktör mekanizmasını işletir ve çok küçük miktarlardaki özel hormonların salınımına yol açar (Ası, 2009).
Pankreas hormonları (insülin, glukagon), tiroid-paratiroid hormonları (PTH, Kalsitonin), böbrek üstü bezi hormonları (Adrenalin, Noradrenalin) hipotalamus tarafından kontrol edilemeyen hormonlardır (Nelson & Cox, 2013).
2.1.4. Tiroid Stimüle Edici Hormon (TSH)
TSH, hipofiz ön lobundan salgılanan moleküler ağırlığı insanda 30 kDa, sığırda 10 kDa, koyunda 35 kDa civarında olan α-β dimer yapısına sahip glikoprotein yapısında bir hormondur. İnsanda α alt birim 92, β alt birim ise 118 amino asitten oluşur. Protein yapısı kükürtçe zengindir. Karbonhidrat kısmı molekül ağırlığının % 20 sini oluşturur ve fukoz, mannoz, galaktoz, glukozamin ve galaktozamin içermektedir. Şekil 2.4’te TSH hormonunun üç boyutlu yapısı görülmektedir (Szkudlinski, Fremont, Ronin ve Weıntraub, 2002).
9
Şekil 2.4. TSH molekülünün 3 boyutlu yapısı (Szkudlinski vd., 2002)
TSH, T3 ve T4 hormonlarının kana salınımı için tiroid bezini uyarır. TSH’ın tiroid bezi işlevi üzerinde akut etkileri vardır. Bu etkiler dakikalar içinde gerçekleşir ve iyodür konsantrasyonu, eşleşme, tiroglobulin hidrolizi, organifikasyon da dahil T3 (3.3’5-triiyodotironin) ve T4 (tiroksin) biyosentezinin tüm fazları ile ilgili artışlarda etkilidir. Tiroid hormonları, gen ifadesi, doku farklılaşması ve genel gelişmeyi düzenler.
TSH Tiroid bezi üzerinde bazı kronik etkilere de sahiptir. Bunlar protein, fosfolipid, nükleik asit sentezlerindeki artışlar ve tiroid hücrelerinin sayısındaki ve ebatlarındaki artışlardır (Murray vd., 1993).
Tiroid hormonlarının kanda azalmasıyla hipotalamusa uyarı gider. Hipotalamus uyarıldıktan sonra tiroid salgılatıcı hormonun (TRH) salınımı gerçekleşir. TRH hipofiz bezi bazal zarındaki reseptörlerine bağlanır. Bu sayede ikincil haberci sistemi uyarılır. Çok fazla miktarda fosforilaz C üretilir. Fosforilaz C üretildikten sonra bir dizi tepkime kana TSH salınımını gerçekleştirir. Kana salınan TSH moleküllerinin tiroid hücre bazal zarındaki reseptörlerine bağlanmasıyla adenilatsiklaz etkinleşir ve cAMP sentezi uyarılır, cAMP miktarındaki artış protein kinazı aktifler, hücre içinde ilgili fosforilasyon basamakları başlar. Tüm bu olaylar sırasıyla gerçekleştikten sonra T3 ve T4 hormonları görevlerini yerine getirmek üzere kana salınırlar.
Kandaki TSH, T3 ve T4 seviyeleri birbirleriyle ilişkili haldedir. Kanda T3 ve T4 hormonlarının konsantrasyonu azaldığında hipofizden TSH salınımı gerçekleşerek kanda T3, T4 hormonlarının seviyelerini arttırır. T3 ve T4 hormonlarının konsantrasyonları azaldığında kanda TSH konsantrasyonu artar, T3 ve T4 hormonlarının konsantrasyonu arttığında TSH konsantrasyonu azalır. (Nelson & Cox, 2013; Wartofsky & Dickey, 2005; Rugge vd., 2015).
10 Şekil 2.5. TSH etki ve salınım mekanizması
TSH metabolizmanın düzenlenmesinden sorumludur. Sinir sistemi, kas-iskelet sistemi ve üreme dokusunun işlevini düzenler. Ayrıca vücut ısısını, vücut ağırlığını ve kan kolesterol seviyesini düzenlemede kritik öneme sahiptir (Moreno vd., 2008; Tarım 2011).
Kan serumunda TSH referans konsantrasyonu yaşa göre değişiklik göstermektedir ve referans değerler yetişkinler için 0.45- 4.12 mIUL-1
ve 70 yaşın üzerindeki yaşlılar için 0.4-5.9 mIUL-1
'dir (Smaniotto, Mezalira, Zapp, Gallardo, Vieira, 2017; Wiersinga, 2003). TSH konsantrasyonunun referans değerlerden daha yüksek ve daha düşük olması, sırasıyla hipotiroidi ve hipertiroidi olarak tanımlanmaktadır (Moreno vd., 2008). Referans değerlerden farklı olan serum TSH düzeyi doğrudan birçok hastalıkla ilişkili olabilir.
11
Düşük TSH düzeyleri, hipopitüitarizme, multinodüler guatra, tiroid nodüllerinin yanı sıra, antikorların TSH'yi taklit ettiği otonomik bir hastalık olan Graves hastalığına yol açabilir (Grenn vd., 2014; You, Park & Yoon 2013). Hipertiroidi, kemik mineral yoğunluğunda bir azalmaya neden olabilir. Ayrıca, kardiyovasküler sistemi etkileyebilir ve kalp hızını artırarak ve egzersiz kapasitesini azaltarak yaşam kalitesini bozabilir (Bernadette & David, 2008).
Yüksek serum TSH düzeyleri konjenital hipotiroidi, Hashimoto tiroiditi ve hipofiz tümörlerine neden olabilir. Hipotiroidizmin lipid profili, kan şekeri düzeyi, yüksek tansiyon ve insülin direnci gibi önemli metabolik parametreleri olumsuz etkileyebileceği bildirilmiştir (Wang 2013; Moura vd., 2014). Hipotiroidizm hamile kadınlarda fetusların nörolojik gelişimini olumsuz etkileyebilir (Haddow vd., 1999) ve çocuklarda ciddi fiziksel ve zihinsel gelişim sorunlarına yol açan endemik kretinizm ise neden olabilir (Kochupillai & Mehta 2008; You vd., 2013). Ayrıca, hipotiroidizmin sistolik hipertansiyon, atriyal fibrilasyon, bozulmuş lipid profili ve vasküler inflamasyona neden olarak kalp ve kardiyovasküler sistem hastalıklarına neden olduğu düşünülmektedir (Langén vd., 2018; Seo vd., 2018).
2.1.5. TSH Tayin Metodları
Hormonlar çok küçük miktarlarda etkili olabilen moleküllerdir ve serum konsantrasyonları da oldukça düşüktür. Bu nedenle hormonların serum konsantrasyonlarının belirlenmesi için kullanılan yöntemler çok hassas analiz metotlarını içermelidir. Hormon analizleri için günümüzde kullanılan metotların temelini immunoassay yöntemleri oluşturur. Bu yöntemlerin esası analizlenecek maddeye karşı bir antikor içermesi ve bir işaretleyici ile kombine edilmesidir. İşlem sonunda spesifik işaretleyicinin konsantrasyonunun belirlenmesi analiz edilecek hormonun konsantrasyonunun hesaplanmasında kullanılır. (Adam, 2000). Şekil 2.6’da imminoassay yöntemlerinin esası şematize edilmiştir.
12 Şekil 2.6. İmmunoassay yöntemlerinin esası
Enzim Linked Immuno Sorbent-Assay (ELISA)
ELISA metodu uzun bir deneysel prosedüre sahiptir ve hassasiyeti diğer immonoassay temelli metotlara göre azdır. Bu tekniğin prensibi antikorla antijen arasındaki reaksiyona dayanır. Sandviç metot olarak da bilinir. Bu teknikte konsantrasyonu belirlenmek istenen madde işaretsiz bir antijendir. Antikorun işaretlenmesi için enzim kullanılır; bu nedenle bu metoda enzim immunoassay adı verilmiştir. Alkalenfosfataz ve horseradishperoksidaz en çok kullanılan enzimlerdir. Ortama kullanılan enzimin substratını ekleyip enzim-substrat reaksiyonunda açığa çıkan rengin şiddeti ölçülerek antijenin miktarı tayin edilir. Renkli ürün oluşumu serumdaki antijen ile ters orantılıdır. Standart grafikten konsantrasyon belirlenir (Adam, 2000; Altınışık, 2004). Şekil 2.7’de ELISA yöntemi şematize edilmiştir.
13 Şekil 2.7. ELISA metodunun esası (Adam, 2000)
Literatürde ELISA metoduna dayalı TSH ölçümüyle ilgili çalışmalar yer almaktadır. Green vd. (2004), Graves rahatsızlığına dayalı göz kuruluğu yaşayan hastalarda 3. Nesil ELISA kiti kullanılarak TRAb-Hızlı ELISA kompleksine kan serumundaki TSH hormonlarının bağlanması ile TSH seviyeleri ölçerek klinik sonuçlar elde etmişlerdir. Wang vd. (2013) sandviç ELISA immünoassay yöntemini kullanarak TSH tayini için antikor seçimine olanak sağlayan yeni bir metot geliştirmişlerdir.
Radioimmunoassay (RIA)
Radyo immunoassay metodunun esası, işaretleyici bir radyoaktif element kullanarak işaretli hormonun miktarının tayin edilmesine dayanır. I125
rakyoaktif element en sık kullanılan işaretçidir. Yarılanma ömrü 60 gün olup, düşük enerjili, yüksek aktiviteli olmasından, ucuz ve kullanım kolaylığından dolayı tercih edilir, fakat radyasyon riski bulunmaktadır. I125
gamma ışınları yayan bir elementtir. Yaydığı gamma ışınları ile hormon miktarı tayin edilir.
14 Deney ortamında I125
ile işaretli TSH molekülleri ile işaretsiz TSH molekülleri bulunmaktadır. Fare ya da tavşan gibi kobay olarak kullanılan deney hayvanlarından hormonun antikoru elde edilir. I125 ile işaretlenmiş hormonlar ise uygun laboratuvar şartlarında in vitro olarak hazırlanır. Radyoaktif işaretleyici element ile işaretlenmiş antijen kit ile antikor hazır olarak bulunmaktadır. Piyasada Count-A-Count kiti olarak ta bilinen bu kitlerde, antikor, plastik tüplere kitleriyle beraber daha evvel bağlanmış olarak bulunmaktadır. Hasta serumlarında ölçülmesi planlanan hormonlar, işaretlenmemiş antijenlerdir.
Metodun esası, işaretli ve işaretsiz antijenlerin antikorlara bağlanmak için yarışmalarına dayanır. Ortamda bulunan işaretsiz antijenlerin sayısının fazla olması antikora bağlanmanın o denli artması anlamına gelmektedir. Deney bitiminde tüpteki sıvı alındıktan sonra tüp cidarında bağlı antikorlar ve antijenler kalır. Gamma sayıcı ile I125'in yaydığı gamma ışınları sayılır. Standart eğri grafiğinden hormon miktar tayini yapılır (Adam, 2000). Şekil 2.8’de RIA metodu şematize edilmiştir.
Şekil 2.8. TSH molekülünün RIA metodu ile ölçülmesinin esası
Bu metodun dezavantajları; radyoaktif izleyici kullanıldığı için sağlık tehlikesi barındırması, raf ömrünün kısa olması, radyoaktif atık bertarafı gerektirmesi ve yüksek
15
maliyetli ekipmanlara ihtiyaç duymasıdır. Bu sebeple yaygın olarak kullanılmamaktadır (Kalia vd., 2004).
Günümüzde RIA metodunu temel alan hazır kitler TSH tayini için kullanılmaktadır. Literatürde de RIA metodunu baz alan çalışmalar yer almaktadır, bunlardan bir tanesinde Glinoer ve Spencer (2010) normal tiroid fonksiyonunun normal bir gebelik için en önemli parametrelerden biri olduğuna vurgu yaparak, hamile kadınlarda tiroid fonksiyon anormalliklerini belirlemek için, kan TSH konsantrasyonlarını RIA metoduyla ölçmüşlerdir.
İmmüno Radyometrik Assay (IRMA)
Kan serumunda konsantrasyonu araştırılan antijene özgül antikorlar polisitiren tüp ya da plastikten oluşan katı fazlara bağlanmış olarak bulunmaktadır. Katı fazlardan oluşan tüplerin içine kan serumu eklenir ve inkübasyona bırakılır. Bu süre boyunca kan serumunda uygun antijenler kendine özgül antikorlara bağlanır ve antikor-antijen kompleksleşmesi oluşur. İnkübasyon işleminden sonra yıkama işlemi yapılarak ortamdaki diğer maddeler uzaklaştırılır.
Yıkama işlemi bittikten sonra tüpe antijene özgül radyoaktif madde ile işaretli antikor (antikor*) ilave edilerek tekrar inkübasyona bırakılır. Bu süre boyunca radyoaktif madde ile işaretlenmiş antikor, antijene bağlanarak, antikor-antijen-antikor* kompleksini meydana getirir. Ortamda antikor-antijen-antikor* dışındaki maddeleri uzaklaştırmak için tekrardan yıkama işlemi gerçekleştirilir.
Gamma sayıcı ile oluşan bu kompleksin radyoaktivitesi ölçülerek standart grafikden antijen miktarı hesaplanır (Altınışık, 2004). Şekil 2.9’da IRMA metodu şematize edilmiştir.
16
Şekil 2.9. IRMA metodunun esasına ait görsel (Ası, 2000)
IRMA metodu yaygın olarak kullanılmamaktadır. Literatürdeki TSH tayinine yönelik nadir çalışmalardan birinde Wilson vd. (1987), Graves hastalığına sahip hastalarda karbizamol ile tedavi sonrasında trioksikozun nüksetmesini öngörmenin mümkün olup olamayacağını belirlemek için kan TSH konsantrasyonlarını IRMA metodu ile belirlemişlerdir.
Floresans Immunoassay Metodu (FIA)
İşaretleyici olarak floresein gibi floresan özellik gösteren maddeler kullanılır. Floresan özellik gösteren bu maddeler önce enerjiyi absorbe ederler ve belli bir süre sonra tekrar salarlar. Bu şekilde oluşturdukları sinyal tespit edilerek ölçüm yapılır (Adam, 2000). Şekil 2.10’da FIA metodu şematize edilmiştir.
FIA metodu ile TSH tayini diğer metodlara nazaran daha az sayıda çalışılmıştır. Papendieck vd (1995) hipotiroidizm tanısı için yeni doğan bebeklerde ilk 48 saat içinde FIA metodu esasına dayanarak TSH seviyelerini belirlemişlerdir.
17 Şekil 2.10. FIA Metoduna ait görsel
TSH tayinine yönelik belirttiğimiz metodlar genel anlamda sıklıkla kullanılıp güvenilir yöntemler olmasına rağmen önemli dezavantajları bulunmaktadır. Belirtilen tüm yöntemlerin ekipmanlarının pahalı olması, ölçüm sürelerinin zaman alması, reaktiflerin raf ömürlerinin kısa olması, özel cihaz, ekipman ve kitlere ihtiyaç duyması, eğitimli uzman personele ihtiyaç duyulması ve yerinde rutin analizlere olanak vermemesi gibi dezavantajlara sahiptirler.
Tüm bunlar değerlendirildiğinde TSH analizleri için antikor-antijen ilişkisini temel alan yeni alternatif tayin metotların geliştirilmesinin gerekliliği açıktır.
2.2. Biyolojik Belirteçler: Biyosensörler
Yaşayan tüm varlıklar yaşamlarını devam ettirebilmek için bulundukları ortamdaki değişimleri algılayıp bu değişimlere uymaya çalışırlar. Biyosensörler bu algı mekanizmasıyla ortaya çıkmıştır (Telefoncu & Kılınç, 2012).
Bir biyosensör; biyoaktif veya biyoalgılama (biyokomponent, biyoreseptör, biyobileşen) kısımlarını içermelidir. Biyobileşen analiti tanımalıdır. Biyoalgılama
18
materyali fiziksel ölçüm bileşeni olan transdüser ile kombine edilmelidir. Tüm bunlar bir biyosensörün sahip olması gereken en önemli özellikleridir.
Genel olarak biyosensörler; kimyasal, biyolojik ya da biyokimyasal sinyali ölçülebilir ve işlenebilir elektriksel sinyale dönüştürebilen ve bir fiziksel bileşen ile birleştirilmiş biyolojik algılama materyali (biyokomponent) içeren bir cihazdır (Coulet, 1988; Datta, 1990; Turner, Karube, Wilson, 1987; Wangner & Guibalt, 1994). Şekil 2.11’de biyosensörler şematize edilmiştir.
Şekil 2.11. Biyosensörlerin şematik olarak gösterimi
Biyobileşenler ile fiziksel bileşenler birbirleriyle kimyasal reaksiyon ya da fiziksel bir yöntem ile birbirlerine bağlanabilmelidirler. En yaygın olarak kullanılan biyobileşenler antikorlar ile enzimlerdir (Telefoncu & Kılınç, 2012). Çizelge 2.2’de bir biyosensörleri oluşturan fiziksel bileşenler ve biyobileşenler şematik olarak gösterilmiştir.
19
Çizelge 2.2. Biyosensörlerin bileşenleri (Özcan, 2010)
Biyosensörler ile hormonlar, nükleik asitler, koenzimler ve inhibitörler gibi pekçok türde maddenin analiz edilmesi mümkündür. Çizelge 2.2’de belirtilen biyokomponent ve fiziksel bileşenler biyobileşenin analit ile ilişkisinin türüne göre genişletilebiri. Çizelge 2.3’te biyosensörü oluşturan biyokomponent ve fiziksel bileşenlerin daha geniş bir dağılımı yer almaktadır.
20
Çizelge 2.3. Biyosensörü oluşturan bileşenlerin içerikleri (Telefoncu, 2008)
2.2.1. Biyosensörlerin Sınıflandırılması
Biyosensörler, biyokomponent türüne göre, analit madde ile biyoaktif bileşen ilişkisine göre ve ölçüm sisteminin türüne göre 3 farklı şekilde sınıflandırılabilirler (Bahadır ve Sezgintürk, 2015; Telefoncu & Kılınç, 2012).
a) Analit madde ve biyoaktif bileşenlerine göre biyosensörler;
Biyoaffinite esaslı biyosensörler
21 b) Biyolojik bileşenlerine göre biyosensörler;
Enzim biyosensörleri
DNA biyosensörleri
İmmünosensörler
Doku biyosensörleri
Mikrobiyal Biyosensörler c) Ölçüm sistemlerine göre biyosensörler;
Elektrokimyasal esaslı biyosensörler
Kalorimetri esaslı biyosensörler
Piazoelektrik biyosensörleri
Optik esaslı biyosensörler
Elektro kimyasal esaslı biyosensörler kendi içerisinde 4 ana sınıfa ayrılır. Şekil 2.12’de elektrokimyasal ölçüm sistemleri gösterilmiştir.
Şekil 2.12. Biyosensörler için farklı elektrokimyasal ölçüm metodları (Bahadırve Sezgintürk, 2015)
22 2.2.2. Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi
Elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS, elektrokimyasal dielektrik spektroskopisi) immobilizasyon işlemi uygulanmış olan sistemlerin, miktarlarındaki değişimleri, yüzeylerindeki hassasiyetleri, kompleks elektriksel dirençlerini analiz etmek için uygulanan hem kolay kullanışlı hem de oldukça etkili bir yöntemdir.
Biyolojik materyallerin birbirleriyle spesifik etkileşimlerinin izlenmesinde ve kantitatif analizlerinde, biyosensörlerin hazırlanmasındaki kolaylıklardan dolayı tercih edilirler.
İmpedans yöntemleri ile biyoreseptör ve analiti arasındaki etkileşmesinin belirlenmesinin yanı sıra, immobilizasyon işleminin gerçekleşmesi ve yüzey modifikasyonunun karakterizasyonlarını da başarıyla gerçekleştirmek mümkündür. Bu özellikleri impedansa, görüntüleme tekniği kullanılarak yüzey morfolojisinin gözlenmesinde yardımcı olan önemli araçtır (Orazem & Tribollet, 2008; Sezgintürk ve Uygun, 2012).
Küçük genlikli bir potansiyel uygulayarak, akım cevabının belirlenmesi ile impedans tayini yapılır. Yani impedans, potansiyel-zaman fonksiyonunun, akım zaman fonksiyonuna bölümü ile hesaplanır. Şekil 2.13’te Potansiyel-Zaman ve Akım-Zaman büyüklerine bağımlı olan bir impedansın matematiksel olarak gösterimi yer almaktadır.
Şekil 2.13. Potansiyel-Zaman ve Akım-Zaman büyüklerine bağımlı olan bir impedansın matematiksel olarak gösterimi
23
İmpedansın birden fazla frekansı tayin etme özelliğinden dolayı difüzyon prosesleri, tabaka, membran veya yüzeylerin değişimleri hakkında bilgi edinilir. Bu bilgileri elde etmek için, impedans spektrumu eşdeğer bir devre kullanarak analiz işlemini gerçekleştirir. Bu devreler çoğunlukla direnç ve kapasitanstan oluşur. İncelenen sistemin farklı fizikokimyasal özellikleri de bu devre ile açıklığa kavuşur. Ayrıca bu sistem; partisyon, elektrokinetik, difüzyon gibi temel yasalardan türetilmiş olan transfer fonksiyonlarıyla da tanımlanır. Bu durumdan dolayı çözelti bileşiminin fonksiyonu, impedans bileşenlerinin (direnç veya kapasitans) değişimlerinden meydana gelmektedir. Konsantrasyondaki değişimle tüm impedans arasında ilişki kurulabilir fakat bu olay bazı durumlarda gerçekleşmektedir (Macdonald, 1987; Rubinstein, 1995; Barsoukov & Macdonald, 2005).
2.2.3. Dönüşümlü Voltametri
Dönüşümlü voltametri (Cyclic Voltammetry, CV), üçgen dalga şeklindeki bir potansiyelin, karıştırılmayan bir çözeltide durgun elektrodun akım cevabı uyarılmasıyla meydana gelir (Skoog, Holler ve Nieman, 1997).
Dönüşümlü voltametride doğrusal olacak şekilde belli bir potansiyel aralığında tarama işlemi gerçekleştirilir. Sonrasında potansiyeli asıl değerine getirebilmek için tarama yönü ters çevrilir. Tarama hızlarında değişiklik yoktur. Birkaç kez daha bu çevirim tekrarlanır. Ters yöndeki bu potansiyele döndürme potansiyelleri ismi verilmiştir. Bir ya da birden fazla analitin yükseltgenme ve ya indirgenmesinin difüzyon kontrollü olarak oluşturduğu potansiyel, döndürme potansiyel aralığını ortaya koyar. Başlangıç taramaları her iki yönlü (pozitif ya da negatif) olabilir. Bu yönler numune bileşimine göre değişiklik gösterir. İleri tarama, negatif potansiyeller yönündedir. Ters tarama da zıt yöndedir (Skoog vd., 1997). Şekil 2.14’te Döngüsel bir voltogram yer almaktadır.
24
Şekil 2.14. Üçgen dalga potansiyel uygulandığında meydana gelen voltammogram (Skoog vd., 1997)
2.3. Hormon Temelli Biyosensörlerde İmmobilizasyon Yöntemleri
Hormon biyosensörleri, immünosensörler sınıfında yer alan, son yıllarda hormon konsantrasyon tayinleri için elektrokimyasal ölçüm metodu olarak popülerliği artan sistemlerdir. Boş elektroda miktarı belirlenecek hormonun antikoru immobilize edilerek Antikor-Hormon etkileşimi ile oluşan elektrokimyasal sinyalin impidimetrik, amperometrik, potansiyometrik ya da konduktometrik olarak ölçülmesine dayanan yöntemlerdir.
Analizlenecek hormona uygun biyoreseptör ve transduseri belirledikten sonra transduser ile biyoreseptör birbiri ile etkileşip bağlanmalıdır. Bu olaya kısaca bireseptörün yani biyokomponentin immobilize edilmesi denir (Telefoncu & Kılınç, 2012).
25
İmmobilizasyon işlemi, biyoreseptörü çözünmez bir hale getirerek fiziksel bileşene kuvvetlice bağlanmasını içerir ve bu immobilizasyon işlemi bir biyosensörü oluşturan en önemli aşamadır (Evtugyn, 2014).
2.3.1. Tutuklama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi
Yüksek sayıda molekül içeren biyomoleküller doğal ya da sentetik jel matrikslerinde, yarı geçirgen membranlarda, misellerde ve mikro kapsüllerde tutuklanarak etkin bir şekilde fiziksel bileşene immobilize edilirler. Tutuklama işlemini yapan jel matrikslerin en yaygınları silikon lastiği, akrilamit polimerleri, nişasta ve polivinilklorürdür (Joshi, 2006). Tutuklama metodu ile immobilizasyon Şekil 2.15’te şematize edilmiştir.
Şekil 2.15. Tutuklama metodu ile immobilizasyon
2.3.2. Adsorbsiyon Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi
Kovalent olmayan etkileşimlerin (hidrojen bağları, çoklu tuz köprüleri ve Van der Walls kuvveti) etkin olduğu en basit immobilizasyon yöntemidir. Biyomoleküllerin sulu çözeltilerinin aktif taşıyıcı maddeleri ile etkileştirilerek adsorbe edilmesi esasına
26
dayanır. Selüloz, silikajel, kollajen, kil, hidroksiapatit en yaygın kullanılan adsorban maddelerdir. (Joshi 2006; Schelfer & Schubert, 1992). Adsorbsiyon metodu ile immobilizasyon Şekil 2.16’da şematize edilmiştir.
Şekil 2.16. Adsorpsiyon metodu ile immobilizasyon
2.3.3. Çapraz Bağlama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi
Çapraz bağlama ufak moleküllü ya da yapısında çoklu fonksiyonel gruplar barındıran moleküllerin transdusere güçlü kovalent bağlarla bağlanıp çözünmeyen bir kompleks oluşturma işlemidir ve kolay pratik bir işleme sahiptir. Glutaraldehit en yaygın kullanılan çarpraz bağlama ajanıdır (Joshi, 2006; Schelfer & Schubert, 1992). Çapraz bağlama metodu ile immobilizasyon Şekil 2.17’de şematize edilmiştir.
27 2.3.3.1. Glutaraldehit ile Çapraz Bağlama
Glutaraldehit molekülünde her iki ucunda da aldehit (-CHO) grubu içeren 5 karbonlu bir bileşiktir. Yapısında bulundurduğu aldehit grupları aminlerle (-NH2) kovalent olarak etkileşip Schiff bazını oluştururlar. Glutaraldehit bir ucu ile protein ile etkileşirken diğer ucu ile fiziksel bileşen yüzeydeki amin grubu ile bağlanarak çarpraz bağlama yapar (Migneault, Dartiguenave, Bertrand ve Waldron, 2004). Şekil 2.18’de glutaraldehitin kimyasal yapısı, Şekil 2.19’da çapraz bağlama reaksiyonu gösterilmiştir.
Şekil 2.18. Glutaraldehit molekül yapısı
28
2.3.4. Kovalent Bağlama Metodu Esasına Dayanan İmmobilizasyon Yöntemi Kovalent bağlama oluşturmak için bağlanma yüzeyi ve etkileşecek moleküllerin reaktif kısımlarında tiyol (-SH), amin (-NH2), Hidroksil (-OH), karboksil (-COOH), karbonil (-C=O) grupları bulunması gerekmektedir. Bu reaktif kısımlar olmadığında kendiliğinden oluşan tek tabakalar (SAM) yüzeyde reaktif gruplar oluşturur. (Joshi, 2006)
İmmobilizasyon yapılacak ortamın koşulları (ortam sıcaklığı, asitlik-bazlık) uygun olduğu takdirde bu kimyasal reaksiyona etki eder ve iyi bir bağlanma biyokomponenti daha dirençli bir hale getirir (Bain, Evall, Whitesides, 1989). Şekil 2.20’de kovalent bağlanma immobilizasyon yöntemi şematize edilmiştir.
Şekil 2.20. Kovalent bağlama metodu ile immobilizasyon
2.3.4.1. Kendiliğinden oluşan tek tabakalar (SAM) yöntemi ile yapısında sülfür bulunduran organik yapının immobilizasyonu
Kendiliğinden oluşan tek tabakalar (SAM), metal yüzeyle (altın, bakır, nikel, platin.) fonksiyonel baş grup içeren organik bir molekülün reaktif kısmının etkileşmesiyle oluşan kovalent yapılardır. SAM oluşumu güçlü bir kemisorbsiyona dayanmaktadır. Organik alkil zincirleri arasındaki Van der Walls etkileşimleri ve hidrofobik etkileşimler sayesinde elektrot yüzeyinde çok düzenli ve iyi organize olmuş bir şekilde tek tabaka oluşumunu sağlar. Elektrot yüzeyinde oluşan SAM, elektron transferi için kinetik bir bariyerdir. SAM’in en büyük avantajı uygun moleküller
29
seçilerek SAM tabakasının kalınlığının kontrol edilebilmesidir (Ulman, 1991; Bain vd., 1989, Wink, van Zuilen, Bult ve van Bennekom, 1997).
Tabaka pürüzsüzlüğü, subsratın yapısı, çözgen, adsorbanın yapısı, sıcaklık ve adsorban miktarı gibi bir çok etken SAM oluşumunu ve paketlenme yoğunluğunu etkiler (Chen & Jinghong, 2006).
Şekil 2.21’de SAM oluşumunun şematik gösterimi yer almaktadır. Şekil 2.22’de Sülfür ve tioyolat moleküllerinin pürüzsüz metal yüzeylerde oluşturduğu SAM gösterilmiştir (Chen & Jinghong, 2006).
30
Şekil 2.22. A: Altın bir yüzeye fonksiyonel grubunda tiyol içeren bileşiklerin oluşturduğu SAM ve B: yüzeyi hidroksillenmiş silisyum dioksitin alkilsiloksan ile SAM yapısının şematik gösterimi (Mrksich & Whitesides, 1996)
Roushani vd. (2015), insanda karyonik gonadotropik hormonunun (hCG) ölçülmesine dayalı bir biyosensör tasarlamışlardır. Tasarladıkları biyosensörde altın elektrodun sisteamin molekülünü immobilize edip ile SAM tabakası oluşturmuşlardır. Sisteamin ile oluşturulan SAM tabakasının üzerine sisteamin moleküllerinin amin gruplarına altın nanopartiküllerini bağlamışlardır. Ölçümü yapmayı planladıkları hormonun antikorunu (Anti-hCG) altın nanopartiküllere immobilize ederek hCG hormonunun ölçülmesine dayalı bir impidimetrik biyosensör tasarlamışlardır. Tasarladıkları biyosensör Şekil 2.23’te şematize edilmiştir.
31
Şekil 2.23. Rosuhani ve arkadaşlarının tasarladığı sisteamin bazlı biyosensöre ait görsel (Roushani, Valipour ve Valipour, 2016)
SAM kullanımının birçok yönden avantajlıdır. Biyomoleküllerin kolayca immobilize olması için müsait bir yüzey sağlarlar. Düzenli bir yapı, ufak boşluklar ve stabil bir tek tabaka oluşması kolay gerçekleşir. Biyomolekül miktarı az olsa dahi SAM üzerine immobilizasyon sağlanır (Chaki & Vijayamohanan, 2002). Bu önemli avantajlar nedeniyle biyosensör tasarımlarında sıklıkla kullanılmıştır.
2.3.4.1.1. Sisteamin
Sisteamin, bir dizi endikasyona yönelik olan ve sistinozu tedavi etmek için FDA tarafından onaylanan bir ilaçtır. Stabil aminotiol, yani hem bir amin hem de bir tiol fonksiyonel grup içeren bir organik bileşiktir. Sisteamin beyaz, suda çözünür bir katıdır.
Yapısında bulundurduğu tiyol (-SH) ve amin (-NH2) fonksiyonel gruplarından dolayı oldukça aktif bir moleküldür. Yapısındaki tiyol kısmı ile katı elektrot yüzey belli bir süre inkübe edildikten sonra SAM tabakası oluşmasını sağlar. Şekil 2.24’te sisteamin molekülü verilmiştir.
32 Şekil 2.24. Sisteamin molekülünün yapısı
Kullanım kolaylığı ve kararlı yapısı nedeniyle SAM oluşum reaksiyonları için oldukça uygun bir moleküldür. Bu nedenle biyosensör tasarımlarında sıklıkla kullanılmıştır.
Canbay ve Akyılmaz, dopamin ölçümünde kullanılmak üzere sisteaminin kullanıldığı bir biyosensör tasarlamışlardır. Tasarladıkları biyosensörde altın elektrot yüzeyine sisteamin ile SAM tabakası oluşturmuşlardır (Canbay & Akyılmaz, 2014).
Sisteamin, bir çok biyosensör tasarımında SAM oluşturmak için kullanılmıştır. (Sezgintürk & Uygun, 2012; Yang vd., 2004; Yorgancı & Akyılmaz, 2011). Şekil 2.25 bu çalışmalardan birisine ait bir görsel içermektedir.
Şekil 2.25. Sisteamim kullanılarak ALP’nin elektrot yüzeyine immobilizasyonu (Yorgancı & Akyılmaz,2011)
33 2.3.4.2. PAMAM (Poliamidoamin)
Poli (amidoamin) veya PAMAM, çoklu dallanmış ve yapısında amin ve amidlerin bulunduğu bir dendrimerdir. Yapısında bulundurduğu çok sayıdaki fonksiyonel gruplardan dolayı biyosensörlerde sıkça kullanılan kovalent bağlanan ajandır. Şekil 2.26’da PAMAM dendrimeri gösterilmiştir.
Şekil 2.26. PAMAM Dendrimeri (Gen.2.0)
Şenel ve Çevik, pirol-PAMAM dendrimerli, hidrojenperoksidaz enzimini ölçmeye dayalı bir amperometrik biyosensör tasarlamışlardır (Şenel & Çevik, 2012).
Literatürde PAMAM dendrimeri kullanılarak bir çok biyosensör tasarlanmıştır (Hatamluyi & Es’haghi, 2019; Sezgintürk & Uygun, 2012; Uygun vd., 2018).
34
BÖLÜM 3
MATERYAL VE METOD
3.1. Materyal
3.1.1. Biyosensörün Geliştirilmesinde Kullanılan Materyaller
Referans elektrot olarak kullanılan, 3 M potasyum klorür ile doyurulmuş Gümüş/Gümüş Klorür referans elektrot; IBAS, Warwickshire, UK’den satın alınmıştır.
Karşıt elekrod olarak kullanılan Platin tel karşı elektrot; IBAS, Warwickshire, UK’den satın alınmıştır.
Çalışma elektrodu olarak kullanılan 2.01 cm2
yüzey alanına sahip Altın çalışma elektrodu; IBAS, Warwickshire, UK’den satın alınmıştır.
Kendiliğinden oluşan tek tabakaların hazırlanması için kullanılan Sisteamin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA’den alınmıştır.
Antijen immobilizasyonunda kullanılan Poliamidoamin dendrimer (PAMAM Gen:1.5); Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA’den alınmıştır.
Çapraz bağlayıcı olarak kullanılan Glutaraldehit; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA’den alınmıştır.
Elektrokimyasal ölçümlerin gerçekleştirildiği, Potasyum klorür, Potasyum ferrisiyanat ve potasyum ferrosiyanür; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA’den, alınmıştır.
35
Yapay serum hazırlanması için kullanılan Serum Replacement Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA’den alınmıştır.
3.1.2. Biyosensörün Geliştirilmesinde Kullanılan Kimyasal Çözeltilerin Hazırlanması
50 mM pH:7.0 Fosfat Tamponu: Önce 3.549 g Na2HPO4 500 mL saf suda çözülür, sonra 3.4015 g KH2PO4 tartılarak saf suda çözülür. Bu iki çözelti pH:7.0 olacak şekilde karıştırılarak tampon çözelti hazırlanır.
5.0 mM K3[Fe(CN)6]: 0.8231 g poasyum ferrisiyanür tartılarak 500 mL pH:7.0
fosfat tamponunda çözülür.
5.0 mM K4[Fe(CN)6]: 1.0560 g potasyum ferrosiyanür tartılarak 500 mL pH:7.0
fosfat tamponunda çözülür.
Redoks Prob çözeltisi: 0.1 M KCl, 5.0 mM K3[Fe(CN)6], 5.0 mM K4[Fe(CN)6] içerecek şekilde hazırlanmıştır.
3.1.3. Biyosensörün Geliştirilmesinde Kullanılan Cihazlar
Geliştirilen biyosensörün tüm optimizasyon ve karakterizasyon çalışmalarında elektrokimyasal impedans ve döngüsel voltametri ölçümleri, Echem Analyst yazılımı içeren bir bilgisayara bağlı olan Gamry Potentiostate/Galvanostate, Reference 1000 (Gamry Instruments, Warminster, USA) cihazı kullanılarak yapılmıştır.
Çalışmada kullanılan diğer cihazlar;
Sıcaklık ve zaman kontrollü ultrasonik banyo (Wise Clean DAIHAN, Kore) Ultra saf su cihazı (ELGA PURELAB OPTION-Q)
Saf su cihazı (ELGA PURELAB OPTION-Q)
Hassas terazi (Precisa XB 220A, Precisa Gravimetrics AG/Switzerland) Mikro Pipetler (10 µL, 200 µL, 1000 µL Eppendorff)
36 Manyetik karıştırıcı (Biosan MSH 300) pH metre (6173 pH, made in China for USA)
3.2. Metodlar
3.2.1. Çalışma Elektrodunun Temizlenmesi
Elektrod temizliği altın çalışma elektrodu yüzeyinde bir önceki denemelerden kaynaklı yada dış ortamdan gelen safsızlıkların ölçüm sonuçlarına etki etmemesi açısından oldukça önemlidir. Her çalışmadan önce altın çalışma elektrodunun temizliği için aliminyum oksit ( Al2O3 < 50 nm partikül büyüklüğü) sentetik suni ipek (Buehler Microcloth PSA, Buehleri UK) üzerinde birkaç damla ultra saf su ile macun kıvamına getirilir. Her çalışmadan önce altın çalışma elektrodu bu yüzey üzerinde hafif hareketlerle gezdirilerek temizlenir. Elektrot yüzeyinde kalan aliminyum oksit partiküllerinin giderilmesi için elektrot önce saf su ile yıkanarak 5 dk saf su içerisinde ultrasonik su banyosunda inkübe edilir, daha sonra 5 dk etanol içerisinde yine ultrasonik su banyosunda inkübasyona bırakılır.
3.2.2. Biyosensörün Hazırlanması
Bu amaçla altın çalışma elektrodu Bölüm 3.2.1’de tarif edildiği şekilde temizlendi ve ultra saf argon gazı altında kurutuldu. Elektrot yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabaka oluşumu (SAM) için, temizlenmiş çalışma elektrodu % 99.9’luk etanolde (v/v) hazırlanan 0.1 M Sisteamin çözeltisi içerisinde 1 saat inkübe edildi. Bu süre sonunda altın çalışma elektodu yüzeyi etanol ve ardından saf su ile yıkanarak yüzeyde bağlanmadan kalan sisteamin molekülleri uzaklaştırıldı. İkinci adımda çalışma elektrodu % 1 lik glutaraldehit (v/v) çözeltisi içerisinde 10 dk bekletildi. Daha sonra anti-TSH’ın immobilize edileceği amino gruplarının sayısını ve dolayısıyla immobilizasyonun başarısını arttırmak amacıyla çalışma elektrodu metanolde % 1.5’lik PAMAM (w/v) içerisinde bir saat bekletildi. Son olarak PAMAM bağlanmış çalışma
37
elektrodu % 1’lik Glutaraldehit (v/v) çözeltisi içerisinde 10 dk bekletilip 1 saat 2.5 ng/µL Anti TSH ile inkübe edildi. Herbir immobilizasyon adımından önce ve sonra CV ve EIS alındı. Şekil 3.1’de biyosensörün tasarımı gösterilmiştir.
Şekil 3.1. Biyosensörün tasarımı
3.2.3. Biyosensörün Çalışma İlkesi
Tasarlanan biyosensörün hazırlanması için ilk önce Bölüm 3.2.1’de tarif edildiği gibi temizlenen çalışma elektrotlarına Bölüm 3.2.2’deki prosedür uygulandı. Her bir immobilizasyon adımından sonra döngüsel voltogramlar ve EIS spektrumları elde edildi. Anti-TSH immobilizasyonu sonrasında hazır hale getirilen biyosensör yüzeyine farklı konsantrasyonlarda TSH örnekleri uygulandı. Her uygulamadan sonra bağlanmadan kalan TSH molekülleri saf su ile yıkanarak uzaklaştırıldı. Her bir TSH inkübasyonu sonrası EIS ölçümleri alınarak, yüzeydeki bağlanmaya bağlı olan yük transfer değişimleri kaydedildi. TSH konsantrasyonlarına karşı yük transfer direncindeki eğimden yararlanılarak kalibrasyon grafikleri hazırlandı. CV ve EIS ölçümleri Bölüm 3.1.2’de tarif edilen redoks prob çözeltisi içerisinde gerçekleştirildi. CV ölçümleri -0.5 - 1.0 V potansiyel aralığında 1 mV adım büyüklüğünde ve 50 mV/s tarama hızında yapıldı. EIS ölçümleri 5 mV alternatif akımda, impedans spektrumları 10000 – 0.05 Hz aralığındadır.
EIS yük transfer direncinin belirlenmesinde kullanılan etkili bir yöntemdir. Hedef analitin konsantrasyonu, analit çalışma elektrot yüzeyine bağlandığında oluşan
38
yük transfer direncindeki değişiklik ölçülerek EIS ile kolayca belirlenebilir. EIS spektrumlarından elde edilen Nyquist eğrileri tipik olarak doğrusal ve yarım daire biçimli iki bölümden oluşur ve elde edilen yarım daire çapı çalışma elektrotunun yüzeyindeki yük aktarma direncini hesaplamak için kullanılır. Yük transfer direncinin doğru hesaplanması için geliştirilen sistem bir eş-değer devre modeline göre modellenmelidir ve bu model kullanılarak yük tranfer direnci hesaplanır. Bu çalışmada Gamry Analyst® yazılımı kullanılarak geliştirilen sistemin modellendiği eş değer devre Şekil 3.2’de gösterilmiştir. Burada Rct; yük transfer direncini, Zw; Warburg İmpedansını, Rs; çözelti direncini, CPE-alpha; sabit faz elemanı kapasitansını göstermektedir.
Şekil 3.2. Eş-değer devre modeli
Yük transfer direncinin hesaplanması için, Nyquist diyagramı Gamry Analyst® yazılımı kullanılarak açılır. Üst menüde yer alan sekmelerden “Impedance” sekmesi tıklanır ve açılan sekmeden “Fit A Model (Simplex Method)” seçilir. Dana sonra açılan pencereden görülen devre sistemlerinden bu çalışmaya uygun olan “CPE with Diffusion” devresi seçilir (Şekil 3.3.).
39
Şekil.3.3. Gambry Analyst® yazılımındaki hesaplama yapılabilen devre modelleri
Devre modeli seçildikten sonra “reset to default values” sekmesi seçilerek hesaplama ekranındaki değerler sıfırlanır (Şekil 3.4). Hesaplama alanındaki değer sıfırlandıktan sonra “calculate” sekmesi birkaç kez tıklanarak hesaplama eğrisinin Nyquist eğrisi ile uyumlu hale gelmesi sağlanır. Yazılımın hesapladığı Rp değeri yük trasfer direncine karşılık gelir ve kaydedilerek bir sonraki hesaplamaya geçilir.
40
Şekil 3.4. Yazılım Hesaplama Ekranı
3.2.4. Biyosensörün İmmobilizasyon Adımlarının Optimizasyonu
Biyosensör dizaynında kullanılması planlanan her bir kimyasalın optimize edilmesi, biyosensör cevaplarının her ölçümde tutarlı olması açısından büyük önem taşır. Bu amaçla immobilizasyon adımlarında kullanılan kimyasalların değişen konsantrasyonlarıyla hazırlanan biyosensörler ile 7 farklı TSH konsantrasyonunda EIS ve CV ölçümleri alındı.
3.2.4.1. Sisteamin Konsantrasyonunun Optimizasyonu
Anti-TSH immobilizasyonun en başarılı olduğu SAM oluşumunda kullanılması gereken optimum sisteamin konsantrasyonunu belirlemek amacıyla dört farklı konsantrasyonda sisteamin çözeltileri hazırlandı. Altın elektrotlar 10 mM, 50 mM, 100 mM ve 150 mM’lık sisteamin çözeltileri içerisinde 1 saat süre ile inkübe edildi. Sisteamin konsantrasyonun biyosensör cevabına etkisinin kesin olarak belirlenmesi için
41
Anti-TSH immobilizasyonunda kullanılan diğer kimyasalların konsantrasyonları sabit tutuldu. Hazırlanan biyosensörler ile analitin farklı konsantrasyonlarında EIS ve CV ölçümleri yapılarak standart grafikler elde edildi
.
3.2.4.2. Sisteamin İnkübasyon Süresinin Optimizasyonu
İmmoblizasyonun ilk aşaması olan SAM oluşumunda en uygun sisteamin konsantrasyonu belirlendikten sonra, biyosensör cevabına sisteamin inkübasyon süresinin etkisinin belirlenmesi amacıyla, altın çalışma elektrotları aynı sisteamin konsantrasyonunda farklı zaman aralıklarında inkübe edildi. 30 dk, 60 dk ve 90 dk’lık inkübasyon periyotları ile hazırlanan biyosensörler ile farklı analit konsantrasyonlarında EIS ve CV ölçümleri alındı. Hazırlanan standart grafikler yardımıyla en iyi biyosensör cevabının elde edildiği sisteamin inkübasyon süresi tespit edildi. Biyosensör cevabına sisteamin inkübasyon süresinin net etkisinin belirlenmesi için diğer immobilizasyon koşulları herbir elektrot için sabit tutuldu.
3.2.4.3 PAMAM Konsantrasyonunun Optimizasyonu
Elektrot yüzeyinde Anti-TSH moleküllerinin immobilize olduğu amino gruplarının sayısının arttırılması için kullanılan PAMAM dendrimerinin en uygun konsantrasyonunun belirlenmesi amacıyla, diğer immobilizasyon koşulları sabit tutularak dört farklı konsantrasyondaki PAMAM çözeltileri ile biyosensörler hazırlandı. Bu amaçla % 0.5, % 1, % 1.5 ve % 2 lik (w/v) PAMAM çözeltileri kullanılarak hazırlanan dört farklı biyosensör ile farklı analit konsantrasyonlarında EIS ve CV ölçümleri gerçekleştirildi. Hazırlanan standart grafikler yardımıyla en uygun PAMAM konsantrasyonu belirlendi.
42
3.2.4.4. Anti-TSH Konsantrasyonunun Optimizasyonu
TSH analizi için biyoreseptör molekül olan Anti-TSH’ın optimum konsantrasyonunun belirlenmesi için dört farklı konsantrasyonda Anti-TSH çözeltileri hazırlandı. 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM ve 5 mM lık antikor çözeltileri ile hazırlanan dört farklı biyosensör ile farklı analit konsantrasyonlarında EIS ve CV ölçümleri yapıldı. Bu aşamada sadece Anti-TSH miktarının biyosensör cevabına etkisini belirlemek için diğer immobilizasyon kimyasallarının konsantrasyonu sabit tutuldu. Hazırlanan standart grafikler yardımıyla en iyi biyosensör cevabının elde edildiği antikor konsantrasyonu belirlendi.
3.2.5. Biyosensörün Karakterizasyonu
Bu kapsamda; doğrusal tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, tayin sınırı, elektrod yüzey alanı ve yapay serumda analizler yapılarak tasarlanan biyosensörün değerlendirilmesi yapılmıştır.
3.2.5.1. Doğrusal Tayin Aralığının Belirlenmesi
Bölüm 3.2.4.’te tanımlanan optimum değerlerin kullanılmasıyla hazırlanan biyosensörler ile altı farklı TSH konsantrasyonunda (0.1-0.6 mIU/L) EIS ölçümleri gerçekleştirildi ve elde edilen veriler kullanılarak kalibrasyon grafiği çizildi. Kalibrasyon grafiğinin hazırlanmasında ∆Rct=Rct(antijen)-Rct(antikor) denklemi kullanıldı.
3.2.5.2. Tekrar Üretilebilirlik
Bölüm 3.2.4.’te tanımlanan optimum değerlerin kullanılmasıyla hazırlanan biyosensörler ile doğrusal tayin aralığında EIS ölçümleri yapıldı. Farklı günlerde hazırlanan biyosensörler ile elde edilen biyosensör cevapları karşılaştırılarak tasarlanan biyosensörün tekrar üretilebilirliği incelendi.
43 3.2.5.3 Yapay Serumda TSH Analizi
Bölüm 3.2.4.’te tanımlanan optimum değerlerin kullanılmasıyla hazırlanan biyosensörler ile doğrusal tayin aralığında yapay serum örneklerinde EIS ölçümleri gerçekleştirildi. Yapay serum örnekleri hazırlamak için ilk önce serum replacement çözeltisi 1/50 oranında seyreltildi, daha sonra son konsantrasyonlar 4.5 mM KCl, 5 mM CaCl2, 145 mM NaCl olacak şekilde tuz ilaveleri yapıldı, son olarak istenilen konsantrasyonda TSH örnekleri eklendi. Bu çalışma ile serum içerisinde bulunan protein ve tuzların biyosensör cevabı üzerine etkisi incelendi.
3.2.5.4. Biyosensörün Yüzey Alanının Hesaplanması
Biyosensörün oluşum aşamasında çalışma elektrodunun ne oranda antikor ile kaplandığını belirlemek amacıyla yalın elektrod ve antikor bağlı elektrodlar kullanılarak 10 faklı potansiyelde (10→100 mV) döngüsel voltogramlar alındı. Döngüsel voltogramlardan elde edilen verilerin Laviron eşitliğine uygulanmasıyla çalışma elektrodu yüzeyinin hangi oranda kaplandığı belirlendi. Laviron eşitliği;
Q = n x F x A x г Eşitlikte;
Q: Yük miktarı
A: Elektrot alanı (0.0201 cm2 )
n: 10 farklı tarama hızında elde edilen döngüsel voltogramlar yardımıyla hazırlan katodik akım- potansiyel grafiklerinin eğimi.
F: Faraday sabiti (96485 C/mol) Г: Kaplanan yüzey alan (mol/cm2
44
BÖLÜM 4
SONUÇLAR VE TARTIŞMA
4.1. Biyosensörün İmmobilizasyon Adımlarına İlişkin Veriler
Biyosensörün hazırlanması aşamasında, herbir immobilizasyon adımından sonra EIS spektrumları ve döngüsel voltogramlar alınmıştır. Şekil 4.1’de EIS spektrumları Şekil 4.2’de döngüsel voltogramlar gösterilmiştir. Ayrıca immobilizasyon adımlarının yük transfer direnci değişimleri Çizelge 4.1’de gösterilmiştir. Burada her bir immobilizasyon adımını işaret eden bazı kısaltmalar kullanılmıştır;
BARE: Temizlenmiş yalın altın çalışma elektrodu.
BARE-SİS: Sisteamin ile modifiye edilmiş altın çalışma elektrodu.
BARE-SİS-PAMAM: SAM oluşumu sonrası PAMAM ile modifiye edilmiş altın çalışma elektrodu.
45
Şekil 4.1. Biyosensörün immobilizasyon basamaklarının impedans spektrumları
